02 Revista Latinoamericana de Biotecnologia Ambiental y Algal

Revista Latinoamericana de BiotecnologaVolumen Ambiental y Algal 1 No.
1, 2010 RELBAA
Revista Latinoamericana de Biotecnologa Ambiental y Algal

RELBAA
www3.inecol.edu.mx/relbaa
Cdula de integracin No. 00000-354. Folio No. 00000-355 Reserva 04-2009-062211101200-102
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Revista Latinoamericana de Biotecnologa Ambiental y Algal RELBAA
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REVISTA LATINOAMERICANA DE BIOTECNOLOGA AMBIENTAL Y ALGAL // INSTITUTO DE ECOLOGA, A.C.
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Objetivos y Temtica
La Revista Latinoamericana de Biotecnologa Ambiental y Algal (RELBAA), es la primera revista en la regin, dedicada a la publicacin de trabajos inditos de carcter cientfico y/o de desarrollo tecnolgico, revisiones crticas y notas cientficas relacionados con la biotecnologa ambiental y algal, y tambin con bioprocesos ms limpios para el desarrollo sustentable. Asimismo, ofrece un foro para que la comunidad cientfica y tecnolgica latinoamericana, comunique sus investigaciones en el mbito internacional. Los manuscritos enviados se sometern a un proceso riguroso de revisin por pares. Se considera a la Biotecnologa Ambiental como un campo multidisciplinario que integra las ciencias y la ingeniera con el objeto de aprovechar el potencial bioqumico de los microorganismos, plantas, animales y su material gentico, para desarrollar, usar y regular sistemas biolgicos para la remediacin de ambientes contaminados (suelo, aire, agua), as como para generar procesos ambientalmente pertinentes para el uso sustentable de los recursos naturales y la conservacin del medio ambiente. Por otra parte, se considera a la Biotecnologa Algal como un campo en donde se integran las ciencias y la ingeniera para el aprovechamiento de las microalgas y de las macroalgas con la finalidad de generar nuevos productos de inters alimentario, farmacutico o energtico y/o para lograr el reciclaje de nutrientes de aguas residuales y/o la captura de carbono y su transformacin en biomasa algal. Finalmente, es importante sealar que en esta revista tambin se incluye la temtica de los Bioprocesos ms Limpios, en consideracin a que contribuyen al desarrollo industrial sustentable. Se adopta la definicin de Produccin ms Limpia de Naciones Unidas: es la aplicacin continua de una estrategia ambiental integrada y preventiva a procesos, productos y servicios para incrementar la eco-eficiencia y reducir riesgos a los seres humanos y el medio ambiente. La revista es una publicacin semestral a cargo de un grupo de investigadores del rea de Biotecnologa Ambiental del Instituto de Ecologa, A.C. Ocasionalmente aparecern nmeros especiales. Se aceptan trabajos en espaol, ingls y portugus. Considerando que la tendencia actual es la publicacin en formato electrnico logrando ahorro de papel, esta revista se publicar exclusivamente en este formato y estar accesible al pblico en general sin costo, por lo menos el primer ao. Sin embargo, es esencial que los usuarios citen los artculos dando crdito a los autores y a la revista, citando la referencia completa como aparece en todas las pginas de cada uno de ellos.

CONTENIDO
Vol. 1 No. 1 2010
Artculos originales de investigacin

Effect of culture medium and nutrient concentration on fatty acid content of Chaetoceros muelleri Juan Manuel Pacheco Vega, Marco Antonio Cadena Roa, M. del Pilar Snchez Saavedra, Dariel Tovar Ramrez y Carlos Rangel Dvalos (Mxico) ............................................................. 6 Variacin estacional de arsnico total en algas comestibles recolectadas en el Golfo San Jorge (Chubut, Argentina) Adriana A. Perez, Laura B. Perez, Analia M. Strobl, Silvina Camarda, Silvia S. Farias, Clara M. Lpez y Mara A. Fajardo (Argentina) ................................................................................... 16 Eliminao autotrfica de nitrognio pela oxidao de tiossulfato atravs de uma cultura mista de microrganismos Rafael S. Amim, Fabrcio B. Santana, Willibaldo Schmidell y Hugo M. Soares (Brasil) ............ 31
Revisiones crticas
Mecanismos de interaccin con cromo y aplicaciones biotecnolgicas en hongos J. Flix Gutirrez Corona, ngeles E. Espino Saldaa, Alejandro Coreo Alonso, Francisco Javier Acevedo Aguilar, Georgina E. Reyna Lpez, Francisco Jos Fernndez, Araceli Tomasini, Kazimierz Wrobel y Katarzyna Wrobel (Mxico) ....................................................... 47 Arthrospira platensis como biofactora de metabolitos secundarios de inters farmacolgico: el cido pipeclico Leopoldo Naranjo-Briceo, Diego Rojas-Tortolero, Hctor Gonzlez, Rubn Torres Parra, Jorge Zegarra Narro, Luca Sena DAnna, y Daynet Sosa del Castill o (Venezuela) .................... 64 Las microalgas oleaginosas como fuente de biodiesel: retos y oportunidades Maribel M. Loera-Quezada y Eugenia J. Olgun (Mxico) .......................................................... 91
Nota Cientfica
Spirulina (Arthrospira) platensis en la prevencin del fotodao celular producido por luz ultravioleta en ratones CF1 Luca Lpez-Agero, Mnica M. Storni, M. Cristina Zaccaro, Ana M. Stella y Gloria Zulpa (Argentina) ........................................................................................................................ 117
Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 6 Artculo original de investigacin
Effect of culture medium and nutrient concentration on fatty acid content of Chaetoceros muelleri
Juan Manuel Pacheco Vega1*, Marco Antonio Cadena Roa1, M. del Pilar Snchez Saavedra2, Dariel Tovar Ramrez3 y Carlos Rangel Dvalos1
Universidad Autnoma de Baja California Sur (UABCS), Apartado Postal 19-B. C.P. 23080. La Paz, Baja California Sur, Mxico. 2 Centro de Investigacin Cientfica y de Educacin Superior de Ensenada (CICESE). Departamento de Acuicultura, Kilmetro 107 Carretera Tijuana-Ensenada. Apartado Postal 2732 C.P. 22860. Ensenada, Baja California, Mxico. 3 Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste (CIBNOR) S.C. Apartado Postal 128, C.P. 23000. La Paz, Baja California Sur, Mxico.
* 1
Author of correspondence: pacheco@uabcs.mx
Resumen
Los cidos grasos en microalgas bajo cultivo pueden ser modificados por las condiciones de cultivo. La propuesta de este trabajo fue determinar el efecto de las formas de nitrgeno y su concentracin en el contenido de cidos grasos polinsaturados (PUFA) de Chaetoceros muelleri. La microalga C. muelleri fue mantenida en cultivos estticos a 19C y una intensidad de luz de 150 mmol m-2s-1. El medio fue utilizado como control. Las microalgas se cultivaron en tres diferentes concentraciones de medio de cultivo (f, f/2 y f/4). El medio de cultivo experimental fue preparado con fertilizantes agrcolas lquidos (AF) en tres diferentes concentraciones (AF, AF/2 y AF/4). La microalga se cosech en la fase exponencial. La extraccin de cidos grasos fue por transterificacin directa y su cuantificacin por cromatografa de gases. El mayor porcentaje de cidos grasos altamente insaturados (HUFA) se obtuvo al utilizar el medio f/2 (8.65%), mientras que el menor porcentaje se obtuvo al utilizar el medio a base de fertilizantes agrcolas (5.78%). Se encontr una relacin directa entre la cantidad de HUFA y la concentracin de nutrientes en ambos tipos de medio de cultivo. Se concluye que para obtener el mayor contenido de HUFA en C. muelleri, sta debe ser cultivada en el medio f/2 o su equivalente AF/2. Adicionalmente, dicha prctica disminuye el costo de nutrientes. Palabras clave: microalgas, Chaetoceros muelleri, cidos grasos, fertilizantes agrcolas, medio de cultivo.
Abstract
Fatty acid content in microalgae can be modified by culture conditions. The purpose of this study was to determine the effect of nitrogen sources and their concentration in the polyunsaturated fatty acid (PUFAs) contents of cultured Chaetoceros muelleri. Chaetoceros muelleri was batch cultured at 19C and a continuous light intensity of 150 mmol m -2s-1. Three different concentrations of culture medium (f, f/2 and f/4) were used. The experimental medium was prepared with liquid agricultural fertilizers (AF) in three concentrations (AF, AF/2 and AF/4).
Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 7 Chaetoceros muelleri was harvested at lag phase. Extraction of fatty acids was performed by direct transesterification and quantified by gas chromatography. The highest HUFA percentage was obtained with f/2 medium (8.65%), while the lowest was obtained with AF/2 medium (5.78%). A direct relationship between HUFA concentration and nutrient concentration in both culture media was found. It is concluded that C. muelleri must be cultured with f/2 medium or its equivalent AF/2 in an effort to obtain the highest HUFAs content. Additionally, the use of AF/2 medium results in a more cost effective option. Key words: microalgae, Chaetoceros muelleri, fatty acids, agricultural fertilizers, culture medium.
1. Introduction
Microalgae cultures are used to feed fish larvae, crustacean larvae and mollusks in all stages (Meireles et al. 2003). Survival and growth of these organisms is determined by the nutritional quality of these cultures, which is also related to the content of highly polyunsaturated fatty acids (HUFAs) (Spektorova et al. 1986; Meireles et al. 2003). Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) have specific physiological functions such as being structural components of phospholipid biomembranes (Trautwein 2001, Miliou et al. 2006). Several groups of marine organisms (e.g. fishes and shrimps) require an exogenous incorporation of PUFA due to their inability to synthesize them. The biochemical composition of microalgae can be modified as a function of culture conditions such as temperature, light intensity and spectral composition, source and concentration of nitrogen (Reitan et al. 1994). Among the different microalgae species used in aquaculture, C. muelleri is one of the most commonly used due to its biochemical composition and ease of production. Agricultural fertilizers are widely used in the preparation of media for microalgae in outdoor cultures for commercial aquaculture in Northwest Mxico (Lpez-Elas et al. 2005). However, fertilizers frequently contain more than one nitrogen source. This may affect their relative availability for
microalgae uptake and growth, causing variations in biomass yield and biochemical composition (Lourenco et al. 2002; Richmond 2003). The aim of this study was to compare the production of HUFA by C. muelleri grown with different concentrations of a standard medium (f medium) and with a non-conventional medium obtained from agricultural fertilizers containing different nitrogen sources (e.g. urea, ammonium and nitrate).
2. Materials and methods

