FECUNDACION

El desarrollo de las tcnicas de fecundacin in vitro FIV as como las tcnicas de cultivo de embriones preimplantados en mamferos, han permitido c omprender los mecanismos celulares y moleculares de la interaccin gamtica, que en ltimo t rmino llevan a la fecundacin. Para que tenga lugar la fecundacin es necesario que los gametos tanto femeninos como masculinos sufran un proceso de maduracin intracelular que los hace aptos para el intercambio de estructuras que dar lugar a un nuevo individuo.

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TRANSPORTE GAMETICO
TRANSPORTE DEL OOCITO

Despus de la ruptura folicular, el vulo es recogido por la trompa, la cual entra en contacto con el ovario por medio de las contracciones miomtricas, el msculo liso del mesosalpings y los ligamentos tuboovricos. Poco despus alcanza la ampolla tubrica sitio de la fecundacin. El perodo durante el cual el vulo eclosionado permanece viable vara entre12 y 24 horas. Pierde su capacidad fecundante al llegar al istmo del oviducto y es completamente infecundo al llegar al tero. Todos los vulos no fecundados se desintegran y fagocitan dentro del tero.

El tiempo de transporte del vulo en el oviducto vara segn la especie y depende de : Contraccin de la musculatura oviductal. Corrientes y contracorrientes de los lquidos en el oviducto Actividad secretora de clulas no ciliadas influida por los estrgenos y progesterona. Hidrodinmica y propiedades reolgicas de los lquidos oviductales. Es importante la sincrona entre la ovulacin y la inseminacin con el fin de lograr una pronta fecundacin. En monta natural el envejecimiento del vulo antes de la penetracin del espermatozoide es bajo.

TRANSPORTE DEL ESPERMATOZOIDE

Durante la eyaculacin los espermatozoides junto con el plasma seminal pasan por la uretra y a travs de movimientos peristlticos se liberan en el tracto genital femenino. La eyaculacin es el reflejo de expulsin de los espermatozoides y el plasma seminal fuera del tracto reproductivo. El reflejo eyaculatorio es el resultado de la estimulacin sensorial especialmente en el glande, lo que causa contracciones musculares coordinadas. Una vez se introduce el pene en la vagina se inicia el reflejo por impulsos que se transmiten del glande a travs del nervio pbico hasta la regin lumbosacra de la mdula espinal. As el semen es forzado a pasar a la uretra lo que induce la contraccin de los msculos uretrales, isquiocavernosos y bulboespongiosos. El eyaculado contiene, adems, las secreciones de las glndulas anexas (vesculas seminales, prstata, glndulas bulbouretrales).

Luego de depositado el semen, los espermatozoides estn expuestos a una serie de circunstancias ambientales que alteran significativamente su nmero y funcin.

Las prdidas de espermatozoides en el tracto genital femenino depende de la naturaleza fsica del eyaculado y el sitio de la deposicin. Los espermatozoides se pierden en el tracto femenino por transporte retrgrado y muchos son fagocitados por los leucocitos, que desde el punto de vista inmunolgico actan como cuerpos extraos, no diferenciando entre vivos o muertos. De hecho un leucocito puede fagocitar varios espermatozoides mviles. Adems son importantes para prevenir infecciones del tracto genital.

El transporte de espermatozoides despus de la cpula puede dividirse en dos fases, una fase de transporte rpido y una fase de transporte lento o prolongado durante la fase rpida los mecanismos del tracto genital permiten la llegada del los espermios al oviducto sin la participacin activa de estos.

Lo ms importante del transporte es la fase de transporte lento durante la cual losespermatozoides son llevados al oviducto de manera sorpresiva desde los reservorios en el crvix y la unin tero tubar. Estos sitios de colonizacin son los mismos lugaresde depsito.

