Celulas NK

Las clulas natural killer (NK)son una subpoblacin pequea de linfocitos (distintos a los T y B),
constituyen del 10% al 20% de las clulas mononucleares circulantes. En condiciones normales se
encuentran en sangre perifrica, bazo y medula sea, pueden migrar a tejidos con procesos
inflamatorios en respuesta a seales bioqumicas. Estas clulas tienen la capacidad de producir
citosina, quimiocinas y regulan la activacin o inhibicin de otras clulas del sistema inmune. Otras
poblaciones de clulas Nk se encuentran en los ganglios linfticos, donde tienen poca actividad
citotoxica.
Se originan en la medula osea, forman una estirpe celular diferente a las de los linfocitos T
citotoxicos, separndose de estas en una etapa inicial de diferenciacin, no necesitan el timo para
su maduracin, actan espontneamente, no requieren de reconocimiento previo y no generan
memoria, razn por la cual se consideran como integrantes de la inmunidad innata. Estos
linficutos tienen la capacidad de lisar diferentes clulas tumorales son estimulacin previa. Estas
representan una poblacin linfoide que a diferencia de los linfocitos T o B no expresan receptores
para antgenos, clonalmente distribuidos, carecen de TCR y de IgM y se caracterizan por presentar
en su superficie, moleculas Fc-gamma R-lll (CD16) y CD56 y carecen de CD3.
Laidentificacion de algunos de estos marcadores puede ser variable, por lo que se pueden
reconocer varias subpoblaciones de clulas NK, tales como clulas altamente positivas para CD56
(CD56 bright), dbilmente positivas para este marcador (CD56 dim), o clulas CD16+ CD56+ o
CD16-CD56-.
En el humano la actividad citotoxica de las clulas NK en la inmunidad tumoral no se conoce con
exactitus, se ha sugerido que estas clulas destruyen clones malignos. En cultivos celulares, las
clulas NK pudene lisar clulas infectadas por virus, especialmente del tipo herpes y ciertas lines
celulares tumorales, especialmente tumores hematopoyticos causados por exposicin a
sustancias txicas. Tambin responden ante clulas que tengas una reducida o defectuosa
expresin de moleculas de clase l del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), que hayan
escapado a la lisis por los CTLs.
Receptores. Activan o inhiben las rutas de sealizacin intracelular que desencadenan las diferentes
funciones efectoras de las clulas NK. La unin especfica de los receptores inhibidores a determinados
alelos de las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA) de clase I inhibe las funciones de
las clulas NK.
Mecanismos de activacin. Las clulas NK son activadas por la interaccin con determinadas molculas de
superficie expresadas en las clulas de los tejidos circundantes, por diferentes factores solubles y por la
matriz extracelular.
Capacidades funcionales. Las clulas NK desarrollan la capacidad de matar clulas diana de forma natural y
dependiente de anticuerpo. Adems, secretan factores solubles que regulan las funciones de otras clulas
del sistema inmune. Por tanto, son clulas efectoras de la inmunidad natural y adquirida. La capacidad
funcional caracterstica de estas clulas es la eliminacin de clulas tumorales y de clulas infectadas por
virus.
Mecanismos de citotoxicidad. El proceso clave de la citotoxicidad es la secrecin de grnulos, los cuales
contienen protenas formadoras de poros y protenas que disparan la apoptosis. La citotoxicidad es selectiva
y tiene lugar en la zona de contacto entre el linfocito citotxico y la clula diana, donde se concentran
molculas que participan en la adhesin, sealizacin y secrecin de los grnulos, constituyendo la
denominada sinapsis inmunolgica.
Muestras de sangre de pacientes y controles
Se recolectaron muestras de sangre perifrica con heparina de 20 pacientes con infecciones
graves o recurrentes (31,32). De estos, seis eran hombres y 14 mujeres, ocho eran nios menores
de 12 aos y 12 eran adultos (cuadro 1).
Los resultados de los anlisis en cada uno de los pacientes se compararon con los de controles
sanos pareados por edad y sexo. Ocho pacientes (1 a 8) presentaban infecciones orales o faciales
por HSV recurrentes y diagnosticadas clnicamente, cinco (9 a 13) padecan de infecciones
recurrentes genitales por HSV, tres (14 a 16) tenan infecciones graves por EBV con cargas virales
en sangre mayores a 10.000 copias/ml, dos pacientes (17 y 18) presentaban verrugas vulgares por
HPV y otros dos pacientes (19 y 20) presentaban diversas infecciones recurrentes, principalmente
neumonas, pero sin diagnstico clnico definido.
