STOPPED-FLOW

Diego Felipe Blanco Jorge Marn Ortega

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1. Introduccin:
Para medir la velocidad de cualquier reaccin es necesario determinar la concentracin de un reactivo o producto en funcin del tiempo. Muchas reacciones qumicas importantes tienen tiempos de vida media en el intervalo de 1 a 10-11 s, y suelen denominarse reacciones rpidas. El trmino de reaccin rpida se aplica en su sentido ms apropiado a las reacciones que no se pueden seguir cinticamente por mtodos convencionales. No basta con decir que una reaccin rpida es aquella con una constante de velocidad elevada, pues esta constante depende de la temperatura, si no una reaccin rpida es aquella que presenta una energa de activacin pequea. Cabe decir que por muy rpida que sea la reaccin, esta depende de las concentraciones de los reactivos o productos. Una reaccin por lo tanto es aquella cuya vida media es menor de unos pocos segundos a temperatura ambiente, utilizando concentraciones convencionales (p.e. 0,1 mol/dm3). Los ejemplos de reacciones rpidas pueden ser perfectamente sistemas biolgicos; por ejemplo, las constantes cinticas para la formacin de un complejo entre una enzima y sustrato suelen ser del orden de 10 6 a 109 dm3 mol-1s-1. En disolucin acuosa, la reaccin ms rpida conocida es: H3O+(aq) + OH-(aq) 2H2O La cual presenta k = 1,4 x 1011dm3 mol-1s-1 a 25 C. Las reacciones de combinacin de radicales libres en fase gaseosa tienen, con frecuencia, valores de k sobre 1011 dm3 mol-1s-1.

2. Fundamentos de las tcnicas FIA

Antes de hablar del mtodo de flujo detenido, tenemos que hablar de las tcnicas FIA (Anlisis de Inyeccin de Flujo) que consiste en flujos no segmentados dentro de mtodos automticos continuos. En los sistemas continuos, la muestra se incorpora a un flujo de lquido o gas, donde es sometida a una serie de procesos desde que se inyecta hasta que se hace llegar al detector. Por otra parte, en los mtodos no segmentados, la muestra es inyectada directamente en el flujo, sin utilizar burbujas de aire para la separacin. En estos mtodos, puede no alcanzarse el equilibrio fsico ni qumico en el momento de la deteccin, y su instrumentacin suele ser ms sencilla y barata que en los anteriores.

2.1.

FACTORES FISICOS

Una muestra introducida, con una vlvula rotatoria, en un sistema de flujo presenta un perfil, en el momento de la insercin, como el representado en la figura

1.a. Si el perfil se mantuviera, por no existir dispersin, la seal producida en el detector (fiagrama) sera la indicada en la misma figura 1.a.

Figura 1: Perfiles de concentracin y seales detectadas. En realidad, el perfil de la muestra insertada se modifica debido al flujo laminar y a causa de la difusin. El transporte de materia en los sistemas FIA se produce en rgimen laminar, lo cual origina un perfil parablico de velocidades (figura 2.a.) ya que las partculas materiales del fluido que circulan por el centro del tubo lo hacen ms rpidamente que las partculas prximas a las paredes. El transporte por difusin se debe a la existencia de gradientes de concentracin, pudindose distinguir dos tipos: difusin axial (figura2.b.), debida a gradientes horizontales de concentracin, y difusin radial (figura 2.c.), debida a diferencias de concentracin entre puntos situados perpendicularmente a la direccin del flujo. Mientras que la dispersin axial no es significativa en tubos estrechos, la radial es siempre importante en cualquier circunstancia.