2.1 Culture maintenance The C. muelleri strain used in this study was obtained from the microalgae culture collection of the Centro de Investigacin Cientfica y de Educacin Superior de Ensenada (CICESE). The main strain was isolated from the Oceanic Institute of Hawaii, USA in 1981. The culture was kept non-axenic and in f/2 medium (Guillard 1975) at 19 C with continuous white light at 150 moles m-2s-1. The experiments in this study were conducted at Pichilingue Aquaculture Laboratory (latitude: 2416'12.80"N, longitude: 11019'19.20"W) at the Universidad Autonoma de Baja California Sur. Seawater was filtered through 10, 5 and 1 m cotton filters and UV irradiated. For culture maintenance, seawater was sterilized as described by Guillard and Ryther (1962). For plastic bag cultures, seawater was
Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 8 disinfected as mentioned by Hemerick (1973). Agricultural fertilizers were prepared with 72% phosphoric acid as the source of phosphorous plus a liquid fertilizer, with 32% total nitrogen provided as urea (16.4%) and ammonium nitrate (15.6%). These proportions matched the phosphorous and nitrogen concentrations of the f/2 medium. The f/2 medium (Guillard 1975) was used as control. For both culture media, three nutrient concentrations were used: f, f/2, f/4 and AF, AF/2, AF/4 (Table 1)
Table 1. Nutrient composition and concentration of the different culture media used in the present study.
Component /
Macronutrients Nitrogen: Nitrate (7.8%), Ammonium (7.8%), Urea (16.4 %). Phosphoric acid Sodium phosphate Silica Micronutrients EDTA-Fe Copper sulfate Zinc sulfate Cobalt chloride Manganese chloride Sodium molybdate Vitamins Biotin Cyanocobalamin (B12) Thiamine HCl (B1) *Only nitrate
AF
mL L
-1
AF/2
ml L
-1
AF/4
mL L
-1
f
mg L
-1
f/2
mg L
-1
f/4
mg L-1 37.5* 2.5 15 g L-1 2.1 4.9 11.0 5.0 90.0 31.5 mg L-1 0.5 0.5 10.0
118.4 4.8 1000.0 gL

-1
59.2 2.4 500.0 gL

-1
29.6 1.2 250.0 gL

-1
150* 10 60 gL
-1
75* 5 30 g
L-1
8.6 19.6 44.0 20.0 360.0 126.0 mg L

-1
4.3 9.8 22.0 10.0 180.0 63.0 mg L

-1
2.1 4.9 11.0 5.0 90.0 31.5 mg L

-1
8.6 19.6 44.0 20.0 360.0 126.0 mg L

-1
4.3 9.8 22.0 10.0 180.0 63.0 mg L

-1
2.0 2.0 40.0
1.0 1.0 20.0
0.5 0.5 10.0
2.0 2.0 40.0
1.0 1.0 20.0
2.2 Acclimation of the microalgae in the culture media Triplicate non-axenic cultures were kept for eight days in 250 ml Erlenmeyer flasks with 150 ml of the three control nutrient concentrations (f, f/2, f/4) and nonconventional (AF, AF/2, AF/4) culture media. For each culture condition plastic translucent bags of 28 cm x 66 cm (9 L), were conducted in triplicate. Cell concentrations were measured daily with a Beckman DU 640 spectrophotometer at 550 nm. The pH was measured daily with an Orion 301 pH meter and maintained at 7-
8. The specific growth rate was measured as described by Fogg and Thake (1987). The cultures were maintained at 19 C with continuous light at 150 moles m -2s-1. Triplicate samples were used to evaluate biomass production and cell composition. Total dry weight was determined gravimetrically according to Sorokin (1973). Protein content was determined according to Lowry et al. (1951) modified by Malara and Charra (1972). Carbohydrates were determined according to White (1987) and Dubois et al. (1956). Lipids were determined colorimetrically according to
Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 9 Pande et al. (1963), after extraction with the method of Bligh and Dyer (1959) modified by Chiaverini (1972). 2.3 Extraction and characterization of fatty acids Samples of each experimental condition (400 mL) were collected on the fourth day of culture post acclimation. Each sample was concentrated to 30 mL by centrifugation at 3000 rpm for 18 min using an IEC Centra GP8R. Samples were then lyophilized with a LABCONCO freeze dry system/freezone 4.5. The extraction of fatty acids was done by direct transesterification (Carrapiso and Garcia 2000). Injection of the samples was then performed in a gas chromatograph, Varian CP-3800, fitted with a Mass Detector 1200L. The samples were injected in 1 l volumes into a capillary column Omegawax 250 of Funded Silica with dimensions of 30m X 0.25 mm X 0.25 um (SUPELCO). The carrier gas was helium (99%) at a flowrate of 1.2 ml min-1. Identification of fatty acids was made by comparing the obtained retention times with those of commercial standards of methyl-esters of PUFA (Kit, SIGMA). In addition, further confirmation was performed by comparing the masses of the obtained compounds with those in a mass spectra (NBS75K and NIST98) library. 2.4 Statistic analysis Statistical analysis was performed using STATISTIC 7.0 software for Windows (Statsoft, USA). Percentage data obtained from the proximal composition and fatty acid profiles were arcsine-square-root transformed prior to analysis. Differences in cell concentration, specific growth rate, dry weight and proximal composition of C. muelleri cultured under the experimental conditions were determined by one-way analysis of variance (ANOVA). When variances were homogeneous and residuals were normally distributed, a Tukey a posteriori test was used to identify significant differences among treatments (P< 0.05). Differences in the percentage of each fatty acid as a function of the culture media and concentration of nutrients were determined with a two-way analysis of variance.
3. Results
Cell concentration and growth rate was significantly different among treatments (P<0.05). The lowest density was obtained in the treatment AF/4, while maximum density was obtained with the AF treatment. Significant differences were found in the growth rate among treatments (P<0.05) (Table 2). The microalgae had the slowest growth rate in AF/4 medium, while maximum growth rates were observed with the f, f/2 and AF/2 media (Table 2). In terms of the proximal composition, the highest protein content was observed with the AF, AF/2, AF/4, f and f/2 treatments, which f/4 had lower protein content (P<0.05). Regarding lipid content, no significant differences were observed for the culture media treatments (P>0.05). The carbohydrate content was not significantly different among treatments (P>0.05) (Table 2). The major saturated fatty acid (SFA) was obtained AF/4 medium, while AF, AF/2, f, f/2 and f/4 had lower content (Table 3). There were significant differences in the fatty acid profiles of monounsaturated (MUFA) polyunsaturated (PUFA) and highly unsaturated fatty acids (HUFA) of C. muelleri due to the culture medium and concentration (P< 0.05).
Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 10