El estado clnico de los pacientes en el momento de la evaluacin del nmero y funcin de los linfocitos NK
fue variable, algunos presentaban infecciones activas y estaban hospitalizados y otros estaban en estado de
remisin (cuadro 1). Cuando las evaluaciones iniciales realizadas a los pacientes se encontraban alteradas, se
realiz seguimiento para determinar si estas eran constantes en el tiempo.
Cuantificacin del nmero y subpoblaciones de linfocitos NK y expresin de perforina por
citometra de flujo
El nmero absoluto de neutrfilos, eosinfilos, linfocitos totales y monocitos se calcul sobre la
base de un conteo total y diferencial de clulas en extendido de sangre perifrica usando la
coloracin de Wright y microscopa convencional. El porcentaje, nmero absoluto y fenotipo de las
subpoblaciones de linfocitos NK (CD3-/CD16+/CD56+) se cuantific por citometra de flujo
empleando anticuerpos monoclonales conjugados con diferentes fluorocromos para los
marcadores de superficie CD3/CD19-APC, CD14-PerCP, CD16-FITC, CD56-PeCy7 (Becton
Dickinson BD, San Jose, CA). La sangre perifrica (100 l) se incub con los correspondientes
anticuerpos monoclonales por 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Seguidamente,
se lisaron los eritrocitos por incubacin con solucin de lisis 1X (Becton Dickinson BD, San Jose,
CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, las clulas se fijaron con 250 l de
formaldehdo al 2 %.
La deteccin de perforinas intracelulares se realiz por incubacin de 100 l de sangre perifrica
con 250 l de solucin tampn cytofix/cytoperm (Becton Dickinson BD, San Jose, CA) por 20
minutos a 4 C, seguida por dos lavados con solucin perm/wash (Becton Dickinson BD, San Jose,
CA). Inmediatamente se adicionaron anticuerpos monoclonales antiperforina o el control de isotipo
conjugado con ficoeritrina a las muestras y se incubaron por 30 minutos a 4 C. Luego de tres
lavados con solucin perm/wash, las clulas se resuspendieron en PBS + 1% de SBF. Las lecturas
de citometra de flujo se realizaron en un citmetro FacsCanto II y los anlisis se hicieron con el
software FlowJo V8-2 (TreeStar, Inc. Ashland, OR, USA).
Para el anlisis se seleccionaron, en primer lugar, los linfocitos segn las caractersticas de tamao
versus granularidad, excluyendo del anlisis los monocitos (CD14+), los linfocitos T (CD3+) y B
(CD19+). Finalmente, las clulas restantes se analizaron para determinar las subpoblaciones de
linfocitos NK CD56dimCD16bright, CD56brightCD16dim/-, CD56dim CD16- y CD56-CD16+ de acuerdo con la
expresin diferencial de CD16 y CD56, as como la expresin intracelular de perforinas.
Ensayo de citotoxicidad
Para evaluar la respuesta citotxica en los linfocitos NK, se realiz un ensayo de mortalidad
usando ster succinimidil de diacetato de 5,6-carboxifluorescena (CFSE) (InvitrogenTM, Carlsbad,
CA, USA) en 11 de los pacientes evaluados. Slo en una oportunidad, en el paciente 12, se utiliz
perclorato de 3,3-dioctadecil carbocianina (DIOC18) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) para
marcar las clulas blanco (lnea celular K562 de eritroleucemia humana) y yoduro de propidio
(Becton Dickinson BD, San Jose, CA) para evaluar la mortalidad de estas clulas. Los ensayos
usando CFSE y DIOC18 son comparables de acuerdo con los controles incluidos en los
experimentos. Las clulas mononucleares de sangre perifrica se estimularon en presencia o no
de IL-2 e IL-15 recombinante humana (25 ng/ml) (Becton Dickinson BD, San Jose, CA) y se
incubaron a 37 C y CO2 por 24 horas. Seguidamente, estas clulas se expusieron a clulas blanco
K562 marcadas con CFSE o DIOC18 durante 4 horas a 37 C y 5 % de CO2 en diferentes
proporciones efector: blanco. Luego, se adicionaron 4 l de solucin de yoduro de propidio (50
g/ml) a las clulas, y se analizaron en un citmetro de flujo Epics XL (Beckman Coulter, Brea, CA,
USA). Los niveles de citotoxicidad se expresaron como el porcentaje de clulas blanco K562
CFSE+ o DIOC18+/IP+ despus de la normalizacin de los datos debido a la muerte celular
espontnea (clulas blanco K562 CFSE+ o DIOC18+/IP+ incubadas en medio de cultivo
solamente).
