Universidade Estadual do Oeste do Paran Centro de Cincias Biolgicas e da Sade Cincias Biolgicas Bacharelado

Reaes Qualitativas para Identificao de Aminocidos

Cascavel, 16 de abril de 2014

Introduo Nesta aula observamos a propriedades fsico-qumicas das protenas, bem como com as tcnicas de reaes de identificao das mesmas. Foram usadas trs reaes: Reao de biureto, e Reao de precipitao de protenas com desnaturao e sem desnaturao. Segundo a Apostila de aulas prticas (2014) Reao de Biureto: O sulfato de cobre em meio alcalino reage com as substancias que contem duas ou mais ligaes peptdicas dando um complexo de colorao caracterstica (prpura). Segundo a Apostila de aulas prticas (2014) Reao de precipitao com desnaturao: A exposio das molculas proticas a agentes como calor, extremos de pH, metais pesados, cidos, detergentes, solues concentradas de uria, solventes orgnicos, radiaes ultravioleta etc., faz com que a maioria delas apresente modificaes fsicas conhecidas como desnaturao. Segundo a Apostila de aulas prticas (2014) Reao de precipitao sem desnaturao: As protenas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturao em funo do pH, fora inica, temperatura e propriedades dieltricas.

Material Utilizado: Tubo de ensaio Banho-Maria Estante para tubos de ensaio Becker Basto de vidro Pipeta de Pasteur Erlenmayer

Mtodos

1 Reao: Reao de biureto Primeiro marcamos os tubos de ensaio de 1 a 3. Aps isso adicionamos aos tubos 1,0 ml de cada uma das amostras: gua destilada ao tubo 1, glicina 0,05 M no tubo 2 e soluo de protena clara de ovo diluda no tubo 3. E em cada um dos tubos adicionamos 1,0 ml de reativo de biureto. Depois agitamos bem os tubos e observamos os resultados obtidos.

2 Reao: 1 parte: Reao de precipitao com desnaturao Primeiramente marcamos os tubos de 1 a 5. Aps adicionamos 2 ml de protena clara de ovo ao tubo 1, e 1 ml de protena diluda nos tubos 2 ao 5. Em seguida, adicionamos 1ml de acido tricloroactico no tubo 2, 1 ml de acetato de chumbo no tubo 3, 3ml de lcool etlico no tubo 4, 1 ml de acido pcrico no tubo 5 e aquecemos o tubo 1 em banho-maria a 100C por 5 minutos e observamos os resultados. 2 Reao: 2 parte: Reao de precipitado sem desnaturao

Primeiro pipetamos 3 ml de clara de ovo em um pequeno Becker. Dilumos com gua destilada, mexendo com um basto de vidro, ate notar o aparecimento de precipitado de globulinas. Em seguida juntamos uma soluo de cloreto de sdio 1 M, gota a gota, ate a redissoluo do precipitado. Esta redissoluo corresponde ao fenmeno "salting in ". Desta soluo pipetamos 2 ml em tubo de ensaio. A seguir juntamos 2 ml de soluo saturada de sulfato de amnio e pudemos observar a formao de precipitado protico, o que corresponde ao fenmeno de "salting out". Aps pipetamos 6 ml de gua destilada a fim de recompor a fora inica anterior e como conseqncia, redissolver o precipitado

Resultados

No primeiro experimento obtivemos os seguintes resultados: Tubo 1 No houve reao, resultando em cor azul. Tubo 2 No houve reao, resultando em cor azul. Tubo 3 Houve reao, resultando em cor prpura. Os tubos 1 e 2, contendo gua destilada e glicina, respectivamente, no possuem ligaes peptdicas, por isso, no foi possvel a reao com o sulfato de cobre. Ao final, preservou-se a cor azul do sulfato de cobre. O tubo 3, contendo soluo de protena, contm vrias ligaes peptdicas, tornando possvel a reao com o sulfato de cobre e resultando em cor prpura.

No segundo experimento obtivemos os seguintes resultados: Tubo 1 Aps o aquecimento, houve precipitao e total solidificao da substncia.

Tubo 2 a 5 Houve precipitao, mas a fase lquida predominou nas substncias. A precipitao ocorreu devido desnaturao das protenas causada pela alta temperatura, no caso do tubo 1; presena de cidos nos tubos 2 e 5; presena de um solvente orgnico no tubo 4 e pelo pH situado no lado alcalino do seu ponto isoeltrico no tubo 3. No experimento 2.2 foi observado o processo de salting in da protena da clara do ovo diluda aps a adio de soluo de cloreto de sdio e, em seguida, o processo de salting out atravs da adio de soluo saturada de sulfato de amnio.

Questes

1. A reao de biureto se fundamenta no princpio de que, em um meio alcalino, uma soluo diluda de sulfato de cobre reage com os grupos (-NH) das ligaes peptdicas das protenas. 2. O biureto utilizado para se determinar a concentrao de protenas em uma certa substncia. Quanto mais intensa for a cor prpura, maior o grau de concentrao de protenas. 3. O grau de solubilidade das protenas relativamente alto quando diludo em gua, em solues de baixa concentrao de sais e em alta temperatura (at o ponto de desnaturao). Constantes dieltricas elevadas tambm aumentam a solubilidade das protenas. A solubilidade diminui quando a concentrao salina elevada ou dissolvida em um solvente orgnico. 4. A estrutura terciria determinada pelo dobramento final da cadeia polipeptdica por conta de interaes de reas com estrutura regular ou de reas sem estrutura definida. A desnaturao acontece quando a conformao nativa da estrutura destruda devido quebra de ligaes no-covalentes, resultando em uma cadeia polipeptdica distendida. Alguns exemplos de agentes desnaturantes so: O calor e cidos e lcalis fortes.

5. A carga eltrica total da molcula de um aminocido resulta da soma algbrica das cargas apresentadas pelos seus grupos ionizveis, as quais dependem dos valores de seus pKa e do pH do meio. Assim, o grupo carboxila pode apresentar-se sem carga ou com carga negativa; o grupo amino neutro ou tem carga positiva. 6. Metais pesados podem alterar a estrutura das protenas de vrias formas, podem romper as pontes salinas pela formao de ligaes inicas com grupos carregados negativamente. Eles tambm se ligam a grupos sulfidrlicos alterando

profundamente a conformao das protenas e formando complexos insolveis. 7. Quanto menos sal existir no meio ocorre uma interao entre os ons salinos e a carga das protenas, levando a uma maior solubilidade. Quanto mais sal no meio ocorre uma competio entre os ons salinos e a carga das protenas pela gua, resultando em uma menor solubilidade.

Referncias Bibliogrficas: LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princpios de bioqumica. 4 ed. So Paulo: Sarvier, 2006. - Maller, A. 2014. Apostila de Aulas Prticas de Bioqumica. Unioeste. Centro de Cincias Biolgicas e da Sade. - MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioqumica bsica. 3 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.