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JLIO CESAR DE CARVALHO

DESENVOLVIMENTO DE BIOPROCESSO PARA A PRODUO DE PIGMENTOS A PARTIR DE MONASCUS POR FERMENTAO EM SUBSTRATO SLIDO
Tese apresentada ao Curso de PsGraduao em Processos Biotecnolgicos, Setor de Tecnologia, Universidade Federal do Paran, como requisito parcial obteno do grau de Doutor em Processos Biotecnolgicos. Orientador: Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol

CURITIBA 2004

JLIO CESAR DE CARVALHO

DESENVOLVIMENTO DE BIOPROCESSO PARA A PRODUO DE PIGMENTOS A PARTIR DE MONASCUS POR FERMENTAO EM SUBSTRATO SLIDO

Orientador:

Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol Departamento de Engenharia Qumica Setor de Tecnologia, UFPR

Examinadores: Prof. Dr. Adriane Bianchi Pedroni Medeiros Departamento de Engenharia Qumica UFPR Prof. Dr. Agenor Furigo Jr. Departamento de Engenharia Qumica e Alimentos UFSC Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa Departamento de Qumica FURG Prof. Dr. Jose Angel Rodriguez-Len ICIDCA Cuba / Prof. Visitante UFPR

CURITIBA 2004

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Termo de Aprovao

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AGRADECIMENTOS Posso me congratular por ter recebido o apoio de muitas pessoas, amigos, colegas e mestres, que me ajudaram e que so em parte responsveis pelo bom termo a que chegou este trabalho. Depois de pouco mais de uma dcada, o LPB conta com uma equipe coesa, onde a regra tem sido a solidariedade no trabalho. A todos agradeo, e mesmo correndo o risco da omisso de nomes, agradeo especialmente: Ao Prof. Soccol, meu orientador neste trabalho, e com cuja orientao para a carreira acadmica pude contar desde o final da graduao; profa. Adriane, pela reviso inicial, dando contribuies importantes, e pela participao nas bancas de avaliao, e aos profs. Jos Angel, que ajudou de forma entusiasmada na discusso da anlise respiromtrica e nas bancas de avaliao, e Jean, pelas idias para anlise cromatogrfica; Ao professor Agenor, amigo e ex-orientador, e ao prof Jorge; ambos se prontificaram em prazo exguo a contribuir na avaliao deste trabalho; s professoras Adenise e Luciana, pelo apoio e confiana no dia a dia da UFPR; Aos colegas Dbora, pela ajuda com o equipamento de respirometria, e Radjis, pela ajuda com anlises cromatogrficas, partes crticas do trabalho de laboratrio; Aos funcionrios Cludio, Rosane e Cleusa, da PUC-PR, sempre solcitos e competentes, e Mitiyo, da UFPR, pela inestimvel ajuda, pronta e eficiente, em todas as etapas prticas do trabalho; Aos estagirios Carolina e Susan, que trabalharam com disposio nas etapas iniciais deste projeto, e sobretudo ao Bruno, cuja ajuda, disposio e bom humor foram vitais para as etapas finais; E por ltimo, porque em destaque, agradeo minha famlia meus pais Snia e Csar, e meus irmos Marco, Dayse e Lucrcia pelo apoio em todas as fases de minha formao, e agradeo minha namorada Llian que muito mais do que revisar o texto, toda a pacincia, amor e disposio de que eu precisava para escrever este trabalho.

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SUMRIO LISTA DE ABREVIATURAS E smbolos ...............................................................viii RESUMO....................................................................................................................ix ABSTRACT.................................................................................................................x 1 Introduo.............................................................................................................1 2 Reviso de Literatura ............................................................................................3 2.1 Pigmentos viso geral ............................................................................3
2.1.1 Terminologia...................................................................................................................3 2.1.2 Histrico..........................................................................................................................3 2.1.3 Por que usar corantes em alimentos? ...........................................................................4 2.1.4 Cor e estrutura................................................................................................................5 2.1.5 Pigmentos naturais versus artificiais ..............................................................................7 2.1.6 Pigmentos microbianos ................................................................................................10 2.1.7 Mercado de pigmentos.................................................................................................10

2.2 Pigmentos de Monascus .........................................................................12 2.3 O microorganismo ...................................................................................15

2.3.1 Ocorrncia ....................................................................................................................15 2.3.2 Linhagens usadas para a produo de pigmentos ......................................................15 2.3.3 Morfologia.....................................................................................................................16 2.3.4 Cepas utilizadas ...........................................................................................................17

2.4 Crescimento e produo de metablitos ...............................................18

2.4.1 Condies fsicas de cultivo: ........................................................................................19 2.4.2 Fermentao em meio slido/submerso ......................................................................20 2.4.3 Teor de umidade em meios slidos .............................................................................21 2.4.4 Composio do meio de cultivo ...................................................................................21 2.4.5 Outros fatores nutricionais ...........................................................................................23

2.5 Mtodos de fermentao .........................................................................24 2.6 Toxicidade dos pigmentos e produo de citrinina..............................25
2.6.1 Citrinina propriedades e anlise................................................................................26

2.7 Mtodos de anlise de pigmentos ..........................................................28 2.8 Uso e estabilidade de pigmentos de Monascus ....................................30

2.9 Mtodo de anlise de biomassa .............................................................30 3 Material e Mtodos .............................................................................................33 3.1 Cepas e Manuteno................................................................................33 3.2 Preparao de inculos...........................................................................33
3.2.1 Inculos em meio lquido..............................................................................................33 3.2.2 Suspenses de esporos...............................................................................................34

3.3 Comparao de cepas .............................................................................34

3.3.1 Determinao de crescimento radial............................................................................34 3.3.2 Comparao de cepas quanto produo de pigmentos ...........................................35

3.4 Comparao de mtodos de extrao....................................................35

3.4.1 Extraes esttica, agitada, com Soxhlet, com diferentes solventes ..........................35

3.5 Substratos utilizados ...............................................................................35

3.5.1 FSS em arroz, em coluna, frasco ou bandeja..............................................................35 3.5.2 FSS em bagao de mandioca, em coluna, frasco ou bandeja ....................................36 3.5.3 FSS de diferentes substratos potenciais, em frascos ..................................................36

3.6 Otimizao das condies de cultivo em bagao de mandioca ..........36 3.7 Ensaios de estabilidade de pigmentos ..................................................37
3.7.1 Isolamento da biomassa ..............................................................................................37 3.7.2 Preparao de extratos ................................................................................................37 3.7.3 Solues de pigmentos ................................................................................................37 3.7.4 Anlises de estabilidade...............................................................................................38

3.8 Extrao de pigmentos e anlise da absorbncia.................................38

3.8.1 Extrao de pigmentos na comparao de substratos ................................................40

3.9 Extrao e anlise da citrinina................................................................40

3.9.1 Extrao .......................................................................................................................40 3.9.2 Cromatografia preparativa de citrinina .........................................................................40 3.9.3 Anlise de citrinina .......................................................................................................41

3.10 Anlise de biomassa em FSS................................................................41

3.10.1 Preparo de padro de biomassa ................................................................................41 3.10.2 Extrao da biomassa................................................................................................41 3.10.3 Extrao do ergosterol ...............................................................................................41 3.10.4 Anlise do ergosterol..................................................................................................42

3.11 Anlise respiromtrica...........................................................................42

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3.11.1 Respirometria em colunas..........................................................................................42 3.11.2 Respirometria em reator.............................................................................................43

3.12 Clculos - Regresso, ajuste de curvas e parmetros cinticos .......43 4 Resultados e discusso.....................................................................................43 4.1 Isolamento e caracterizao do microorganismo. ................................44 4.2 Comparao de cepas. ............................................................................45 4.3 Otimizao das condies de extrao de pigmentos .........................48
4.3.1 Extraes estticas ou agitadas...................................................................................48 4.3.2 Extrao usando diferentes solventes .........................................................................48 4.3.3 Quantidade de solvente ...............................................................................................51 4.3.4 Eficincia na extrao ..................................................................................................52

4.4 Comparao de diferentes substratos ...................................................53 4.5 Ensaios utilizando bagao de mandioca como substrato....................55
4.5.1 Teor de umidade na FSS de bagao de mandioca .....................................................55 4.5.2 Cintica de produo de pigmentos em bagao de mandioca ....................................56 4.5.3 Otimizao das condies de cultivo em bagao de mandioca. .................................57

4.6 Desenvolvimento do mtodo de anlise de biomassa via ergosterol .62 4.7 Determinao da aerao adequada, em coluna de Raimbault ...........63 4.8 Anlise respiromtrica em colunas ........................................................64
4.8.1 Fases da fermentao:.................................................................................................67 4.8.2 Determinao dos parmetros da fermentao usando o programa FERSOL...........68

4.9 Correlao biomassa-pigmento..............................................................69 4.10 Cintica de fermentao em reator do tipo tambor horizontal ..........70 4.11 Comparao da produo em frascos, colunas, bandeja e reator tipo tambor horizontal, com arroz como substrato ..................................................74 4.12 Avaliao da estabilidade dos pigmentos ...........................................75 5 Concluses e sugestes ...................................................................................79
5.1.1 LPB 31 uma linhagem adequada para a produo industrial de pigmentos. ...........79 5.1.2 Etanol o solvente orgnico mais adequado para a extrao de pigmentos. ............79 5.1.3 Arroz o substrato bruto mais adequado para a produo de pigmentos. .................79 5.1.4 Bagao de mandioca puro um substrato potencial para produo de extratos.........80

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5.1.5 Condies para cultivo em meio slido arroz. ..........................................................80 5.1.6 Estabilidade de pigmentos de Monascus.....................................................................80

5.2 Sugestes para trabalhos futuros ..........................................................81

5.2.1 Gerao e seleo de linhagens mutantes de Monascus ...........................................81 5.2.2 Formulaes com substratos mistos............................................................................81 5.2.3 Desenvolvimento de um condicionador de ar para reatores de FSS ..........................81

6 Referncias Bibliogrficas ................................................................................82

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LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS ATCC: American Type Culture Collection, banco de cepas - EUA BM: bagao de mandioca ca: circa (cerca de) CCT: Centro de Culturas Tropicais, banco de cepas daFundao Andr Tosello Brasil DMSO: dimetil sulfxido FL: fermentao lquida FSS: fermentao em substrato slido LPB: laboratrio de processos biotecnolgicos NmL, NL: normal mililitro ou normal litro, volume de gs expresso em condies padro (0 C, 1 atm) NRRL: Northern Research Regional Laboratories, banco de cepas pblico EUA PA para anlise PDA potato dextrose Agar PTS: protena texturizada de soja : velocidade especfica de crescimento microbiano (em tempo-1)
max:velocidade

mxima especfica de crescimento microbiano

UA: unidades de absorbncia UV: ultravioleta v/v volume por volume v/m volume por massa YEA: levedura seca de panificao

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RESUMO Os pigmentos naturais de Monascus apresentam um grande potencial para a agroindstria, podendo agregar valor a matrias-primas baratas como cereais e outros substratos amilceos. No presente trabalho, determinou-se meio e condies de cultivo, extrao, anlise de pigmento e de citrinina e parmetros cinticos para a linhagem LPB 31, um isolado do gnero Monascus, e estimou-se a estabilidade dos pigmentos para aplicao em alimentos. Os resultados obtidos indicam que a linhagem isolada adequada produo de pigmentos por FSS. O solvente mais adequado para extrao etanol a 60%, com a agitao por 1h do fermentado com o solvente, temperatura ambiente, na proporo de 3 partes de solvente para 1 parte de fermentado seco. Extraes exausto podem aumentar o rendimento da extrao em 20%. A forma de fermentao influencia bastante a produo, devido perda de umidade e outros fatores fsicos. Comparado a outros substratos, o arroz o substrato bruto mais adequado fermentao, embora o bagao de mandioca apresente potencial de aplicao para a produo de extratos de pigmento. Para a produo de pigmentos de Monascus em FSS, as condies mais adequadas so as de aerao forada (com ar saturado de umidade) de 1NmL/min.g de substrato mido, para um leito de 8 cm de altura, durante 8 dias, com inculo vegetativo, a 32 C. Obtm-se nessas condies uma velocidade especfica mxima de crescimento de 0,039h-1, e uma velocidade especfica de produo de pigmentos de 27,5 UA/g biomassa.h-1 e uma produo da ordem de 110UA/g produto seco. A produo tambm pode ser feita em bandejas, com produo de pigmento inferior, mas ainda comercialmente adequada. Nesse caso recomenda-se uma altura de leito de 2 cm. A produo de citrinina pela linhagem LPB 31 inferior s outras linhagens testadas. Os pigmentos de Monascus so instveis frente a extremos de pH e temperaturas altas, devendo ser usados em aplicaes a temperaturas inferiores a 60 C e pH prximos da neutralidade. PALAVRAS-CHAVE Pigmentos naturais, Monascus, fermentao em substrato slido, arroz, bagao de mandioca

ABSTRACT Natural pigments from Monascus present a high potential for agro-industries, since they may add value to cheap raw materials such as cereals and other starchy substrates. In the present work, the adequate conditions for cultivation, extraction, pigment production and citrinin analysis were defined for the strain LPB 31, an isolate from the genus Monascus. It were also determined the kinetic parameters and pigment stability for food applications. The results indicate that this strain is adequate for the production of pigments in SSF (solid substrate fermentation). The best solvent for extraction is 60% ethanol, with shaking for 1h of the fermentate with the solvent, at ambient temperature, in the proportion of 3 parts solvent to 1 part dry fermentate. Exhaustive extractions may improve extraction yield up to 20%. The fermentation method highly affects production, an effect due to humidity loss and other physical factors. Compared to other substrates, rice is the raw material most adequate to fermentation, although cassava bagasse shows potential use for the production of pigment extracts. Regarding the production of Monascus pigments in SSF, the ideal conditions are forced aeration (with moist air) of 1NmL/min.g dry substrate, for an 8 cm high bed, for 8 days, with a vegetative inoculum, at 32 C. In such conditions, a maximum -1 specific velocity of 0.039h is obtained, and the maximum specific pigment production velocity is 27.5 UA/g biomass.h-1, with a production of the order of 110 UA/g dry product. Production may also be accomplished in trays, with a lower pigment production, but still commercially feasible. In this case, it is recommended a bed height of 2 cm. Citrinin production by the strain LPB 31 is lower than other tested strains. Monascus pigments are unstable to extreme pH and high temperature, so that they should be used in food applications at temperatures lower than 60 C and pH near neutrality. KEYWORDS Natural pigments, Monascus, solid substrate fermentation, rice, cassava bagasse

1 INTRODUO A cor uma caracterstica essencial dos alimentos. Embora a cor de um alimento nem sempre tenha relao direta com o valor nutricional, tem importncia central na sua aceitabilidade. Os pigmentos naturais vm tendo uma participao cada vez mais importante no mercado, devido s restries cada vez maiores no uso de corantes sintticos. Esses pigmentos naturais so de origens diversas, como plantas ou animais. Pigmentos microbianos, por sua vez, apresentam-se como uma alternativa vivel aos outros pigmentos de origem animal ou vegetal, porque so considerados naturais, no apresentam problemas de sazonalidade e possuem produtividade alta. Entre os pigmentos passveis de produo por fermentao, destacam-se os pigmentos de Monascus sp, um fungo filamentoso que produz uma srie de pigmentos de estrutura policetdica, com cores que variam entre tons de amarelo, laranja e vermelho. Como ocorre com diversos outros fungos, as linhagens de Monascus produzem tambm micotoxinas, contaminantes cuja quantidade deve ser a mnima possvel em um produto. No caso de Monascus, a micotoxina produzida a citrinina, uma substncia nefrotxica que apresenta tambm atividade antibitica. Os pigmentos de Monascus vm sendo usados em alimentos tradicionais, em pases orientais, h sculos. No entanto, a pesquisa sobre a produo e aplicao industrial desses pigmentos bem mais recente e ganhou fora especialmente na ltima dcada, em conjuno com a produo de outros aditivos alimentares por fermentao. A produo tradicional desses pigmentos feita por fermentao em arroz cozido, distribudo em bandejas, ao passo que a pesquisa e a produo industrial geralmente so voltadas para a fermentao submersa. Os pigmentos de Monascus apresentam uso potencial em produtos crnicos, bebidas, molhos e sopas, embora seu uso no seja ainda regulamentado em diversos pases ocidentais. Tanto a produo em substrato slido, mais eficiente em termos de quantidade e concentrao de pigmentos, quanto a aplicabilidade desses pigmentos na indstria de alimentos traduzem-se em um grande potencial de agregao de valor a matrias-primas abundantes no estado do Paran, motivo pelo qual adotou-se essa linha de pesquisa.

Este trabalho apresenta, numa abordagem de desenvolvimento de processo, uma descrio das informaes em que se fundamentou, e os resultados que se obteve, em um plano de trabalho de doutorado, cujo objetivo era o de produzir pigmentos de Monascus por fermentao em substrato slido. A reviso da literatura apresenta algumas informaes importantes e de domnio pblico sobre pigmentos naturais, a produo de pigmentos por Monascus, a anlise de biomassa e de citrinina e os mtodos de cultivo. A seo material e mtodos descreve as tcnicas tradicionais ou eventualmente desenvolvidas e utilizadas na realizao das etapas de laboratrio deste trabalho. A seo resultados e discusso descreve, inicialmente, como se verificou qual linhagem de Monascus a mais adequada produo isto , com a maior produo e produtividade de pigmentos e a menor produo possvel de citrinina. Foi tambm determinada a melhor forma de extrair pigmentos de Monascus para a preparao de extratos concentrados. Em seguida, trabalhou-se com a formulao de meios de cultivo adequados produo industrial, levando em conta o custo da matria prima e o rendimento do processo. Definido o substrato, determinou-se as condies de fermentao mais adequadas para fermentao em substrato slido, em termos de aerao. A etapa seguinte consistiu em estudos de respirometria, em que dados cinticos e de metabolismo do microorganismo puderam ser verificados, analisando-se a produo de pigmentos e de biomassa como funo do tempo de fermentao e o consumo de oxignio. Essa etapa de respirometria foi repetida para uma escala maior de produo, utilizando um reator tipo tambor horizontal. Os resultados dessa etapa foram confrontados com os obtidos em coluna, em frascos e em bandeja. Finalmente, verificou-se como a estabilidade dos pigmentos em solues aquosas, com o objetivo de estimar a aplicabilidade desses pigmentos em alimentos. A seo concluso e sugestes sumariza as principais informaes levantadas a partir dos experimentos realizados, e apresenta novos rumos a se tomar dentro desta linha de pesquisa.

