INTEGRACIN DEL METABOLISMO

MANUAL DE PRCTICAS | CURSO 2013-14

Alumno/a : ..

1 PRCTICA 1 SEPARACIN DE PROTENAS DE SUERO MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA. OBTENCIN DE UN PROTEINOGRAMA

1. INTRODUCCIN 1.1. Diferencia entre plasma y suero

Tanto el plasma como el suero corresponden a la fraccin lquida de la sangre. Para obtener el suero se extrae la sangre y se deja que coagule; a continuacin, se separa mediante centrifugacin la fraccin slida (clulas) de la lquida (suero). Para obtener el plasma debemos extraer la sangre hacia un tubo que contenga sustancias anticoagulantes para evitar el proceso de coagulacin; a continuacin, se parte lquida (plasma). Por tanto, el suero, a diferencia del plasma, no contiene fibringeno ni el resto de factores de la coagulacin, porque se han agotado en el proceso de coagulacin. Sin embargo, muchas veces se utilizan ambos trminos indistintamente (por ejemplo: protenas plasmticas y protenas de suero) aunque estrictamente no son trminos equivalentes. separa mediante centrifugacin la parte celular de la

1.2. Protenas plasmticas

Las protenas plasmticas son protenas que ejercen su accin en el sistema vascular y por ello su concentracin en el plasma es mayor que en los tejidos o que en otros lquidos extracelulares. Se han descrito ms de 200 protenas localizadas en el plasma en hombre y animales. Sin embargo, muchas de ellas no pueden ser consideradas estrictamente como protenas plasmticas ya que el plasma es simplemente un lugar de transicin entre el lugar de sntesis y su destino final. El nmero total de protenas plasmticas es de aproximadamente 50. Las protenas plasmticas tienen funciones muy diversas. Entre ellas destacamos las siguientes: Mantenimiento de la presin onctica o coloidosmtica (presin osmtica debida a protenas) de la sangre; en consecuencia, regulan el paso de lquido entre el compartimento extracelular (liquido intersticial) y el compartimento vascular. Mantenimiento del balance cido-base de la sangre, ya que al tratarse de sustancias anfteras, funcionan como sistema tampn. Intervencin en el proceso nutritivo, siendo una fuente de aminocidos para los tejidos.

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(Las tres funciones citadas anteriormente son inespecficas. La albmina, al ser la protena plasmtica ms abundante es la que contribuye en mayor medida a estas funciones) Transporte de iones o molculas de naturaleza muy diversa, como por ejemplo iones metlicos, cidos grasos, hormonas, frmacos Participacin en la respuesta inflamatoria y de defensa frente a agentes infecciosos, toxinas Participacin en la coagulacin sangunea (fibringeno, factores de coagulacin). No existen en suero.

1.3. Separacin de protenas de plasma/suero mediante electroforesis

La electroforesis es una tcnica que permite la separacin de molculas con carga elctrica, debido a su desplazamiento a lo largo de un soporte al que se aplica un campo elctrico externo. Se utiliza principalmente para la separacin de protenas y de cidos nucleicos.

La mayora de las protenas presentes en el suero, a pH alcalino, se encuentran cargadas negativamente, porque los grupos carboxilo de las cadenas R de sus aminocidos se hallan disociados (COO). En consecuencia, cuando se someten a un campo elctrico externo migran hacia el nodo (polo positivo), desplazndose ms o menos en funcin de la cantidad de carga negativa que poseen. Una tcnica ampliamente utilizada es la electroforesis en placas en agarosa (o tambin la electroforesis en acetato de celulosa), que permiten separar las protenas de suero/plasma en los siguientes grupos: 1. Albmina 2. -globulinas (subgrupos 1 y 2) 3. -globulinas (subgrupos 1 y 2) 4. -globulinas Excepto la albmina, que es una protena concreta, los dems grupos incluyen diferentes protenas con funciones variadas.

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Las protenas ms importantes de cada grupo y sus funciones se recogen en la siguiente tabla: Grupo albmina Sub Protena(s) albmina 1-antitripsina 1 1-antitrombina III 1-lipoprotena 1-glucoprotena cida (orosomucoide) -globulinas 2-lipoprotena 2-macroglobulina haptoglobina 2 ceruloplasmina eritropoyetina (EPO) -lipoproteina transferrina Hemopexina 1 globulina fijadora de esteroides -globulinas plasmingeno 2-microglobulina 2 Protenas del sistema complemento (c3, c4) IgG IgA -globulinas IgE IgM IgD
Defensa humoral frente a agentes infecciosos, toxinas, etc.