Table 2. Mean values and standard deviations of cell concentrations (106 cells ml-1), specific growth rate (divisions day-1), dry weight (g per 106 cells) and proximate composition (as percentage of dry weight) of Chaetoceros muelleri cultures in f and AF media prepared with agricultural fertilizer (AF) at different nutrient concentrations. Standard deviation is indicated in brackets; values with the same letter within the same row indicate that they are not significantly different (P>0.05; a>b>c>d>e>f). Parameter Culture medium f Cell concentration 1846.8 (152.9)d Specific growth rate Proteins 0.832 (0.02) 28.9 (3.4) Lipids 6.5 (0.1) Carbohydrates 16.4 (2.0) Dry weight 57.5 (5.2)
b a a a a
f/2 2482.1 (206.9)f 0.914 (0.11) 29.9 (0.6) 7.0 (0.2) 17.8 (2.6) 58.0 (2.0)
b a a a a
f/4 488.1 (45.1)d 0.479 (0.11) 22.7 (0.2) 6.1 (0.6) 18.0 (1.2) 71.4 (6.8)
a a a b b
AF 3818.7 (478.3)a 0.860 (0.13) 25.1 (0.7) 6.5 (0.9) 18.2 (0.1) 54.6 (5.0)
b a a a a
AF/2 2907.5 (141.2)b 0.548 (0.10) 27.2 (3.2) 7.3 (0.2) 19.6 (2.7) 52.6 (2.2)
b a a a b
AF/4 803.7 (19.4)e 0.378 (0.07)c 29.6 (3.6)a 7.2 (0.3)a 21.4 (2.2)a 77.4 (6.8)a
The lowest SAFA concentration was found in f media (50.33%) and the highest in AF/2 media (63.95%). The lowest MUFA concentration was found in the AF/4 treatment (28.45%) and the highest value was for F/4 treatment (36.51%). The lowest PUFA was for AF/4 media (4.62%) while that the highest value was for f/2 treatment (17.18%). Significant differences were obtained in the concentration of HUFAs (P<0.05) such as arachidonic acid (ARA), eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) due to culture medium and concentration. The lowest HUFA percentages were observed in treatment AF/4 (1.25%) and the highest percentage was for treatment f/2 (8.65%). The EPA (20:5 n-3) levels in both culture media and all concentrations were significantly different (P<0.05). Arachidonic acid (20:4 n-6) was not detected in the AF treatment. Docosohexaenoic acid
(22:6 n-3) was only detected in the AF/2 treatment (Table 3).
4. Discussion
The biochemical composition of C. muelleri can be altered by the culture medium and the nutrient concentration in the medium. As expected, those media with the lowest concentrations of nutrients (f/4 and AF/4) showed the lowest cell densities, possibly due to the effect of low nutrient concentration on the metabolic processes of the microalgae (Darley 1987). Different nitrogen sources could have affected microalgae growth, as it is well known that in plant tissues nutrient assimilation and transport is modulated by nitrogen sources. For instance, reduced nitrogen forms (ammonium and urea) are preferred over more oxidized forms, such as nitrate or nitrite (Iriarte et al. 2007).

Table 3. Mean values of fatty acids of Chaetoceros mulleri cultures in f and AF media with different nutrient concentrations. Data is presented as percentage of fatty acids; values with the same letter within the same row indicate that they are not significantly different ( P>0.05; a>b>c>d>e>f). Culture medium f 18.35 b 1.10 a 28.70cde Trace 1.25 b 0.48 b 0.45 c 50.33 f/2 24.19 ab 1.05 a 21.55 d 0.05 c 3.38 a 0.57 b 0.80 b 51.59 f/4 13.69 c 1.19 a 36.28 b 0.10 a 0.15 a 0.80 b 52.21 AF 25.68 a 1.40 a 25.07 de 0.08 b 0.28 d 0.17 d 0.63 b 53.31 AF/2 15.32 bc 1.17 a 32.38 ce 0.04 c 0.72 c 2.11 a 1.48 a 0.28 a 53.5 AF/4 13.78 bc 1.37 a 47.15 a 0.11 a 0.33 c 1.21 a 63.95
Fatty acid Saturated 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 Sum SAFA Monounsaturated 16:1 (n-7) 16-1 (n-5) 17:1 22:1 (n-7) 22:1 (n-9) 20:1 (n-6) Sum MUFA Polyunsaturated 16:2 (n-4) 16:3 (n-3) 18:2 (n-6) 18:3 (n-3) 18:4 (n-3) 20:4 (n-6) 20:5 (n-3) 22:6 (n-3) Sum HUFA (ARA, EPA and DHA)
29.04 bc 0.41 ab 0.47 a 4.69 34.61
32.15 ab 0.37 b 0.19 b 1.09 b 33.80
36.11 a 0.18 b 0.08 c 0.13 c 36.51
27.98 bc 0.65 ab 0.18 b 0.81 a 29.62
33.39 ab 0.29 b 0.06 c 0.17 c 2.11 a 36.02
27.85 bc 0.14 b 0.46 b 28.45
3.96 a 5.50 ab 1.07 0.23 c trace 4.06 e 4.06

