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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CINCIAS DA SADE DEPARTAMENTO DE FARMCIA DISCIPLINA DE CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS

HPLC

Docente: Raquel de Melo Barbosa Discentes: Allia Moraes da Rosa Jane Karla L. Menezes Saury Kitayama da Silva Thuany Ramos da Silva

NATAL 2014

1. Introduo

A cromatografia um mtodo analtico moderno, devido facilidade em efetuar separao, identificao e quantificao de espcies qumicas, fundamentando-se na migrao diferencial dos componentes de uma mistura devido suas interaes entre duas fases imiscveis (fase estacionria e fase mvel). A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) empregada para separar e determinar uma grande variedade de materiais orgnicos, inorgnicos e biolgicos, sendo o tipo mais empregado de cromatografia por eluio. Possui capacidade de realizar anlises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vrios tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilidade. O tipo de CLAE definido pelo mecanismo de separao ou pelo tipo de fase estacionria, podendo ser do tipo: partio, adsoro, troca inica, excluso, afinidade e quiral. A partir dos anos 70 se conseguiu um avano considervel da cromatografia lquida moderna que at ento era essencialmente subdesenvolvida, apesar de que um dos primeiros experimentos sobre cromatografia, no inicio do sculo, foi o tipo que hoje chamado cromatografia lquida clssica. O avano foi gradual e atingiu o atual nvel de sofisticao que a CLAE apresenta, devido ao revolucionrio desenvolvimento tecnolgico da prtica deste tipo de cromatografia. Nos ltimos dez anos ocorreram o desenvolvimento de vrios detectores espectrofotomtricos que operam em

comprimentos de onda varivel at 190 nm, e houve um aumento na utilizao dos detectores por fluorescncia, eletroqumicos, e por fluorescncia induzida por laser, bem como acoplamento com o espectrmetro de massas. Com estes, tornou-se possvel a deteco da maioria dos compostos e a anlise de traos em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos, petrleo, etc. 1. INSTRUMENTAO A instrumentao do CLAE composta por: 1. Reservatrio: Frasco de vidro que contm o solvente. Possui furos na tampa para passagem da tubulao da fase mvel e de um gs para degaseificao, contendo

filtro para reter partculas slidas, se existentes. A eluio pode ser feita por um nico solvente (isocrtica) ou pela mistura de dois ou mais (gradiente). 2. Sistema de Bombeamento: As bombas devem operar em presses at 500atm, possuir sada livre de pulsao, vazes empregadas de 0,005 at 3mL/min e no devem ser corrodas pela fase mvel empregada. O bombeamento pode ser isocrtico ou por gradiente. 3. Sistema de Injeo da amostra: A injeo feita com auxlio de vlvulas especiais que permitem a introduo com preciso e exatido, de quantidades mnimas. 4. Sistema de Separao (Coluna): a principal parte do equipamento. Existem as prcolunas e colunas. A pr-coluna colocada entre a boba e o injetor com o objetivo de reter as impurezas da FM e da amostra para preservar a coluna. A coluna pode conter a fase normal polar, ou fase reversa, apolar. A escolha depender do analito. 5. Sistema de Deteco: O detector monitora as mudanas de concentrao ou a massa dos compostos da amostra que est saindo da coluna. A interpretao dos registros dos detectores produz dados qualitativos e quantitativos sobre a amostra. Os detectores podem ser de absorbncia UV/VIS, eletroqumico, por ndice de refrao, fluorescncia, espectrmetros de massa e ressonncia magntica nuclear. 6. Sistema de Aquisio e Processamento: Obtm-se um cromatograma e a identificao realizada por tempo de reteno. O sistema pode ser exemplificado pela figura abaixo:

Figura 1: Esquema representativo da instrumentao de um CLAE/HPLC

2. Objetivo Avaliar por HPLC uma amostra em trs concentraes diferentes.

3. Metodologia

Componentes do HPLC: injetor manual, bomba, reservatrio de solventes, coluna, detector e descarte. A gua que deveria ser utilizada na anlise era gua ultrapura, porm em sua falta apenas para anlise demonstrativa foi usada gua destilada. Os solventes foram previamente filtrados (filtrao vcuo por membrana de 0,22 micrmetros), fez-se desgaseificao, colocou-se os solventes(tietrilamina e gua acidificada em pH 3,5) no reservatrio e ligou-se o equipamento. Ao plugar, fez-se a lavagem do sistema para verificar se havia bolhas, limpando e retirando resqucios de outros solventes que foram previamente utilizados em outra anlise. Quanto amostra extraiu-se o mximo de interferentes possveis, lembrando que geralmente se trabalha em microgramas, dilui-se e filtrou-se. Ressaltando que sempre importante saber estrutura qumica do frmaco, pKa, solubilidade para escolha da fase mvel e fase estacionria e ser solvel na fase mvel para no danificar coluna.

4. Resultados e Discusso

As amostras com concentraes diferentes analisadas por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) apresentaram os seguintes parmetros: Concentrao de 10ppm

Tempo de Reteno [min] 1 2,325 2 2,825 3 3,1517

Tempo Inicial [min]

Temp o Final [min]

Valor Inicial [mAu]

Valor Final [mAu ]

rea [mAU.s]

Altura

rea

Altu ra (%)

W05 [min]

Pico de pure za

do Pico (%) [mAU]

2,175 2,700 3,627

2,508 3,033 3,808

-1,393 2,186 -2,362

6,820 3,102

669,765 671,016

83,166 78,020

24,3 24,4 51,3

30,1 28,3 41,6 0

0,14 0,15 0,18

810 914 622

-1,189 1411,139 114,98 9

Tabela 1: Parmetros cromatogrficos da Amostra 10ppm.

Figura1: Cromatograma 10ppm. Concentrao de 30ppm

Tempo de Reteno [min] 1 2,333

Tempo Inicial [min]

Temp o Final [min]

Valor Inicial [mAu]

Valor Final [mAu ]

rea [mAU.s]

Altura

rea

Altu ra (%)

W05 [min]

Pico de pure za

do Pico (%) [mAU]

2,183

2,663

-5,491

-1,507 2011,048 234,91 8

26,7

30,8

0,14

701

2 2,833

2,683

3,067

1,507

1,547

1854,541 207,84 4

24,6

27,2

0,15

846

3 3,525

3,258

3,833

-7,866

-3,372 3669,230 321,13

48,7

42,0

0,18

781

3 Tabela 2: Parmetros cromatogrficos da Amostra 30ppm.

Figura 2: Cromatograma 30ppm Os tempos de reteno apresentaram-se diferentes, graas a influncia exercida pelo tamanho da partcula, esta controla o processo de difuso das molculas da amostra ao penetrar e sair dos poros da partcula. Quanto maior o tamanho da partcula porosa, mais lento o processo de difuso e, como consequncia, mais lenta a transferncia de massa entre a fase estacionria e a fase mvel. Isto acontece porque, medida que aumenta o tamanho da partcula, aumenta tambm a profundidade dos poros e consequentemente a amostra demora mais para ser retida, isto pode se observar na amostra com concentrao de 30ppm que demonstrou um maior tempo de reteno. Porm, os picos da amostra de 10ppm se apresentaram mais largos, que os de 30ppm, isto eles migraram mais rapidamente pela fase mvel em comparao com os de maior concentrao, e isto resulta em um alargamento de picos.

5. Concluso

Portanto conclui-se que esse mtodo ainda inacabado, est bom para analise, pois h uma boa separao dos picos, no h presena de coeluies, tendo que melhorar a altura do pico e um pouco mais de simetria do pico.