Funcin
Regula la presin onctica Transportador polivalente de sustancias (AGL) Inhibidor de tripsina y otras proteasas Inhibe la coagulacin Forma parte de HDL Respuesta inflamatoria Forma parte de VLDL Antiproteasa Transporta hemoglobina liberada de eritrocitos Oxidante de Fe, antioxidante general (contiene Cu) Induce sntesis de eritrocitos y plaquetas (sintetizada en rin) Forma parte de LDL Transporte de Fe a tejidos Transporte grupo hemo hasta el hgado Transporte de esteroides Precursor de la proteasa plasmina con actividad fibrinoltica Reconocimeinto intercelular; forma parte del complejo de histocompatibilidad potencian la respuesta inflamatoria, facilitan la fagocitosis y dirigen la lisis de clulas incluyendo la apoptosis

1.4. Proteinogramas
La separacin electrofortica de las protenas sricas es un tipo de analtica que se efecta rutinariamente en clnica para detectar determinados estados patolgicos caracterizados por la alteracin en la cantidad total de protenas sricas o en alguna de sus fracciones. Para ello, una vez realizada la separacin de las protenas de suero mediante electroforesis, se determina la cantidad relativa de protenas de cada grupo/subgrupo. Este proceso se realiza con la ayuda de un aparato denominado densitmetro, que cuantifica la intensidad relativa de la mancha

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correspondiente a cada grupo/subgrupo de protenas en la placa de agarosa y las representa en una grfica conocida con el nombre de proteinograma. Por tanto, un proteinograma es una grfica en la que se representan las concentraciones relativas de los diferentes grupos/subgrupos de las protenas presentes en un suero. Los patrones electroforticos de protenas sricas (proteinogramas) varan entre especies. Por otra parte, la concentracin de las diferentes protenas sricas se ve alterada en un gran nmero de enfermedades (procesos inflamatorios, hepatopatas, tumores, desrdenes del sistema inmunitario, enfermedades renales) y, por tanto, los proteinogramas tienen una gran importancia desde el punto de vista clnico, ya que resultan tiles en el diagnstico de estos procesos patolgicos.

Proteinogramas correspondientes a diferentes especies de mamferos

Comparacin de proteinogramas de sueros normales con proteinogramas correspondientes a diferentes procesos patolgicos

En esta prctica vas a realizar un anlisis de las protenas de suero de diferentes especies de animales domsticos mediante electroforesis en geles de agarosa.

2. MATERIAL Y REACTIVOS 2.1. Muestras

Sueros: vaca, oveja, perro, caballo y conejo.

2.2. Reactivos
Tampn salino: fosfato 50 mM con ClNa 0,1 M (pH 7.0) Tampn de electroforesis: TRIS-barbital (pH 8,8). (contiene azida de sodio al 0.02%!!!). Estable a temperatura ambiente ~2 meses. Solucin de tincin: colorante azul de Coomassie 0.2% (p/v) en cido actico al 5%. Disolver bien y filtrar. Solucin decolorante: 45% metanol, 45% agua destilada y 10% cido actico.

2.3. Material
Gel de agarosa para protenas sricas (TITAN GEL). (Conservar a temperatura ambiente) Plantilla de aplicacin de muestras Pipeta automtica Recipiente para tincin Probeta

2.4. Equipos de laboratorio

Cubeta de electroforesis TITAN GEL Fuente de alimentacin Densitmetro

3. MTODO 3.1. Preparacin y aplicacin de las muestras

Diluir los sueros 1:3 con tampn salino Sacar el gel de la caja y colocarlo sobre un papel de filtro. Secar la superficie del gel en la zona de aplicacin de la muestras entre ambas marcas 0 del borde del gel con un papel secante Colocar la plantilla de aplicacin de las muestras sobre el gel, alineando las rendijas con las marcas 0 del borde del gel. Colocar el papel secante encima de la plantilla y deslizar un dedo a lo largo de la plantilla para asegurar un buen contacto con el gel. Retirar el papel secante

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Aplicar 3 l de muestra (suero diluido) en cada rendija de la plantilla. Los alumnos/as de cada mesa aplicarn una muestra de suero correspondiente a una especie animal diferente. Esperar aproximadamente 4 minutos para que la muestra sea absorbida Verter aproximadamente 25 ml de tampn de electroforesis en cada uno de los compartimentos interiores de la cubeta de electroforesis TITAN GEL Despus de la absorcin de las muestras de suero, secar cuidadosamente la plantilla con papel secante y retirar ambos

3.2. Desarrollo electroforesis

Colocar la placa en la cubeta de electroforesis, con la capa de agarosa hacia abajo; tapar la cubeta colocando correctamente los polos positivo y negativo en sus posiciones correspondientes Conectar la cubeta a la fuente de alimentacin y realizar la electroforesis a 125 V durante un perodo de 25-30 minutos Una vez finalizada la electroforesis, desconectar la fuente de alimentacin, retirar el gel y secarlo con un secador de pelo durante 1-2 minutos Introducir el gel en solucin de tincin durante 10 minutos con agitacin suave Desteir completamente el gel mediante lavados sucesivos con solucin decolorante Lavar brevemente con agua destilada para eliminar las marcas de desteido y secar en estufa a 50-60C durante 1h