Sin embargo, investigaciones recientes demuestran que los espermatozoides que llegan al oviducto a los pocos minutos despus de la cpula no eran viables, por lo que su importancia puede solamente representar un exacerbacin de la actividad de transporte por la contractilidad del tracto femenino junto con la cpula. Estudios recientes demuestran que un alto porcentaje de los espermatozoides depositados en el tero en lavaca se pierden por transporte retrgrado. En la IA el 60% se pierden por este mecanismo dentro de las 12 horas siguientes a su depsito. Por lo anterior se ha recomienda depositar el semen en lo ms anterior posible del crvix, lo que implica una nueva instruccin del personal responsable de la inseminacin. Luego del servicio en la vaca los espermatozoides deben sortear el sistema altamente circunvolucionado del cerviz por medio de su capacidad natatoria en el medio mucosocompuesto por sialomucinas y sulfomucinas. Las primeras muy viscosas desempean un mecanismo de lavado y las segundas ms fluidas facilitan el movimiento y la natacin del esperma. El tiempo requerido para que el espermatozoide mvil entre y atraviese este medio especial influye significativamente en la fase de transporte lento. (SENDER) La produccin diaria de espermatozoides y la cantidad de espermatozoides frtiles est notablemente relacionada con el tamao testicular. Este se estima por la longitud y el grosor o bien por la circunferencia escrotal. Sin embargo estos parmetros estn influenciados por la raza, el fenotipo y la edad, no pudiendose establecer estandares para todas las razas y edades. El bovino eyacula de 4 a 10 ml de semen con un contenido espermtico de 800 a 2.000 millones de espermatozoides por ml, siendo depositado en la parte anterior de la vagina. El total de espermatozoides por eyaculado se incrementa con la edad, hasta los siete aos y despus decrece. Existen grandes diferencias entre las caractersticas de produccin de espermatozoides entre toros, entre el primer y segundo eyaculado y entre los intervalos de una recoleccin a otra. La utilizacin prolongada de eyaculados colectados a una frecuencia elevada, comenzando en la pubertad, no tiene efecto negativo sobre el crecimiento o la eficiencia reproductiva de los toros. (HAFEZ)

MADURACION FINAL DEL OOCITO La maduracin del oocito no se limita a la fase folicular, sino que ocurre desde la fase de embriognesis. Se presenta en cuatro fases que son:

1.- Divisin mittica de las CGP. 2.- Detencin del desarrollo nuclear en fase de dictioteno. 3.- Crecimiento citoplasmtico. 4.- Reinicio de la meiosis. La divisin mittica se efecta antes del nacimiento y asegura que la hembra nazca con una cantidad suficiente de clulas germinales que formarn el reservorio de los futuros folculos. La ltima divisin mittica de la oogonia se constituye en un paso importante para que el oocito primario entre en la primera divisin de la profase meitica. Durante este perodo el ncleo del oocito primario permanece inactivo hasta que es estimulado por las gonadotropinas luego de la pubertad, hasta la ovulacin. El propsito de esta suspensin es el de inactivar el ADN en el gameto femenino de tal manera que no sea vulnerable a po sibles lesiones durante el perodo de vida de la hembra. Las lesiones o dao del gameto femenino puede comprometer la reproduccin al inducir la muerte embrionaria despus de la fecundacin. Una vez el folculo entra en la fase de dominancia, el oocito alcanza un tamao mnimo crtico y adquiere la capacidad de reiniciar la meiosis, cuando ocurre la descarga preovulatoria de LH. Poco despus del pico de LH, las uniones GAP entre las clulas de la y el oocito se deterioran. Cuando las proyecciones de las clulas de la se disocian del citoplasma del oocito, el AMPc junto con el inhibidor meiotico dejan de suspender el desarrollo del oocito y este queda libre para iniciar divisin meitica. granulosa granulosa del oocito la primera

En el folculo dominante, el ncleo del oocito comienza a migrar hacia la periferia y se adosa contra la membrana plasmtica del oocito, lo que se constituye en el primer signo morfolgico de la iniciacin de la maduracin final del oocito.

En rumiantes el ncleo se vuelve polimrfico y adquiere varias lobulaciones seguidas de la disociacin de la membrana nuclear. Los cromosomas bivalentes se alinean y las cromtidas se separan por el sistema de microtubulos que empujan

aparte a los cromosomas, formando el primer cuerpo polar. Esta primera divisin meitica ocurre poco antes de la ovulacin.