Figura 2 Transporte de fluidos en tubos. Por otra parte, el perfil de la muestra insertada depende del tiempo transcurrido desde la insercin. En los primeros momentos predomina el transporte por conveccin y el perfil es tpicamente parablico (figura 1.b.). El fiagrama terico estara constituido por un tramo vertical inicial, correspondiente a la salida del extremo de la parbola y una cola de cada de la seal. Al cabo de algn tiempo, la contribucin de la difusin radial comienza a ser significativa, por lo que se frena el avance por el centro y se redondean las colas finales (figura 1.c.). El fiagrama presenta un crecimiento casi vertical y una cola de retorno a la lnea base.
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Si el transporte se realiza durante bastante tiempo, la difusin radial puede colaborar en mayor medida que el transporte por conveccin. El perfil del bolo es ms redondeado, y la forma del fiagrama es una gaussiana casi perfecta (figura 1.d.). Este tipo no se da casi nunca, ya que debe transcurrir mucho tiempo o trabajar con caudales muy bajos, lo cual no suele ser habitual. Para caracterizar la dispersin suele utilizarse el parmetro propuesto por Ruzicka en 1977, denominado dispersin prctica, y definido por la expresin:

Siendo C0 la concentracin del analito de la muestra inyectada, y C la concentracin del pico en el detector, despus de que haya tenido lugar el proceso de transporte en un determinado sistema FIA. El coeficiente de dispersin de un determinado sistema FIA puede determinarse fcilmente, inyectando una muestra de un colorante y obteniendo la altura del pico, h, que ser proporcional a la concentracin, C. (figura 3.a.). Seguidamente, se sustituye el portador por el colorante, llenando completamente el sistema, con lo que se obtiene la seal h0, proporcional a C0. El coeficiente de dispersin siempre es un nmero superior a la unidad. Cuanto mayor sea D, menor es la seal obtenida (menor sensibilidad) y ms ancho es el fiagrama obtenido, con lo que disminuye la capacidad de muestreo (menor nmero de bandas por unidad de tiempo).

Figura 3: Determinacin del coeficiente de dispersin. Factores que afectan a la dispersin La dispersin est influida por las siguientes variables: volumen de muestra, longitud y caractersticas del reactor y por la velocidad de bombeo.
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La influencia del volumen de muestra sobre la dispersin se indica en la figura 4.a., observando que D disminuye al aumentar aqul. Por otra parte, el tiempo de residencia y el ancho de banda, t, aumentan al hacerlo el volumen, mientras que el tiempo de arranque, ta, permanece inafectado. Por lo que respecta al caudal, al aumentar ste, disminuye la dispersin, as como tambin el tiempo de arranque y la anchura de pico, como se muestra en la figura 4.b.

Figura 4: Influencia del volumen de muestra y del caudal sobre la dispersin La influencia de la longitud del tubo sobre la dispersin se muestra en la figura 5, donde se han representado diversos diagramas superpuestos realizados con tubos de las longitudes que se indican en la figura, y manteniendo constante la velocidad de bombeo y el tamao de muestra.