2 REVISO DE LITERATURA 2.1 Pigmentos viso geral 2.1.1 Terminologia A palavra pigmento tem origem latina e originalmente denominava uma cor (no sentido de matria corante), mas foi mais tarde estendida para indicar adereos coloridos (maquiagem, por exemplo). No incio da Idade Mdia, a palavra foi usada tambm para descrever os mais diversos tipos de extratos de plantas e vegetais, especialmente aqueles usados para colorao de alimentos. A palavra pigmento ainda vem sendo usada nesse sentido na terminologia biolgica: matria corante presente em animais ou plantas e que ocorre em grnulos dentro das clulas ou membranas celulares, como depsitos nos tecidos, ou suspensa nos fluidos corpreos (Ullmann, 1985). O significado moderno associado palavra pigmento (em ingls, pigment) foi originado no sculo XX, significando uma substncia constituda de pequenas partculas que praticamente insolvel no meio aplicado, e usada devido s suas propriedades corantes, protetivas ou magnticas (Ullmann, 1985). Essa definio aplica-se bem aos pigmentos de origem mineral, como dixido de titnio ou negro de fumo; para materiais corantes solveis, geralmente compostos orgnicos, mais adequado usar a expresso corante (em ingls, dye). No entanto, ambos os termos (corante e pigmento) so usados para denominar substncias usadas para conferir cor a alimentos, s vezes indistintamente. No presente trabalho, para manter consonncia com os termos usados na literatura tcnica, prefere-se citar substncias corantes vegetais ou animais, indistintamente de sua solubilidade ou insolubilidade, como pigmentos. 2.1.2 Histrico Pigmentos naturais inorgnicos provavelmente vm sendo usados desde os tempos pr-histricos, o que se pde verificar analisando pinturas em cavernas. Carvo vegetal, ocre, marrom de mangans e argilas esto entre os materiais

usados em pinturas de mais de 30000 anos em cavernas do sul da Frana, norte da Espanha e norte da frica. H cerca de 2000 anos, alguns desses pigmentos j eram aquecidos para modificar sua colorao, aumentando assim a variedade de pigmentos disponveis. Com o desenvolvimento da alquimia e da qumica, diversos compostos inorgnicos de forte colorao (como o cinbrio, os sulfetos metlicos, os xidos de chumbo, etc.) foram usados extensivamente como pigmentos, embora a maioria seja insolvel. Os pigmentos orgnicos naturais so tambm conhecidos h bastante tempo, destacando-se os extratos de plantas como o aafro e o ndigo, ou de animais como a cochonilha. At meados do sculo XIX, os pigmentos orgnicos naturais eram os mais importantes tanto para alimentos e cosmticos quanto para a indstria txtil; a indstria de tintas sempre pde contar com vrios pigmentos inorgnicos que so, no entanto, txicos para o consumo humano. Aps 1850, com a sntese da malva por W. Perkins, houve o florescimento da indstria de pigmentos orgnicos e, em contrapartida, o recrudescimento de agroindstrias tradicionais como o ndigo, na ndia. A variedade de novos pigmentos orgnicos sintticos fez com que muitos fossem aplicados sem grande preocupao com a toxicidade. Em 1900, cerca de 80 pigmentos artificiais eram usados em alimentos nessa poca, no havia regulao quanto ao uso ou pureza dessas substncias; hoje, por outro lado, a maioria desses pigmentos tem uso vetado para alimentos (FDA, 1998). 2.1.3 Por que usar corantes em alimentos? A cor uma propriedade importante dos alimentos, e a natureza nos ensina cedo a esperar certas cores em determinados alimentos. Nossa aceitao de alimentos no futuro acaba dependendo grandemente dessa expectativa. No entanto, diversos fatores como sazonalidade, armazenamento e efeitos de processamento podem alterar a cor de um alimento, o que requer que um fabricante adicione corantes para satisfazer a expectativa dos consumidores. As razes para adicionar corantes a alimentos incluem (FDA, 1998): - reforar a cor perdida devido exposio luz, ao ar, e a extremos de temperatura, umidade e condies de armazenamento. - corrigir variaes naturais da cor (embora mascarar qualidade inferior seja

inaceitvel). - reforar cores que ocorrem naturalmente, mas em nveis menores do que aqueles associados a um determinado alimento. - conferir cor a alimentos que, de outra forma, seriam quase incolores. - conferir cores vivas a alimentos divertidos, como doces festivos. - proteger aromas e vitaminas que podem ser afetados pela luz do sol durante o armazenamento. - fornecer uma variedade atrativa de alimentos ao consumidor. 2.1.4 Cor e estrutura A cor de cada pigmento est associada absoro ou reflexo da luz em comprimentos de onda determinados, o que uma caracterstica da molcula do pigmento. A interferncia com a luz visvel est associada a transies eletrnicas dos eltrons de valncia (Gordon, 1995): a energia (e conseqentemente a freqncia, e portanto a cor) da luz est associada diferena de energia envolvida entre os estados dos eltrons nessas transies. A cor percebida depende da cor absorvida, de acordo com a complementaridade das cores (Figura 1).
Figura 1 cores primrias subtrativas absorvem comprimentos de onda determinados. Cada crculo representa um filtro absorvendo cor, por isso a combinao das cores a ausncia de cor, o negro.
filtro que filtro observa-se ciano que absorve a luz verde observa-se magenta

absorve a luz vermelha

filtro observa-se amarelo

que

absorve a luz azul

As cores primrias subtrativas so o amarelo, o ciano e a magenta. Assim, se da luz branca for absorvido o componente amarelo, percebe-se a cor azul; de forma anloga, quando a cor de um composto amarela, esse composto deve absorver luz no comprimento de onda correspondente ao azul (Bodner e Pardue, 1995). por

isso que, para a anlise de pigmentos vermelhos, a absoro mxima se d para comprimentos de onda baixos correspondendo ao azul, e vice-versa. A absoro de ftons de luz com energias especficas um fenmeno bem conhecido e explorado em tcnicas de anlise como a espectrofotometria. Na prtica, quando se trata de substncias corantes, h bandas de absoro faixas de comprimentos de onda, ao invs de linhas espectrais como em ons inorgnicos simples. No entanto, o princpio de formao da cor o mesmo (Figura 2).
Figura 2 O espectro eletromagntico na faixa visvel. Comprimentos de onda maiores (700nm) correspondem ao vermelho, enquanto comprimentos de onda menores (400nm) correspondem ao violeta. 700 nm 400nm

A energia requerida por eltrons capazes de excitao depende do orbital que esses eltrons ocupam. A energia requerida menor (e, portanto, maiores comprimentos de onda, menos energticos, sero adequados) quando duplas ligaes ocorrem. Se uma srie de duplas ligaes duplas conjugadas est presente, a energia de excitao ainda menor, a ponto de poder ser promovida pela luz visvel portanto, pode-se observar cor. medida que o comprimento do sistema de duplas ligaes conjugadas aumenta, o comprimento de onda de mxima absoro tambm aumenta. (Margalith, 1992). Por exemplo, enquanto o antraceno (trs anis aromticos lineares) incolor, o naftaceno (4 anis lineares) laranja e o pentaceno (5 anis lineares) azul (MERCK, 1996). Em pigmentos naturais, esses sistemas conjugados so observados com freqncia por exemplo, nos carotenides, compostos que conferem a cor a tomates, cenouras e outros vegetais. A formao de sistemas conjugados com heterotomos como oxignio ou nitrognio (apresentando igualmente orbitais p conjugados) tambm relevante em compostos como quinonas, ndigo e carmim.

2.1.5 Pigmentos naturais versus artificiais A partir de meados de 1850, com a sntese da malva (o primeiro pigmento sinttico), a prtica de colorir alimentos tomou um impulso to expressivo que o aspecto toxicolgico dos corantes nem sempre era considerado. Em alguns casos, no entanto, existe razovel toxicidade, e desde 1971, o efeito cancergeno de substncias diversas no organismo humano vem sendo estudado (Nazar, 2001). Dvidas crescentes concernentes segurana de vrios corantes artificiais vm estimulando a sua substituio por corantes naturais (Kim et al., 1995). Alguns dos corantes artificiais, como azorubrina ou tartrazina, podem causar alergias (Multon, 1992, in Fabre, 1993); mesmo a lista de corantes artificiais permitidos vem diminuindo devido a novas informaes sobre efeitos adversos de um ou outro corante. H 9 corantes artificiais correntemente permitidos em medicamentos, alimentos e cosmticos (FD&C colors) nos EUA, dos quais dois tm uso restrito. Por outro lado, h 21 tipos de corantes naturais (dos quais cinco tm uso restrito), liberados para os mesmos usos. Esses corantes naturais so de fontes diversas: desde sucos de frutas e vegetais e extratos (como o de casca de uva, por exemplo), at caramelo, o corante mais usado (FDA, 1998). A tabela na prxima pgina (Tabela 1) mostra os corantes permitidos para alimentos segundo a legislao brasileira, pelo estabelecido na Resoluo n 4, da ANVISA, de 24 de novembro de 1988. Essa resoluo foi adaptada em termos de quantidades permitidas de cada corante, por classe de alimento, atravs de resolues posteriores de 1999, 2000 e 2001. (Anvisa, 2004).

Tabela 1 Corantes de uso permitido em alimentos e bebidas no Brasil (ANVISA, 2004) Corantes naturais Corantes sintticos Corantes artificiais idnticos aos naturais Amarelo crepsculo Azul Brilhante Bordeaux S ou Amaranto Eritrosina Indigotina Beta-caroteno, Beta-apo- Ponceau 4R 8-carotenal, ster etlico Tartrazina do cido Beta-apo-8- Vermelho 16.035 carotenico

Aafro cido carmnico Antocianinas Cacau Carmin Carotenides: , e -caroteno, bixina, norbixina, capsantina, capsorubina, licopeno Carvo vegetal Clorofila, clorofilas e clorofilinas cpricas e seus sais Choconilha Corantes caramelo Crcuma, Curcumina Hemoglobina ndigo Corantes Inorgnicos Pprica Alumnio Riboflavina Riboflavina e riboflavina Carbonato de clcio 5 fosfato de sdio Urucum Dixido de titnio Urzela: orcena, orcena sulfonada Ouro Vermelho de beterraba xidos e hidrxidos de ferro Xantofilas: cantaxantina, Xantofilas: cantaxantina, Prata criptoxantina, flavoxantina, lutena, criptoxantina, rodoxantina, rubixantina, flavoxantina, lutena, violaxantina rodoxantina, rubixantina, violaxantina

A anlise da Tabela 1 mostra que a legislao brasileira permite o uso de diversos pigmentos naturais, mas bastante restritiva com relao aos artificiais, com apenas 8 pigmentos artificiais liberados para uso em alimentos. A tabela a seguir (Tabela 2) mostra os corantes correntemente permitidos para uso em alimentos na Unio Europia (EU) (Arlt, 1998).

Tabela 2 Corantes permitidos na Unio Europia para uso em alimentos (Arlt, 1998) Uso at quantum satis Uso permitido at um nvel em qualquer alimentoa mximo, em alguns alimentos especficos Riboflavina (E101) Curcumina (E100) Clorofilas e clorofilinas Amarelo Tartrazina (E102) (E140) Complexos de cobre de Amarelo de quinolina (E104) clorofilas e clorofilinas (E141) Caramelo (E150a) Amarelo crepsculo FCF, laranja crepsculo S (E110) Caramelo sulfito (E150b) Cochonilha, cidos carmnicos, carmins (E120) Caramelo amnia (E150c) Azorubina, carmoisina (E122) Caramelo sulfito-amnia Vermelho Ponceau 4R, (E150d) Vermelho cochonilha A (E124) Carvo vegetal (E153) Vermelho allura AC (E129) Carotenides (E160a) Azul marinho V (E131) Extrato de pprica, Indigotina, ndigo carmin (E132) capsantina, capsorubina (E160c) Vermelho de beterraba, Azul brilhante FCF (E133) betaninas (E162) Antocianinas (E163) Verde S (E142) Carbonato de clcio Negro brilhante BN, negro PN (E170) (E151) Dixido de titnio (E171) Marron HT (E155) xidos e hidrxidos de Licopeno (E160d) ferro (E172) Beta 8-carotenal (C30) (E160c) ster etlico de cido beta-apo8carotenico (C30) (E160f) Lutena (E161b) Uso restrito, permitido apenas para alguns alimentos Amaranto (Vermelho Bordeaux) (E123) Eritrosina (E127) Vermelho 2G (E128) Marron FK (E154) Cantaxantina (E161g) Alumnio (E173) Prata (E174) Ouro (E 175) Litorubina BK (E180) Urucum, bixina,norbixina (E160b)

a uso at quantum satis: tanto quanto necessrio, dentro das boas prticas

de fabricao. A anlise da Tabela 2 mostra que, enquanto vrios pigmentos naturais apresentam uso liberado na quantidade necessria em alimentos, nenhum dos pigmentos artificiais (destacados na tabela) tem uso irrestrito: devem ser usados em quantidades limitadas. A legislao vigente nos EUA, EU e Brasil, exemplificada atravs da Tabela 1 e da Tabela 2, mostra claramente que o mercado de pigmentos naturais bastante promissor, inclusive porque os pigmentos naturais ora permitidos no cobrem toda a faixa espectral (Vargas, 2000). No entanto, interessante notar

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que, presentemente, o uso de pigmentos de Monascus como aditivo intencional de cor no est previsto pela legislao vigente nos EUA, EU e Brasil. 2.1.6 Pigmentos microbianos Pigmentos microbianos so uma classe de pigmentos naturais que apresenta vantagem em termos de produo em relao aos seus similares extrados de vegetais ou animais: o desenvolvimento de espcies vegetais superiores mais lento que a de microorganismos e algas. Assim, a produo de pigmentos por bioprocessos envolvendo microorganismos, cuja velocidade de crescimento relativamente alta, pode garantir uma produtividade tal para o processo que o torna vantajoso. Correntemente, os pigmentos produzidos por via microbiana e utilizados comercialmente so a riboflavina (vitamina B2, um pigmento amarelo de uso permitido na maioria dos pases), por Eremothecium ashbyii e Ashbya gossypi; os pigmentos de Monascus (objeto deste trabalho, discutidos frente), por M. purpureus e M. ruber; carotenides (pigmentos amarelos produzidos por diversos microorganismos, mas que at o momento s so economicamente viveis quando produzidos por microalgas) como -caroteno (por Dunaliella salina e D. bardawil) e astaxantina (por Haematococcus pluvialis); e ficobiliprotenas como a ficocianina (um pigmento azul usado em alimentos e cosmticos, produzido por Spirulina sp.; os que apresentam potencial de uso so os indigides, as antraquinonas e naftoquinonas (Jacobson e Wasileski, 1994). 2.1.7 Mercado de pigmentos O mercado para pigmentos naturais produzidos por bioprocessos difcil de estimar; por um lado, existe uma preferncia cada vez maior por aditivos naturais em alimentos e cosmticos; por outro, a via de produo natural pode ser, em alguns casos, 10 vezes mais cara que a via sinttica. O caso mais bem sucedido o do caroteno produzido por microalgas, que tem um custo de cerca de U$1000/kg contra U$ 500/kg por via sinttica; apesar do preo maior, o -caroteno produzido por via biotecnolgica pode competir em nichos onde importante que todos os ingredientes sejam naturais; alm disso, o pigmento microbiano uma mistura de ismeros cis- e trans, com efeitos teraputicos contra o cncer que o -caroteno

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sinttico, predominantemente cis-, no apresenta. O mercado para pigmentos no mundo foi estimado, em 1987, em U$ 320 milhes dos quais cerca de 1/3 (U$120 milhes) era de corantes naturais ou idnticos a naturais. Desses, por sua vez, cerca de U$ 35 milhes eram de corantes extrados de fontes naturais, U$35 milhes de idnticos aos naturais e U$ 50 milhes em corantes derivados de processamento (como caramelos). Como o mercado de pigmentos, similarmente ao de aromas, tem tido um crescimento de aproximadamente 10% ao ano (Jacobson e Wasileski, 1994), o mercado atual deve ser expressivamente maior, algo entre U$700 milhes e U$1,5 bilhes. De fato, de acordo com Downham e Collins (2000), uma razovel estimativa para o mercado global de alimentos hoje da ordem de U$ 940 milhes, distribudos em 400 milhes para pigmentos sintticos, 250 milhes para pigmentos naturais, 189 milhes para pigmentos idnticos aos naturais e 100 milhes para caramelos (Figura 3).
Figura 3 - Participao de cada classe no mercado mundial de pigmentos, em 1987 e 2000

Artificiais 62%

Artificiais 42% Idnticos aos naturais 20%

Caramel os 16%

Naturais 11%

Idnticos aos Caramelos naturais 11% 11%

Naturais 27% Mercado mundial em 2000: total U$ 940 milhes pigmentos naturais: U$ 250 milhes

Mercado mundial em 1987: total U$ 320 milhes pigmentos naturais: U$ 35 milhes

Nota-se, analisando a Figura 3, que a participao proporcional dos pigmentos naturais aumentou nas ltimas dcadas. Enquanto a produo mundial de pigmentos aumentou cerca de 3 vezes entre 1987 e 2000, a produo de pigmentos naturais aumentou mais de 7 vezes no mesmo perodo. Os maiores mercados para pigmentos so a Europa e os Estados Unidos. A distribuio de consumo no proporcional ao consumo de alimentos, porque pigmentos so usados em alimentos processados: existe uma demanda potencial grande em pases em desenvolvimento, como o Brasil, nos quais uma melhora no

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perfil econmico deve garantir o aumento no consumo de alimentos processados. No caso especfico de pigmentos de Monascus, o consumo anual desses pigmentos no Japo subiu de 100 t em 1981 para 600 t em 1992 e foi avaliado em cerca de U$12 milhes, de acordo com um levantamento publicado nesse mesmo ano (Lee et al, 1995; Hajjaj et al., 1997) 2.2 Pigmentos de Monascus Pigmentos de Monascus so usados h centenas de anos como corantes para alimentos, em pases orientais. Os fungos do gnero Monascus produzem uma srie de pigmentos policetdicos de estruturas relacionadas (Figura 4). Embora por muito tempo se tenha reconhecido que h 6 pigmentos, na ltima dcada foram descobertos alguns novos, como a xantomonascina e o amarelo II, possivelmente derivados da rubropunctatina (Sato et al., 1992; J szlov et al., 1996; Watanabe et al., 1997). Recentemente duas novas estruturas, chamadas monascopiridinas A e B, anlogos hidrogenados dos pigmentos vermelhos, foram descritas. Esses compostos apresentam mximos de absoro em UV a 306 nm, e a sua contribuio na colorao de Monascus ainda no foi investigada (Wild et al., 2003). Segundo alguns autores, h mais de 10 pigmentos, embora nem todos de estrutura conhecida (Shin et al., 1998).

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Figura 4 estruturas de pigmentos de Monascus sp.

R O O R O R

O O O

O O O

O O O

NH

R monascin monascina R= =C C5 5H11 11 R = C7H15 ankaflavin R = C7H15 ankaflavina

(yellow) (amarelo)

R =R C = C11 rubropunctatin 5H 5H 11 rubropunctatina R = C7H15 monascorubrin R = C7H15 monascorubrina

(orange) (laranja)
C5H11

R= =C C rubropunctmina R rubropunctamine 5H 5H 1111 R = C7H15 monascorubramine R = C7H15 monascorubramina

(red) (vermelho)

C7H15 O

O O HO O O

R O

HO O O

HO

CHO

O O O

Yellow Amarelo II II (yellow) (amarelo)

R xanthomonascin A A RR =C monascopyridine A 5H 11 R= =C C xantomonascina =5H C11 5H 11 5H11 monascopiridina A R = C7H15 xanthomonascin B R = C7H15 monascopyridine B R = C7H15 xantomonascina B R = C7H15 monascopiridina B (yellow) (amarelo)

Os

pigmentos

alaranjados,

monascorubrina

rubropunctatina,

so

sintetizados no citosol a partir da acetil coenzima A, pelo complexo multienzimtico policetdeo sintase. Esses pigmentos no so hidrossolveis e so instveis em pH extremos (Hajjaj, 2000), mas apresentam estruturas responsveis pela sua alta afinidade com compostos contendo grupos amino primrios (so por isso chamados de aminfilos). Reaes com aminocidos levam formao de pigmentos vermelhos hidrossolveis, monascorubramina e rubropunctamina. O mecanismo de formao dos pigmentos amarelos no est ainda claro; alguns autores consideram que estes so produtos da alterao dos pigmentos alaranjados, enquanto outros acreditam que se trata de pigmentos com uma rota metablica prpria (Lin e Demain, 1991; J zlov et al., 1996). A via metablica das policetdeo sintases razoavelmente bem conhecida, mas elucidar os detalhes da biossntese de pigmentos de Monascus necessrio para permitir melhor manipulao das

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condies e composio do meio de cultivo, com base no metabolismo do fungo. H trabalhos sobre anlogos de pigmentos de Monascus produzidos por um fungo de outro gnero, Penicillium sp. AZ, usando vias metablicas similares (Ogihara et al, 2000). Devido afinidade por grupos amino, os pigmentos de Monascus esto associados freqentemente a protenas (Wong e Koehler, 1981) ou parede celular, formando um complexo que pode ser de difcil extrao. Outros autores consideram que pode haver fixao dos pigmentos a lipdios da biomassa fngica, de forma que a extrao envolveria rompimento celular e dissoluo em solvente orgnico (St. Martin et al, 1990). Ainda devido a essa afinidade por grupos amino, possvel converter pigmentos alaranjados lipossolveis em pigmentos vermelhos hidrossolveis por reao com aminocidos e compostos anlogos in vitro (St. Martin et al, 1991). Nesse caso, o nitrognio do grupo amino (do aminocido ou anlogo) substitui o oxignio do anel da rubropunctatina ou da monascorubrina, fornecendo anlogos da rubropunctamina ou da monascorubramina, mas com um radical ligado ao N em substituio ao H dos pigmentos vermelhos naturais. Entre os possveis aminocidos que podem ser usados para induzir a formao de pigmentos hidrossolveis in vivo est o cido glutmico, na forma de glutamato monossdico (MSG) (Lin e Demain, 1992). Em um estudo usando glucose como fonte de carbono em um meio lquido contendo MSG, observou-se a formao de N-glucosil derivados dos pigmentos vermelhos, correspondendo a at 10% dos pigmentos totais (Hajjaj et al, 1997). Entre os pigmentos produzidos por Monascus so geralmente de maior interesse os vermelhos, que so possveis substitutos de corantes sintticos como a eritrosina (FD & C vermelho no. 3) (Johns & Stuart, 1991); trata-se de pigmentos estveis na faixa de pH 2-10, termoestveis e que podem ser autoclavados (op. cit. em Lin e Demain, 1992). Alguns estudos mostram que pigmentos de Monascus podem ser usados como substitutos de aditivos alimentares tradicionais, como nitritos e cochonilha, em pats e embutidos (Fabre et al, 1993). H outros estudos em curso verificando resposta sensorial, testes de alergenicidade e toxicidade, embora pases orientais como o Japo faam uso extensivo desses pigmentos h muitas dcadas por exemplo, pigmentos amarelos hidrossolveis para doces (Watanabe et al, 1997), ou pigmentos vermelhos para vinho de arroz.