La activacin del ovocito, expresada en el Reinicio de la meiosis se puede poner en evidencia por la eliminacin del segundo polocito, 20 a 30 minutos despus de la fusin gamtica. El set haploide de cromosomas del ovocito forma el proncleo hembra, que junto con el proncle o macho, restablece el nmero diploide de cromosomas de la especie para iniciar el desarrollo de un nuevo individuo.
(BARROS)

Despus de la fecundacin sucede la segunda divisin meitica produciendo el segundo cuerpo polar. En algunos casos, el primer cuerpo polar se divide produciendo dos cuerpos polares hijos, por lo que se pueden ver tres cuerpos polares.

MADURACION DEL ESPERMATOZOIDE El perodo de vida de los espermatocitos secundarios es de unas pocas horas, dividiendose rpidamente por mitosis para dar lugar a las espermtidas, tambin haploides, para transformarse en espermtidas maduras elongadas con cabeza y cola que posteriormente sern liberadas en la luz del tbulo seminfero. Estos cambios tienen lugar en el ncleo y el citoplasma. Estas clulas estn unidas entre s por puentes citoplasmticos y en comunicacin con las clulas nutricias o de Sertoli, las que inducen a partir de clulas sealizadoras la maduracin final de la espermiognesis. La espermiogenesis consta de cuatro fases, las cuales se clasifican mediante la reaccin de PAS (Periodic Acid Shiff) al teir los componentes acrosmicos en desarrollo de un color rojo oscuro El papel del espermatozoide maduro es el de liberar el material gentico a un oocito maduro durante la fecundacin. Para que estas clulas sean capaces de fertilizar, las espermtidas esfricas sufren una serie de cambios en los cuales el ncleo se vuelve altamente condensado, se forma el acrosoma y la clula se hace mvil. La capacidad de nadar o motilidad, requiere del desarrollo de un flagelo y una fuente generadora conocida como hlice mitocondrial. Este proceso consta de cuatro fases: Fase de Golgi Fase de Capuchn Fase de Acrosomal Fase de maduracin

La Fase de Golgi es el primer paso para la formacin del acrosoma. En esta fase la organela del mismo nombre se acerca al ncleo, desprende vesculas que se le sobreponen y poco a poco se unen para convertirse en la vescula acrosomal que se localiza en la parte apical del ncleo. Los centrolos situados en forma de T, muy cercanos al aparato de Golgi, van migrando hacia lo que ser la base del ncleo.

El centrolo proximal se sita en la parte basal del ncleo y, a partir del centrolo distal crece el axonema conformado por dos microtbulos centrales y 9 pares de microtbulos perifricos.

En la fase de capuchn, la vescula acrosomal se aplana formando una verdadera capucha sobre el ncleo. El ncleo se compacta mucho ms al cambiar las histonas por protaminas, de tal forma que no puede haber ni replicacin ni transcripcin (Fase G0 del ciclo celular). La inactividad transcripcional del ncleo hace que el espermatozoide sea dependiente de modificaciones postranscripcionales como la fosforilacin de protenas necesarias para adaptar su funcin de acuerdo a las necesidades.

En la Fase Acrosomal la espermtida gira de tal forma que el acrosoma queda en direccin de la membrana basal; se depositan grnulos en el acrosoma, el citoplasma se desplaza hacia la base de la cabeza y se localiza por debajo de la unin ncleo axonema; las mitocondrias se agrupan alrededor de este ltimo en su parte cercana al ncleo, formando la pieza media. En esta fase el espermatozoide adquiere su morfologa definitiva.

El acrosoma es una membrana lisosomal que contiene enzimas hidrolticas como la acrosina, hialuronidasa, zona lisina, esterasas e hidrolasas cidas, necesarias para la penetracin de la zona pelcida del oocito.

Finalmente se sucede la Fase de Maduracin, donde se observan las caractersticas finales de los espermatozoides: forma de la cabeza caracterstica de cada especie (oval y plana), cubierta en sus dos terceras partes por el acrosoma; y la cola compuesta por las piezas media, principal y terminal (vase Figura 1); en la pieza media se encuentran las mitocondrias en forma de hlice. En esta fase se elimina gran parte del citoplasma por desplazamiento del mismo hacia la pieza terminal de la cola originando la llamada gota citoplasmtica.