Figura 5: Influencia de la longitud del tubo

Se observa que tanto D, como ta e t aumentan con la longitud del tubo. Los reactores se utilizan para favorecer la difusin radial, consiguen que la mezcla o reaccin qumica que se produce en la zona de muestra sea ms eficaz. Conseguimos tambin que se reduzca la difusin axial que se forma al insertar la muestra dentro del flujo laminar de la disolucin portadora. Cuanto ms se ayude a la difusin radial, el gradiente de concentracin ser ms simtrico y el diagrama mostrar un pico casi-gaussiano. Entre las distintas geometras de reactores nos encontramos: Tubo recto: Con un reactor tubular recto de dimetro uniforme, el perfil parablico formado por flujo laminar permanece sin alteraciones. En el corto tiempo que dura un ensayo en FIA no consigue la difusin radial equipararse a la axial, por consiguiente se registra un pico asimtrico. Reactor enrollado: Es el serpentn enrollado el ms usado, causa el mezclado en la direccin radial debido a los frecuentes cambios de direccin. El resultado es un pico ms simtrico. Mientras ms apretado sea el arrollamiento, ms pronunciado ser su efecto. Cmara de mezclado: La cmara de mezclado genera mayor dispersin. Reactor empaquetado con bolitas de vidrio inertes: Estos reactores son muy efectivos para causar la mezcla radial, debido a que el flujo es ms sinuoso. Reactor anudado: Este tipo de reactor presenta un camino espacialmente desordenado, lo cual promueve la dispersin radial. Es preferible para el sistema de flujo detenido Es preferible para el sistema de flujo detenido un rgimen de flujo turbulento el cual mejora la mezcla de los reactivos y disminuye la dispersin. Para un tubo de 1mm de dimetro, la velocidad de flujo para que sea turbulento es de 2m/s, por debajo de la cual el flujo sera laminar. Adems la dispersin que se pueda producir cesa cuando se detiene el flujo. Esto se aprovecha para aumentar la sensibilidad de las medidas, al dejar un tiempo para que las reacciones se completen, sin que se diluya la zona de muestra por dispersin, lo cual es una ventaja con respecto a otros sistemas de flujo. Si inyectamos muestras en un sistema de flujo detenido con un rgimen de flujo turbulento y chocan en un punto, conseguimos una mezcla casi sin dispersin de las molculas. Por lo tanto cuando se detiene el flujo, las molculas que se encuentran en sus celdas de disolvente saldrn de estas por difusin debida a los gradientes de concentracin hasta encontrarse con la molcula con la que va a reaccionar. Cuando
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las molculas se encuentran quedan atrapadas dentro de la celda de disolvente y se producen muchas colisiones entre ellas. En el caso de gases, esto no es as porque las molculas estn distantes y se mueven de forma libre entre colisiones. La experiencia demuestra que se cumplen las siguientes ecuaciones en la difusin:

Esta es la 1 ley de Fick, donde D es el coeficiente de difusin, dn/dt moles por unidad de tiempo, A es el rea perpendicular al eje x y dc/dx es la variacin de la concentracin con respecto a la coordenada x.

2.2.

FACTORES QUIMICOS

Las conclusiones expuestas anteriormente respecto a la influencia de diferentes parmetros sobre la dispersin, pueden no ser totalmente vlidas si existe una reaccin qumica adicional. En este caso, es imprescindible conocer la contribucin de la cintica a la dispersin, toda vez que las medidas en FIA se efectan en condiciones de no equilibrio. Si entrar en demasiados detalles, de forma general, si se produce una reaccin qumica en el sistema FIA y se mide una propiedad de algn producto de la reaccin, la contribucin qumica hace disminuir el valor del coeficiente de dispersin. Por el contrario, cuando se mide alguna propiedad de uno de los reactivos, el coeficiente de dispersin aumenta, como consecuencia de la reaccin qumica.

2.3.

CARACTERISTICAS DEL FIA

Las principales caractersticas diferenciales del FIA con respecto a los mtodos analticos, en orden a la sensibilidad, selectividad, precisin, rapidez, coste y versatilidad pueden resumirse en los siguientes: Sensibilidad. Los mtodos FIA son menos sensibles que los manuales, debido a la existencia de la dispersin o dilucin del analito en el portador, y a que, cuando tiene lugar algn proceso qumico, se obtienen rendimientos parciales, como consecuencia de tiempos de reaccin pequeos. Selectividad. Generalmente, los mtodos FIA suelen estar sometidos a un menor nmero de especies interferentes. Este mayor nivel de selectividad puede atribuirse a que en muchos casos, las reacciones paralelas indeseables
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no se desarrollan en el corto espacio de tiempo que transcurre entre la inyeccin y la medida. Precisin. La precisin conseguida con la metodologa FIA es comparable a la que se obtiene con mtodos manuales. El factor ms crtico en orden a la precisin en los mtodos FIA es la constancia en el caudal, para lo cual se requiere un tipo de bomba que proporcione caudales constantes. Rapidez. Es, sin duda alguna, la caracterstica ms sobresaliente de estos mtodos, ya que superan claramente a los mtodos manuales y a otros mtodos automticos. La gran velocidad de muestreo que presenta el FIA se debe a la existencia de la difusin radial, merced a la cual es posible realizar un lavado eficaz entre dos muestras consecutivas que evite su contaminacin. Coste. La tcnica FIA se caracteriza por ser ms barata que cualquier otra tcnica automtica que permita obtener resultados anlogos. El bajo coste, no solo se refiere a la instrumentacin, sino al consumo de reactivos. En este ltimo aspecto supera claramente a las tcnicas manuales. Versatilidad. La sustitucin de cualquiera de los componentes de un sistema FIA y la incorporacin de otros es una operacin sencilla, lo cual permite la adaptacin segn las necesidades. Por otra parte, es posible incorporar a sistemas FIA instrumentos de uso normal en los laboratorios, como pH-metros, espectrofotmetros, fluormetros, etc. mediante clulas de flujo convencionales.

