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Transcripciones de Cátedras

Biología Molecular

Díaz, H. Las Heras, M. Pinto, F. Reyes, M. Rivera, C. Romero, R.

24 05 -2011 REPLICACIÓN II MODELOS DE REPLICACIÓN Daniela Seelenfreund

Modelo de replicación de E. coli

Esto es básicamente lo que habíamos visto, el modelo de E. coli, en el cual hay un origen y a partir de éste se replica el DNA en forma bidireccional. Sin embargo, existen también otras estrategias de replicación.

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Estructuras de distintos intermediarios de replicación

Una forma de tratar de estudiar estos sistemas de replicación es mirar cuáles son los intermediarios del proceso, es decir, qué estructuras se forman en el camino.

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Cuando uno pone esto en un gel se ve en forma absolutamente anómala (esos geles se ven súper feos, así que no hay que asustarse en caso de que se vea esto en un paper). En lugar de bandas que migran perfectamente bien, todas estas estructuras generan alteraciones electroforéticas.

Factorías en E. coli

La replicación, como habíamos mencionado, no ocurre en cualquier parte de la bacteria, sino que en focos específicos, que se llaman factorías de replicación (aquí es donde se están formando las horquillas de replicación). En ellas están ensambladas las DNA polimerasas y otras proteínas.

En el proceso de replicación lo que en realidad se mueve es el DNA y lo que está fijo es la proteína (no es la imagen que uno tiene de una locomotora corriendo a través de un riel que sería el DNA, sino que es al revés).

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Esto

se

puede ver

en

la

imagen

siguiente.

Aquí

se

tiene

 

una

marcación para la proteína

SeqA.

Como

vemos,

ellas

están

concentradas

en

ciertos

puntos

 

que

coinciden

con

los

sitios

donde se ve incorporación

de

BrU

(bromouridina,

recordemos

que

es

un

análogo de nucleótido). Si

se

sobreponen

ambas

imágenes

se

ve

que en

realidad

son

los

mismos

puntos, lo que nos dice que hay algún tipo de organización incluso en coli.

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Esto de las factorías se vio inicialmente en eucariontes. Debemos pensar que hay múltiples orígenes de replicación (recordemos que puede haber más de un origen de replicación o replicón) y éstos están organizados en factorías. Nuevamente es el DNA el que va a los lugares especializados, dentro del núcleo en este caso, y ahí se asocian todas las proteínas que participan.

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Otras estrategias replicativas

Círculo rotatorio

Esta fotografía corresponde a un plasmidio o a un DNA genómico viral que se está replicando con un sistema totalmente distinto a lo que habíamos visto (un origen y replicación bidireccional). Esto es DNA de doble hebra, aquí hay una replicación perfectamente asimétrica y este tipo de replicación existe en muchos sistemas. Es un sistema de replicación muy versátil llamada círculo rotatorio.

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El

sistema

de

círculo

rotatorio

puede

generar

múltiples

productos

diferentes.

 

Este DNA circular (ver imagen) va a ser el molde para la replicación. El producto de esa replicación es un DNA inicialmente de una hebra.

Este sistema de círculo rotatorio

utiliza en plasmidios, por ejemplo (conjugación).

se

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En este nuevo sistema se va a replicar sólo una de las dos hebras. Aquí se parte con un DNA de doble hebra. Lo primero que ocurre es un nick, un corte en un punto específico producido por una endonucleasa, lo que genera un extremo 3` OH libre, gracias a lo cual nos saltamos el problema del partidor, debido a que es el mismo sustrato el que está ofreciendo el extremo 3` OH (esto es análogo a lo que habíamos visto sobre cómo se transfiere el TDNA o a lo del proceso de conjugación). Esto podría ser equivalente al OriT, el origen de transferencia. Entonces aquí empieza a replicarse. Para que esto comience esa hebra debe desplazarse y al hacerlo queda disponible el molde para esta nueva hebra que se empieza a sintetizar como siempre en el sentido 5`3` a partir de un 3` OH libre.

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Replicación del fago lambda mediante círculo rotatorio

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Éste se replica por el sistema de círculo rotatorio. En este caso el DNA es lineal y el producto de esta replicación va a ser cortado al término de cada unidad de genoma. Entonces, después de que se sintetiza, se forma un DNA de doble hebra que se corta en el largo equivalente a un genoma y eso se empaqueta dentro del fago. Esto es asimétrico (a partir de un DNA de doble hebra se replica una hebra).

¿Qué otros sistemas usan esto? Bacteriófago X-174

Es un fago chiquitito que tiene DNA circular de una hebra (el sistema entonces sirve tanto para DNA lineal como para DNA circular de doble hebra o de hebra simple).

Normalmente el punto

de corte,

en

el

caso

de fagos, es siempre el mismo

lugar y

se

produce por una nucleasa propia del fago (no es un corte al azar en cualquier zona del DNA).

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Fago M13

M13 es un fago filamentoso, pequeño y su DNA también es de una hebra y circular. Este fue uno de los primeros fagos que se utilizó para secuenciar.

Cuando M13 infecta a E. coli lo primero que hace es sintetizar una forma intermediaria replicativa que es de doble hebra (a partir de la hebra genómica simple y con la ayuda de varias enzimas) para producir un sustrato de doble hebra que pueda ser replicado mediante círculo rotatorio.