El proceso de maduracin termina con la Espermiacin, o liberacin de los espermatozoides a la luz del tbulo seminfero. Mediante movimientos peristlticos los espermas son transportados de la rete testis a los ductos eferentes y de all al epiddimo en cuya cola se almacenan. En la pubertad y a lo largo de la vida adulta del macho se producen continuamente en los tbulos seminferos las clulas germinales y la posterior liberacin de espermatozoides en el proceso de

espermatogenesis, los cuales son reemplazados por espermatozoides de nuevas generaciones. Cada nueva generacin va empujando la anterior hacia el lumen del tbulo seminfero, a tiempos e intervalos regulares lo que constituye el llamado ciclo del epitelio seminfero, cuya duracin de cada ciclo en el toro es de 14 das y en el caballo 12 das. Se requieren de 4 a 5 ciclos para que una espermatogonia tipo A del primer ciclo complete la metamorfosis para un total de 60 das, duracin de la espermatognesis.

ESPERMATOZOIDE FERTIL Para que el espermatozoide sea capaz de fecundar el vulo debe sufrir una serie de cambios tanto en los testculos como en las vas genitales femeninas.
CAMBIOS EN EL EPIDIDIMO

El espermatozoide una vez ha sido expulsado del tubo seminfero, no es apto para fecundar. Comienza a adquirir sta capacidad en su paso por el epiddimo, en donde sufre una serie de cambios morfolgicos, fisiolgicos y bioqumicos cuyo conjunto recibe el nombre de Maduracin Epididimal y tiene una duracin de10 a 15 das. Los cambios en el epiddimo dependen de las secreciones del epiddimo y del tiempo de transporte. Estos cambios son: Adquisicin de la motilidad. (GADDUM) Modificaciones en la distribucin y densidad de grupos aninicos en su superficie. (YANAGIMACHI) Formacin de puentes de sulfuro -S-S- tanto en el ncleo como en estructuras de la cola del espermio. (CHANG) El conjunto de cambios sealados, es eventualmente, su capacidad fecundante. quizs lo que le permite al espermatozoide adquirir

CAMBIOS EN LA VIA GENITAL FEMENINA

El espermatozoide eyaculado, a diferencia del testicular, es capaz de fecundar, debido a los cambios que ocurren en condiciones normales en la va geni tal femenina. Es necesaria la Capacitacin Espermtica para la fecundacin del oocito. El espermatozoide adquiere la capacidad de mover el flagelo en su trnsito por el epiddimo, pero el movimiento empieza despus de la eyaculacin. Este proceso es conocido como la Activacin del Esperma. (OLIVERA) La movilidad del esperma se desencadena por cambios en el medio inico extracelular, por interaccin con ligandos especficos y por glucosa, presentes en el lquido seminal y en el tracto reproductivo femenino; estos cambios inducen seales citoslicas flagelares, a travs de la fosforilacin de protenas, de canales de Ca++ y de vas dependientes de nucletidos cclicos (GMPc y AMPc). El espermatozoide, activado y capturado por las microvellosidades del istmo del oviducto se capacita, y esto desencadena seales intracelulares que inducen lahiperactivacin. La activacin y la hiperactivacin utilizan mecanismos moleculares similares para generar el movimiento del flagelo cuyo eje funcional es el axonema y cuya protena motora principal es la dinena. El axonema, adems, est compuesto por microtbulos, molculas chaperonas, protenas fijadoras de calcio y protenas quinasas/fosfatasas.