ab
3.30 b 4.35 b 0.17

d
1.04 c 0.81 c 1.11

b
2.21 b 6.77 0.52 4.80 b 4.80

a c
1.58 c 3.95 b 0.44

c
0.73 c 0.89 c 1.14 a 0.43 b 0.18 a 0.13 d 1.12 f 1.25 4.62
0.71 a trace 1.24 b 7.41 a 8.65
0.34 bc 0.03 b 0.50 c 0.99 d 1.49
0.34 b
0.95 a trace 0.26 c 4.58 c 0.94 5.78 12.70
Sum PUFA 14.82 17.18 4.82 14.64 Trace= detection of fatty acids present in trace amounts, - not detected.
11
South and Whittick (1987) described that nitrogen sources that are reduced to ammonium (NH+4) are preferably used for amino acid biosynthesis. The low protein concentration in the f/2 medium could have had an effect on the low cell densities obtained. The nitrogen deficiency in the microalgae, due to nitrogen limitation during the log phase, possibly affected protein synthesis, thus reducing the amount of soluble protein available for metabolic processes. This was also observed by Matos Moura et al. (2007). An increase in the lipid content of the cultures with lower nutrient content was observed, since the accumulation of lipids in microalgae can be induced by nitrogen limitation in the medium (Snchez-Saavedra and Voltolina 2005, Medina-Reyna and Cordero-Esquivel, 1998). In other studies, results obtained with Nannochloris atomus and Tetraselmis sp. showed that the lipid content decreases when a limitation of phosphorus exists (Reitan et al. 1994). We found no differences in the percentages of carbohydrates. Collectively, these results suggest that by the third day of culture (harvest day), the microalgae had not been able to accumulate carbohydrates. The low dry weight in the microalgae cultured with f/2 and AF/2 is attributed to the decline of nutrients in the media, which eventually leads to a decrease in the cellular content. Desaturases catalyze the formation of double bonds for the conformation of unsaturated fatty acids (Martin et al. 2007). Previous studies with Euglena gracilis found that the desaturase acitivty is stimulated when cultures are in the presence of NH+4. Also, quantitative differences between distinct forms of nitrogen can be determined from the intake of nutrients by cells. In cyanobacteria, it is known that there is a periplasmic protein that makes solute binding easier. These are integral
cytoplasmic proteins with ATPase activity associated that regulate the intake of NO-3 and NO-2 into the cell (Wu and Stewart, 1998; Martinez-Espinosa 2003). However, in eukaryotic cells such as C. muelleri, NH4+ permeates through biological membranes (Martinez-Espinoza 2003). Therefore, our results show that the nutrient concentrations of f/2 and AF/2 facilitate cell intake, thus producing in this way the highest levels of HUFA. Results in this study also show that the fatty acid profile of C. muelleri can be modified by the concentration and source of nitrogen. Liang and Mai (2005) found that in C. gracilis the total amount of MUFA increased while that of PUFA decreased with culture age. These trends were also observed in the present study. The biosynthesis of fatty acids in chloloroplasts may be regulated by acetyl coenzime-A and malanolin-ACPs, which are enzymes that initiate the formation of ACP protein transporters (Mcginnis and Sommerfeld 2000). In addition, the proportion of PUFA in C. muelleri may vary when different nitrogen sources are used (Post-Beittenmiller et al. 1992 and Liang et al. 2006). For instance, in a study by the later authors, urea was the only chemical form that yielded a high quantity of 20:5 n-3 fatty acids, followed by nitrates and ammonia. In that same study, no significant differences were found in the content of other HUFAs, such as DHA. The present results do not show a clear relationship among the contents of HUFAs. Low (f/4 and AF/4) and high (AF) nutrient concentration diminished the HUFA concentration in C. muelleri. On the other hand, induced stress by reducing nutrient concentration in the culture media increased the total lipid content of the microalgae. However, this not always applies to the HUFA proportion.
Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 13 The results presented in this work are in agreement with those of Pernet et al. (2003), who mentioned that total lipids in C. muelleri could increase because of nutrient deficiency. The relative proportion of nutrients can modify the fatty acid profile of the microalgae, increasing SAFA and MUFA proportion and in smaller amount PUFA content. The percentage of phosphorus was found to be the limiting nutrient related to the synthesis of phospholipids. Nevertheless, fatty acid biosynthesis and proportion may vary according to the microalgae species (GuanQun 2007).
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5. Conclusions
Based on the results of the present study it is concluded that, under the described conditions, the specific growth of a four-day culture of C. muelleri is affected when the culture medium contains a low concentration of nutrients (f/4 and AF/4). Depending on the desired major cellular component (proteins, lipids or carbohydrates) it is recommended to use the culture medium accordingly. To get the highest value of HUFAs, the use of f/2 or the proposed AF medium (agricultural fertilizers) is recommended.
Acknowledgments
This work was supported by the internal project AICM-CTM-04-11-25-11-05-24 of Universidad Autnoma de Baja California Sur and the project SEP-CONACyT 454844. We would like to thank Daniel Porras for his assistance and Laura Carren for technical training. We also thank Dr. L. Salinas-Flores for critical and English review of the original manuscript.
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Perez et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):16-30
16 Artculo original de investigacin
Variacin estacional de arsnico total en algas comestibles recolectadas en el Golfo San Jorge (Chubut, Argentina)
Adriana A. Perez1*, Laura B. Perez1, Analia M. Strobl1, Silvina Camarda1, Silvia S. Farias2, Clara M. Lpez 3 y Mara A. Fajardo1
1
Centro Regional de Investigacin y Desarrollo Cientfico Tecnolgico (CRIDECIT), Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Comodoro Rivadavia, Chubut, Argentina. 2 Comisin Nacional de Energa Atmica, Gerencia de Tecnologa y Medio Ambiente (CNEA). Buenos Aires, Argentina. 3 Ctedra de Toxicologa y Qumica legal. Universidad da Buenos Aires (UBA). Buenos Aires, Argentina. J. M. Rodrigo 527 (9000) Comodoro Rivadavia, Chubut.
*
Autor de correspondencia: aaperez@sinectis.com.ar
Resumen
En las costas Patagnicas Argentinas las macroalgas marinas son explotadas para la obtencin de ficocoloides destinados a la alimentacin y asimismo podran utilizarse como indicadoras de bioacumulacin de contaminantes metlicos. El objetivo de este trabajo, fue determinar la variacin estacional del arsnico total (As) en Porphyra columbina (alga roja) y Ulva sp. (alga verde) en tres zonas del Golfo San Jorge (Argentina) y evaluarlas desde el punto de vista de la inocuidad alimentaria. Las zonas de muestreo fueron Baha Solano (BS) y Punta Maqueda (PM), ambas alejadas de la actividad antropognica y la desembocadura del Arroyo La Mata (AM), sitio que recibe efluentes de la actividad petrolera e industrial. El As total se cuantific mediante un espectrmetro de emisin de plasma inductivo (ICP-OES) multielemental simultneo, axial, con detector de estado slido. En Porphyra columbina las medianas de la concentracin de As total, oscilaron entre 21,9 a 39,3 g g-1 peso seco (p.s.) con variacin estacional en AM y PM. En Ulva sp. las medianas fluctuaron entre 3,0 a 8,8 g g-1 p.s. y las variaciones estacionales se dieron en BS y PM. La Ingesta Semanal Tolerable Provisional de As (ISTP-OMS) para As inorgnico, que es la especie ms txica, es de 15 g-1kg de peso corporal por semana. Para una persona de 70 kg correspondera un ISTP de 1050 g As por semana. El consumo de 30 g de Porphyra columbina seca por semana, aportara valores de As cercanos al ISTP si se tratara slo de As inorgnico, mientras que el consumo de Ulva sp. no supondra un riesgo para la salud dado que Porphyra columbina bioconcentra ms As que Ulva sp. Se recomienda llevar a cabo estudios de especiacin de As para evaluar el riesgo real asociado a la ingesta de As a partir de macroalgas comestibles recolectadas en el Golfo San Jorge que bioacumulan As. Palabras clave: macroalgas, arsnico total, Porphyra columbina. Ulva sp., Argentina.
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Abstract
In Argentineans Patagonian coast, marine seaweeds are exploited to obtain ficocoloids and food, as well as to use them as pollutants biomonitors. The aim of this study was to determine the seasonal variation of total arsenic (As) in Porphyra columbina (red seaweed) and Ulva sp. (green seaweed) from three places of Gulf San Jorge (Argentina) and to evaluate them from the point of view of food safety. Sampling sites were located at Bay Solano (BS) and Punta Maqueda (PM) (non polluted areas, far from anthropogenic activities) and the mouth of the Arroyo La Mata (AM), area that receives effluents from the oil activity. Total As was quantified by multielemental, simultaneous inductively coupled plasma- optical emission spectrometry (ICP-OES) provided with axial view and of solid state detectors. Arsenic concentration, expressed in g g-1 dry weight (d.w.), in Porphyra columbina, ranged from 21.9 to 39.3; and seasonal variations for the metalloid were observed in AM and PM. For Ulva sp., Arsenic levels ranged between 3.0 at 8.78 g g-1 (d.w.); seasonal variations were detected in BS and PM. Provisional Tolerable Weekly Intake (PTWI) value of 15 g As week-1kg-1 corporal weight is referred to inorganic As. For a 70 kg person, a PTWI of 1,050 g As per week, would be expected. Considering As only present as inorganic As, a 30 g of Porphyra columbina (d.w.) intake per week would provide As values near to the As ISTP. In contrast, the intake of Ulva sp. would not represent a threat for human health. In conclusion, Porphyra columbina bioaccumulate much more As than Ulva sp. and represents a higher risk. Authors strongly suggest to carry out speciation studies related to As species present in edible seaweeds from San Jorge Gulf to evaluate the real health risk. Keywords: seaweed; total arsenic, Porphyra columbina; Ulva sp., Argentina.
1. Introduccin
El medio ambiente recibe aportes de elementos de origen natural y antropognico. Los naturales provienen de la formacin de menas, meteorizacin, erosin de rocas, lixiviacin y fenmenos asociados al vulcanismo. Los aportes de origen antropognico son consecuencia de la actividad humana, principalmente procedentes de la actividad industrial (Prs, 1980). El medio acutico y en especial el marino, es uno de los ambientes ms expuestos a los contaminantes debido a que es el receptculo final de todas las descargas naturales y de la actividad humana. Los ocanos cubren alrededor del 71% de la superficie terrestre, aproximadamente 360 millones de km2. Ellos son un espejo de la vida del planeta Tierra (Gerlach, 1981). Esta inmensidad contribuye al mito de que tienen una
capacidad de dilucin infinita y que por lo tanto, pueden considerarse como un gigantesco vertedero para todos los desperdicios del hombre. Los ocanos contienen ms de 30 elementos, metales o metaloides presentes en cantidades traza en los tres compartimentos: agua, sedimentos y biota marina. Sus concentraciones se ven incrementadas fcilmente con la contaminacin generada por la actividad antropognica. Algunos de esos elementos vertidos, como es el caso del As, pueden llegar a ser txicos para el crecimiento y el metabolismo de los vegetales y los animales marinos (Yun et al., 2001). El arsnico (As), un metaloide de color gris acero y de olor aliceo, se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza formando diferentes compuestos minerales. En su mayor parte, el arsnico es