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Una vez que se produce el nick empieza la replicación de círculo rotatorio y a partir de un producto del círculo rotatorio obtenemos nuevas copias del DNA genómico (esto ocurre dentro de la bacteria que infectó).

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Etapa 1: Síntesis de la forma replicativa

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RFIIrelajado

RFIsobreenrollado

Esto se ha estudiado en tres fagos distintos como modelo que se replican por círculo rotatorio (M13, G4 y X174). Todos ellos poseen un genoma de DNA circular de una hebra.

Para formar el intermediario de doble hebra (RFI), el DNA de una hebra se tapiza por proteínas ssb (proteínas ssb de la célula que infectó). Quedará tapizada toda la hebra, excepto la zona que va a funcionar como partidor para la síntesis de la segunda hebra, debido a que ésta va a formar estructura secundaria (ssb no se va a unir al DNA que no esté como hebra simple). Una vez que se unió ssb, se forman estas horquillitas que van a ser el punto de partida para sintetizar el partidor (aquí sí necesitamos un partidor). Estos partidores serán sintetizados por distintos conjuntos de enzimas en cada fago. En M13 será por la RNA polimerasa. En G4 por una primasa y en x174 por un sistema de primasas complejo formado por muchas proteínas, llamado primosoma. Entonces en todos ellos, lo primero que se sintetiza en la segunda hebra es la zona complementaria con esta mini horquilla.

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Síntesis de partidor en fagos DNAss

Cuando se sintetiza el partidor (por la primasa), se desplaza a ssb. A partir de ese partidor se va a completar la segunda hebra.

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Formación de RF en fago G4

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Zona de horquilla en fago G4

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Proteínas

célula)

que participan en la formación de DNA ds (RF) de M13 (se utiliza la maquinaria de la

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Una vez que se tiene la forma intermediaria, se puede proceder a la segunda etapa que va a ser la replicación vía círculo rotatorio.

Etapa 2: Replicación mediante círculo rotatorio

M13

En el caso de M13 se produce en un punto específico en el origen un corte (Nick) por una endonucleasa llamada proteína A (ProtA) y que es propia del fago (no es de la célula). Esta proteína además se queda unida al DNA, entonces va a estar marcando el extremo parental.

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Fago X 
Fago X

Aquí empieza la síntesis igual a lo que vimos en el caso anterior, la

diferencia es que la proteína queda unida

y

al

completarse

un

círculo

se

une

al

punto de inicio y se sella este círculo y la

proteína vuelve

a

quedar

unida

en

el

punto

donde se inició

la replicación. En

este caso se obtiene DNA circular de una

hebra (es versátil el sistema).

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Genoma mitocondrial humano

También funciona distinto y no es un círculo rotatorio.

El DNA mitocondrial humano

es

un

DNA

súper

estudiado

(el

genoma mitocondrial es pequeño y

compacto,

 

contiene

genesque

codifican

para

proteínas

mitocondriales).

 

En azulgenes que codifican para tRNA (están intercalados).

Hay genes en todas partes, excepto en una zona conocida como D-loop (se llama así por

desplazamiento, que es lo que ocurre

al

inicio

de

la replicación del

DNA

mitocondrial).

Esta

zona

que

no

contiene genes se estudia para

identificación

de

individuos

(al

no

contener genes puede variar mucho

más). En

esta

región está el origen

para una hebra (el DNA mitocondrial

es de doble hebra). Aquí cada hebra tiene su propio origen de replicación

(esta

replicación

no

ocurre

por

el

sistema del círculo rotatorio pero en este caso también tenemos una

asimetría,

en

el

sentido

que

cada

hebra tiene

su

propio

origen de

replicación).

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Las hebras

se

denominan

como

hebra

H

y

hebra L (replicación no sincronizada de

cada

hebra).

En

la

zona

del

D-loop

está la zona para la

hebra H, entonces

esa

inicia

su

replicación

desplazándose

en

la

hebra

parental.

Ésta

se

sigue

replicando

hasta

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que llega a la zona del otro origen de replicación, el origen OL. Es como si se “destapara” esa zona del origen para que pueda comenzar la síntesis de la segunda hebra en el sentido opuesto (así es como se replica el DNA mitocondrial).

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En cloroplastos pasa algo muy similar al caso de la mitocondria con la replicación del DNA, ya que también usa el sistema D-loop, pero en lugar de tener un origen para cada hebra tiene varios orígenes (2 o 3) para cada hebra, por tanto es la misma idea pero más complejo.

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Adenovirus (replicación DNA lineal)

Tiene DNA lineal de doble hebra, un genoma no segmentado y es más grande que un fago (38-40Kb, 30-40 genes). Este DNA se puede encontrar como DNA lineal o circularizarse gracias a que los extremos de las secuencias son complementarios entre sí (estructura de mango de sartén).

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Los adenovirus tienen una proteína asociada que se une al genoma viral en el extremo 5` de cada hebra (proteína terminal, propia del virus). Esta proteína tiene unida covalentemente una citosina, que aporta un primer (mínima expresión de un primer, una sola base). Esta citosina ofrece entonces el extremo 3`OH libre, lo que permite que de ahí pueda partir la DNA polimerasa.

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Proteínas que participan en la replicación de DNA de adenovirus

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Replicación de adenovirus

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