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2.3 O microorganismo 2.3.1 Ocorrncia Facilmente encontrado em diversos ecossistemas, fungos do gnero Monascus so usados tradicionalmente em pases orientais, originalmente na China e Tailndia, para preparar um arroz fermentado de forte colorao vermelha e que encontra aplicaes diversas, desde conferir cor a outros produtos como vinho, queijo e carne, at usos medicinais e como preservativo de carne (Wong e Koehler, 1981). Enquanto alguns metablitos do fungo so importantes devido forte colorao, outros possuem atividade hipocolestermica e antimicrobiana, e vm sendo estudados com mais intensidade na ltima dcada (Martnkova et al, 1995; Zhang et al, 2000). No momento, diversas empresas comercializam o arroz vermelho seco e pulverizado como um suplemento alimentar natural com capacidade para diminuir o colesterol, e outras vendem o produto seco ou os extratos purificados como corantes alimentcios (Allok, 2003). O gnero Monascus compreende trs espcies pertencentes famlia Monascaceae e classe Ascomyceta (M. pilosus, M. purpureus e M. ruber) (Pitt, 1997), cuja caracterstica mais importante a capacidade de produzir metablitos secundrios de estrutura policetdica (J zlov et al, 1996), alguns com forte pigmentao amarela, alaranjada ou vermelha. As duas primeiras espcies so mais importantes na produo de pigmentos, enquanto M. ruber associado decomposio de diversos alimentos. Uma espcie nova foi isolada de solo no Iraque, mas esta no importante para alimentos (Pitt e Hocking, 1997). 2.3.2 Linhagens usadas para a produo de pigmentos Cepas utilizadas: geralmente so isolados, provenientes do Japo, China, Tailndia ou Indonsia, de diversos alimentos fermentados: queijo de soja, koji vermelho para fabricao de queijo de soja ou kaoliang, e a fonte mais comum, angkak ou anka (arroz vermelho) (ATCC, 1987). As cepas variam na capacidade de produo e tonalidade dos pigmentos, alm de outros fatores como velocidade de crescimento e o perfil de metablitos. A temperatura, pH e umidade so fatores que alteram tambm pigmentao e crescimento do fungo.

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Figura 5 cultura de Monascus em PDA, aps 7 dias de incubao a 32 C. Nota-se o halo de difuso de pigmentos hidrossolveis e a cor caracterstica do miclio.

2.3.3 Morfologia Colnias de 20 a 30 mm de dimetro em PDA, aps 7 dias. As colnias so planas, eventualmente com pequeno desenvolvimento areo, esparsas, com textura superficial floculenta, miclio inicialmente branco (1 a 2 dias), passando para laranja a vermelho pardo medida que a cultura se desenvolve, com a formao de cleistotcios e aleuriocondias (Figura 5). Geralmente h formao de pigmentos solveis que difundem-se pelo gar. Os cleistotcios so esfricos, de 30 a 60m de dimetro, formados como um n de hifas a partir de um pednculo bem definido, com paredes celulares tornando-se marrons com a maturao; ascosporos elipsides, hialinos, 5-7 x 4-4,5m, parede celular lisa (Figura 6). Pode haver formao de aleuriocondias em pedculos laterais s hifas, mas mais comumente terminais, s vezes nascendo isolados mas mais comumente em cadeias de at 10 clulas de comprimento, esfricas a piriformes, freqentemente arredondando na maturao, com 10-14m de dimetro ou 10-18 x 8-14m, com paredes espessas, lisas e marrons. A maioria das espcies produz tambm clamidocondias e artrosporos. As colnias de M. ruber so de crescimento mais rpido que outras espcies (Pitt e Hocking, 1997).

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Figura 6 - Cultura de Monascus observada ao microscpio (aumento de 400 vezes). Note em a um cleistotcio rompido e diversos esporos. Em b, observa-se a colorao difusa do miclio e um cleistotcio intacto.

2.3.4 Cepas utilizadas Excludas aquelas que so exclusivas de institutos de pesquisa,

universidades ou empresas, as cepas mais referenciadas na literatura de Monascus so as listadas a seguir (Tabela 3). Note que a mesma cepa apresenta diversas denominaes, dependendo da instituio em que est conservada. Algumas dessas cepas foram depositadas com um nome diferente do aceito hoje; a tabela mostra a denominao aceita em 2004, e algumas referncias relacionadas especificamente com a produo de pigmentos (j que algumas linhagens foram usadas para estudos metablicos e de produo de anti-hiperlipidmicos).

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Tabela 3 Cepas mais utilizadas na pesquisa com Monascus, fonte de origem, sinonmia e algumas referncias (em destaque, linhagens utilizadas neste trabalho). Cepa ATCC16360 CBS 283.34 ATCC 26311 IFO 4478 ATCC 16362 CBS 285.34 ATCC 36927 DSM 1603 IFO 4485 ATCC 16365 CBS 109.07 ATCC 16426 IFO 4513 IMI 210765 NRRL 1596 ATCC 16367 CBS 288.34 DSM 1604 IFO 4484 ATCC 16427 NRRL 2897 ATCC 16435 NRRL 1991 ATCC 36928 IFO 6540 CCT 3802 ATCC 96218 MR1 Espcie, origem e depositante Monascus purpureus Went depositado no CBS. Isolado de Angkak (gros de arroz fermentado) Monascus purpureus Went depositado no CBS. Isolado de Angkak (gros de arroz fermentado) Referncias Miyake et al., 1984

Sheperd e Carels, 1979 Rosenblitt et al. 2000.

Monascus purpureus Went Sheperd e Carels, 1979 Miyake et al., 1984 depositado no CBS. Isolado de Angkak (gros de arroz fermentado), Java Monascus purpureus Went Sheperd e Carels, 1979 depositado no CBS. Isolado de kyokusi (massa de leveduras fermentadas, China) Monascus purpureus Went Sheperd e Carels, 1979 depositado no NRRL. Broder e Koehler, 1980. Monascus sp. Sheperd e Carels, 1979 depositado no NRRL. Isolado de koji para manufatura de vinho tinto de arroz, China. Monascus purpureus Went Yamaguchi et al. 1973 Miyake et al., 1984 depositado no IFO. Miyashira et al., 2003 Monascus purpureus Went Santerre et al., 1994 Fabre et al., 1993 depositado na ATCC. Por PJ Blanc Isolado de arroz fermentado, China

Fonte: ATCC, maro de 2004

2.4 Crescimento e produo de metablitos O crescimento e produo de metablitos dos fungos do gnero Monascus se do em condies diversas. H vrios meios de cultivo adequados, mas os mais comuns so PDA (gar batata dextrosada) e MEA (gar extrato de malte) (ATCC, 2004). O crescimento se d de 15-18C (mnimo) at cerca de 45C (mximo), (Pitt e Hocking, 1997) com a produo de pigmentos variando largamente com a espcie e com as condies de cultivo. Entre os metablitos importantes de Monascus esto os pigmentos j descritos, a citrinina (uma micotoxina que ser abordada adiante), e

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uma srie de substncias anti-hiperlipidmicas como monacolinas K e L (Ma et al, 2000), que no sero discutidas neste trabalho. Durante o cultivo de Monascus, CO2, etanol e acetato tambm so produzidos. Ao trabalhar com FSS em arroz, Rosenblitt et al (2000) mostraram que ao final de uma fermentao de 240h, o balano de carbono : cerca de 23% do carbono convertido a biomassa, 35% a CO2, 15% a etanol, 1% a cido actico e 17% permanece no convertido. Esses resultados contabilizam 91% da fonte de carbono; a diferena (para 100%) provavelmente devida a mudanas nas vazes de aerao e uma subestimao do etanol produzido. 2.4.1 Condies fsicas de cultivo: Temperatura: A faixa de temperatura tima , em mdia, de 28-32C, em acordo com os registros de cada espcie em bancos de cepas, embora essa temperatura varie dependendo da linhagem entre 25C e 37C (Lin, 1991). No caso de M. purpureus CBS 109.7, por exemplo, a temperatura tima de 34C; a temperatura mnima de 18C e a mxima, de 46C (Rasheva et al, 1997). Essas temperaturas so timas para crescimento, mas para produo de pigmento geralmente uma temperatura mais alta mais adequada. Presena de oxignio: Os fungos do gnero Monascus so incapazes de crescimento estritamente anaerbio usando glicose como substrato, mas podem crescer em condies de limitao de oxignio. Nessas condies, aumenta a produo de etanol e de CO2, mas h menor produo de pigmento; em condio de maior aerao, a produo de etanol diminui enquanto a de pigmento aumenta. Observou-se ainda que um aumento na presso parcial do CO2 aumenta a produo de pigmento (Pastrana et al, 1995). Em altas concentraes de glucose (acima de 20g/L, em cultura lquida) ocorre um efeito tipo Crabtree, isto , o desvio para um metabolismo predominantemente anaerbio, com a produo de etanol, mesmo em condies de boa aerao (Chen e Johns, 1994). Com concentraes mais baixas de glucose ou com outros acares, possvel dividir a produo em duas fases: inicialmente a glucose sendo convertida a etanol e biomassa, e em seguida o etanol sendo convertido a biomassa e pigmento (Hamdi et al, 1996). Em um meio de composio definida, em condies de limitao de oxignio, a produo de

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pigmentos vermelhos associada ao crescimento, enquanto em excesso de oxignio a produo de pigmentos pode ser inibida pelo efeito de um produto desconhecido (Hajjaj et al, 2000). A influncia da concentrao de oxignio em fermentao em substrato slido tambm foi investigada; a uma presso de 0,02 atm CO2, um aumento da presso parcial de oxignio at 0,5 atm forneceu alto rendimento em pigmentos, enquanto baixas presses de CO2 com presso de 0,21 atm de O2 forneceu rendimento ainda maior (Han e Mudgett, 1992). pH inicial: Em diferentes trabalhos observou-se crescimento em uma ampla faixa de pH, desde 2,5 at 8,0, sendo a faixa ideal de 4,0 a 7,0 (Yongsmith et al, 1993). Dentro dessa faixa a variao no crescimento pequena, com desempenho ligeiramente melhor em pH 4,0 (Lin et al, 1991; Chen e Johns, 1993). Embora o crescimento seja melhor em pH 4, o rendimento em biomassa maior em pH 6,5 (Chen e Johns, 1993). A produo de pigmentos afetada de forma diversa, sendo que em pH mais baixo h predominncia de colorao amarela e em pH mais alto predominncia de colorao vermelha. Em pH 2,5 h produo principalmente de um pigmento amarelo brilhante com esqueleto semelhante ao dos pigmentos tradicionais (Yongsmith et al, 1993); em pH 4 h favorecimento da produo de ankaflavina (amarelo), e a produo total de pigmentos aumenta com o aumento de pH at 5,5; acima desse valor, h diminuio na produo de pigmentos (Lin et al, 1991), embora a produo de pigmento vermelho seja maior em relao aos amarelos. Em pH 7, j no h produo importante de pigmentos amarelos (Yongsmith et al, 1993). pH durante o crescimento: A mudana de pH durante o crescimento depende das fontes de nitrognio, em primeiro lugar, e em segundo das de carbono. Independentemente do pH inicial, o pH final tende a ser o mesmo (Juslov, 1996), na faixa de 7 a 8. (Yongsmith et al, 1993). 2.4.2 Fermentao em meio slido/submerso Embora a produo tradicional de angkak para uso como corante seja sobre um suporte slido (arroz), a maioria dos estudos feitos em laboratrio foi realizada com meios de cultivo lquidos. Ocorre que na fermentao slida, embora obtenhase produtividade de pigmento muito maior que na submersa, geralmente so

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utilizados meios naturais de formulao complexa, o que dificulta as anlises necessrias para desvendar rotas metablicas e outros fatores durante o crescimento. Em um estudo foram comparados meios lquidos com meios slidos de mesma composio, obtidos pela adio de gelificante ao meio lquido e extruso em partculas com tamanho prximo s de arroz. Os meios slidos assim preparados forneceram produo at trs vezes maior de pigmento que o meio lquido, mas os cultivos feitos em arroz ainda foram superiores (Johns e Stuart, 1991). 2.4.3 Teor de umidade em meios slidos O processo tradicional de produo de angkak o mesmo usado para outras variedades de koji (arroz fermentado com diferentes espcies de fungos, geralmente Aspergillus), da o nome alternativo "koji vermelho". O processo de produo consiste em manter arroz no aglutinante imergido em gua por at 24h, com posterior cozimento por vapor (ou, mais recentemente, autoclavagem), adio de um inculo (uma poro de arroz anteriormente fermentado), e adio de gua a intervalos determinados para manter a umidade. (Palo et al, 1960; Wong e Koehler, 1981). A umidade exigida na fermentao de arroz varia dependendo da descrio tradicional, mas recomenda-se que a umidade seja suficiente para garantir o crescimento do miclio pelo gro sem a desintegrao dos gros. O teor de umidade ideal para a produo de pigmentos da faixa de 56%, com pH 6, segundo Johns e Stuart (1991). 2.4.4 Composio do meio de cultivo Fontes de carbono diversas vm sendo usadas como substrato para o crescimento de Monascus, sendo as mais comuns a glucose, a sacarose e o amido. O melhor crescimento geralmente observado com glucose (St. Martin et al, 1990). A produo de pigmentos, no entanto, depende de fatores diversos como a natureza e a concentrao do substrato, alm da fonte de nitrognio e do pH. A produo volumtrica de pigmento em meio submerso melhor com amido e dextrina, enquanto a produo especfica melhor com maltose e quase to boa quanto com glucose (Lin e Demain, 1991), mas essa comparao entre acares deve ser feita

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verificando-se cuidadosamente as concentraes. Em concentraes de glucose inferiores a 20g/L, o crescimento e a produo de pigmento vermelho so excelentes; concentraes de glucose superiores a 20g/L levam a um comportamento tipo Crabtree, com produo significativa de etanol, e crescimento celular e produo de pigmento reduzidos, mesmo em presena de oxignio. Isso indica que pode haver efeito repressor da glucose e que o uso de outro acar pode evitar esse efeito. De fato, em altas concentraes (50g/L), a maltose melhor que a glucose, especialmente em presena de peptona. Essas diferentes concentraes de acares tm mais efeito sobre os pigmentos amarelos que vermelhos, embora quando se use maltose a produo de pigmentos vermelhos seja estimulada. (Chen e Johns, 1994). Uma boa fonte alternativa de carbono o etanol (J zlov et al, 1996), que , afinal, produzido naturalmente pelo fungo em condies de limitao de oxignio ou excesso de glucose (Pastrana et al, 1995; Hamdi et al, 1997). Como a produo de biomassa favorecida com o uso de carboidratos, pode-se fazer a cultura em dois estgios (por exemplo, maltose-etanol) para aumentar a eficincia no uso de etanol para produo de pigmentos (Juszlov et al, 1996). H algumas contradies no que se refere ao efeito de fontes de carbono; por exemplo, Lin e Demain (1991) no encontraram efeito repressor para nenhuma fonte de carbono, trabalhando com concentraes de at 10% de carboidratos. Essas contradies podem ser possivelmente atribudas a diferenas entre organismos e taxas de aerao empregadas. Fontes de nitrognio usadas para o crescimento de Monascus vo desde nitrognio inorgnico (amnia e nitratos) at peptonas (Carvalho et al, 2003). Na produo tradicional de angkak, no h necessidade de adio de fonte de nitrognio, j que o arroz possui de 5 a 8% de protenas, (base seca) (Franco, 1992). Ao usar outros substratos, a adio de uma fonte de nitrognio (especialmente N orgnico) estimula a produo de pigmentos. Segundo Lin (1991) o uso de glutamato monossdico como fonte de nitrognio estimula fortemente a produo de pigmentos, o que foi confirmado em diversos trabalhos posteriores por outros autores. O tipo de pigmento e a sua excreo pela clula so tambm relacionados fonte de nitrognio: usar nitrognio orgnico, como em aminocidos, favorece a formao de pigmentos vermelhos (Yongsmith et al, 1993; Juslov et al, 1996), e o uso de peptonas melhor para a produo de pigmento e para o crescimento

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celular, bem como para a secreo de pigmentos a pH 6,5 (Chen e Johns, 1993), embora o uso de polipeptonas favorea a formao de pigmentos amarelos (Juzlov et al, 1996). Tentou-se justificar o efeito estimulante de aminocidos sobre a produo ou liberao de pigmentos postulando que os derivados dos pigmentos, ligados a aminocidos, so mais solveis que os pigmentos originais. Na verdade, esse efeito dos aminocidos sobre a produo ou liberao de pigmentos talvez no exista, ou deva ser explicado de outra forma, j que trabalhos usando vrios aminocidos revelaram que h forte influncia, positiva ou negativa, de aminocidos diversos sobre a produo de pigmento. O derivado com leucina, por exemplo, hidrossolvel e ainda assim causa represso da produo de pigmento (Lin e Demain, 1994). O uso de nitrognio inorgnico (nitratos, amnia e seus sais) estimula o crescimento celular (Lin e Demain, 1991), embora a amnia seja melhor que o nitrato (Chen e Johns, 1993). Estudos demonstram que o uso de amnia como fonte de nitrognio pode favorecer a produo de pigmento alaranjado (Juzlov et al, 1996). Uma comparao das quantidades relativas e da qualidade de cor de pigmentos produzidos usando diversos aminocidos mostra que pigmentos amarelos e alaranjados no so afetados pela fonte de nitrognio, enquanto que os pigmentos vermelhos diferem em tonalidade e solubilidade (Jung et al, 2003). 2.4.5 Outros fatores nutricionais Diversos outros fatores podem afetar o crescimento do fungo e a produo de pigmentos. Segundo Lin e Demain (1991), altas concentraes de fosfato e de sulfato de magnsio so inibidoras da produo de pigmentos; por outro lado, o crescimento uma funo linear e crescente da concentrao de MgSO4, na faixa de 0,5-16mM. A adio de leo de milho estimula (dobra) a produo de pigmento, enquanto a adio de 0,4% de tween 80 no afeta o consumo de glicose nem retarda a taxa de crescimento, mas aumenta a produtividade de pigmento (6 a 8 vezes, atingindo 8535 unidades de absorbncia/g matria seca) (Chiu e Poon, 1993). Meios de cultivo adequados para a produo de pigmentos de Monascus so os mais diversos, desde os de composio definida at os naturais; como este fungo

