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Argomento della lezione


Riarrangiamento genico
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Gli immunologi per spiegare la struttura gli anticorpi si
sono trovati davanti ad almeno tre grossi problemi:
lesistenza della enorme variabilit (diversit) del
sito combinatorio; il repertorio anticorpale dato
da tutte le specificit anticorpali disponibili in un
individuo. Nelluomo, il loro numero totale almeno
maggiore di 10
11
.
lesistenza nello stesso anticorpo di una parte
variabile ed una costante;
lesistenza di diversi isotipi con la stessa specificit
nella regione variabile.
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Gli immunologi per dare una spiegazione alla struttura particolare
degli anticorpi elaborarono due teorie:
1. La teoria della linea germinale (un gene per ciascuna
diversa catena immunoglobulinica, repertorio in gran
parte ereditato).
2. La teoria della variabilit somatica (modificazioni
durante la vita di un individuo, partendo da un numero
limitato di geni).
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La clonazione dei geni delle Ig ha rivelato che entrambe
le teorie erano corrette:
- Sequenza di DNA codificante generata dal
riarrangiamento di un numero relativamente piccolo di
segmenti genici ereditati.
- Diversificazione aumentata attraverso processo di
ipermutazione somatica che avviene nelle cellule B
mature attivate
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Nella configurazione germinale (nel DNA) le catene pesanti e leggere
sono codificate da famiglie multigeniche distinte, localizzate su
cromosomi differenti.
Organizzazione multigenica dei geni delle immunoglobuline
Ciascuna famiglia multigenica contiene molteplici sequenze codificanti,
dette segmenti genici, separate da sequenze non codificanti.
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La famiglia delle catene pesanti si trova su un singolo cromosoma
(14) e contiene i segmenti genici V, D, J (regione variabile) e C
(regione costante).
Le famiglie delle catene leggere e si trovano su due cromosomi
differenti (2 e 22 rispettivamente) e contengono i segmenti genici V e J
(regione variabile) e C (regione costante).
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I diversi segmenti genici nelluomo
40
25
Chromosoma 2 22 14
Regione Variabile
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Organizzazione germinale dei loci delle catene
leggere e pesanti delle Ig
Locus catena (1050 Kb, cromosoma 22)
Locus catena (1820 Kb, cromosoma 2)
Locus catena H (1250 Kb, cromosoma 14)
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Dimostrazione sperimentale della teoria di Bennett e Dreyer (modello a due
geni) ad opera di Tonegawa e Hozumi (1976)
RE= enzimi di restrizione
Nelle cellule B, i geni delle Ig
sono riarrangiati
Southern
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Meccanismi per determinare
la diversitdel repertorio
1. Diversit combinatoria (presenza di molti
segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversit giunzionale
3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante
e leggera
4. Ipermutazione somatica
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Riarrangiamento della catena pesante
L
H
1 V
H
1 L
H
2 V
H
2 L
H
V
H
~40
J
H
1-6
DNA germinale
D
H
1-25
C