3. Flujo detenido
Roughton introdujo este mtodo en 1934 y mejorado ampliamente por Chance unos seis aos despus. El principio del mismo se ilustra en la figura 6. Las dos jeringas impulsoras se comprimen para proporcionar unos 50-200 L cada una siendo entonces detenidas mecnicamente. Supongamos que existe un punto de observacin 1 cm despus de la cmara de mezcla. Si la velocidad de flujo es de 10m/s durante el periodo de compresin, entonces durante el perodo de flujo continuo el detector ve una solucin que tiene una edad de 1 ms. Cuando se detiene el flujo, la solucin envejece normalmente con el tiempo y entonces el detector ve los acontecimientos que suceden despus de un milisegundo. La edad de la solucin en la observacin inicial se conoce como tiempo muerto del aparato.

El mtodo de flujo detenido es la herramienta rutinaria del laboratorio mientras que el aparato de flujo continuo se utiliza solamente en algunos casos especiales. La tcnica de flujo detenido slo necesita 100-400 L de solucin o menos para el transcurso de tiempo completo de una reaccin, tiene un tiempo muerto bajo,
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de orden de 0.5 ms y las observaciones pueden prolongarse durante varios minutos. Necesita, sin embargo, un sistema rpido de deteccin y de registro. El mtodo de flujo continuo requiere volmenes de reaccin muy grandes y slo pueden realizarse lecturas hasta unos 100 ms debido a las dificultades prcticas para utilizar tubos de observacin mayores. Tambin hay dificultades en el aspecto de que todo el tubo debe ser barrido por el detector. Aparte de problemas mecnicos, esto puede conducir a errores sistemticos si el tubo no es de dimensiones uniformes, no est regularmente termostatizado, etc. Es, sin embargo, una tcnica ligeramente ms rpida, con tiempos muertos del orden de 50.-100 microsegundos. La deteccin requiere una traccin de mili-segundos y puede dar lugar a ondas de choque demasiado vigorosa. Otra ventaja es que pueden ser utilizados detectores de respuesta ms lenta ya que en un punto concreto del tubo de desage la edad de la solucin es constante. Esto fue particularmente importante en los experimentos originales de Hartridge y Rpigjtpm quienes antes de la introduccin de foto multiplicadores, usaron un espectroscopio manual (de reversin) como detector.

Figura 6: Esquema de un aparato de flujo detenido.