18 transportado en el ambiente por el agua, donde est usualmente en forma inorgnica, como As (V) o As (III). En los organismos marinos, se han detectado especies arsenicales inorgnicas y orgnicas, estas ltimas de menor toxicidad como es la arsenobetana (que se encuentran en concentraciones elevadas en los pescados, moluscos y crustceos) y los arsenoazcares presentes en macroalgas marinas y en algunos moluscos (Cullen y Reimer, 1989; Rose et al., 2007). El As, ingresa al hombre por va digestiva a travs del agua, los alimentos y por malos hbitos higinicos en el trabajo (Falc et al., 2006). En sus formas inorgnicas pueden producir intoxicaciones tanto agudas como crnicas, y est considerado como un carcingeno para el hombre. Es genotxico y un conocido carcingeno asociado especialmente con cncer de hgado, pulmn y piel. El As (III) es capaz de unirse a los grupos sulfihidrilos e inhibir la accin de determinadas enzimas relacionadas con el metabolismo celular y la respiracin (Soria et al., 1995) y es generalmente reconocido por ser mas txico que el As (V) (Rose et al., 2007). La utilizacin de las macroalgas como alimento humano es una de las aplicaciones ms antiguas y se remonta al ao 2.700 a.C. en China. Paralelamente, los griegos y los romanos las empleaban como alimento, como plantas medicinales y en cosmtica. Este hbito tan antiguo se observa an en varios pases del sureste de Asia. Adems de ser utilizadas para la alimentacin, tienen aplicaciones industriales, agropecuarias, mdico-farmacolgicas, preparados cosmticos y en la restauracin ambiental (Mabeau y Fleurence, 1993; Caliceti et al., 2002). Se conocen unas 25.000 especies de algas, y el hombre utiliza para alimentarse unas 160 (25 verdes, 54 pardas y 81 rojas) (Leister y Morris, 1990). En Europa, desde hace unos aos, se estn convirtiendo en una autntica revolucin en materia alimentaria debido a su contenido en nutrientes (Darcy- Vrilln, 1993). En los pases occidentales el uso de algas ha estado relacionado tradicionalmente con la industria farmacutica y cosmtica. En las ltimas dcadas se ha incrementado el consumo directo de distintas especies de algas por los beneficios nutricionales y teraputicos ya que constituyen un alimento rico en protenas, minerales y vitaminas y otros nutrientes especficos como los cidos grasos poliinsaturados (Mabeau y Fleurence, 1993; Darcy-Vrillon, 1993; Van Netten et al., 2000). Las algas del litoral martimo argentino constituyen recursos naturales renovables econmicamente importantes (Ferrario et al., 1997). La mayora de las algas de la costa patagnica argentina son explotadas para la obtencin de ficocoloides. Sin embargo, existen especies con posible utilizacin en alimentacin como Porphyra columbina y Ulva sp. (Fajardo et al., 1998). La ingesta media de algas marinas en los pases occidentales est lejos de ser la de los pases orientales. En Japn, las algas llegan a representar hasta un 25% de la dieta diaria, siendo incorporadas directamente en estado fresco o seco. Los japoneses consumen anualmente un promedio de 1,6 kg de algas marinas secas por persona (Fujiwara-Arasaki et al., 1984) por lo que se estima una ingesta de 3,3 g en peso seco por da (Darcy-Vrillon, 1993); asimismo se debe considerar en todos los pases, la existencia de consumidores mayores al promedio porque siguen una dieta macrobitica y no se dispone de antecedentes correspondientes en la Argentina. Solamente se cuenta con datos previos realizados en la zona, los cuales determinaron que el consumo de 30 g de Porphyra columbina seca (tres cucharadas de algas seca y molida), contribuiran con una ingesta de 85 a 124 mg de cido
19 ascrbico, 400 a 636 mg de potasio, 200 a 272 mg de magnesio, de 6,2 a 9,0 g de protenas, y 11,6 a 16,3 de fibra diettica, en funcin de la estacin del ao en que sean recolectadas (Fajardo, 1998). Existe otro aspecto a tener en cuenta adems de los beneficios nutricionales y es el que las algas presentan una elevada capacidad de bioconcentrar no slo elementos esenciales, sino tambin elementos txicos del medio ambiente. Por dicha razn, si las algas provienen de reas contaminadas, su consumo puede representar un peligro para la salud pblica, aunque tambin pueden ser utilizadas como bioindicadoras de contaminacin y agentes de remediacin del ecosistema marino (Riget et al., 1997; Almela et al., 2002). En Argentina, las algas y productos derivados, carecen de regulacin especfica respecto al As. Desde el punto de vista de la evaluacin de la seguridad alimentaria de estos productos, la estimacin de la ingesta de arsnico inorgnico a travs del consumo de algas est siendo estudiada en pases europeos, en el Sudeste asitico y China (Yasui et al., 1983; Morita y Shibata, 1990; Almela et al., 2002; Laparra et al., 2003, 2004; FSA, 2004) y en forma ms exhaustiva desde que se ha encontrado una elevada concentracin de As total (103149 g g-1 p.s.) y As inorgnico (32,1- 69,5) en un alga utilizada para la alimentacin humana, llamada hiziki (Hizikia fusiforme). En tal sentido, en julio del 2004 la British Food Standard Agency advirti no ingerir esta alga por su elevada concentracin de As inorgnico (Besada et al., 2009). El objetivo de este trabajo fue determinar la variacin estacional del As total en Porphyra columbina (alga roja) y Ulva sp. (alga verde) del Golfo San Jorge (Argentina) y evaluar su seguridad como alimento. 2.1 Zona de Muestreo El Golfo San Jorge est situado en la costa de las provincias del Chubut y de Santa Cruz, entre el Cabo Dos Bahas y el Cabo Tres Puntas. De toda la costa Argentina es el golfo ms pronunciado, con acantilados activos que poseen una altura promedio de 2,50 m. La costa es muy irregular, con un rgimen macromareal alto, posee accidentes menores y plataformas de abrasin (localmente llamadas restingas) que quedan expuestas en bajamar. Las puntas de este golfo encierran una cuenca sedimentaria rica en hidrocarburos, denominada Cuenca del Golfo San Jorge (Sciutto, 1995). Considerando estas caractersticas, las zonas de muestreo elegidas de Norte a Sur fueron: 1) Baha Solano (BS): a 20 km al norte Comodoro Rivadavia Provincia de Chubut (45 38 L.S., 67 21 L.O.). Se caracteriza por estar alejada de la actividad antropognica. 2) Desembocadura del Arroyo La Mata (AM): se ubica a 10 km al Sur de Comodoro Rivadavia, Provincia de Chubut (45 52 L.S., 67 30 L.O.). Recibe efluentes de la actividad industrial y petrolera. 3) Punta Maqueda (PM): se ubica a 30 km. al Sur de Comodoro Rivadavia, en la Provincia de Santa Cruz (46 01, L.S., 67 34 L.O.). Se caracteriza por estar alejada de la actividad antropognica y por poseer una restinga rocosa con piletas de marea de poca extensin y profundidad. Los tres lugares de muestreo se observan en la Figura 1. En las zonas de muestreo se colectaron las especies de inters: Porphyra columbina y Ulva sp. estacionalmente (verano, otoo, invierno y primavera) durante el ao 2002. Al realizar la colecta se lavaron las algas in situ con abundante agua de mar para liberarlas de cuerpos extraos y de otras clases de algas (epfitas). Se guardaron en bolsas de polietileno y se transportaron refrigeradas a 5 C al laboratorio.
2. Materiales y Mtodos
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Figura 1. Golfo San Jorge sitios de muestreo: Baha Solano, Arroyo La Mata y Punta Maqueda
En el laboratorio se lavaron con agua ultra pura y se secaron a temperatura ambiente durante 24 horas. Finalmente el material se guard en envases plsticos, a -20 C hasta el momento de su procesamiento. Se conservaron rplicas en congelacin y se apart material algal para ser herborizado. 2.2 Lavado del material El material utilizado en la recoleccin, pretratamiento y mineralizacin de las especies estudiadas fue lavado con detergente neutro, enjuagado con agua, sumergido en HNO3 al 50% v/v durante 24 h y enjuagado 6 veces con agua ultra pura. El agua ultra pura fue obtenida por bidestilacin en destilador de vidrio convenientemente tratado con cido ntrico y luego enjuagado con agua ultra pura.
2.3 Control de calidad del mtodo analtico La exactitud de la metodologa se evalu de acuerdo a requerimientos de la Norma IRAM 301:2005 (equivalente a ISO/IEC 17025:05) y la gua EURACHEM-CITAC, 2000, empleando un material de referencia certificado (CRM) BCR 279 Sea lettuce, Ulva lactuca (Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM, Bruselas, Blgica). El material de referencia certificado (0,100 0,001 g) y un blanco de reactivos, fueron tratados y mineralizados en las mismas condiciones que las muestras para ser analizados cada 25 determinaciones. Los resultados no mostraron diferencias significativas con los valores certificados. La precisin evaluada como repetibilidad fue del orden del 5% para los mbitos de concentraciones evaluadas en este trabajo (Tabla 1).
21
Tabla 1. Concentracin promedio DE en material certificado de referencia BCR 279 (Sea lettuce) ao 2002, (n=10) Elemento Certificado Encontrado Recuperado g g-1 p.s. g g-1 p.s. % As 3,09 0,20 2,87 0,17 93,3 4,8 p.s.: peso seco
2.4 Determinacin de humedad y molienda De todas las algas recolectadas se eligieron al azar siete organismos de cada especie (siete muestras) los cuales fueron procesados individualmente. Se descongelaron, se llevaron a peso constante mediante el mtodo indirecto por desecacin en estufa a 100 5 C (AOAC, 2006) y se molieron en morteros de porcelana. 2.5 Mineralizacin Se pesaron 0,100 0,001 g 0,200 0,001 g de la muestra seca y molida de cada unidad muestral; se colocaron en vasos de Tefln (Parr Instrument Company, Illinois, USA) y se le agregaron 2 o 4 ml de HNO3 (J.T. Baker ACS, EEUU), respectivamente. Se colocaron en bombas de digestin, que fueron llevadas a un digestor de microondas para su puesta en solucin, a una potencia de 1200 watts (Sapp, 1991). Todos los mineralizados fueron guardados en recipiente de polipropileno a 20 C, hasta el momento de su cuantificacin. 2.6 Anlisis elemental cuantitativo Las determinaciones de As se realizaron mediante un espectrmetro de plasma inductivo de argn (ICP OES), axial, multielemental simultneo, provisto de detector de estado slido y automuestreador marca Perkin Elmer Optima 3100 XL (Perkin Elmer, Ma. USA), cuyo software operativo es el ICP- OPTIMA (Winlab 32 Versin 2.4). El argn fue de calidad soldadura para alimentacin de la descarga. Se emplearon argn y nitrgeno calidad ultrapuro para el enfriamiento de los detectores y para el sistema ptico, respectivamente, provistos
por Indura S.A. (Argentina) en ambos casos. Las lneas analticas fueron elegidas a partir de la biblioteca del equipo. Las curvas de calibracin se realizaron por sucesivas diluciones de un estndar comercial de As de concentracin 1000 g As/ml (CertiPUR Merck, Darmstadt, Alemania) en HNO3 1,5 M. Las muestras se analizaron por duplicado, previa dilucin 1/10, para ajustar los valores de acidez a los de las respectivas curvas de calibracin. Las concentraciones halladas en solucin en las muestras analizadas se obtuvieron por interpolacin en las respectivas curvas de calibracin. Los valores de concentracin de As (p/p) se obtuvieron corrigiendo esos valores por las pesadas y diluciones correspondientes. 2.7 Anlisis estadstico Los resultados descriptivos se expresaron como promedio con su desviacin estndar y mnimomximo (Min-Max) para poder comparar con los datos de bibliografa y como mediana y quartilo (Q25 - Q75) por tener una distribucin no paramtrica. Para evaluar la asociacin entre variables se utiliz el mtodo de las diferencias aplicando la prueba de Wilcoxon-Mann Whitney y Kruskal-Wallis empleando el test de Student-Newman-Keuls como prueba posthoc. Los clculos estadsticos se realizaron con el paquete informtico INSTAT 2.02 y se consider como estadsticamente significativo un valor de p<0,05 y altamente significativo un p<0,01 (Dawson y Trapp, 1994).
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3. Resultados
En las Tablas 2 y 3 se observan las concentraciones de As en Porphyra columbina y en Ulva sp., respectivamente, recolectadas en Baha Solano, Arroyo La
Mata y Punta Maqueda durante el ao 2002. En las Figuras 2 y 3 se observan las variaciones estacionales de las concentraciones de As en Porphyra columbina, y en Ulva sp.
Tabla 2. Concentraciones de As en Porphyra columbina (g g-1 p.s.) en Baha Solano, Arroyo La Mata y Punta Maqueda (n=7) Estacin del ao Verano Baha Solano 28,65,1 (18,8-34,3) 29,1 a (27,3-31,7) 35,24,5 (27,7-42,3) 35,2 a (33,8-36,7) 43,611,1 (37,1-65,8) 39,3 a (37,7-41,8) Nd Arroyo La Mata 33,84,5 (27,5-39,3) 34,0 a (30,9-37,1) 37,24,4 (31,6-44,3) 37,7 a (33,9-39,3) 30,7 12,3 (22,8-49,0) 25,5 a (24,6-31,6) 22,38,2 (12,9-28,3) 25,8 a (19,4-27,0) Punta Maqueda 22,94,4 (18,1-31,5) 21,9a (20,7-39,9) 34,716,8 (26,9-44,9) 34,9 a (29,2-38,8) 36,1 5,1 (29,4-43,1) 36,3 a (33,7-38,3) 35,66,3 (27,4-42,7) 36,1 a (33,6-38,1)
x DE (Min-Max) Mediana (Q25-Q75) x DE (Min-Max) Mediana (Q25-Q75) x DE