Ricombinazione DJ
Es: D
H
25-J
H
4
L
H
1 V
H
1 L
H
2 V
H
2 L
H
V
H
~40
C

J
H
4 J
H
5 J
H
6 D
H
25
V
H
2 L
H
2
Ricombinazione V-DJ
Es: V
H
2-DJ
C

J
H
4 J
H
5 J
H
6 D
H
25
RNA trascritto primario
C

V
H
2 L
H
2 J
H
4 J
H
5 J
H
6 D
H
25
AAA
mRNA
DJ V L C

AAA
Splicing
Trascrizione
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Riarrangiamento genico o ricombinazione
somatica della catena leggera K
DNA riarrangiato della catena K
J V L
C
L
K
1 V
K
1 L
K
2 V
K
2 L
K
3 V
K
3 C
K
L
K
V
K
~40 J
K
1-5
DNA germinale
Ricombinazione VJ
V
K
1 L
K
1 C
K
J
K
3 J
K
3 J
K
4 J
k
5
J V L
C
AAA
RNA Trascritto primario
J V L
C
AAA
Trascrizione
Splicing
mRNA
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Sequenza nucleotidica delle RSS (sequenze segnale di ricombinazione
dallinglese Recombination Signal Sequence)
RSS a due giri
RSS a un giro
eptamero eptamero nonamero nonamero
RSS= eptameri e nonameri palindromici conservati Sequenze spaziatrici= 12 o 23 paia di basi
Sequenze spaziatrici a 12 paia di basi= un giro dellelica del DNA
Sequenze spaziatrici a 23 paia di basi= due giri dellelica del DNA
Meccanismi della ricombinazione somatica
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Localizzazione delle RSS nel DNA germinale delle Ig
Regola 12/23
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I segmenti genici della regione V sono riuniti grazie alla ricombinazione
Gli enzimi che catalizzano la
giunzione tra i vari segmenti V-
(D) J sono detti ricombinasi.
Sono codificati da due geni,
chiamati RAG-1 e RAG-2
(dallinglese: Recombination
Activating Genes: geni attivanti la
ricombinazione).
SCID (Severe Combined
ImmunoDeficiency)
Altri geni implicati nella
recombinazione VDJ:
Ku70:Ku80, DNA-PK,
Cernunnos, Arthemis la cui
inattivazione responsabile di
SCID nelluomo
Orientamento trascrizionale in
direzioni opposte
Esoni V
e J:
Stesso orientamento
trascrizionale
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Meccanismi per determinare
la diversitdel repertorio
1. Diversit combinatoria (presenza di molti
segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversit giunzionale
3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante
e leggera
4. Ipermutazione somatica
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1
2
3
4
5
6
20
21
Aggiunta dei nucleotidi P ad
opera degli enzimi riparatori
Aggiunta dei nucleotidi N ad
opera dell enzima TdT
TdT= enzima desossinucleotidil
transferasi terminale
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Riarrangiamento
produttivo
Riarrangiamento
non produttivo
Flessibilit
giunzionale
Flessibilit giunzionale
Due su tre riarrangiamenti non sono produttivi
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24
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Meccanismi per determinare
la diversitdel repertorio
1. Diversit combinatoria (presenza di molti
segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversit giunzionale
3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante
e leggera
4. Ipermutazione somatica
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Fattori che contribuiscono alla generazione della diversit del
repertorio anticorpale
catene
N geni della linea germinale
H
V 40 40 30
D 25 0 0
J 6 5 4
Ricombinazione 40 x 25 x 6 = 6000 40 x 5 = 200 30 x 4 = 120
Associazione catene H e L 6000 x (200 + 120) = 1,9 x 10
6
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Meccanismi per determinare
la diversitdel repertorio
1. Diversit combinatoria (presenza di molti
segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversit giunzionale
3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante
e leggera
4. Ipermutazione somatica
Prime fasi di
maturazione,
negli organi
linfatici centrali
Organi linfatici
periferici
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30
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Lipermutazione somatica introduce diversificazione nella
regione variabile riarrangiata
Mancanza di Citidina Deaminasi Indotta dallAttivazione (AID) blocca
laccumulo di mutazioni somatiche
32
40
25
1,9 X 10
6
5 X 10
13
3 X 10
11
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Immunoglobulina di membrana
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Ig di membrana e secretoria
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Co-espressione di IgM ed IgD
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Isotype switch = Scambio di isotipo = Generazione di Ac con
la stessa specificit antigenica ma funzioni effettrici diverse
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Isotype switch = Scambio di isotipo
Mancanza di AID
blocca
completamente lo
scambio isotipico
ed associato a
immunodeficienza:
sindrome da iper
IgM di tipo 2.
Locus
murino
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Sommario
Le catene pesanti e leggere sono codificate da famiglie multigeniche
distinte, localizzate su cromosomi differenti.
Ciascuna famiglia multigenica contiene molteplici sequenze codificanti,
dette segmenti genici, separate da sequenze non codificanti.
Le famiglie delle catene leggere e si trovano su due cromosomi
differenti (2- 22 respettivamente) e contengono i segmenti genici V e J
(regione variabile) e C (regione costante).
La famiglia delle catene pesanti si trova su un singolo cromosoma (14)
e contiene i segmenti genici V, D, J (regione variabile) e C (regione
costante).
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La specificit del sito combinatorio determinata da:
ricombinazione dei vari segmenti genici,
diversit giunzionale (e aggiunta dei nucleotidi N, P),
associazione tra la catena pesante e quella leggera,
ipermutazione somatica
La stessa regione V pu essere associata con diverse regioni C,
grazie allo scambio di isotipo che permette la produzione di Ac
con la stessa specificit antigenica ma funzioni effettrici diverse