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um contaminante comum em gros e isolado de diversos substratos com alta concentrao de slidos, trata-se de um fungo xeroflico (Pitt e Hocking, 1997), que cresce em uma larga variedade de substratos naturais. Alguns substratos naturais j experimentados, alm do arroz e outros cereais, so o amido de mandioca (Yongsmith et al, 1993; Lee et al, 1995; Carvalho et al, 2001), o suco de figo da ndia (Hamdi et al, 1996), e o soro de leite (Kujumdzieva et al, 1997). Em alguns casos, como no amido de mandioca, necessrio suplementar esses substratos com extrato de levedura e peptonas, como fontes de vitaminas e nitrognio orgnico. Os componentes dos meios de fermentao complexos usados, j discutidos no texto, compreendem uma srie de acares (mais comumente glicose), oligoelementos e fontes de nitrognio orgnico (aminocidos, peptonas) ou inorgnico (amnio, nitratos). Um meio usado em alguns trabalhos composto de: glucose 40g/L; NH4NO3 3 g/L; K2HPO4 1981, op.cit. em Lin, 1991). 2.5 Mtodos de fermentao A fermentao em substrato slido (FSS, tambm conhecida como fermentao em meio slido, FMS e fermentao em estado slido, FES) um mtodo tradicional de fermentao, usado h sculos para a produo de alimentos tradicionais orientais, como o prprio angkak (Pandey, 1992; Pandey et al 2000, 2001). Existem vantagens na produo de pigmentos de Monascus por FMS: o habitat mais natural para fungos (Pandey, 2001; Soccol e Vandenberghe, 2003), com alta produtividade de pigmentos em processo relativamente barato fermentao em bandejas, por exemplo. Esse mtodo o mais vantajoso quando o pigmento a ser usado pode conter resduos do substrato como amido e fibras, bem como o prprio miclio. Caso seja necessria apenas a frao corante para uso em bebidas, por exemplo o pigmento precisa ser extrado por um solvente orgnico, e em seguida o solvente deve ser evaporado, por exemplo em um spray drier. Nesse caso, pode ser interessante trabalhar com fermentao submersa, que embora apresente o pigmento diludo em um grande volume de lquido, pode ter a biomassa e outros 6g/L; KH2PO4 6g/L; MgSO4.7H2O 0,5g/L; KCl 0,5g/L; FeSO4.7H2O 10mg/L; ZnSO4.7H2O 10 mg/L; MnSO4.H2O 3mg/L; pH final 6,3 (Wong

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eventuais componentes insolveis prontamente retirados por filtrao, e em seguida pode-se efetuar a evaporao do solvente. Segundo Lee et al (1995), a produo de pigmentos de Monascus, embora tradicionalmente feita em fermentao slida, industrialmente levada a cabo em fermentadores submersos. Isso se deve ao fato de que a fermentao slida de difcil controle de aerao, umidade, temperatura e pH, enquanto que a fermentao submersa tem parmetros controlados com facilidade; uma planta de fermentao submersa flexvel pode usar o mesmo fermentador para culturas diversas, o que interessante em termos operacionais. O controle de pH, por exemplo, pode permitir o direcionamento da fermentao no sentido de favorecer a produo de pigmentos vermelhos (Santerre et al, 1995). Ainda assim, pesquisa-se modelos de reatores e mtodos de fermentao slida devido ao potencial desta forma de operao. No caso de Monascus, inclusive, obteve-se produo at 3 vezes maior de pigmentos em meio slido, comparado com meio lquido de mesma composio (Johns e Stuart, 1991). Mais recentemente, usou-se uma fermentao submersa com um bloco de amido de mandioca gelatinizado, numa tentativa de aumentar a concentrao de acares usando esse substrato, que barato e incolor. Usando o amido em um bloco, h bastante fonte de carbono disponvel, mas sem aumentar a viscosidade do meio com amido livre, o que no compromete a transferncia de oxignio, sabidamente necessria (Lee et al, 1995). Fermentaes usando mandioca e derivados em fermentao slida so alternativas ao uso de arroz (Carvalho, 2001). 2.6 Toxicidade dos pigmentos e produo de citrinina Diversos trabalhos foram j realizados com relao ao estudo da toxicidade de pigmentos de Monascus, que aparentemente so incuos nas quantidades testadas. O longo tempo pelo qual os pigmentos de Monascus j vm sendo usados depem a favor da sua toxicidade baixa ou inexistente (Lin, 1991a). Por algum tempo, desde que os fungos do gnero Monascus comearam a ser estudados sistematicamente, acreditou-se que os pigmentos produzidos apresentavam tambm propriedades antibiticas; mais tarde, verificou-se que essa atividade deve-se principalmente a outra substncia, chamada monascidina A (Wong e Koehler, 1981). Estudos posteriores mostraram que essa substncia na verdade a citrinina,

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micotoxina de ao nefrotxica produzida por diversos fungos (Blanc et al., 1995a), e que nem todas as cepas de Monascus produzem citrinina. Verificou-se ainda que a fonte de nitrognio usada pode influenciar a produo de citrinina: para a mesma cepa de M. ruber em meio sinttico com etanol, a produo de citrinina vai de 0mg/L usando metionina como fonte de nitrognio at a 100mg/L usando nitrato de amnio como fonte de nitrognio (Blanc et al., 1995). Finalmente, estudos sobre a toxicidade de fraes purificadas dos pigmentos mostraram que h atividade biolgica para os pigmentos de Monascus, especialmente os alaranjados e, em menor grau, os vermelhos (Martnkov et al., 1995). Embora no haja uma concluso definitiva sobre a toxicidade dos pigmentos e da produo de citrinina em processos industriais, diversas aes podem ser tomadas para evitar ou minorar a produo de toxinas: o uso de cepas que no produzam citrinina; o controle da fonte de nitrognio (fontes de nitrognio orgnico favorecem a produo de pigmentos vermelhos e desfavorecem a produo de citrinina); o controle das condies de cultivo (aerao, pH, fermentao slida ou submersa); a transformao de pigmentos laranja em complexos vermelhos, atxicos, usando aminocidos (Blanc et al., 1995, 1995a; Juzlov et al.,1996) e a extrao em condies de baixa solubilidade de citrinina, o que pode ser feito controlando-se o pH, j que a citrinina apresenta carter fortemente cido (Merck, 1996). 2.6.1 Citrinina propriedades e anlise A citrinina um metablito fngico conhecido desde 1931, quando foi isolada de Penicillium citrinum e mais tarde da planta australiana Crotolaria crispata. Dez anos mais tarde foi caracterizada como um antibitico e antibacteriano, e mais tarde testada para atividade contra bacterifagos, sarcomas, protozorios, clulas animais e clulas de plantas superiores. A citrinina foi implicada na nefropatia porcina e foi encontrada como contaminante de milho, arroz, trigo e outros cereais, e em tomates podres. Assim, a citrinina uma micotoxina potencialmente importante que pode ser ingerida por animais e pelo homem e poderia causar doenas. Em adio, efeitos fitotxicos da citrinina foram reportados (Betina, 1984). A estrutura da citrinina ilustrada a seguir (Figura 7):

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Figura 7 Estrutura da Citrinina

O HO C O

OH O CH3 CH3 CH3

A citrinina tem carter cido pronunciado, praticamente insolvel em gua, solvel em lcool a quente, dioxano e solventes apolares. Devido s duplas ligaes conjugadas, a citrinina absorve luz no comprimento de onda visvel a sua colorao varia de amarelo-limo em pH 4,6 a vermelho-cereja em pH 9,9 e seus mximos de absoro encontram-se na faixa de ultravioleta: 250 e 331nm. Apresenta ponto de fuso 175C e massa molar 250,25 g/mol (Merck, 1996). Derivados da citrinina como decarboxicitrinina tm funo metablica desconhecida, mas diversos estudos em sistemas in vivo e in vitro indicam que a citrinina em si possui ao biolgica pela inibio da sntese de colesterol e triglicerdeos, esta inibio sendo possivelmente causada por danos a sistemas de transporte e/ou interferncias no metabolismo energtico (Betina, 1984). A produo da citrinina se d de forma incidental em cereais contaminados por fungos, ou no apodrecimento de frutas. uma das toxinas microbianas menos comuns como contaminante em safras do Ocidente, se comparada com aflatoxinas e ocratoxinas, embora aparea como metablito secundrio em algumas cepas de microorganismos comuns no Oriente. A produo proposital se d em meios lquidos, em condio esttica ou submersa, e em cereais por fermentao slida. A ordem de produo em cultura esttica, para P. citrinum de at 1,75g/L em meio com 4% de sacarose e 2% de extrato de levedura, inoculados com suspenses de esporos de culturas com 10 a 14 dias. A produo mxima de citrinina se d aps 21 dias de fermentao. (Davis et al., op.cit. em Betina, 1984). A anlise da estrutura da citrinina mostra que, em meio bsico, a citrinina pode ter at dois grupos OH ionizados, o que aumenta a sua solubilidade em gua, e em meio cido deve possuir os grupos no ionizados (Figura 7). Assim, acidificase o meio a pH 4,5 e extrai-se com um solvente apolar. Esse solvente dissolve

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tambm os lipdios e outros compostos apolares, de forma que uma purificao posterior necessria. Essa purificao pode ser feita atravs de cromatografia preparativa em camada delgada, em que a toxina pode ser identificada pelo ndice de reteno e pela fluorescncia caracterstica em luz UV (ultravioleta). A anlise de citrinina em culturas slidas de fungos filamentosos pode ser feita pela extrao direta com acetonitrila. O extrato, aps filtrao, desengordurado duas vezes com isooctano. Aps a adio de um volume igual de gua e acidificao a pH 4,5 com cido sulfrico 50% (v/v), o extrato particionado com CHCl3. A fase inferior evaporada at a secura, redissolvida em metanol (Blanc et al., 1995). A anlise da soluo pode ser feita por HPLC, mas a tcnica inicial mais simples a cromatografia em camada delgada (CCD). Anlise qualitativa: por CCD. A fase fixa compe-se de placas de slica gel 60 com espessura 0,2mm, impregnadas antes do uso com cido oxlico (soluo a 10% em metanol). Padres e amostras da soluo so colocados usando micropipetas com ponteiras descartveis (de 5L). O desenvolvimento da amostra pode ser feito em uma dimenso usando clorofrmio-acetona (90:10, v/v) ou em duas dimenses (clorofrmio-acetona 90:10, depois tolueno-acetato de etila-cido frmico 60:30:30 v/v/v) (Blanc et al., 1995a). Anlise quantitativa: por espectrofotometria ou HPLC. Aps a identificao, por fluorescncia em luz UV, da citrinina (comparada com um padro na mesma placa ou pelo clculo do tempo de reteno, de 0,6) a citrinina pode ser isolada da fase estacionria pelo cuidadoso corte da placa de alumnio e a ressuspenso da amostra em solvente adequado, por exemplo CHCl3, e a anlise contra uma curva padro de citrinina no mesmo solvente, para 250 ou 331nm (Blanc et al., 1995a). 2.7 Mtodos de anlise de pigmentos A anlise da produo de pigmentos de Monascus geralmente feita pela medida da absorbncia do pigmento nas faixas prximas a 400, 470 e 500nm para pigmentos amarelos, alaranjados e vermelhos respectivamente (Johns e Stuart, 1991; Lin 1992). A relao absorbncia a 500nm /absorbncia a 400nm d, supostamente, a relao entre pigmento vermelho e amarelo (Wong e Koehler, 1981). Alguns autores analisam pigmentos totais extracelulares e intracelulares

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somando as absorbncias de pigmentos extracelulares ( medida a absorbncia do meio de cultivo lquido, filtrado) e intracelulares ( medida a absorbncia de um extrato etanlico do miclio, filtrado) (Lin, 1991; Juzlov et al., 1994). Quando se trata de fermentao slida, o mtodo usado tem de ser a extrao por solvente para posterior leitura da absorbncia. A quantidade de solvente usada , geralmente, de 5mL de solvente para cada grama de material fermentado, e o tempo de extrao varia de 1 a 12h, dependendo do autor. Como as amostras precisam em muitos casos ser diludas para que se faa a leitura, os valores de absorbncia no devem ser diretamente comparados e podem ser extrapolados para absorbncia especfica, levando em conta o fator de diluio da amostra (Chiu, 1993). A separao dos pigmentos pode ser feita usando CCD (cromatografia em camada delgada) com slica gel 60 e desenvolvendo o cromatograma com clorofrmio:metanol:cido actico 285:21:9 (Carels, 1977, op. cit em Martnkov, 1995). Os pigmentos podem tambm ser analisados por cromatografia lquida, usando uma coluna C18 e um detector adequado. Note-se que a solubilidade do pigmento vermelho mais elevada em uma soluo aquosa contendo 60-70% de etanol (Carvalho et al., 2002). Outros solventes podem ser usados (acetonitrila, dimetilsulfxido, isopropanol), mas o nico solvente comum que extrai pigmentos melhor que o etanol o metanol que, porm, no recomendado para uso alimentcio por ser txico. O fato de que os pigmentos amarelos, alaranjados e vermelhos de Monascus so produzidos como uma mistura provavelmente afeta a anlise por simples medida de absorbncia. No entanto, a grande maioria dos pesquisadores de Monascus estimam a produo de pigmento por esse mtodo, com produes de pigmento variando na faixa de centenas de unidades de absorbncia/mL de meio de cultivo em fermentaes submersas (por exemplo, 220 UA510/mL, em condies timas, por Kim et al, 2002, a milhares de unidades de absorbncia/g de substrato seco, em FSS (por exemplo, 5430 UA500/g matria seca, por Lin e Demain [1992]). O melhor procedimento para a anlise de pigmentos provavelmente a cromatografia lquida, que permite separar e quantificar pigmentos individuais; usando este mtodo, Hajjaj (2000) determinou que 1 unidade UA480 correspondente a 15 mg/L de pigmento vermelho com M = 498 g/mol, e usou essa equivalncia para converso de medidas de absorbncia de extratos em medidas de massa de pigmentos.

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2.8 Uso e estabilidade de pigmentos de Monascus Surpreendentemente, poucos trabalhos tratam da estabilidade de

preparaes base de Monascus, considerando que diversas indstrias produzem esse pigmento. Alguma documentao pode ser obtida por consulta ao site www.allok.com. De acordo com Lin e Demain (1992), esses pigmentos so razoavelmente estveis autoclavagem e em uma ampla faixa de pH. De acordo com Fabre (1993), molhos ou pats coloridos com pigmentos vermelhos de Monascus apresentam uma cor residual de 92 a 98% aps trs meses a 4 C, com boa aceitao sensorial. Os pigmentos so, no entanto, instveis frente luz (apenas 20% de cor residual aps 50 dias) e calor (45% de cor residual aps 2h a 100 C). Esses pigmentos so mais estveis em pH bsico ou neutro (Fabre et al., 1993; Lee e Chen, 2000). 2.9 Mtodo de anlise de biomassa Na fermentao em estado slido geralmente no possvel fazer uma determinao direta da biomassa, devido impossibilidade de separar eficientemente a biomassa da matriz do substrato, o que descarta os mtodos gravimtricos. A biomassa pode ser medida de forma indireta pela determinao de componentes celulares como a glicosamina (presente na quitina, componente da parede celular de fungos), do ergosterol (presente na membrana celular), de protenas ou de cidos nuclicos (Pandey et al., 2001). possvel ainda estimar a biomassa produzida atravs de um balano de CO2, levando em conta a composio da biomassa e estequiometria do processo. Nas anlises por componentes celulares, necessrio levar em conta as possveis interferncias da composio do substrato: por exemplo, em fermentaes usando quitina como parte do substrato, haver provvel interferncia na anlise de glicosamina; de forma semelhante, a anlise de protena sofre interferncia das protenas do substrato, especialmente quando no h adio de fontes de nitrognio. O ergosterol (Figura 8) um componente celular que pode ser vantajosamente utilizado para a determinao indireta de biomassa fngica, devido sua facilidade de extrao e anlise. Esse componente comumente quantificado para a determinao de biomassa fngica em solos, porque o esterol mais

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importante na membrana celular de fungos e de algumas microalgas (Gong et al., 2001), mas praticamente ausente em plantas e animais superiores (Mattila et al., 2002). A anlise de ergosterol foi proposta inicialmente para estimar a contaminao de cereais por fungos, mas logo foi adotada como um mtodo para estimar a biomassa fngica viva em solos, pressupondo que o ergosterol um marcador lbil, que sofre rpida decomposio aps a morte da clula.
Figura 8 - Estrutura do ergosterol

HO
Outra aplicao para a dosagem de ergosterol a determinao de biomassa e de esporos em superfcies de materiais paredes, tijolos, etc. Em trabalhos recentes, determinou-se que o ergosterol no lbil persistindo em quantidades importantes dependendo das condies a que submetido o que exige cuidado quando se pretende us-lo como marcador para clulas vivas (Lindblom et al., 2004, Zhao et al., 2004). Isso, no entanto, refora a utilidade em FMS, j que se garante a quantificao da biomassa total, com a permanncia do ergosterol durante o processo. A extrao do ergosterol varia dependendo do grupo de pesquisa, mas de uma forma geral baseia-se no mtodo de Seitz et al. (1979), que consiste em extrair os lipdios de uma amostra (de gros) com metanol em refluxo, saponificar a amostra com soluo de KOH a 70 C por 30 min e fazer uma nova extrao com um solvente apolar, como o ciclohexano. Na tentativa de acelerar a extrao, diversos autores usaram tratamentos trmicos ou mecnicos alternativos, com bons resultados por exemplo, aquecendo o material em um forno de microondas (Montgomery et al., 2000), situao em que a temperatura aumenta muito rapidamente e a recuperao de ergosterol quase total. Outro mtodo consiste na

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agitao em vrtex da amostra com metanol e prolas de vidro, seguida de centrifugao - sem saponificao ou extrao posterior (Gong et al, 2001), com recuperao de 100%; outro trabalho usa o mtodo de Seitz, mas substituindo o aquecimento em refluxo pela sonicao da amostra, seguida de resfriamento e saponificao (Zhao et al., 2004). Para amostras secas (liofilizadas), a extrao com hexano pode ser feita antes da saponificao, como em Klamer e Bth (2004). A anlise do ergosterol nos extratos feita em geral por HPLC, com detector PDA (matriz de fotodiodos) a 282nm, que o maior pico de absorbncia para o ergosterol. A Tabela 4 mostra as condies de anlise para algumas referncias selecionadas:
Tabela 4 Condies de anlise de ergosterol em HPLC Coluna C18 C18 C18 4 m C18 5 m C18 Fase mvel (V/V) Acetonitrila : metanol 98:2 Metanol Metanol Metanol Acetonitrila metanol (gradiente) Vazo, mL/min 2 1,0 1,5 1 2 Tr, Referncia min Montgomery (2000) 15 Gong (2001) 7-8 Zhao (2004) 12,5 / Lindblom (2004) 13,7 12 a Este trabalho 13

ainda possvel estimar a quantidade de ergosterol pela anlise usando um espectrofotmetro, como fizeram Gutarowska e Zakowska (2002), embora isso inclua a absorbncia por eventuais contaminantes, e exija, portanto, uma consistente extrao prvia. O teor de ergosterol varia bastante para diferentes espcies de fungos: na faixa de 3 a 5 mg/g biomassa seca em alguns basidiomicetos (Matilla et al., 2002), 4 mg/g biomassa seca em alguns actinomicetos (Montgomery et al., 2000) e em mdia 3,1 mg/g biomassa seca (numa faixa de 1 a 24 mg/g biomassa seca) para uma srie de fungos presentes em composto, mais 2 basidiomicetos (Klamer e Bth, 2004) No caso especfico de Monascus em FMS sobre arroz, a anlise de biomassa via quantificao ergosterol um mtodo prtico, j que a de nitrognio protico invivel pois o prprio substrato possui um teor de protenas da ordem de 1%, que seria convertido parcialmente biomassa e necessariamente quantificado indistintamente com a mesma. A anlise de glicosamina, alm de tediosa, feita a 530 nm (Germano, 2000), podendo sofrer interferncia dos pigmentos de Monascus.