(Min-Max) Mediana (Q25-Q75)
Otoo
Invierno
Primavera
x DE (Min-Max) Mediana (Q25-Q75)
Superndices distintos en la misma fila indican diferencias estadsticamente significativas (p<0,05). Nd: no determinado. DE: desviacin estndar. p.s.: peso seco
4. Discusin
Del anlisis de la Tabla 2 se desprende que las concentraciones de As encontradas en Porphyra columbina, oscilaron entre 21,9 a 39,3 g g-1 p.s. y que no existen diferencias estadsticamente significativas entre los lugares de muestreo (p>0,05) en cada estacin del ao. Esto indicara que a pesar de que la desembocadura del Arroyo La Mata es una zona que recibe los efluentes
industriales y. petroleros no habra descargas de este elemento. Sin embargo, en Ulva sp. las concentraciones de As (que oscilaron entre 3,0 a 8,8 g g-1 p.s.) presentaron diferencias estadsticamente significativas entre los lugares de muestro en invierno y verano (p<0,05) siendo la desembocadura del Arroyo La Mata donde el alga exhibi valores mas altos (Tabla 3) .
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Tabla 3. Concentraciones de As en Ulva sp. (g g-1 p.s.) en Baha Solano, Arroyo La Mata y Punta Maqueda (n=7) Estacin del ao Verano Baha Solano 2,98 0,54 (2,09-3,45) 3,03 a (2,92-3,39) 7,79 0,94 (6,20-8,88) 8,10 a (7,42-8,23) 7,210,71 (6,27-7,98) 7,44 a (6,62-7,69) Nd Arroyo La Mata 5,612,42 (2,08-8,46) 6,47 b (3,79-7,35) 9,221,67 (7,13-11,7) 8,78 a (8,2-10,2) 8,150,79 (6,95-9,14) 8,16 a (7,75-8,69) 7,731,01 (6,7-9,04) 7,59 a (7,09-8,23) Punta Maqueda 4,560,97 (3,74-6,36) 4,02 a (3,86-5,04) 6,641,3 (4,11-8,10) 7,00 a (6,39-7,25) 6,311,51 (4,90-9,46) 6,12 b (5,45-6,39) 6,762,93 (3,61-10,53) 7,80 a (3,94-7,92)
x DE (Min-Max) Mediana (Q25-Q75) x DE (Min-Max) Mediana (Q25-Q75) x DE (Min-Max) Mediana (Q25-Q75) x DE