3.3. Obtencin del proteinograma

Leer la placa en un densitmetro siguiendo las instrucciones del fabricante

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4. RESULTADOS
Obtener una imagen del gel de agarosa y sealar los diferentes grupos de protenas sricas Comentar las diferencias observadas en los proteinogramas correspondientes a las diferentes especies animales

9 PRCTICA 2 DETERMINACIN CUANTITATIVA DE GLUCOSA EN SUERO

1. INTRODUCCIN 1.1. Regulacin de la glucemia en animales

La glucosa es una fuente de energa fundamental para las clulas de los seres vivos. Los animales deben mantener los niveles de glucosa en sangre (glucemia) dentro de unos mrgenes dado que la glucosa aportada por la sangre es la nica fuente de energa para algunos tejidos como el cerebro, los eritrocitos, la mdula renal, el cristalino o la crnea. La glucemia est regulada hormonalmente Los niveles normales de glucosa en sangre son consecuencia de un equilibrio entre la accin de la insulina y el glucagn como se muestra en el siguiente esquema:

Cuando la glucemia es elevada, la liberacin de insulina por el pncreas estimula el transporte de glucosa al interior de las clulas, la sntesis de glucgeno y la conversin de glucosa en cidos grasos. Por el contrario, cuando baja la glucemia se libera glucagn (con un efecto anatagnico al de la insulina) el cual activa la degradacin de glucgeno y la sntesis de glucosa mediante gluconeognesis a partir de glicerol, lactato y aminocidos. En esta prctica vamos a determinar mediante un mtodo colorimtrico los niveles de glucemia en diferentes especies de animales domsticos.

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1.2. Determinacin de la concentracin de glucosa mediante un mtodo colorimtrico. Fundamento del mtodo.
La glucosa oxidasa (GOD) es una enzima altamente especfica que cataliza la oxidacin de glucosa a cido glucnico. En esta reaccin se consume oxgeno y se produce perxido de hidrgeno (H2O2). Para poder seguir el curso de esta reaccin colorimtricamente es necesario acoplarla a una segunda reaccin enzimtica catalizada por una peroxidasa (POD). En esta segunda reaccin, el H2O2 reacciona con 4-aminoantipirina (ampirona) y fenol, generando un producto coloreado con estructura de quinonaimina. La intensidad del color formado, medida en un espectrofotmetro, es proporcional a la concentracin de glucosa presente en la muestra analizada.

2. MATERIAL Y REACTIVOS 2.1. Muestras

Sueros: vaca, oveja, perro, caballo y conejo.

2.2. Reactivos
Tampn 1: Tris-ClH 92 mM (pH 7.4), conteniendo fenol 0,3 mM Mezcla de enzimas: GOD (15.000 U/l), POD (1.000 U/l), conteniendo 4-aminoantipirina (4-AP) 2.6 mM Glucosa control: solucin de glucosa 100 mg/dl (todos los reactivos han de resguardarse de la luz)

2.3. Material
Tubos de ensayo Pipetas de vidrio Pipetas automticas

Cubetas de espectrofotmetro de 1 cm de paso de luz

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2.4. Equipos de laboratorio
Espectrofotmetro

3. MTODO
Previamente a la realizacin de la prctica preparar la disolucin Enzimas disolviendo la mezcla de enzimas en 125 ml de tampn 1. Esta disolucin es estable 1 mes a 4 C. [Precauciones a tener en cuenta: el producto puede contaminarse con mucha facilidad; por esta razn es conveniente tomar la mxima precaucin evitando pipetear con la boca y usar el material limpio] NOTA: Tanto el patrn, como las muestras han sido diluidas 1:10 para poder trabajar ms fcilmente con ellas. En una serie de tubos, aadir los componentes que se indican en la siguiente tabla:

Tubos Blanco Patrn (diludo 1:10) Suero 1 (bovino) Suero 2 (perro) Suero 3 (equino) Suero 4 (conejo) Suero 5 (ovino)

Muestra 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l

H2O 100 l -

Enzimas 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Absorbancia 505 nm

Mezclar e incubar 10 min a 37 C o 20 min a temperatura ambiente Leer la absorbancia del patrn y de las muestras en un espectrofotmetro (= 505 nm), ajustando la absorbancia a 0 con el blanco.

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4. RESULTADOS

Calcula la concentracin de glucosa en cada muestra de suero:

absorbancia de la muestra x 100 mg = concentracin de glucosa en la muestra absorbancia del patrn dl

Haz una media con los valores de concentracin de glucosa que has obtenido y los valores que han obtenido tus compaeros para las mismas especies Con los resultados obtenidos, discute acerca de los valores de glucemia en las diferentes especies

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