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3 MATERIAL E MTODOS Todos os experimentos descritos neste trabalho foram realizados no Laboratrio de Processos Biotecnolgicos (LPB) da Diviso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da UFPR. 3.1 Cepas e Manuteno Um total de 4 cepas (linhagens) de Monascus foi utilizado neste trabalho: duas cepas fornecidas pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, NRRL 1991 (Monascus. sp) e NRRL 2897 (M. purpureus), uma cepa fornecida pela Fundao Andr Tosello, CCT 3802 (M. purpureus), e LPB 31, uma cepa isolada no LPB da UFPR atravs da tcnica de repiques sucessivos em meio PDA, at obteno de uma cultura pura, a partir de miclio de Monascus sobre arroz. A manuteno foi feita atravs de repiques peridicos (em intervalos de 3 a 4 meses) em PDA, com incubao a 30-32 C durante 10 dias e refrigerao no perodo subseqente, at o repique seguinte. 3.2 Preparao de inculos Para as fermentaes, dois tipos de inculos foram usados, dependendo do experimento: 1) inculo em meio lquido, para inoculao de fermentaes em meio lquido (com volume superior a 500mL), fermentao em frascos para comparao de substratos, e fermentaes em bandeja, e 2) suspenso de esporos/miclio extrados de culturas em placa de Petri, para as fermentaes em colunas, frascos, reator e culturas lquidas em erlenmeyer. 3.2.1 Inculos em meio lquido Foram obtidos pela inoculao com suspenso de esporos (obtidos de culturas em gar PDA), de meio lquido com composio conforme Lin e Demain, 1991: para 1 litro de meio, so adicionados 40g de glicose, 3g de NH4NO3, 6g de K2HPO4, 6g de KH2PO4, 0,5g de MgSO4.7H2O, 0,5g de KCl, 10mg de FeSO4.7H2O, 10mg de ZnSO4.7H2O, 3mg de MnSO4.H2O, pH ajustado com NaOH ou HCl a 5,5-

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6,3; aps inoculao, o meio incubado por 3 dias a 100rpm e 32 C, em shaker, e utilizado para inoculao na proporo de 5% em relao massa ou volume do meio de cultivo a inocular, imediatamente antes do perodo de incubao, por transferncia com pipetas (para meios slidos) ou bomba peristltica (para fermentador de bancada). 3.2.2 Suspenses de esporos Estes inculos foram preparados imediatamente antes do seu uso, e obtidos a partir das culturas-estoque por inoculao, com ala metlica, sobre gar PDA estril, em placas de Petri, e incubadas por 8 a 10 dias. Aps a incubao, foi feita a suspenso de esporos atravs da adio de 5 mL de Tween 80 a 0,1% sobre as placas, com o auxlio de uma ala de Drigalski. As suspenses de esporos foram padronizadas pela adio de gua, para 0,5 a 1.106 esporos/mL, contando como esporos os prprios esporos e tambm fragmentos miceliais intactos. A contagem foi feita por microscopia, utilizando-se uma cmara de Neubauer (Leica DMLS). Os inculos foram transferidos aos frascos ou colunas em que foram feitas as fermentaes, usando pipetas, com posterior homogeneizao do meio. A taxa de inoculao utilizada foi equivalente a 5% do volume (em fermentao lquida em erlenmeyer) ou da massa (em FSS) do material a fermentar. Por exemplo, em FSS de 20g de arroz em frascos foi utilizado 20 x 5% = 1mL de suspenso de esporos. 3.3 Comparao de cepas 3.3.1 Determinao de crescimento radial O crescimento radial das linhagens foi medido inoculando-se placas com meio PDA com as respectivas linhagens, em um nico ponto no centro de cada placa, em duplicata (8 placas). As placas foram incubadas a 30 C, por 12dias. A medida das colnias foi feita com rgua, a partir do centro da placa, ao longo de 2 eixos perpendiculares (4 medidas por placa), a intervalos de cerca de 24h. Os valores obtidos foram usados para compor valores mdios (mdia aritmtica) de comprimento x tempo de incubao.

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3.3.2 Comparao de cepas quanto produo de pigmentos A comparao foi feita incubando 10g de meio (arroz com 56% de umidade ou bagao de mandioca com 70% de umidade) a 32 C em frascos de vidro de 600mL, aps inoculao com suspenses de esporos das diferentes cepas, por 8 dias (arroz) e 10 dias (bagao de mandioca). Aps a incubao, os fermentados foram secos, e determinou-se o teor de pigmentos (mtodo na pgina 39) e de citrinina (mtodo na pgina 40). 3.4 Comparao de mtodos de extrao 3.4.1 Extraes esttica, agitada, com Soxhlet, com diferentes solventes Como trata-se de desenvolvimento de mtodo, os mtodos utilizados encontram-se na seo Resultados e Discusso (pgina 48). Os solventes utilizados foram dimetil sulfxido (DMSO, (CH3)2SO); n-hexano, ter etlico, lcool etlico, acetonitrila, metanol, clorofrmio e isopropanol. Todos os solventes utilizados eram PA. A gua utilizada para extraes era deionizada. Quando necessrio, o pH da gua foi ajustado com HCl ou NaOH. 3.5 Substratos utilizados Alm dos meios de cultivo utilizados para inculos (vide seo anterior), foram usados os seguintes meios, dependendo do objetivo do experimento: 3.5.1 FSS em arroz, em coluna, frasco ou bandeja Arroz cateto integral umedecido com gua deionizada, at 56% de umidade, com ajuste do pH para 6,5 com adio de HCl ou NaOH, e posterior autoclavagem a 121 C por 15 minutos. O ciclo da autoclave garante o cozimento do arroz e a gelatinizao do amido, mas para melhores resultados necessrio permitir que o arroz absorva parte da gua antes da esterilizao, deixando-o em repouso por 2 a 4 horas. O meio de cultivo assim preparado deve ser usado logo depois do resfriamento, para evitar aglutinao excessiva. O mtodo tradicional de preparo de inculo consiste em deixar o arroz de molho em gua, por 24h, e posteriormente

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cozinh-lo com vapor (Palo et al, 1960; Wong e Koehler, 1981); esse mtodo, embora eficiente, inconveniente para os ensaios com umidade controlada, devido impossibilidade de controlar a absoro de vapor pelo arroz. 3.5.2 FSS em bagao de mandioca, em coluna, frasco ou bandeja Bagao de mandioca com granulometria entre 0,8 e 2,0 mm, adicionado de gua deionizada at 70% de umidade, com ajuste de pH para 6,5 com adio de HCl ou NaOH e posterior esterilizao em autoclave por 15 min a 121 C. 3.5.3 FSS de diferentes substratos potenciais, em frascos Foram usados como substratos quirera de milho, quirera de arroz, trigo para quibe, soja moda, farelo de soja, protena texturizada de soja, tapioca, mandioca crua, bagao de mandioca, farinha dgua e batata seca. Esses substratos foram modos e classificados por peneiramento, utilizando-se a frao de granulometria entre 0,8 e 2,0mm. Os meios foram preparados pela mistura de 10g de substrato com gua suficiente para completar 56% de umidade, ajustando o pH para 6,5 quando necessrio e prosseguindo com a esterilizao a 121 C por 15 min. Os experimentos foram feitos em triplicata, inoculados com 5% v/m de uma cultura ativa em meio lquido (Lin e Demain, 1991) e incubados a 30-32C por 8 dias. 3.6 Otimizao das condies de cultivo em bagao de mandioca Para os planejamentos experimentais descritos na seo Resultados e Discusso (item 4.5.3) foram utilizados meios preparados com bagao de mandioca de granulometria 0,8-2,0 mm, adicionados de levedura seca (fermento biolgico Burgemann) e protena texturizada de soja, micronizada com um moinho de lminas no LPB. Os componentes dos meios foram adicionados a frascos de vidro de 600mL, autoclavados e inoculados com suspenses de esporos, e incubados por 10 dias a 32 C. A anlise de pigmentos foi feita como descrito no mtodo da pgina 39.

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3.7 Ensaios de estabilidade de pigmentos Os pigmentos usados para ensaios de estabilidade foram extrados de biomassa pura, obtida de uma fermentao lquida. O inculo para esta fermentao foi uma cultura ativa de 3 dias, em meio lquido (conforme descrito na pgina 33). A fermentao foi feita em um fermentador Bio-Flo de 15L, com 12L de meio lquido, com um aerao de 10 NLPM (litros normais por minuto, isto , a aerao equivalente a 10 litros de ar a 0 C e 1atm, por minuto), controlado atravs de um rotmetro com vlvula. A agitao foi de 100 rpm, a 32C, por 10 dias. O meio utilizado foi o de Lin e Demain (1991). 3.7.1 Isolamento da biomassa Aps o cultivo, o meio de fermentao foi filtrado atravs de um filtro de tecido, e a biomassa lavada com gua deionizada, drenada e congelada a -20 C. Essa biomassa foi posteriormente utilizada para os ensaios de estabilidade de pigmentos. 3.7.2 Preparao de extratos Uma amostra de 5g de biomassa drenada e congelada foi misturada com 25_mL de etanol 95%. Aps 1h de extrao com agitao peridica, a mistura foi filtrada atravs de uma membrana de 0,47m, e o filtrado foi usado como extrato bruto de pigmentos. 3.7.3 Solues de pigmentos Um volume de 5mL do extrato alcolico bruto foi diludo com gua suficiente para completar 500g. A partir dessa soluo, foram preparadas outras solues com a mesma concentrao, mas com pH ajustado a valores diversos 4,1; 4,7; 6,0; 7,3 e 7,9 pela adio de solues de NaOH ou HCl. A diluio causada pela adio de cido ou base foi estimada como sendo da ordem de 0,5% em peso. Uma soluo alcolica foi preparada de forma similar, diluindo 1mL de extrato alcolico bruto em lcool 95%, at um volume final de 100mL.

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3.7.4 Anlises de estabilidade As solues aquosas e alcolicas foram armazenadas em tubos de ensaio de mesmo tamanho, cor e espessura, com tampa, e incubadas a diferentes temperaturas por vrias horas. A intensidade de cor foi lida como absorbncia a 500nm, diretamente para cada tubo, contra gua como branco. Com esse procedimento, evitou-se a alterao da absorbncia dos extratos por transferncias sucessivas para a cubeta de leitura do espectrofotmetro. Os resultados foram normalizados dividindo a absorbncia obtida para cada tubo ao longo da incubao, pela absorbncia inicial nesse mesmo tubo. 3.8 Extrao de pigmentos e anlise da absorbncia Os pigmentos de Monascus foram extrados de meios fermentados por FSS ou de biomassa separada por filtrao de fermentados de FL. O solvente utilizado foi etanol a 95%, exceto para experimentos de comparao de solventes. A proporo de etanol:fermentado utilizada foi de 5mL etanol para cada grama de fermentado seco, ou maior (quando se desejava realizar uma diluio do pigmento no mesmo passo da extrao), exceto para ensaios de proporo solvente:substrato na extrao. O tempo de extrao foi de 12 a 24h, em extrao esttica. A produo de pigmentos nos experimentos foi estimada atravs da leitura da absorbncia a 500nm (expressa como UA, unidades de absorbncia). Os valores obtidos para ensaios em condies idnticas podem ser comparados diretamente, apenas corrigindo o valor de absorbncia para a diluio. Se for necessrio comparar ensaios diferentes (inclusive quando varia o inculo de uma duplicata de experimento), os resultados devem ser transformados em uma absorbncia especfica, isto , corrigidos pela diluio e pela quantidade de fermentado do qual se extraiu o pigmento. A Figura 9 ilustra um exemplo em que 1g de meio fermentado extrado, filtrado, diludo e analisado.

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Figura 9 Procedimento de extrao e anlise de pigmentos de Monascus para determinao da produo de pigmentos vermelhos
5mL Amostr extrao esttica de Diluio: suficiente para

12-24h de

Meio fermentado, 10g de o Filtra e/ou

Ler absorbncia

a da

A leitura de absorbncia dos extratos dos diversos ensaios foi feita no comprimento de onda de 500 nm, correspondendo a um mximo de absorbncia para os pigmentos vermelhos (Johns e Stuart, 1991; Lin e Demain 1992), aps filtrao com membrana (0,47 m) ou centrifugao por 15 min a 10.000g. Quando necessrio, os extratos foram diludos com etanol. A absorbncia obtida foi corrigida contra branco (etanol 95%) e multiplicada pela diluio, pelo volume de solvente usado na extrao e dividida pela massa seca inicial de substrato, para fornecer o que chamamos de absorbncia especfica. Por exemplo, para uma extrao de 10g de fermentado seco, extrado com 50mL de etanol 95%, diludo a 1:20 e com a absorbncia da amostra sendo 0,354: ABS especfica = 0,354 x 20 x 50 / 10 = 35,4 UA/g sendo o resultado dado em UA/g, unidades de absorbncia por massa seca de substrato. Esse resultado comparado diretamente para diferentes experimentos, sendo considerado como proporcional quantidade de pigmentos vermelhos produzidos na fermentao (Johns e Stuart, 1991; Lin e Demain, 1992; Chiu e Poon, 1993). Embora a maioria dos pesquisadores de Monascus trabalhe com a produo de pigmentos expressa como UA/frasco ou UA/g fermentado seco, alguns pesquisadores especialmente os que utilizam fermentao lquida convertem os valores de UA em massa de pigmento. Hajjaj et al. (2000) consideram que 1UA480 ~ 15mg/L. A partir dessa considerao, pode-se concluir que a absorbncia especfica do pigmento puro de 66,7kUA/g pigmento. Usando esse fator de converso para estimar a massa de pigmentos em FSS, possvel comparar a produo obtida em experimentos usando FSS (onde a produo de

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pigmentos geralmente expressa em funo da absorbncia) com resultados de fermentao submersa (onde a produo expressa como concentrao em mg/L). A absorbncia relativa , dentro de um conjunto de valores de absorbncia especfica, a porcentagem em relao ao valor mais alto. 3.8.1 Extrao de pigmentos na comparao de substratos Os meios fermentados foram secos a 55 C por 24h, seguindo-se extrao esttica com etanol a 95% por 12h, e finalmente centrifugao dos extratos a 10000g por 15 minutos para precipitar partculas. Quando necessrio, as amostras foram diludas para permitir leitura no espectrofotmetro. 3.9 Extrao e anlise da citrinina 3.9.1 Extrao Para verificar a produo de citrinina nas culturas de Monascus, necessrio efetuar uma extrao; o mtodo consiste em efetuar uma extrao aquosa a partir das culturas slidas, deixando-as por 1h em contato com gua, sob agitao a 100_rpm, na proporo de 10 mL de gua/ g de substrato seco original. O extrato filtrado e extrado duas vezes com 10 mL de n-butanol saturado com gua. A fase orgnica , em seguida, seca com Na2SO4 anidro, e a soluo concentrada por secagem a vcuo (a uma temperatura mxima de 45 C). O resduo seco redissolvido em 50 mL de gua deionizada, que acidificada at pH 2 (medido com papel de pH universal), usando HCl 3M. A soluo extrada 2 vezes com acetato de etila (2x10mL), seca com Na2SO4 e evaporada sob vcuo reduzido, e finalmente ressuspendida em metanol (500 L/g de substrato seco original) para anlise cromatogrfica. 3.9.2 Cromatografia preparativa de citrinina Para separar melhor a frao correspondente citrinina no extrato em anlise, procedeu-se aplicao de uma alquota de 200 L de soluo metanlica em placas de slica gel 60 (Merck & Co, NJ EUA) em paralelo com um alquota de

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50 L de citrinina 2000ppm em metanol. A corrida foi feita com uma mistura gua metanol 1:1 (v/v) acidificada com HCl (pH 3). A regio da placa contendo a frao correspondente citrinina foi recortada, ressuspendida em metanol (2mL), filtrada, evaporada at secagem, ressuspendida em 20 L de metanol e injetada como amostra no HPLC. 3.9.3 Anlise de citrinina Aps a extrao, o resduo ressuspendido que pode conter citrinina analisado por cromatografia em HPLC usando uma coluna C18 com um gradiente de concentrao de H2O/MeOH temperatura ambiente, com vazo de 0,8mL/min, com a leitura sendo feita a 260 nm. (Blanc et al., 1995a). O padro de citrinina usado para comparao foi citrinina PA, Sigma. 3.10 Anlise de biomassa em FSS Foi utilizado 1g de amostra de cada coluna sob anlise (as mesmas amostras usadas na respirometria). 3.10.1 Preparo de padro de biomassa Foram preparados 100 mL de meio lquido (Lin e Demain, 1991), que foram em seguida autoclavados e inoculados com um pedao de miclio em gar (cerca de 0,5 cm2), incubado sob agitao (120 rpm) por um dia e de forma esttica por mais 7 dias, a 32 C. 3.10.2 Extrao da biomassa A biomassa obtida na fermentao anterior foi filtrada em papel e seca a 40 C em dessecador com slica gel como adsorvente, por 12 horas. 3.10.3 Extrao do ergosterol Mtodo adaptado de Seitz (1979): 0,5 g das amostras de fermentado e 0,4 g de biomassa seca foram colocados em frascos de vidro, aos quais adicionou-se 2mL

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de etanol P.A. e 1 mL de soluo de NaOH 2M. Os frascos foram agitados, tampados e incubados a 70 C por 30 min., com agitao peridica. Aps a incubao, adicionou-se a cada frasco 2mL de cido clordrico 1M, agitou-se, adicionou-se 1mL de KHCO3 1M e 2 mL de n-hexano. A mistura foi agitada, transferida para um tubo de ensaio e centrifugada para separar as fases leve e pesada. A fase leve (n-hexano) foi recolhida, e procedeu-se a nova extrao com mais 2mL de n-hexano, e uma ltima extrao com 1mL de n-hexano. O extrato na fase orgnica foi evaporado a vcuo (200mmHg) a 35 C, ressuspendido em 200mL de n-hexano e filtrado em membrana de PVDF. 3.10.4 Anlise do ergosterol A anlise dos extratos foi feita em um HPLC Varian ProStar, com coluna C18 e detetor PDA (matriz de fotodiodos) regulado a 282 nm. As condies de eluio do analito foram desenvolvidas a partir de Montgomery et al., (2000); Gong et al., (2001); Zhao et al., (2004); e Lindblom et al., (2004) e ajustadas para o equipamento usado no LPB. Utilizou-se 10 L de amostra. A fase mvel utilizada foi metanol puro (de 0 a 3 min), acetonitrila pura de 3 a 10 minutos, e metanol puro de 10 a 15 minutos com vazo de 2mL/min, para eluir outros componentes presentes na amostra. O tempo de reteno obtido foi de 3,35 minutos. Como amostra padro foi utilizada uma soluo de ergosterol PA a 10000 g/mL , com diluies a 5000 e 1000 g/mL. Como amostra para a linha base utilizou-se 10 mL de hexano puro. 3.11 Anlise respiromtrica 3.11.1 Respirometria em colunas Com o objetivo de determinar parmetros cinticos de crescimento e produo de pigmentos por Monascus LPB 31, foi utilizado um sistema de fermentao em colunas, com banho de temperatura controlado a 32 C. Foram utilizadas 10 colunas, contendo 60g de arroz com 53% de umidade inicial + 3 mL de inculo lquido com 2,5.106 esporos/mL (aumentando portanto a umidade para cerca de 56%). O meio de cultivo inoculado foi pesado dentro de uma cmara de fluxo

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laminar. As colunas foram fechadas em ambas as extremidades com filtros de algodo, e ligadas a umidificadores para saturar o ar com umidade. A aerao utilizada foi de 1NmL.min-1.g-1 de substrato para cada coluna, medido usando-se um rotmetro; a temperatura foi controlada em 32 C. O CO2 produzido e o O2 consumido pelas culturas foram medidos atravs de um sistema de cromatografia gasosa (Shimadzu GC-8A, Shimadzu Co., Japo) acoplado a um programa de controle do cromatgrafo, integrao e registro dos resultados (Chroma Biosystmes, Ltd., Frana). A coluna utilizada no cromatgrafo foi uma Porapak 80/100 a 60 C, com 2m de comprimento, com hlio como gs de arraste e detector de condutividade trmica. medida que os meios foram fermentando, as colunas foram retiradas uma a uma, a intervalos de cerca de 24h, e congeladas a -20 C em freezer para posterior anlise. Antes das extraes, os fermentados das colunas foram secos a vcuo (10mmHg) a 45 C por 24 horas, para posterior anlise dos pigmentos e da biomassa (via anlise do ergosterol). 3.11.2 Respirometria em reator Uma segunda anlise respiromtrica foi feita usando um reator desenvolvido no LPB, com 2400g de arroz com 56% de umidade, fermentado com uma temperatura controlada em 32 C. Amostras foram retiradas diariamente do reator e congeladas a -20 C em freezer, para posterior secagem a vcuo (10mmHg) a 45 C por 24 horas. Para este experimento foi feito o mesmo acompanhamento e anlises feitas para o sistema em coluna, exceto a anlise de biomassa. 3.12 Clculos - Regresso, ajuste de curvas e parmetros cinticos Quatro programas de computador foram utilizados para a determinao dos parmetros cinticos, superfcies de resposta, etc. Para os grficos de planejamento experimental YEA-PTS-H2O foi utilizado o software Statistica 4.3 (STATSOFT). Para os ajustes sigmoidais de biomassa e pigmentos foi utilizado o software Origin Pro 6.1 (OriginLab); para ajustes de regresso linear e demais grficos foi utilizado o software Excel 2002 (Microsoft). Para determinao de parmetros cinticos, de acordo com Pandey et al. (2001), foi utilizado o programa FERSOL (RodriguezLen,_1988).