Generalmente, la cmara de observacin es una celda fotomtrica dispuesta de tal manera que el haz ptico es perpendicular a la direccin del flujo, para mediciones de observacin. La disolucin de reactivo debe pasar por todo el camino a travs de la clula antes de la aparicin de la inscripcin, lo que aumenta significativamente el tiempo muerto. Los dispositivos comerciales tienen una resolucin de menos de 5 ms. Una reduccin del tiempo muerto se logra mediante la reduccin de la longitud del camino
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de la clula. Conseguir una mezcla homognea es esencial, ya que una mezcla incompleta revela una prdida de seal despus de detener el flujo. Se pueden vaciar las jeringuillas bien hidrulicamente o por presin de gas impulsado por un pistn el cual empuja al mismo tiempo las dos jeringuillas de reaccin a travs de un bloque unidad. Hay otro sistema en el que las disoluciones de reactivo estn directamente sometidas a alta presin de gas y el flujo se libera mediante la apertura de una vlvula electromagntica. Las dos jeringuillas de reaccin normalmente tienen el mismo volumen, para que ambos reactivos sean disueltos en una proporcin 1:1 despus de la mezcla. El sistema puede generar burbujas de aire y con ello formarse una fina niebla en la cmara de observacin debido al proceso de relajacin de la mezcla. No se recomienda vaciar y rellenar el aparato despus de cada disparo, sino que tras el final de la reaccin, la disolucin sea retirada moviendo el mbolo hacia atrs. Entonces se sustituye por los reactivos que hay en las jeringuillas de reserva. Los datos recogidos se muestran en un osciloscopio o se almacenan en una memoria de datos digital. Hay ms sistemas alternativos, como por ejemplo detener el flujo, no cuando llega al detector, sino cuando llega a la zona del reactor para aumentar el tiempo de residencia y evitar ms dispersin de las molculas, lo cual permite un aumento de la sensibilidad en la medida de la seal de concentracin Por otra parte la tcnica de flujo detenido tambin se puede combinar con otras tcnicas para estudiar reacciones rpidas como el mtodo de salto de temperatura (T-jump), el mtodo de salto de la presin y la fotlisis flash.

3.1.

Mtodos de observacin

3.1.1. Mtodos espectroscpicos

Los mtodos espectroscpicos son los mtodos ms utilizados para los sistemas de flujo detenido. Regiones ultravioleta y visible:

En este mtodo se aplica la ley de Lambert-Beer: ( )

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Donde P0 y P son las intensidades de luz incidente y transmitidas, es el coeficiente de absorcin, c es la concentracin y b es el camino recorrido por el haz de luz a travs de la muestra. Con este mtodo se puede llegar a trabajar con concentraciones de 10-5M. Infrarrojo:

En esta regin se estudian los cambios de especies con grupos funcionales que suelen tener coeficientes de absorcin muy grandes (X-H, CO, NO, CN, etc). Fluorescencia:

Presenta una gran sensibilidad para los estudios cinticos y permite trabajar con concentraciones de 10-7M. Adems esta tcnica es muy til para estudio de biomolculas. Polarimetra:

Esta tcnica se utiliza cuando en la reaccin tienen lugar cambios de quiralidad, por ejemplo en el estudio de cambios conformacionales de las protenas y otras molculas biolgicas. La capacidad rotatoria de un compuesto pticamente activo depende de su entorno y este hecho puede usarse para realizar estudios cinticos. Resonancia magntica nuclear (RMN):

La regin de RMN puede usarse simplemente como una tcnica analtica cualquiera en la cual la intensidad de la seal es una medida de la concentracin de una especie particular. La desventaja que presenta es que se necesita concentraciones de 0,05 a 0.25 M.

3.1.2. Mtodos electroqumicos

Este tipo de mtodos son en general menos tiles que los espectroscpicos, aunque en ciertos casos pueden ser el nico mtodo de observacin aplicable. Potenciomtrico (variacin de la concentracin de protones):

El cambio en la concentracin de la concentracin de protones en una reaccin puede usarse cualitativamente para comprender los cambios que ocurren en una reaccin y cuantitativamente para medir la velocidad de la reaccin. Potenciomtrico ( variacin de la concentracin de un ion):

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Si se cuenta con un electrodo que responda especficamente a la concentracin de algn ion, es claro que si la concentracin de este cambia durante la reaccin, este se podr emplear para observarlo. Conductividad:

Es uno de los mtodos ms sensibles para estudiar el cambio de carga que tiene lugar mediante una reaccin.

4. Bibliografa:
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