Ensayo de translocacin de CD107a
El CD107a es una molcula presente en la membrana de los grnulos citotxicos de los linfocitos NK y
linfocitos T CD8+ en reposo que se transloca a la membrana celular luego de la estimulacin. La
translocacin de esta molcula permite evaluar la capacidad de fusin de los grnulos citotxicos con la
membrana celular de los linfocitos NK, lo cual descarta defectos en la degranulacin de las clulas
citotxicas de los pacientes (33,34). Para evaluar la translocacin de CD107a a la superficie celular se
emplearon clulas mononucleares de sangre perifrica en todos los pacientes y linfocitos NK purificados por
seleccin negativa con perlas magnticas (InvitrogenTM/Dynal, Oslo-Norway) en el paciente 14. Luego de 24
horas de cultivo con o sin estimulacin previa con IL-2 e IL-15 como se describi anteriormente, las clulas
mononucleares de sangre perifrica o linfocitos NK se expusieron a las clulas blanco K562 en una
proporcin 1:1 en presencia del anticuerpo monoclonal anti-CD107a-PeCy5 (BD) durante tres horas a 37 C
y 5 % CO2. Para evitar el reingreso de las molculas de CD107a expuestas en la membrana se adicion 0,5 l
de solucin GolgiStopTM (Becton Dickinson BD, San Jose, CA) al cultivo despus de una hora de incubacin. La
translocacin espontnea de CD107a se evalu en las clulas mononucleares de sangre perifrica o
linfocitos NK cultivados sin ningn estmulo. Finalmente, despus de un lavado con PBS (Sigma-Aldrich), las
clulas se marcaron con anticuerpos monoclonales anti-CD56/CD16-FITC, anti-CD3/CD19-APC y anti-CD14-
pacific blue para ser analizadas en un citmetro FacsCanto II (Becton Dickinson BD, San Jose, CA). La
expresin de CD107a en superficie se evalu en los LNK CD3-/CD19-/CD14-/CD16+/CD56+ en el software
FlowJo, verin 8-2.
Las alteraciones en la distribucin de las sub-poblaciones de los linfocitos NK CD56dimCD16bright son
persistentes en algunos pacientes con infecciones recurrentes






Citotoxicidad nk
En esta prueba se mide la capacidad de estas clulas para matar clulas blanco especiales
(K562). La citotoxicidad suele determinarse mediante el uso de Cr
51
.
Por citometra de flujo se determina la actividad de estas clulas utilizando los
marcadores especficos.
C- Ensayos de citotoxicidad: valoracin de la funcionalidad de los
linfocitos T CD8+ o citotxicos y de las clulas NK.
Determinan la capacidad del linfocito Tc para lisar clulas diana que
presenten
el complejo pptido-CMH I especfico que reconocen. Estas clulas diana al
haber sido cultivadas previamente con cromo radiactivo (Cr51), cuando se
lisan
liberan radiactividad que puede medir. Se realiza con linfocitos aislados de
sangre perifrica.
Inmunologa. Curso 2009-10.Tema 17
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Un ensayo similar se emplea para valorar la actividad citotxica de las
clulas
NK de sangre perifrica, generalmente empleando lneas celulares
tumorales
sensibles (ya que las clulas NK no estn restringidas por el CMH I).




Cuantificacin de clulas NK
Las clulas NK son un componente importante del sistema inmune innato, son
capaces de lisar las clulas infectadas por virus o clulas tumorales y son la fuente de
una gran variedad de citocinas, cuando se presentan defectos en este tipo de clulas
se incrementa la posibilidad de presentar mayor susceptibilidad a infecciones virales.
La cuantificacin de las clulas NK se realiza por citometra de flujo, estas clulas
coexpresan en su superficie las molculas CD16/CD56 por lo que es bastante sencilla
su cuantificacin en sangre perifrica
Figura 3. Anlisis de las subpoblaciones de
linfocitos NK y correlacin entre la disminucin de
los porcentajes de clulas CD56dimCD16bright y el
aumento del porcentaje de otras subpoblaciones y
permanencia de esta alteracin en enfermedad
activa y remisin.
Anlisis representativo de las subpoblaciones de
linfocitos NK en sangre perifrica de un individuo sano
que incluye: a. Seleccin de la poblacin de linfocitos de
acuerdo con los parmetros de tamao (FSC-A) y
granularidad (SSC-A);