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4 RESULTADOS E DISCUSSO 4.1 Isolamento e caracterizao do microorganismo. A linhagem LPB 31 foi isolada a partir de arroz contaminado com fungos vermelhos. Pores do miclio e esporos foram retirados da amostra com uma ala metlica, e inoculadas em um tubo com gar PDA inclinado, com incubao a 28 C. Aps o crescimento, uma alada do miclio foi repicada em gar PDA, que foi incubado novamente. O processo foi repetido sucessivamente at a obteno de culturas de aspecto homogneo, consideradas como culturas puras. A observao dessas culturas revela que o microorganismo isolado apresenta as caractersticas tpicas de culturas de Monascus, isto : colnias planas, com algum desenvolvimento areo, miclio inicialmente branco, ganhando pigmentao ao longo do envelhecimento (do centro para a borda), pigmentao caracterstica pardo-avermelhada, com difuso de pigmentos pelo gar. A Figura 10a mostra uma placa de gar PDA com algumas colnias bem desenvolvidas. Nota-se um halo de pigmentao, bem difundido por quase toda a placa, e o aspecto floculento do miclio areo.
Figura 10 (a) aspecto macroscpico e (b,c) microscpico, com aumento de 400 vezes, da cepa LPB 31 aps 7 dias, em PDA a 30 C

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O exame microscpico mostra um miclio com pigmentao pardoavermelhada, cleistotcios com paredes finas e ascsporos hialinos de forma ovalada. A Figura 10b mostra uma poro isolada do miclio areo, com a formao de aleuriocondias terminais, piriformes e isoladas. A Figura 10c mostra um cleistotcio intacto e outro rompido, com a liberao de esporos. O aspecto das culturas da linhagem isolada em placa tambm remete a outras espcies de Monascus, inclusive pela produo de pigmentos de colorao tpica. A Figura 11 mostra as 4 linhagens de Monascus usadas neste trabalho, incubadas a 30-32 C.
Figura 11 Diferentes linhagens de Monascus em PDA, incubadas por 8 dias a 30-32 C

4.2 Comparao de cepas As quatro cepas de Monascus utilizadas foram comparadas quanto velocidade de crescimento em PDA, medido atravs do crescimento radial (Figura 12) e pela produo de pigmentos vermelhos em arroz e em bagao de mandioca, aps 7 e 11 dias de fermentao, respectivamente.

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Figura 12 raio mdio das colnias (mm) x tempo de incubao (h) para as linhagens comparadas
40 35
raio mdio das colnias, mm

raio mdio x tempo

30 25 20 15 10 5 0 0 50 100 150
tempo de incubao, h

1991 2897 3802 LPB31

200

250

300

A anlise do grfico mostra que as linhagens 1991, 2897 e LPB 31 desenvolvem-se de forma comparvel, com tamanho de colnia um pouco maior para LPB 31, enquanto a linhagem CCT 3802 apresenta colnias cerca de 30% menores. Os resultados da Figura 12 mostram que a cepa isolada, LPB 31, apresenta velocidade mdia de crescimento similar das cepas NRRL 2897 e NRRL 1991, e superior linhagem CCT 3802.
Tabela 5 Crescimento, produo de pigmentos e produo de citrinina pelas linhagens testadas, aps 7 dias de incubao (arroz) e 11 dias (bagao de mandioca). Cepa Crescimento Coeficiente de Produo de pigmento (UA radial mdio regresso para / g de produto seco) (mm/dia) o crescimento radial, R2 Arroz, 56% BM, 70% umidade umidade 2,9 0,983 16,9 2,4 3,0 0,998 14,1 13,0 2,3 0,980 15,5 2,1 3,1 0,994 89,3 20,0 Produo de citrinina em arroz g/g produto seco 25 22 20 18

NRRL 1991 NRRL 2897 CCT3802 LPB 31

A Tabela 5 indica ainda que a cepa isolada apresenta tambm produo de pigmento expressivamente superior s outras testadas, em bagao de mandioca e

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especialmente em arroz (o bagao de mandioca foi utilizado por ser um substrato tradicional usado em FSS no LPB, enquanto o arroz o substrato tradicional para a produo de pigmentos de Monascus). Comparando as caractersticas das linhagens testadas com outras linhagens avaliadas por Miyashira et al. (2003), tambm em FSS de arroz, verifica-se que a linhagem isolada, LPB 31, superior s outras linhagens de Monascus testadas, e apresenta nessas condies pigmentao apenas 13% inferior a um produto comercial (Tabela 6):
Tabela 6 Comparao de linhagens diversas quanto produo relativa de pigmentos, a produtividade e a produo de citrinina, para fermentao em arroz. Absorbncia relativa (500nm) CCT 3802 0,15a ATCC 6405 0,47 a ATCC 16365 0,47 a UFPE 3196 0,14 a Produto comercial 1,00 a NRRL 1991 0,16 NRRL 2897 0,14 CCT 3802 0,15 LPB 31 0,87 a valores extrados de Miyashira, 2003 Linhagem Produtividade dia-1 0,021 0,047 0,067 0,01 0,07 0,023 0,020 0,021 0,124 Citrinina g/g produto 20 23 83 29 31 25 22 20 18

A absorbncia relativa a absorbncia obtida para cada cepa, nas mesmas condies, dividida pelo maior valor (o do produto comercial). A produtividade foi calculada dividindo-se a absorbncia relativa pelo tempo de fermentao. Verifica-se pela anlise da Tabela 6 que a melhor linhagem testada o isolado LPB 31, tanto em termos de produo relativa inferior apenas ao produto comercial, em ca 13% quanto em produtividade de pigmento, superior aos demais, e produo de citrinina, a menor entre todas. Isso mostra que um produto fabricado a partir dessa linhagem pode ser similar ao comercial em termos de cor, e melhor em termos de toxicidade, apresentando cerca de 40% menos citrinina que o produto comercial. Assim, a cepa LPB 31 foi selecionada para os demais ensaios, visando o desenvolvimento de um bioprocesso para a produo desses pigmentos.

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4.3 Otimizao das condies de extrao de pigmentos Todos os ensaios de comparao de substratos, formulao de meios de cultivo, cintica de produo de pigmentos e a prpria separao e formulao de um produto baseado em Monascus dependem da extrao eficiente dos pigmentos. Os experimentos a seguir foram realizados para definir as melhores condies de extrao de pigmentos de Monascus, a partir de fermentados obtidos em frascos de vidro como descrito em Material e mtodos. 4.3.1 Extraes estticas ou agitadas A extrao de pigmentos de Monascus pode ser feita de forma esttica com agitao ocasional, por perodo de 1h ou mais, ou esttica por 12 horas, (Chiu e Poon, 1993) com resultados equivalentes. Uma forma de aumentar a eficincia da extrao usar um extrator de Soxhlet (realizando extraes sucessivas, exausto) o que apresenta um grau de extrao superior em cerca de 20% s extraes estticas, mas com aparato mais complexo (dados no publicados). Os ensaios a seguir foram feitos com fermentados diversos, mas sempre em condies idnticas dentro de um mesmo ensaio, com tempo de extrao de 24h, para garantir a eficincia na extrao. 4.3.2 Extrao usando diferentes solventes Analisando as estruturas dos pigmentos vermelhos produzidos por Monascus, pode-se concluir que as molculas so pouco polares, devido aos trs grupos carbonila presentes na molcula e ao grupo amino (Figura 13); como existe uma cadeia apolar (de inspeo da estrutura. 7 carbonos na monascorubramina e 5 carbonos na rubropunctamina), difcil prever a solubilidade desses pigmentos pela mera

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Figura 13 Estrutura dos pigmentos vermelhos de Monascus

O O NH O
A solubilidade dos pigmentos vermelhos em diferentes solventes foi testada usando bagao de mandioca fermentado, previamente seco (para evitar a interferncia de umidade) para diferentes quantidades e tipos de solventes, de acordo com o descrito na seo Material e Mtodos. Os resultados dos experimentos so ilustrados a seguir (Tabela 7). Os solventes esto listados em ordem decrescente de ndice de polaridade de Snyder. Tabela 7 Absorbncia relativa de pigmentos vermelhos extrados com diferentes solventes, a partir de 1g de substrato seco fermentado
Solvente gua, pH 1 gua, pH 3 gua, pH 7 gua, pH 11 gua, pH 12,3 DMSO Acetonitrila Etanol 95% ter etlico Hexano Absorbncia relativa (% do mximo extrado) 2,2 6,2 5,6 3,8 19,7 100 70,8 96,6 76,7 8,3

Os resultados indicam que a gua no um solvente adequado para a extrao de pigmentos de Monascus produzidos em FSS. A mudana na cor em pH 12,3 indicada na Tabela 7, pode ser devida a mudanas em componentes do substrato ou na estrutura dos pigmentos, o que merece investigao futura. Outra possibilidade que em pH 12,3 ocorra saponificao dos lipdios da membrana celular dos microorganismos, com maior disperso dos pigmentos intracelulares. Se

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for esse o caso, significa que os pigmentos so melhor extrados por lcoois no s pela sua solubilidade intrnseca, melhor que a da gua (Hajjaj, 2000 postula que os pigmentos de Monascus no so hidrossolveis), mas tambm pelo efeito de permeao da membrana celular. Como parece haver um grau de correlao entre o ndice de polaridade dos solventes e a capacidade de solubilizar pigmentos de Monascus, mais algumas extraes foram feitas, usando tambm como solventes clorofrmio, isopropanol e metanol. A Figura 14 mostra a quantidade de pigmentos extrados, na forma de absorbncia especfica, em funo do ndice de polaridade dos solventes. Aparentemente pode haver correlao entre as duas grandezas, verificando-se um mximo para a faixa prxima a IP = 6,51, e uma menor eficincia na extrao para IP acima e abaixo dessa faixa.
Figura 14 Quantidade de pigmentos extrados (como ABS SP) em funo do ndice de polaridade dos solventes.
300,0

250,0

metanol DMSO etanol

ABS SP (AU/g)

200,0

ter isopropanol

acetonitrila

150,0

100,0

CHCl3 gua gua hexano

50,0

0,0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ndice de polaridade (de Snyder)

Entre os solventes orgnicos, o dimetil sulfxido (DMSO) e o etanol tiveram os melhores resultados, quase equivalentes entre si, perdendo apenas para o metanol. Apesar do melhor desempenho, o metanol um solvente txico, cujo uso

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no liberado para preparao de pigmentos para alimentos (ANVISA, 2004). O dimetil sulfxido, embora pouco txico, menos voltil que os lcoois, mais caro e tambm no liberado para uso em alimentos. Como o etanol mais barato, voltil, atxico e de uso liberado para preparao de formulaes de pigmentos (ANVISA, 2004), foi usado para os experimentos subseqentes. Esses resultados esto em concordncia com experimentos realizados por Lin (1992) com etanol e metanol. 4.3.3 Quantidade de solvente As condies tpicas de extrao usadas por diversos autores so: extrao com etanol 95%, em proporo 1:5 g substrato fermentado:mL de solvente. Com o objetivo de determinar se h saturao do solvente com os pigmentos nessas condies de extrao, e em que grau, foram feitas extraes agitadas usando diferentes quantidades de solvente (etanol 95%). Os resultados obtidos so apresentados a seguir (Tabela 8) Tabela 8 Influncia da quantidade de solvente (etanol 95%) usada na extrao de pigmentos vermelhos de Monascus
Massa de Massa de fermentado solvente (g) (BM) (g) 5 15 5 20 5 28 10 90 5 95 5 95 4 96 3 97 2 98 2 98 1 99 0,8 99,2 0,4 99,6 0,2 99,8 Razo solvente / substrato 3 4 5,6 9 19 19 24 32,3 49 49 99 124 249 499 Pigmentos UA extradas por (UA500/g 1g de solvente substrato seco) (UA/g) 16,2 5,40 15,5 3,87 15,0 2,65 16,6 1,85 16,0 0,84 18,1 0,95 16,6 0,69 16,3 0,50 16,0 0,33 17,5 0,36 15,2 0,15 15,3 0,12 15,8 0,06 18,3 0,04

Pode-se concluir, analisando a Tabela 8, que h pouca diferena na absorbncia especfica usando grandes quantidades de solvente. Isso mostra que o solvente extraiu, dentro da faixa de propores solvente:fermentado testada,

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praticamente todo o pigmento que poderia ser dissolvido de forma que a absorbncia proporcional no quantidade de solvente, mas quantidade de substrato usado para a extrao. Esses resultados indicam que, embora a relao 5:1, freqentemente usada, seja adequada, menos solvente poderia ser utilizado. Uma proporo 3:1 de solvente:substrato fermentado seco apresenta boa eficincia na extrao. Isso significa menos solvente a utilizar durante o processamento industrial, alm de menor quantidade de solvente a extrair em uma eventual etapa de evaporao. A maior eficincia poderia eventualmente implicar em menor tempo de extrao (embora isso no tenha sido especificamente testado). 4.3.4 Eficincia na extrao Extraes estticas usando etanol 95% por 24h no mostraram efeito significativo da temperatura, em uma faixa de cerca de 60 C, com valores de teste de 2, 22, 32, 39 e 58C. Assim sendo, as extraes feitas nas etapas subseqentes deste trabalho foram feitas sem controle de temperatura. Misturas de solventes etanol/gua. Com o objetivo de verificar se lcool anidro, etanol 70%, etanol 95% ou outra concentrao podem ser mais ou menos eficientes na extrao de pigmentos, um ensaio foi realizado com 1g de fermentado sendo extrado por misturas de gua-etanol com diferentes propores, em extrao esttica (Tabela 9):
Tabela 9 efeito da composio do solvente (misturas de etanol e gua) na eficincia na extrao (como absorbncia relativa) de pigmentos vermelhos produzidos por Monascus Etanol (g) gua (g) ndice de polaridade estimado 5,6 5,9 6,3 6,6 7 7,3 7,6 8,0 8,3 8,7 9 5,8 Absorbncia relativa (%) 76,8 81,3 94,5 88,5 100,0 83,3 74,4 47,4 36,0 30,0 18,0 95,5

10 0 9 1 8 2 7 3 6 4 5 5 4 6 3 7 2 8 1 9 0 10 95% etanol, soxhlet

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Os resultados mostrados na Tabela 9 indicam que h uma faixa de eficincia mxima na extrao usando etanol a cerca de 60% (g/g) em gua. Este tambm um resultado importante em termos de processo, j que significa que menos solvente orgnico que a quantidade normalmente utilizada necessrio; alm disso, o uso de um solvente com maior quantidade de gua pode prevenir a dissoluo de outros componentes do fermentado (lipdios, por exemplo) no solvente, fornecendo um extrato mais puro. Por outro lado, esse resultado mostra que o fermentado no precisa passar por secagem prvia extrao com etanol, desde que se utilize solvente mais concentrado, levando em conta a incorporao de gua da massa fermentada: pode-se chegar aos mesmos 60% de concentrao ao adicionar, por exemplo, etanol a 95% ao fermentado mido. Finalmente, o ndice de polaridade estimado para etanol a 60% fica tambm prxima a 6,5 como o metanol e o DMSO. Isso corrobora a hiptese levantada de relao IP x capacidade de extrao de pigmento. Em sntese, as condies mais adequadas extrao de pigmentos de Monascus so etanol a 60%, na proporo 3:1 em massa de solvente em relao massa de fermentado seco, por 12h esttica ou 1h com agitao. importante notar que nos experimentos subseqentes no foram utilizadas essas condies, mas sim etanol a 95%, por praticidade (j que a concentrao do produto comercial), e para uma comparao direta com outros dados de FSS obtidos anteriormente no LPB e por outros autores. 4.4 Comparao de diferentes substratos Com o objetivo de comparar diferentes substratos potenciais para a produo de pigmentos de Monascus, 11 diferentes substratos foram testados. Esses substratos foram escolhidos por serem substratos tradicionais para FSS (no caso de arroz e trigo), resduos agroindustriais baratos (no caso do bagao de mandioca), ou ricos em amido e protenas. O teor de umidade de 56% foi escolhido por ser a faixa ideal para o arroz, um pouco baixa para o bagao de mandioca mas possivelmente prxima do ideal para outras fontes amilceas pouco fibrosas. A quantidade de pigmentos produzida com diferentes substratos (expressa como absorbncia especfica a 500nm) variou bastante, como se v na_

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Tabela 10. A mesma tabela mostra tambm a composio aproximada dos substratos (Franco, 1992). Nota-se que so todos substratos muito ricos em carboidratos (de 33 a 91%) e protenas (9 a 48%), exceo da mandioca e seus derivados, que possuem sobretudo amido.
Tabela 10 Produo de pigmentos (UA500/g substrato seco) e composio do substrato Substrato Composio aproximada (g/kg base seca) carboidratos protenas fsforo 820 770 780 330 400 320 900 910 660 800 90 140 130 400 480 7 20 14 11 100 1,14 3,63 3,19 6,00 7,00 0,407 0,33 2,20 0,96 Absorbncia especfica mdia (UA500/g substrato seco) 216 79 60 13 22 12,6 119,6 38,5 98,1 15,7 4,7

Arroz Trigo Milho (quirera) Soja Farelo de soja PTS Mandioca Tapioca Farinha dgua Bagao de mandioca Batata Fonte: Franco, 1992.

Esperava-se que todos os cereais fossem bons substratos, j que o arroz (um cereal, com composio centesimal no to distante do milho e do trigo) o substrato tradicional para o cultivo de Monascus. O desempenho do trigo e do milho, embora superior ao bagao de mandioca ou a batata, por exemplo, foi baixo em comparao com o do arroz. Era de se esperar tambm que substratos com um maior teor de carboidratos, protenas ou fsforo (elemento tipicamente limitante no desenvolvimento de organismos) poderiam ser melhores meios de fermentao para Monascus, em comparao com o arroz. Isto tambm no ocorreu, como uma inspeo dos valores mostra: trigo, milho ou batata so similares ao arroz (com relao a esses nutrientes), mas apresentaram desempenho fraco. Finalmente, notase que para outros substratos testados a produo de cor bastante inferior produzida no arroz, com exceo da mandioca cuja produo de pigmentos, embora cerca de 55% menor que a do arroz, ainda significativamente superior de vrios outros substratos. Possivelmente o teor de umidade, sempre 56%, no foi adequado para todas as fermentaes; de fato, a soja, a tapioca e a batata

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aglutinaram muito mais que os outros substratos, deixando at gua livre nos frascos. possvel que o desempenho desses substratos possa melhorar combinando componentes: por exemplo, misturando batata, cuja estrutura frgil, a bagao de mandioca. Ainda assim, os resultados da Tabela 10 permitem concluir que, em FSS de substratos puros, adequado trabalhar com arroz ou mandioca. Finalmente, questiona-se: o que torna o arroz um substrato superior? Vrias hipteses podem ser aventadas, desde a diferena na estrutura fsica do suporte at a composio qumica. Por exemplo: o arroz o cereal de maior poder diastsico (Aquarone et al., 2002) entre os substratos testados. Assim, concebvel que haja enzimas residuais no inativadas na autoclavagem, ou que atuaram parcialmente sobre o substrato na preparao do meio de cultivo. Isso poderia aumentar a biodisponibilidade da fonte de carbono para o fungo na fermentao. Outra possibilidade que o fungo tenha se desenvolvido nos outros substratos, mas com menor produo de cor, devido diferente composio dos substratos. 4.5 Ensaios utilizando bagao de mandioca como substrato Entre os substratos testados na etapa anterior para a produo de pigmentos, o bagao de mandioca foi escolhido para fermentaes adicionais, numa tentativa de determinar condies timas de produo. A razo que o bagao de mandioca um substrato barato (na verdade, um resduo) de forma que mesmo uma produo mais baixa que o arroz poderia justificar seu uso economicamente. 4.5.1 Teor de umidade na FSS de bagao de mandioca De forma a verificar a influncia do teor de umidade na produo de

pigmentos, foram preparadas formulaes com diferentes teores de umidade, na faixa de 60 a 90%. A 80% ou mais de umidade, os meios de cultivo tornam-se muito midos, com gua visivelmente livre e aglutinao do substrato. A composio dos meios de cultivo e os resultados obtidos so mostrados na Tabela 11.