(Min-Max) Mediana (Q25-Q75)
Otoo
Invierno
Primavera
Superndices distintos en la misma filas indican diferencias estadsticamente significativas (p<0,05). DE: desviacin estndar. Nd: no determinado. p.s.: peso seco
Este comportamiento podra sugerir que aunque en sta alga verde se hayan registrado las concentraciones mas bajas de As, esta especie es sensible a pequeos cambios de concentracin de As y debera tenerse en cuenta durante el proceso de seleccin de una especie bioindicadora de contaminacin de As, como lo han referido varios autores en estudios similares realizados sobre la bio concentracin de metales pesados en Ulva sp. (Haritonidis y Malea, 1995, Caliceti et al., 2002, Castellanos et al., 2005). En las Figuras 2 y 3 se observa que existi variacin estacional estadsticamente significativa en ambas especies (p<0,05). En Porphyra columbina hay disminucin de las concentraciones en verano en PM y BS mientras que en la desembocadura del arroyo La Mata las concentraciones diminuyen en los meses de invierno y primavera y en Ulva sp. se observa un comportamiento similar
excepto en AM donde no existi variacin estacional. Existen distintos factores que pueden explicar las variaciones estacionales. Entre ellos se describen los medioambientales (variaciones en las concentraciones de metal en solucin, interacciones entre metales y otros elementos, salinidad, pH), los metablicos (dilucin de volmenes de metal debido al crecimiento), o pueden ser debidas a las interacciones entre todos estos factores. La idea de que las concentraciones de metal disminuyen en la macroalga durante los periodos de crecimiento y aumentan durante el periodo inactivo en invierno ha sido considerada desde hace mucho tiempo (Fuge y James, 1974). Riget et al. (1995) observ la variacin estacional en las concentraciones de metal en Fucus vesiculosus. Este estudio se llev a cabo en Groenlandia en una rea alejada de fuentes antropognicas de metales y as las
24 fluctuaciones encontradas deberan reflejar las variaciones naturales; en este estudio se describi que la variacin estacional podra ser atribuible al crecimiento, por lo tanto, en invierno fue cuando las concentraciones eran ms altas ya que el crecimiento era mnimo y estas disminuyeron en verano cuando el crecimiento era mximo; sin embargo, en todos los casos la variacin no podra explicarse por este fenmeno. Haritonidis y Malea (1995, 1999) atribuyeron el modelo de variacin estacional de las concentraciones de varios metales en Ulva rigida y Enteromorpha al crecimiento y a los factores como la edad del tejido examinada, y a factores abiticos como la salinidad y temperatura (Villares et al., 2002). Si se considera que Porphyra columbina tiene un mximo de crecimiento al fin del invierno y a los comienzos de la primavera (Boraso de Zaixso, 1998), se puede presumir que las concentraciones ms altas de As en dicha estacin se deberan a su crecimiento.
Verano
Otoo
Invierno
Primavera
Figura 2. Variacin estacional de la concentracin de As total en Porphyra columbina (medianas DE); superndices distintos en la misma zona y lugar indican diferencias estadsticamente significativas (p<0,001).
Verano
Otoo
Invierno
Primavera
Figura 3. Variacin estacional de la concentracin de As total en Ulva sp. (medianas DE); superndices distintos en la misma zona y lugar indican diferencias estadsticamente significativas (p<0,001).
25 No est estudiado el comportamiento ecolgico de Ulva sp. en el Golfo San Jorge como para establecer patrones de comparacin. En general, los niveles de As tanto para Porphyra columbina como para Ulva sp. descritos en este estudio son del mismo orden que los documentados por varios autores (Tabla 4).
Tabla 4. Concentraciones de As (g g-1 p.s.) en especies de Ulva sp. y Porphyra sp. de distintas reas geogrficas del mundo (promedios o rangos) Especies Ulva lactuca Ulva sp. Ulva sp. Ulva sp. Ulva sp. Ulva sp. Ulva sp. Ulva sp. Ulva fasciata Ulva rigida Porphyra sp. Porphyra sp. Porphyra sp. Porphyra sp. Porphyra sp. Porphyra sp. Porphyra sp. Porphyra sp. Porphyra umbilicales rea Golfo de Thermaikos (Grecia) Chile Qubec (Canad) Laguna de Venecia Italia Espaa Sud frica Pennsula de Delmarva EEUU Baha de Cienfuegos (Cuba) Baha de Cienfuegos (Cuba) Espaa Qubec (Canad) Lago de Venecia Italia Chile Espaa Inglaterra Korea Japn Francia Espaa As 4,5-11,1 4,07 6,0 2,4 73 5,2 0,05 6,20,30 3,70 1,15 1,25 1,10 6,417,06 19 4,2 13 13 20,00 28,3 0,5 18-29 6,28 0,19 9,70 1,20 4,25 0,13 28,949,5 Referencias Djingova et al., (1987) Vasquez, (1996) Phaneuf et al., (1999) Caliceti et al., (2002) Almela et al., (2002) Misheer et al., (2006) Chaudhuri et al., (2007) Castellanos et al., (2005) Castellanos et al., (2005) Besada et al., (2009) Phaneuf et al., (1999) Caliceti (2002) Vasquez (1996) Almela et al., (2002) Martn Rose et al., (2007) Rdenas de la Rocha et al., (2009) Rdenas de la Rocha et al., (2009) Rdenas de la Rocha et al., (2009) Besada et al. (2009)
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Caliceti et al., (2002) en Italia, por Almela et al., (2002) en Espaa, por Misheer et al., (2006) en las costas de Africa y por Wei et al., (2003) en China y mas bajos que los descriptos por Sfriso et al. (4 a 65 g g-1 p.s., con una media de 30 g g-1 p.s.) (Sfriso et al., 2000) y ms altos que los encontrados en Cuba en la Baha de Cienfuegos (Castellanos et al., 2005). Los valores de As son tambin del mismo orden que los analizados por Besada et al. (2009) en productos comerciales de algas comestibles. Asimismo, un estudio realizado por Faras et al. (2002) en la Antrtida mostr resultados para algas rojas en los que las concentraciones de As oscilaban entre 5 y 28 g g-1 p.s. Adems, los valores reportados en este estudio para las dos especies estudiadas coinciden con los resultados obtenidos por Muse et al., (1989) en
macroalgas de dos localidades de la provincia de Chubut. Varios autores (Phillips, 1990; Almela et al,. 2002), describieron que la acumulacin de As total en diferentes algas marinas es funcin de la especie algal. La secuencia de mayor a menor capacidad de bioacumulacin observada por dichos autores es: algas marrones > algas rojas > algas verdes. Esta secuencia se observa en las algas de este estudio, como puede observarse en la Figura 4. En tal sentido, las concentraciones medias anuales de As en Ulva sp., fueron significativamente mas bajas que en Porphyra columbina (p<0,001). Esto sugiere que la acumulacin de As depende de las caractersticas particulares de las algas marinas ms que de los niveles medioambientales de este elemento (Besada et al 2009).
Figura 4: Concentraciones de As total en Ulva sp. y Porphyra columbina (Promedio anual DE.); superndices distintos en la misma zona y lugar indican diferencias estadsticamente significativas (p<0,001).
Desde el punto de vista de la evaluacin de riesgos, el contenido de As total en alimentos carece de valor toxicolgico. Por tal motivo, es necesaria la cuantificacin del As inorgnico, trmino que engloba a las especies arsenicales cancergenas y de
mayor toxicidad de las cuantificadas hasta ahora en alimentos: As (III) + As (V). La OMS establece el valor de referencia toxicolgico para el As como As inorgnico, no como As total y la Ingesta Semanal Tolerable Provisional (ISTP) recomendada
27 es de 15 g semana-1 kg-1 de peso corporal, lo que para un sujeto de 70 kg correspondera a 1050 g As semanales (Almela, 2002). Si se estableciera una legislacin especfica para los contenidos de As inorgnico en las algas, se conseguira compatibilizar la comercializacin y la proteccin del consumidor. Sera pues conveniente seguir el ejemplo de legislaciones ms avanzadas, que regulan especficamente los niveles de As inorgnico en algas proponiendo 1 concentraciones de 1 g g- p.s. como es el caso de Australia y Nueva Zelanda (ANZFA, 1997) y de 3 g g-1 p.s como Francia y USA. (Mabeau y Fleurence, 1993). El primer aporte al respecto, fue el realizado por Norman et al. (1987) quien incluy adems del As inorgnico a los cidos monometilarsnico y dimetilarsnico, sobrestimando probablemente el contenido de As inorgnico (Almela et al., 2006). Aunque actualmente la concentracin de As total no es un parmetro til, en el estudio de las implicancias toxicolgicas derivadas del consumo de algas comestibles, es el parmetro utilizado. Si se supone un consumo de 30 g de Porphyra columbina seca por semana (Fajardo, 1998), considerando el mximo valor de As detectado (39,3 g g-1 en invierno) y en el hipottico caso de que todo el As fuera inorgnico, el ISTP para un sujeto de 70 kg que habita en la zona de estudio sera de 1179 g, valor que supera el lmite establecido por la OMS. Este anlisis amerita llevar a cabo estudios de especiacin del As, As (III) + As (V), para evaluar el riesgo real que supone el consumo de estas algas. Los niveles de As en Ulva sp. menores a los encontrados en la Porphyra columbina, hace suponer que su consumo no constituira un riesgo para la salud.