CAPACITACION ESPERMATICA

La capacitacin espermtica comprende todos los cambios concurrentes que permitan que frent e a niveles fisiolgicos de Ca ++ libre se induzca la Reaccin del Acrosoma y que el flagelo de la cola sea Hiperactivado (BEDFORD) Los espermatozoides son retenidos en las criptas oviductales y all pierden los factores decapacitantes como mucopolisacridos y protenas que haban aportado las glndulas anexas; ste es el comienzo del proceso conocido como Capacitacin , nombre que indica el potencial que adquiere el espermatozoide para hiperactivarse y para lograr laReaccin Acrosomal. Este proceso se lleva a cabo en las criptas del istmo donde se adosan los espermas, y termina con la liberacin del mismo hacia el mpula; aqu al encontrar el oocito ocurre el reconocimiento y la adherencia para que el espermatozoide empiece a atravesar la zona pelcida. ZP La capacitacin, se caracteriza por la salida de colesterol de la membrana y el ingreso de Ca++ y HCO3- al citosol (OLIVERA) lo cual tiende a aumentar la fluidificacin de la membrana, niveles de AMPc y cambios en algunas enzimas como la proteinKinasa (LANGLAIS) Todos los espermatozoides no son capacitados al mismo tiempo, perodo relativamente largo dependiendo de su localizacin en el tracto femenino sino que lo hacen en un de varias horas

No hay duda que la membrana plasmtica del espermatozoide, particularmente la cabeza, sufre una serie de cambios bioqumicos durante la capacitacin. Durante la mezcla del esperma con el plasma seminal, este ltimo recubre el esperma con varias protenas, las cuales son retiradas en el tracto genital femenino. Un concepto importante en relacin con la capacitacin es el que este proceso puede ser reversible si se reincorporan los espermatozoides capacitados al plasma seminal. Por ejemplo, cuando se retiran espermatozoides capacitados del tracto reproductivo femenino y se mezclan con plasma seminal, estos se decapacitan nuevamente, necesitndose de un nuevo perodo de capacitacin en el tracto genital para que puedan ser frtiles. (SENDER)

HIPERACTIVACION DE LA

MOTILIDAD

La aparicin de la Hiperactivacin la Motilidad es necesaria para la penetracin de las cubiertas ovocitarias, particularmente la Zona Pelcida.(BEDFORD)

de

Cuando el espermatozoide alcanza el istmo del oviducto inicia un movimiento asimtrico, amplio y acelerado del flagelo (caracterstico de la hiperactivacin), lo que lo lleva a moverse en crculos y lo ayuda a liberarse de las criptas oviductales para avanzar a travs del lumen y alcanzar la mpula, atravesar el cmulus ooforo (clulas de la granulosa que rodean el oocito) y adosarse a la ZP donde es reconocido (reconocimiento entre gametos)

La hiperactivacin de la motilidad sucede en la mpula del oviducto, vara de una motilidad progresiva en lnea a una motilidad acelerada en crculos y se cree es originada por la presencia de algunas molculas especficas producidas en el epitelio de esta zona y se desencadena por cambios en el medio inico extracelular, por interaccin con ligandos especficos y por glucosa, presentes en el lquido seminal y en el tracto reproductivo femenino; estos cambios inducen seales citoslicas flagelares, a travs de la fosforilacin de protenas, de canales de Ca++ y de vas dependientes de nucletidos cclicos (GMPc y AMPc) (SENDER- OLIVERA) Los ligandos especficos ms conocidos son: la progesterona y el esteroide sulfatado SAAF (Sperm Activating and Attracting Factor) que inducen la entrada de Ca++; el pptido activador de espermatozoide (PAS) y el pptido atrial natriurtico (PAN) que actan, ya sea por medio de un receptor de membrana, o por activacin directa de la guanilil ciclasa ligada a membrana (GCm). Otros ligandos especficos son los factores de tipo olfatorio y odorante (hOR17-4) producidos por el oocito para inducir la quimiotaxis del espermatozoide. La hiperactivacin depende de la temperatura con un tiempo mnimo de 2.5 Hs a 40 C y de 12 Hs a 23 C. Normalmente la hiperactivacin tiende a ocurrir al mismo tiempo que la reaccin del acroso ma. (MAHI) La hiperactivacin facilita el contacto del espermatozoide con el oocito, mediante interaccin de las protenas de la superficie de la zona ZP con las protenas del acrosoma. la

La ZP contiene tres glicoprotenas denominadas Zona Proteinas 1-2-3 (ZP1-ZP2-ZP3). La ZP1 y ZP2 suministran las protenas que conforman la estructura e integridad de la ZP. La ZP3 acta como un receptor hormonal y se une a protenas de la membrana del espermatozoide. La membrana plasmtica del espermatozoide posee dos sitios de unin a la ZP. El primero se denomina como Sitio de Unin Primario de la ZP, responsable de la adherencia del esperma a la ZP. El segundo se denomina Sitio de Unin Promocin de la Reaccin del Acrosoma. Cuando se produce el contacto de estos sitios con la molcula ZP3 se produce una seal de transduccin, con lo cual se inicia la reaccin del acrosoma