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Tabela 11 Absorbncia especfica (UA500/g substrato seco) de pigmentos extrados com etanol a 95%, produzidos em FSS em bagao de mandioca com diferentes teores de umidade Substrato Bagao de mandioca 60% 13,2 70% 25,2 Teor de umidade, % 80% 6,5 85% 3,5 90% 10,7

Como se esperava, o bagao de mandioca, por ser mais poroso que o arroz e apresentar um teor de fibras maior, apresenta melhor produo de pigmentos em um teor de umidade superior ao necessrio para FSS em arroz. Esses resultados esto em concordncia com Johns e Stuart (1991), para arroz, e Soccol e Vandenberghe (2003) para bagao de mandioca. A partir desses resultados, as condies de fermentao (FSS) para a produo de pigmentos foram estabelecidas como: arroz, 56% de umidade (Johns e Stuart, 1991) - confirmada em experimento no LPB (dados no apresentados) e bagao de mandioca, 70% de umidade com pH ajustado, quando necessrio, a 6,5, e temperatura de incubao de 32 C. Esse experimento foi feito em 7 dias; como o tempo de fermentao ideal depende largamente da qualidade do inculo e do substrato, para a produo industrial necessrio acompanhar a cintica de produo de pigmento em cada fermentao. Ainda assim, dados cinticos podem ser levantados para permitir uma avaliao do perodo mdio de fermentao: 4.5.2 Cintica de produo de pigmentos em bagao de mandioca Com o objetivo de determinar a cintica de produo de pigmentos em bagao de mandioca, uma fermentao foi feita com a durao de 24 dias, obtendose como resultados as curvas de produo de pigmentos apresentadas na Figura 15. A produo mxima de pigmentos (ABS SP 500 = 47UA/g) se d com 10 a 11 dias, o que um perodo superior ao de fermentao de arroz usando o mesmo inculo (dados no ilustrados). Esse resultado pode ser devido a uma biodisponibilidade maior do amido de arroz em relao ao de mandioca, ou a uma menor quantidade de oligoelementos ou vitaminas.

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Figura 15 Produo de pigmentos de Monascus em FSS de bagao de mandioca, expressa como absorbncia especfica (em UA/g substrato seco) em funo do tempo (em horas)
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 SP ABS 400 SP ABS 500

absorbncia especfica (AU/g biomassa seca)

tempo de fermentao (h)

A anlise da Figura 15 tambm mostra que a absorbncia dos pigmentos maior a 400nm, comparando com a absorbncia a 500nm, mas com uma boa proporcionalidade. Muitos autores usam a relao ABS500/ABS400 para indicar a proporo de pigmentos vermelhos em relao aos amarelos; como nesta fermentao a relao aproximadamente constante, a ABS400 pode ser usada para mostrar a evoluo da formao de pigmentos para baixas concentraes, por apresentar resposta mais sensvel. Para utilizar bagao de mandioca como substrato para produo de pigmentos por Monascus, o meio de cultivo teria de ser suplementado com uma fonte de nitrognio, fsforo ou oligoelementos, que poderia melhorar a produo ou produtividade de pigmentos; os experimentos a seguir pretendem avaliar essa possibilidade. 4.5.3 Otimizao das condies de cultivo em bagao de mandioca. O bagao de mandioca um substrato rico em amido, que foi usado com sucesso em diversos processos de fermentao em substrato slido. Com o objetivo de maximizar a produo de pigmento a partir do bagao de mandioca, um planejamento experimental 33-1 com 10 pontos extras (6 pontos completando os

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centros dos planos, uma repetio do ponto central e trs repeties dos nveis mnimos, totalizando 9 + 6 + 1 + 3 = 19 pontos) foi realizado utilizando bagao de mandioca em quantidade fixa, teor de umidade varivel e protena texturizada de soja (PTS) e levedura de panificao inativada (YEA) como aditivos, em nveis variveis. Tanto PTS como YEA so fontes de nitrognio orgnico de custo relativamente baixo, e YEA representa tambm uma fonte de oligoelementos e vitaminas. A Tabela 12 mostra a composio dos meios de cultivo e os resultados obtidos.
Tabela 12 Composio dos meios de cultivo e produo de pigmentos no planejamento experimental 33-1 umidade, PTS, YEA para fermentao de bagao de mandioca frasco % H2O % PTS % YEA Produo de pigmento (UA500/g matria seca inicial) 0,40 0,55 0,20 0,70 0,10 3,40 3,65 4,80 20,50 3,05 frasco % H2O % PTS % YEA Produo de pigmento (UA500/g matria seca inicial) 8,00 23,70 23,00 23,70 15,30 18,05 0,30 15,85 20,50

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

50 50 50 50 50 60 60 60 60 60

0 10 5 0 10 5 0 5 5 10

0 0 2 4 4 0 2 2 2 2

11 12 13 14 15 16 17 18 19

60 70 70 70 70 70 50 60 70

5 0 10 5 0 10 0 0 0

4 0 0 2 4 4 0 0 0

A anlise dos resultados mostra uma grande variao de valores para a absorbncia especfica; fica claro, no entanto, que para teores mais baixos (50 e 60%) de umidade, todos os experimentos apresentam baixa produo de pigmentos, enquanto para 70% de umidade a produo mais alta. A Figura 16 mostra no apenas que a maior umidade favorece a produo de pigmentos (com um efeito positivo, ao nvel de 95% de confiana), como a presena YEA e PTS no afeta a produo de pigmentos.

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Figura 16 Diagrama de Pareto para os efeitos lineares e quadrticos dos fatores avaliados, correspondentes ao planejamento 33-1,
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: ABS_SP 3 3-level factors, 1 Blocks, 19 Runs; MS Residual=32,10884 DV: ABS_SP p=,05 (1)%_H2O(L) %_H2O(Q) 1Lby3L (3)%_YEA(L) %_PTS(Q) 2Lby3L 1Lby2L (2)%_PTS(L) %_YEA(Q) -1 0
-,947688 -,779114 -,738168 ,6740258 ,4188584 ,281562 -,146655 -,01539 5,948958

Efeito estimado (valor absoluto)

O resultado mostrado por esse planejamento foi inesperado, na medida em que, supunha-se, os aditivos YEA e PTS favoreceriam o crescimento do fungo ou pelo menos no atrapalhariam. Como a umidade mostrou-se o fator determinante, com maior eficincia ao nvel de 70%, preparou-se um novo plano experimental, com o teor de umidade nesse patamar e pesquisando melhor uma rea de valores de YEA x PTS. A Tabela 13 mostra os valores usados de YEA e PTS, e a resposta correspondente aps 11 dias de fermentao, tempo suficiente para haver boa produo de pigmentos, permitindo a avaliao dos meios de cultivo.

Effect Estimate (Absolute Value)

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Tabela 13 composio dos meios de cultivo e valor de absorbncia especfica correspondente, em planejamento 72 incompleto YEA x PTS em bagao de mandioca. Frasco BM YEA (% (g) sobre o bagao) PTS (% sobre o bagao) ABS SP Frasco BM YEA (% 500 (g) sobre o (UA/g bagao) matria seca inicial) 53,3 16 10 4 32,1 17 10 4 17,4 18 10 4 19,8 19 10 4 14,1 20 10 6 33,9 21 10 6 18,0 22 10 6 30,8 23 10 6 12,9 24 10 6 11,1 25 10 8 14,0 26 10 8 13,5 27 10 8 12,6 28 10 8 12,7 29 10 8 12,0 30 10 0 PTS (% sobre o bagao) ABS SP 500 (UA/g matria seca inicial) 10,7 11,6 9,0 11,3 9,0 6,8 7,5 6,1 8,0 7,6 7,5 5,3 3,9 5,1 39,9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

0 0 0 0 0 1 1 2 2 2 2 2 3 3 4

0 2 4 6 8 1 3 0 2 4 6 8 1 3 0

2 4 6 8 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0

Os resultados de absorbncia apresentados na Tabela 13, proporcionais produo de pigmentos, podem ser melhor apreciados atravs da Figura 17, em que uma funo polinomial foi ajustada pelo mtodo dos mnimos quadrados aos pontos experimentais, usando o programa Statistica:

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Figura 17 (a) Influncia da concentrao (%) em YEA e PTS na absorbncia especfica do fermentado. A curva plotada a funo obtida por regresso polinomial (mnimos quadrados) dos valores experimentais. (b) Diagrama de Pareto dos efeitos das variveis YEA e PTS sobre a produo de pigmentos.
z=42,154-7,53*x-6,068*y+0,39*x*x+0,47*x*y+0,362*y*y

6,696 10,242 13,788 17,333 20,879 24,425 27,971 31,517 35,063 38,609 above pontos experimentais
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: ABSSP Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados; 2 factors, 1 500 Blocks, 30 Runs; MS Residual=20,23094 varivel: ABS SP , planejamento 72 incompleto, 1 bloco, 30 ensaios DV: ABSSP p=,05

(1)YEA%(L)

-8,42512

1Lby2L

4,487084

(2)PTS%(L)

-4,30987

YEA%(Q)

3,086318

PTS%(Q)

2,86283

10

Effect Estimate (Absolute Value) Estimativa do efeito (valor absoluto)

A inspeo da Figura 17a permite concluir que a adio de leveduras ou de PTS realmente desfavorece a produo de pigmento. A Figura 7b indica efeitos lineares negativos, tanto para PTS como para YEA. Note-se que os efeitos positivos de interao e quadrticos, no independentes, so apenas conseqncia da

62

magnitude dos efeitos lineares (Carvalho, 1999). No se espera que os aditivos YEA e PTS realmente atrapalhem ambos o desenvolvimento do fungo, pelo menos em nveis modestos (1 a 2%). Dessa forma, o que pode explicar a produo menor de pigmentos que a adio desses componentes favoreceu um desvio de metabolismo, retardando ou diminuindo a produo de pigmentos. Essa hiptese poderia ser testada pela quantificao da biomassa produzida. Como, no entanto, o objetivo era produzir pigmentos de Monascus de forma suficientemente eficiente para permitir estudos de respirometria para futuro escalonamento, decidiu-se mudar o substrato de trabalho exclusivamente para arroz integral, j que trata-se efetivamente do melhor substrato testado anteriormente. 4.6 Desenvolvimento do mtodo de anlise de biomassa via ergosterol Para determinar a equivalncia entre a absorbncia e as concentraes de ergosterol na anlise cromatogrfica, 10 L de hexano puro e 10 L de trs padres de ergosterol, com 1000, 5000 e 10000 g/mL foram injetados de acordo com o mtodo descrito (vide Material e Mtodos). A partir das reas dos picos, obteve-se por regresso linear a seguinte expresso para a concentrao de ergosterol: ergosterol ( g/mL) = 5,54.10-5.A, com R2 = 0,999 (A a rea do pico). A recuperao estimada de 10% foi feita procedendo-se extrao, segundo o mesmo processo aplicado s amostras, de 0,5 g de arroz dopado com 2000 g de ergosterol, o que forneceu uma massa de ergosterol de 198 g na anlise. uma recuperao baixa, devida possivelmente partio pouco seletiva do ergosterol entre o hexano e a fase alcolico-aquosa. Levando em conta, no entanto, que as anlises foram feitas da mesma forma, com idnticos volumes de solventes, podemos supor que os teores de ergosterol nos extratos guardam boa proporo com o teor na biomassa. Essa hiptese reforada pelo fato de que os dados de biomassa (via ergosterol) e produo de pigmentos (ABS SP 500) mostram boa correlao para diversas fases do cultivo (ver item 4.2). Para estimar a equivalncia entre biomassa e concentrao de ergosterol, foi analisada uma amostra de 0,4g de biomassa seca temperatura ambiente com slica. Aps a extrao e injeo, obteve-se um pico de rea A = 18283018 , o que equivale a 1013 g/mL no extrato. Considerando que o volume de diluio dos

63

extratos 0,200 mL, a massa de ergosterol de 1013 g.mL-1 x 0,2 mL = 202,6 g nos extratos. Como a recuperao de ergosterol na extrao foi de 10%, a massa de ergosterol na biomassa de 2026 ergosterol:biomassa seca 2026 g. Temos, portanto, que a proporo g:0,4g = 5,06 mg/g, resultado prximo da

expectativa, comparando com os resultados de outros autores, discutido em material e mtodos. Temos ento que: biomassa na amostra(mg) = 5,54.10-5.ABS.0,2 / 506,4. Os valores obtidos so usados na anlise respiromtrica frente. 4.7 Determinao da aerao adequada, em coluna de Raimbault Para a determinao da aerao tima para fermentao em arroz, foi feito um ensaio em colunas de Raimbault contendo 60g de arroz com 56% de umidade. O meio foi inoculado com 5%(v/m) de suspenso de esporos com 106 esporos/mL, e incubado a 32 C em montagem ilustrada na Figura 18, resultando em maior produo de pigmentos para uma velocidade de aerao de 60NmL./min
Figura 18 Sistema de respirometria (colunas, cromatgrafo e computador). Ao fundo (esquerda) se v o fermentador piloto de 30kg. No detalhe (direita), uma coluna de FSS parcialmente preenchida.

64

Os resultados de absorbncia especfica, proporcional produo de pigmentos, so mostrados na Figura 19, como funo da vazo de ar utilizado:
Figura 19 Efeito da aerao na produo de pigmentos (como ABS SP) em arroz, a 32 C
produo de pigmentos (UA500/g substrato seco) 120 100 80 60 40 20 0 0,00 0,33 0,67 1,00 1,33 1,67 2,00 aerao (NmL/g.min)

A anlise do grfico mostra que a velocidade de aerao mais adequada da ordem de 1 NmL/g.min (1 mililitro de ar em condies padro, por grama de substrato mido, por minuto). Nos experimentos subseqentes em coluna, foi feito o controle da aerao nesse valor, usando-se um rotmetro de fluxo sada das colunas. 4.8 Anlise respiromtrica em colunas Para a determinao da cintica de produo de pigmentos e de biomassa em arroz, foi feito um experimento em colunas, com a montagem da Figura 18, com colunas de Raimbault com 60g meio inoculado com 5% v/m de suspenso de esporos com 106 esporos/mL. Os resultados de concentrao de O2 e CO2 (obtidos por cromatografia gasosa), biomassa (obtidos via ergosterol, por cromatografia lquida de extratos de amostras dos fermentados) e pigmentos (obtidos por extrao do pigmento e leitura da absorbncia) foram tabulados em planilha de clculo e apresentados a seguir (Figura 20):

65

Figura 20 Resultados da anlise respiromtrica em colunas com arroz como substrato consumo horrio de O2, produo horria de CO2, produo de pigmentos (como ABS SP500), produo de biomassa e quociente respiratrio Q.
0,25
O2 consumido

0,2

Q biomassa, g/coluna prod. pigmento, 1000UA/coluna

V gs, NL/h

0,15 3 0,1 2 0,05

0
0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00

0
300,00

tempo (h)

Adaptando curvas sigmoidais (Equao de Boltzmann) aos dados de biomassa e de pigmento produzido, obtm-se as seguintes expresses (Eq. 1 e 2): Biomassa (g) = [(0,1778 4,7352) / (1 + e(tempo-152,09)/16,83)] + 4,7352 com (R2 = 0,950) ABS SP500 (UA/g) = [(0 5459) / (1 + e(tempo-166,30/18,13)] + 5459 com (R = 0,980) Essas equaes foram usadas para gerar os grficos a seguir (Figura 21a e Figura 22), usando o programa MS-EXCEL. O clculo das velocidades especficas foi feito ponto a ponto, pelas expresses: ~X-1 X/ t, e qp~X-1 P/ t. A Figura 21b mostra os valores do logaritmo da biomassa por coluna, ao longo da fermentao.
2

(Eq.1)

(Eq. 2)

biomassa (g/coluna), produo de pigmentos (1000UA/coluna), Q [adimensional]

CO2 produzido

66

Figura 21 a) Biomassa e pigmentos produzidos ao longo da fermentao (modelo sigmoidal adaptado aos dados experimentais) e b) logaritmo da biomassa real x tempo
6000
pigmento (UA500/coluna)

5000 4000 3000 2000 1000 0 0 50

pigmento pig. real biomassa biom real

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 150 tempo (h) 200 250 300

100

ln biomassa (g)

1,2 0,7 0,2 -0,3 0 -0,8 -1,3 50 100 150 200 250 300

tempo (h)

Figura 22 Velocidade especfica de formao de pigmentos e de biomassa, baseado no modelo sigmoidal.

30 25 20 15 10 5 0
0 50 100 150 200 250 300 350

velocidade especfica de formao de produto (UA500.g2/h)

0,045 0,035 0,03 0,025 v pigmentos v biomassa 0,02 0,015 0,01 0,005 0 tempo (h) Velocidade especfica de crescimento (h-1) 0,04

Biomassa (g)

67

A anlise da Figura 20, da Figura 21 e da Figura 22 poderia ser discutida para cada grandeza, mas pode ser vantajosamente dividida por fases, pela anlise da curva de Q (quociente respiratrio) e de biomassa e pigmentos: 4.8.1 Fases da fermentao: 0 a 60h fase lag: Essa fase representa a adaptao ao meio de cultivo e a germinao dos esporos, de forma que a quantidade de CO2 produzida (e diluda pela corrente de aerao) provavelmente baixa demais para ser detectada pelo cromatgrafo tanto que o quociente respiromtrico Q calculado nulo para tempos inferiores a 60h. A biomassa e o pigmento detectados tambm apresentam valores baixos. Note-se que 60h uma fase lag excessivamente grande para fermentaes industriais, e denota a necessidade de aumentar a concentrao ou a forma de inoculao, trabalhando em um pr-fermentador. 60 a 90h fermentao: A partir de 60h e at cerca de 85h o valor de Q aumenta, chegando a um valor mximo prximo de 2, o que indica uma atividade respiratria grande, com CO2 formado superior ao O2 consumido (em um processo de respirao ideal, Q = 1). Portanto, deve-se formar outro metablito que no exclusivamente CO2. De fato, o odor do fermentado no incio da fermentao de lcool, o que tambm foi observado por outros autores (Pastrana et al., 1995, Rosenblitt et al., 2000). A aerao, contudo, deveria ser suficiente para o desenvolvimento aerbico da pouca biomassa presente nessa fase; possivelmente trata-se de um efeito tipo Crabtree, observado por outros autores (Chen e Johns, 1994; Hamdi et al., 1996) em fermentao submersa. 90h a 140h mudana para respirao: Nessa fase diminui Q, at um valor prximo a 0,8 e comea a aumentar a produo de biomassa e de pigmentos; o consumo de O2 e a produo de CO2 atingem um mximo (t = 150 a 160h). Nessa fase, como pode-se verificar pela grande variao do ln da biomassa na Figura 21b, o desenvolvimento do miclio bastante grande, chegando ao mximo valor estimado de = 0,039 h-1, para t = 130h. A produo especfica de pigmentos tambm mxima, atingindo 27,50 UA.g-2.h-1 para t = 140h (valores obtidos pela derivao da curva modelo X=f(t), que podem ser verificados na Figura 22.