REACCION DEL ACROSOMA. La reaccin del acrosoma comienza cuando la membrana plasmtica del espermatozoide se fusiona en mltiples sitios con la membrana acrosomal externa, en donde se presenta un proceso de perforacin o fenestracin y se forman pequeas vesculas, proceso llamado vesiculacin, que permite la dispersin del contenido acrosomal, quedando la membrana nuclear del esperma rodeada por la membrana acrosomal interna. La lesin de la membrana acrosomal y la membrana plasmtica es irreversible y se debe a los cambios de presin osmtica, enfriamiento brusco, calentamiento brusco o cambios marcados de pH. La liberacin de las enzimas acrosomales permite que el espermatozoide digiera las membranas de la ZP y penetre el oocito.

Austin y Bishop encontraron espermatozoides cuyo acrosoma haba reaccionado mientras se movan entre las clulas del cmulo ooforo. La fenestracin que se produce durante la reaccin del acrosoma, permite la salida gradual de hialuronidasa,cuya localizacin intraacrosmica ha sido comprobada, facilitando la penetracin del cmulo por parte del espermio. La reaccin del acrosoma compromete fundamentalmente la porcin principal y ms anterior del acrosoma, quedando la porcin posterior o segmento ecuatorial sin vesicularse . (BARROS) La prematura reaccin del acrosoma impide la fertilidad del espermatozoide. Experimentalmente se ha demostrado que la reaccin del acrosoma es Ca ++ dependiente. Al incubar espermios en un medio sin Ca ++ la reaccin no se presenta. Posteriormente al agregar Ca ++ stos sufren la reaccin del acrosoma y son capaces de fusionarse con los ovocitos.

PENETRACION DEL ESPERMATOZOIDE

La penetracin de la ZP por el espermatozoide es un proceso rpido y probablemente tome solo unos pocos minutos. La Acrosina es una de las enzimas liberadas que permite la hidrlisis de las protenas de la ZP as como los cambios para que el espermio se una a la ZP. La fuerza mecnica generada por el movimiento flagelar de la cola es suficiente para empujar el espermio a travs de un espacio oblicuo en la ZP denominado Zona Lisina.

 FUSION DE LAS MEMBRANAS

Cuando el espermatozoide penetra totalmente la ZP y alcanza el espacio privitelino (espacio entre la ZP y la membrana plasmtica del oocito) en donde hay una capa de microvellosidades de la membrana plasmtica del oocito. La membrana plasmtica del oocito se fusiona con el segmento ecuatorial y el espermatozoide frtil es engullido, facilitando la mezcla de protenas en este sitio denominado Fusin de Proteinas. La nica regin libre es aquella que se encuentra por encima del sitio en donde se ubica la placa de la segunda metafase. En sta zona no se ha observado nunca fusin gamtica. Probablemente sta diferenciacin evita que el ncleo espermtico sea eliminado junto con el 2 polocito. Luego de la fusin de las membranas el oocito sufre una serie de que le permiten prepararse para la embriognesis temprana. cambios

Durante la primera y segunda divisin meitica de la oognesis, pequeas estructuras esfricas, densas denominadas Grnulos Corticales que contienen mucopolisacridos, proteasas, activadores de plasmingeno, fosfatasas cidas y peroxidasas, se mueven hacia la periferia del citoplasma y entran en Exocitosis o Decondensacin lo cual permite la salida de su contenido originando el Bloqueo o Reaccin de La ZP que impide la penetracin de ms espermatozoides o Polispermia.

Despus de la penetracin del espermatozoide tiene lugar la Decondensacin del Ncleo de tal manera que los cromosomas del macho se aparean o fusionan con los cromosomas del proncleo femenino, formndose por lo tanto un solo ncleo con el ADN del macho y la hembra, evento

denominado Singamia que da lugar a la formacin del Zigoto como primer paso para la embriognesis.