68

140h ao fim da fermentao respirao e sntese de pigmentos: Nessa fase Q permanece constante, na faixa de 0,8. O consumo de O2 e a produo de CO2 tambm so constantes; h formao de grande quantidade de pigmentos, o que consistente com a formao de metablitos secundrios (Pandey, 2001). A velocidade especfica de formao de biomassa e de pigmentos diminui (Figura 21). Isso denota a desacelerao do crescimento, que deixa de ser exponencial. A partir de 280h, a produtividade de pigmentos (0,76 UA/g.h) cerca de 10 vezes inferior produtividade mxima, de cerca de 74 UA/g.h s 170h de fermentao. 4.8.2 Determinao dos parmetros da fermentao usando o programa FERSOL O programa FERSOL utiliza dados de oxignio consumido e biomassa produzida para estimar os parmetros de fermentao para o modelo (Eq. 3):

dO2 1 dX = + mX dt YX / O dt
onde:

(Eq. 3)

dO2/dt a taxa de consumo de oxignio, em g/h; Yx/o a relao entre biomassa formada e oxignio consumido [unid biomassa/unid O2] dX/dt a taxa de produo de biomassa, em g/h m um coeficiente de manuteno, refletindo a quantidade de O2 usada para outras funes que no a produo de biomassa, em h-1 X a quantidade de biomassa no sistema, em g

Foram aplicados ao programa os dados constantes na Tabela 14:

Tabela 14 valores de tempo, biomassa e pigmento produzidos, O2 consumido e converses de substrato e oxignio em biomassa e pigmento, usados para a estimativas de parmetros cinticos. tempo de Biomassa Pigmento O2 O2 Yp/s Yx/s Yp/o Yx/o fermentao, produzida, produzido consumido, acum mg/g g/g g/mol g/mol h mg/coluna UA500/coluna mmol/h 0 30 0 0 59 278 0 0,224 0,01 0 0,0219 0 107 480 109,7 4,804 136 0,109 0,0298 0,0121 3,3100 131 681 313,5 7,227 275 0,268 0,0372 0,0171 2,3687 152 3040 2082,3 9,283 454 1,503 0,1449 0,0688 6,6290 180 3625 3423,3 6,261 683 2,088 0,1463 0,0751 5,2635 297 4816 5458,9 0 915 3,335 0,1950 0,0894 5,2307

69

A partir dos valores de tempo, biomassa e O2 consumido da Tabela 14, chegou-se aos seguintes valores utilizando o programa FERSOL: Yx/o = 3,703 g biomassa/mol O2, m = 0,000 h-1 e
max

= 0,038 h-1, na faixa de 59 a 180 h, com

coeficiente de regresso R2 = 0,989 um valor que indica boa correlao entre os dados e o modelo. O valor de m ~ 0 indica, na verdade, que o valor pequeno demais para ser estimado pelo programa, o que mostra que a produo de biomassa deve ser muito superior de pigmentos (ou outros metablitos que exijam o consumo de oxignio). Essa hiptese reforada pelos pequenos valores de YP/S, de 0,00335 e YP/O de 0,0894 ao final da fermentao, mostrando que as converses de substrato e oxignio em pigmentos so bem inferiores s converses em biomassa. O valor de YX/O obtido atravs do programa prximo do valor obtido pelo clculo direto dos parmetros cinticos apenas na faixa prxima a 107h de fermentao. O valor encontrado para sigmoidal, de
max -1 max

prximo ao obtido com o modelo

= 0,039 h . Esse valor indica que uma fermentao com

Monascus poderia ter seu tempo reduzido a cerca de 130h, partindo da mesma concentrao inicial de biomassa, se as condies de inoculao e incubao fossem tais que a fermentao se desse exclusivamente em fase exponencial. Ao final da fermentao em coluna, obteve-se 17mg de pigmento/g de biomassa, um valor prximo ao obtido em fermentao submersa por Hajjaj (2000), estimado atravs de um grfico em 16,8mg de pigmento/g de biomassa. No entanto, na FSS esse pigmento est menos disperso, na proporo de cerca de 5g pigmento/kg de fermentado mido (com cerca de 60% de umidade), contra cerca de 0,1g pigmento/L na fermentao lquida. 4.9 Correlao biomassa-pigmento Uma anlise de correlao dos dados apresentados na Tabela 14, de biomassa e pigmento produzidos, apresenta coeficiente R = 0,977, o que sugere uma razovel proporcionalidade entre ambos os fatores. Usando mais dados de biomassa x absorbncia ( Tabela 15), chega-se expresso (Eq. 4):

70

Biomassa = -2.10-06.ABSSP2 + 0,0028.ABSSP + 0,0302, com R2 = 0,9955

onde: biomassa: biomassa no fermentado seco (g/g) ABSSP: absorbncia especfica, em UA/g substrato seco

(Eq. 4)

Tabela 15 biomassa e ergosterol em diferentes fases de fermentao de arroz dados para correlao. ABS SP 500 biomassa UA/g g/g 0 0,01591 1,29 0,04040 3,68 0,03499 12,57 0,06044 112,8 0,35717 315,8 0,71838 269,5 0,58909 232,8 0,59636 291,7 0,68121 499,9 0,93737

Embora essa expresso deva ser usada com ressalvas, pois deve depender da cepa utilizada e das condies de cultivo, uma forma simples de estimar a biomassa na fermentao, j que a extrao de pigmentos e leitura de absorbncia uma anlise mais simples que a extrao do ergosterol e a anlise cromatogrfica. 4.10 Cintica de fermentao em reator do tipo tambor horizontal Para verificar o comportamento do sistema de fermentao com um aumento de escala, uma nova fermentao foi feita, utilizando as mesmas condies da fermentao em coluna (arroz com 56% de umidade, inoculado com suspenso de esporos, temperatura controlada em 32 C). A massa de meio a fermentar foi de 2400g, 40 vezes maior que a utilizada em colunas, de forma que a aerao foi mantida na mesma proporo (1Nml/g.min), ou seja, 2,4NL/min. Portanto, o critrio de escalonamento utilizado foi uma razo vazo de ar/massa de meio constante. Como o reator utilizado no tem camisa de aquecimento, este foi feito atravs do aquecimento do ar, aps a umidificao, imediatamente antes da entrada no reator. Um isolamento trmico foi feito no reator, e um sensor de temperatura foi colocado

71

prximo sada de ar do reator, ligado a um termostato e um aquecedor foram usados para controlar a temperatura do sistema. Ainda assim, houve oscilao de temperatura, especialmente no 5 dia de fermentao, alm de duas quedas de energia que causaram flutuaes nas leituras do cromatgrafo. Os resultados apresentam a mesma tendncia observada na fermentao em coluna (Figura 23).
Figura 23 Resultados da anlise respiromtrica em biorreator tipo tambor utilizando arroz como substrato consumo horrio de O2, produo horria de CO2, produo de pigmentos (como ABS SP500), produo de biomassa e quociente respiratrio.
4,5
Volume de O2 consumido Q biomassa (g/g fermentado seco), produo de pigmentos (UA/g fermentado seco)

350
Volume de CO2 produzido biomassa, mg/g prod. pigmento, UA/g

4 3,5
V gs, NL/h, Q [adimensional]

300

250

3 2,5 2 1,5 100 1 0,5 0

0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00

200

150

50

0 tempo (h)

A anlise da Figura 23 permite observar o mesmo padro fermentativo presente nas fermentaes em colunas. Novamente, o quociente respiratrio Q pode ser usado como referncia para classificar as fases da fermentao: abaixo de 80h h uma fase de crescimento muito pequeno, de 80 a 150h um metabolismo predominantemente anaerbio, com Q >1 e pequeno aumento na produo de biomassa; de 150 a 220h h um declnio no Q, que estabiliza na faixa de 0,8, ainda com aumento na produo de pigmentos e de biomassa; de 220 a 350h a produo de pigmentos e de biomassa alta, com Q em uma faixa aproximadamente constante. O forte declnio na quantidade de oxignio consumido e CO2 produzido, na vizinhana de 280h, sugere problemas de anlise, pois contrasta com a forte produo de pigmentos e de biomassa.

72

Adaptando novamente um modelo sigmoidal aos valores de produo estimada de biomassa x tempo e produo de pigmento x tempo, obtm-se as seguintes expresses (Eq. 5 e 6): biomassa (g) = [(46,114 341,55) / (1 + e(tempo-283,8)/35,666)] + 341,55 com (R = 0,953) ABS SP500 (UA) = [(3038 129000) / (1 + e(tempo-292,9/40,894)] + 129000 com (R2 = 0,957) Essas equaes foram usadas para gerar os grficos a seguir (Figura 24), usando o programa MS-EXCEL. O clculo da velocidade especfica de crescimento foi feito ponto a ponto, pelas expresses: ~X-1 X/ t, e qp~X-1 P/ t (Eq. 6)
2

(Eq. 5)

73

Figura 24 (a) Biomassa e pigmentos produzidos ao longo da fermentao (modelo sigmoidal adaptado aos dados experimentais). (b) logaritmo da biomassa produzida x tempo (c) Velocidade especfica de formao de pigmentos e de biomassa, baseado nesse mesmo modelo.
400 350
biomassa produzida (g)

biomassa biomassa real pigmentos pig. real

2,5 pigmento produzido (g) 2 1,5 1 0,5 0 400,0

300 250 200 150 100 50 0 0,0 50,0

100,0

150,0

tempo (h)

200,0

250,0

300,0

350,0

ln biomassa

5,5 4,5 3,5 0,0 100,0 200,0 tempo (h) 300,0 400,0

velocidade especfica de formao de biomassa (h-1)

0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0 0,0 100,0 200,0 300,0 tempo (h) 400,0 500,0 v biomassa v pigmento

70 60 50 40 30 20 10 0 600,0

A inspeo da Figura 24 permite concluir que o modelo sigmoidal representa de forma satisfatria a produo estimada de biomassa. A velocidade especfica mxima de crescimento
max

= 0,013h-1, um valor sensivelmente inferior ao obtido

velocidade especfica de formao de produto (10-6g/gh)

0,014

80

74

em coluna, possivelmente devido ao controle deficiente de temperatura e eventualmente formao de caminhos preferenciais no leito do fermentador, diminuindo a aerao efetiva (embora em cada amostragem diria se homogeneizasse o meio, desfazendo grumos). A velocidade especfica de formao de produto foi de cerca de 70 g pigmento/g biomassa.h, ou 4,7 UA/g.h, e a produo total de pigmentos foi de 108,7 UA/g de fermentado seco. 4.11 Comparao da produo em frascos, colunas, bandeja e reator tipo

tambor horizontal, com arroz como substrato Os seguintes valores de produo de pigmentos foram obtidos com diversos mtodos de fermentao (Tabela 16).
Tabela 16 Comparao da produo de pigmentos em diferentes quantidades de substrato (arroz) e condies de fermentao em FSS Mtodo Massa de substrato mido 20g 200g 60g 2400g Aerao Tempo de fermentao Teor de slidos ao final da fermentao 86% 85,5% 19,9% 22,6% Pigmento produzido (UA500/g de fermentado seco) 89,3 117,78 499,9 108,7

Fermentao em frascos de vidro Bandeja Fermentao em coluna Fermentao em reator

Difuso Difuso Forada Forada

7 dias 8 dias 12 dias 16 dias

Nota-se que a produo de pigmentos em frasco e em bandeja prxima; o tempo de fermentao para mxima produo de cor semelhante, e ocorre secagem do meio, mesmo tentando-se incubar o material em estufa com ar saturado de umidade. A produo de pigmentos em coluna , em mdia, 5 vezes superior produo em frascos e bandeja, o que pode ser atribudo ao efeito da aerao forada, e no haver secagem do meio de cultivo. A produo em reator que, esperava-se, deveria ser semelhante produo em coluna, revelou-se inferior a todas as outras, levando em conta que a produo se deu em 16 dias, com uma produtividade mais baixa (15 vezes inferior aos 74UA/g.h obtidos em coluna). A causa dessa produo relativamente baixa pode ser uma deficincia na aerao, e

75

provavelmente h grande influncia de oscilaes de temperatura. Nota-se tambm a importncia de controlar a umidade, j que nos sistemas sem aerao forada (frascos e bandeja) o meio secou ao longo da fermentao, chegando a cerca de 15% de umidade ao final do processo. provvel que, com a umidade mantida em um valor mais alto, a produo em bandeja fosse maior. Possivelmente, para uma melhor produo em bandejas, a umidade deve ser controlada pela asperso direta de gua (j que usar ar saturado com gua no foi eficiente) e para uma melhor produo em reator, necessrio controlar de forma eficiente a temperatura. Uma forma de controlar a temperatura do reator controlando rigorosamente a temperatura de entrada do ar saturado, j que um fluido que deve percolar todo o meio de cultivo. 4.12 Avaliao da estabilidade dos pigmentos Com o objetivo de verificar quo estveis os pigmentos de Monascus podem ser em aplicaes diversas, alguns ensaios foram realizados com a incubao de solues aquosas e alcolicas de pigmentos em diferentes condies de temperatura e pH. A estabilidade foi medida atravs da avaliao da absorbncia dos extratos. A absorbncia das solues aquosas de pigmentos de Monascus diminui com o tempo, em qualquer das condies testadas. A diminuio na absorbncia mais significativa em temperaturas mais altas; a Figura 25 mostra esse efeito para 5 amostras de pigmentos em soluo aquosa a pH 6 (um valor tpico para alimentos) e diferentes temperaturas:

76

Figura 25 variao da cor (medida como absorbncia relativa) com o tempo (em h) para solues aquosas de pigmento, a diferentes temperaturas de incubao com pH 6

1,0 0,9 0C 0,8 0,7 0,6 0,5 0 1 2 3 30 C 40 C 60 C 100 C

absorbncia relativa

tempo (h)

O efeito da temperatura similar ao efeito em outras degradaes trmicas, embora um modelo de Arrhenius (de decaimento exponencial) no represente bem o sistema. Isso se deve, possivelmente, ao fato de que o extrato uma mistura de pigmentos, cuja degradao pode se dar a diferentes velocidades e temperaturas. Fica claro, no entanto, que alteraes de cor devem ser esperadas na formulao de produtos com Monascus que exijam processamento trmico por exemplo, autoclavagem, secagem ou defumao. O efeito do pH igualmente claro: quando vrias amostras de pigmento foram incubadas mesma temperatura mas com diferentes valores de pH, na faixa de 4,1 a 7,9, observou-se que em pH mais baixos a diminuio da cor mais significativa. Esse efeito ilustrado na Figura 26:

77

Figura 26 Variao da cor (medida como absorbncia relativa) com o tempo (em h) para diferentes pHs, a 100 C

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,00

Absorbncia relativa

pH 4,1 pH 4,7 pH 6,0 pH 7,3 pH 7,9

0,50

1,00

Tempo (h)

1,50

2,00

2,50

3,00

A absorbncia diminui mais rapidamente em valores de pH baixos. Esse efeito pode ser um problema para o uso de Monascus em alimentos cidos, como iogurte. O efeito do pH pode ser devido acelerao de interaes com as molculas de pigmentos, como por exemplo o rompimento de uma ligao ster nos pigmentos rubropunctamina ou monascorubramina; isso fica claro quando se observa que a estabilidade dos pigmentos muito mais alta em etanol (dados no mostrados). O efeito do pH e da temperatura sumarizado a seguir (Tabela 17):
Tabela 17 Absorbncia residual relativa de solues de pigmentos, aps 25h de incubao a diferentes temperaturas e pHs. O valor mximo 1,00;os menores valores indicam a maior degradao. 0 0,799 0,870 0,831 0,827 0,837 Temperatura, C 32 40 60 0,863 0,794 0,493 0,885 0,820 0,460 0,865 0,805 0,572 0,843 0,863 0,724 0,916 0,883 0,789 100 0,132 0,149 0,155 0,266 0,531

pH 4,1 4,7 6,0 7,3 7,9

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Em uma tentativa de estabilizar os pigmentos, uma srie de solues a pH 7,0 com diferentes solutos como o antioxidante cido ascrbico, sais oxidantes de Fe3+ e Cu2+, e peptona (para providenciar grupos amino complexos, presentes em protenas) foram testados; nenhum desses fatores contribuiu apreciavelmente para a estabilizao dos pigmentos. Ensaios com as solues etanlicas mostraram alta estabilidade do pigmento, o que indica bom potencial de uso em bebidas alcolicas. Em resumo, os resultados indicam que h uma diminuio importante na cor para todos os pHs em temperaturas superiores a 60 C, e que em pH mais altos (prximos neutralidade) o pigmento mais estvel. Esses resultados esto em concordncia com os encontrados por Fabre et al. (1993) e Lee e Chen (2000). Estudos futuros devem ser voltados para o mecanismo de degradao, provendo informao para a estabilizao de pigmentos. A perda de cor por degradao na indstria de alimentos comum, justamente por se utilizar pigmentos naturais com freqncia. Por isso, pigmentos de Monascus continuam sendo um aditivo de cor promissor, mas preciso considerar na formulao do produto que parte da cor pode degradar, dependendo das condies de processo e do tipo de alimento.

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5 CONCLUSES E SUGESTES No presente trabalho comparou-se uma linhagem isolada de Monascus sp com outras linhagens, avaliou-se substratos potenciais, mtodos de extrao de pigmento, formas de produo em arroz e estabilidade dos pigmentos produzidos. A partir dos resultados obtidos, pode-se chegar s seguintes concluses: 5.1.1 LPB 31 uma linhagem adequada para a produo industrial de pigmentos. Os resultados obtidos mostram que a cepa isolada, LPB 31, uma linhagem de Monascus sp com capacidade de crescimento equivalente ou superior s outras linhagens testadas, tanto em arroz como em bagao de mandioca, em frascos. O teor de citrinina no fermentado produzido por essa linhagem inferior ao obtido com as outras linhagens testadas, e mesmo inferior ao teor no produto comercial. A produo de pigmentos e a produtividade, foram superiores s das outras linhagens testadas, perdendo apenas para o produto comercial (produo 13% menor), donde pode-se concluir que a linhagem LPB 31 adequada para a produo industrial de pigmentos de Monascus, sobre arroz. 5.1.2 Etanol o solvente orgnico mais adequado para a extrao de pigmentos. Para extrair pigmentos de Monascus, sugere-se o uso de etanol at a concentrao de 60% no meio extrativo, ou outro sistema de solventes de forma que o ndice de polaridade mdio do meio seja igual a 7. A forma de extrao mais conveniente industrialmente a agitao por 1h do fermentado com o solvente, temperatura ambiente, na proporo de 3 partes de solvente para 1 parte de fermentado seco. Extraes exaustivas podem aumentar o rendimento da extrao em 20%. No entanto, o uso de etanol mais concentrado favorece a posterior evaporao do solvente. 5.1.3 Arroz o substrato bruto mais adequado para a produo de pigmentos. Embora a produo de pigmentos de Monascus seja possvel em substratos diversos, que com uma otimizao podem vir a apresentar produo compatvel com a obtida em arroz, quando se trata de substratos puros (outros cereais e tubrculos),

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o arroz o que fornece a maior produo de pigmentos. O bagao de mandioca, substrato-alvo inicial do presente trabalho, apresenta em condies timas uma produo cerca de 10 vezes menor que a de arroz. 5.1.4 Bagao de mandioca puro um substrato potencial para produo de extratos. Embora a produo em arroz seja 10 vezes superior obtida em BM, este substrato um resduo agroindustrial, cujo custo pode justificar o seu uso para a produo de extratos (o uso de BM fermentado seco como aditivo no seria possvel, devido ao baixo teor de cor). Outra vantagem do BM a maior porosidade e menor aglutinao, que o tornam candidato produo com escalas maiores de fermentao. 5.1.5 Condies para cultivo em meio slido arroz. Para a produo de pigmentos de Monascus em FSS, as condies mais adequadas so aerao forada (com ar saturado de umidade) de 1NmL/min.g de substrato mido, para um leito de 8 cm de altura, durante 8 dias, com inculo vegetativo, a 32 C. Obtm-se nessas condies uma velocidade especfica mxima de crescimento de 0,039h-1, e uma velocidade especfica de produo de pigmentos de 27,5 UA/g biomassa.h-1. A produo tambm pode ser feita em bandejas, com produo de quase igual (embora reconhea-se a necessidade da otimizao de condies no reator). Nesse caso recomenda-se uma altura de leito de 2 cm. 5.1.6 Estabilidade de pigmentos de Monascus. Os pigmentos de Monascus so instveis frente a extremos de pH e temperaturas altas, devendo ser usados em aplicaes a temperaturas inferiores a 60 C e pH prximos da neutralidade. O pigmento especialmente adequado para aplicao em alimentos refrigerados, caso em que a degradao de cor baixa, ou em bebidas alcolicas caso em que a degradao de cor no pode ser observada em um intervalo de vrios meses.

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5.2 Sugestes para trabalhos futuros Seguem algumas sugestes para futuros trabalhos relacionados a este tema, no LPB. 5.2.1 Gerao e seleo de linhagens mutantes de Monascus A maior parte dos pigmentos produzidos por Monascus sp intracelular, comum a frao pequena de pigmentos hidrossolveis. Como a verificao qualitativa da produo de pigmentos em placas de Petri simples, por inspeo, possvel tentar gerar mutantes (usando luz ultravioleta) que produzam mais pigmentos hidrossolveis. Essa uma forma simples de aumentar o potencial industrial de linhagens j conhecidas. 5.2.2 Formulaes com substratos mistos Como a maior produo de pigmentos se d com o arroz, que um substrato de fcil aglutinao e compactao para escalas de processo, ensaios futuros de produo de pigmentos deveriam incluir um estudo de formulaes de arroz + BM, procurando um compromisso entre a produo de pigmentos e a compactao do meio. 5.2.3 Desenvolvimento de um condicionador de ar para reatores de FSS Um dos problemas encontrados na fermentao em reator o controle de temperatura do meio de fermentao. Um condicionador do ar de entrada, controlado usando como referncia a temperatura mdia no leito do reator certamente melhorar a qualidade das fermentaes.

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