5. Conclusiones
Existi variacin estacional de la concentracin de As total en Porphyra columbina, la cual se observ AM y PM. En Ulva sp. las variaciones estacionales se dieron en BS y PM. Estos datos debern ser considerados en el proceso de su recoleccin para el consumo humano. La ingesta de 30 g de Porphyra columbina seca por semana aportara valores de As cercanos al ISTP si se considerara que todo el As estuviese presente como As inorgnico. En el caso de la ingesta de la misma cantidad de Ulva sp, sta no supondra un riesgo para la salud. Considerando los aspectos toxicolgicos y su posibilidad de ser utilizados para la alimentacin humana, es de destacar la mayor capacidad de bioacumulacin de As que posee Porphyra columbina respecto a Ulva sp. Sera prioritario notificar a los consumidores de estos cambios estacionales y establecer vedas de consumo de macroalgas en temporadas de mayor acumulacin del As, as como realizar monitoreos peridicos para llevar a cabo estudios de especiacin de As y as poder evaluar el riesgo real en las algas comestibles recolectadas en el Golfo San Jorge.
Agradecimientos
A la Dra. Dinoraz Vlez del Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos, Valencia, Espaa por su valioso aporte para el desarrollo del presente trabajo.
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Referencias
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Amim et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):31-46
31 Artculo original de investigacin
Eliminao autotrfica de nitrognio pela oxidao de tiossulfato atravs de uma cultura mista de microrganismos
Rafael S. Amim1, Fabrcio B. Santana2, Willibaldo Schmidell1 e Hugo M. Soares1*
1
Departamento de Engenharia Qumica Universidade Federal de Santa Catarina, Laboratrio de Engenharia Bioqumica, Centro Tecnolgico. Campus Universitrio, C.P. 476 CEP: 88010-970 Florianpolis SC Brazil 2 Departamento de Qumica, Universidade Federal do Rio Grande Rua Eng. Alfredo Huch 475, Rio Grande RS Brazil
*
Autor de correspondncia: soares@enq.ufsc.br
Resumo
Atualmente o principal impacto poluidor nos recursos hdricos ocasionado pelo lanamento de efluentes industriais e esgotos domsticos sem tratamento. A matria orgnica continua sendo aquela de maior impacto, devido s grandes quantidades envolvidas principalmente em pases em desenvolvimento. No entanto, outros poluentes como metais pesados, nitrognio, fsforo e enxofre, alm de micro poluentes de difcil biodegradao, tm sido matria de investigao. Uma nova tecnologia para remover alguns destes poluentes dos efluentes a desnitrificao autotrfica pela oxidao de compostos de enxofre como tiossulfato (S2O3-2), sulfeto (S-2) e enxofre elementar (S0). Este processo realizado pela bactria Thiobacillus denitrificans. Neste trabalho foi enriquecida uma cultura mista de microrganismos, inicialmente inoculado com uma mistura de bactrias aerbias e anaerbias, provenientes de plantas de tratamento de efluentes domsticos e industriais, submetidas a um meio autotrfico, para remover nitrognio na forma de nitrato (N-NO3-) pela oxidao de compostos de enxofre na forma de tiossulfato (S-S2O3-2). Um reator de 10 L de volume til foi alimentado diariamente durante 211 dias para adaptar a biomassa. Uma remoo de nitrognio acima de 90% e uma converso total do enxofre na forma de tiossulfato a sulfato foi obtida quando o processo apresentava-se estvel. Um balano de massa feito para o reator em condies de pseudo estado estacionrio demonstrou que o processo tratava-se da desnitrificao autotrfica do nitrato, utilizando o tiossulfato como doador de eltrons, apresentando valores de relao entre a produo de sulfato e remoo de nitrognio (YN/S) similares ao estequiomtrico (0,35 mgN-NO3-/mg S-SO4-2). Ensaios cinticos em batelada, realizados com a cultura mista de microrganismos enriquecida, comprovaram os resultados do balano de massa apresentando valores similares da relao YN/S. Concluiu-se que possvel estabelecer este processo a partir de uma cultura mista de microrganismos facilmente encontrados em sistemas de tratamento de efluentes convencionais, apresentando um grande potencial para sua aplicao em larga escala. Palavras chave: desnitrificao autotrfica, Thiobacillus denitrificans, remoo de nitrognio, oxidao de enxofre.
32
Abstract
Nowadays, the main environmental impact is the pollution of the water resources caused by industrial and domestic wastewater without treatment. The organic matter is still the main pollutant that causes environmental impact on developing countries because of the large quantities it is generated. However, other pollutants such as heavy metals, nitrogen, phosphorous and sulfur, besides recalcitrant micro pollutants, have being a matter of investigation. A new technology used to remove some of these pollutants in wastewaters is the autotrophic denitrification by the oxidation of reduced sulfur compounds, such as thiosulfate (S2O3-2), sulfide (S-2), and elementary sulfur (S0). This process is performed by Thiobacillus denitrificans. In this work, it was enriched a mixed culture of microorganisms, inoculated with a mixture of aerobic and anaerobic bacteria cultures from industrial and domestic wastewater treatment plants, submitted to an autotrophic media, to remove nitrogen as nitrate (N-NO3-) by sulfur oxidation as thiosulfate (S-S2O3-2). A 10 L net volume reactor was used to adapt the biomass during about 211 days of operation. Nitrogen removal above 90% and a complete conversion of the sulfur as thiosulfate to sulfate was reached when the process was stable. A reactor input and output mass balance on a pseudo steady state conditions demonstrated the main processes occurred was the nitrate autotrophic denitrification using thiosulfate as final electron acceptor, showing a nitrate removal and sulfate production yield (YN/S) similar to the stoichiometric value (0,35 mgN-NO3/mg S-SO4-2). Kinetic assays in batch reactors with the enriched microorganisms confirmed the results obtained in the mass balance, showing similar values for YN/S. It was concluded that it is possible to establish this process starting from a mixed culture of microorganisms easily found in conventional wastewater treatment systems, presenting a great potential for its application in full scale plants. Keywords: autotrophic denitrification, Thiobacillus denitrificans, nitrogen removal, sulfur oxidation.
1. Introduo
Atualmente, o principal impacto poluidor a degradao dos recursos hdricos, ocasionada pelo lanamento de efluentes industriais e esgotos domsticos sem tratamento. Estes efluentes contm diversos poluentes como metais pesados, matria orgnica, e substncias como nitrognio e enxofre. Os impactos ocasionados pelo nitrognio no meio ambiente so o fenmeno da eutrofizao, toxicidade aos peixes (amnia), doena em recm nascidos (nitrato), alm do fato da amnia gerar demanda qumica de oxignio (Liu e Koenig, 2002; Kimura et al., 2002). Vrias indstrias promovem a gerao de efluentes contendo elevadas
concentraes de nitrognio, podendo-se citar a qumico-farmacutica (340 mgNNH4+. L-1), abatedouros (200mgN-NH4+.L1 ), curtume (200-500 mgN-NH4+.L-1), usina de lcool e acar (450 -1610 mgN.L-1), suinocultura (1000 mgN-NH4+.L-1) entre outras (Ramos et al., 2007; Mittal, 2005; Carrera, 2003). O impacto ambiental gerado pelo enxofre consiste principalmente pela formao da chuva cida, odor ofensivo, corroso de ao e concreto, demanda qumica de oxignio, toxicidade aos microrganismos e ao homem (Gadekar et al., 2006; Vaiopoulou et al., 2005). Entre as empresas que possuem efluentes com essas caractersticas destacamse a txtil (1800-2000 mg SO4-2.L-1), curtume (1800 mgSO4-2.L-1), fermento (5000
33 mg SO4-2. L-1); minerao (drenagens cidas de minas, 350550 mg SO4-2.L-1, ou at 1500 7200 mg SO4-2.L-1), entre outras (Menert et al., 2004; da Silva, 2005; Roger et al., 2006; Boshoff et al., 2004). De acordo com a resoluo do Conselho Nacional de Meio Ambiente Brasileiro (Conama 357/2005) para lanamento de efluentes nos corpos dgua, devem ser mantidos os limites de 20 mgN-NH4+.L-1 e 1,0 mgS-2.L-1, alm de preservar as caractersticas e padres de cada classe de gua (por exemplo guas doces, classe 1, 10 mgN-NO3-.L-1 e 250 mgSO4-2.L-1). Diante desta situao necessrio promover o tratamento de efluentes evitando-se a degradao do meio ambiente. Os processos de tratamento para remoo de nitrognio esto amplamente difundidos na literatura, destacando-se o de nitrificao/desnitrificao, alm dos novos processos, Sharon, Oland, Canon, Anammox e NOx (Schmidt et al., 2003; Verstraete e Philipps, 1998; Ahn, 2006). Os destinados remoo de enxofre, at hoje desenvolvidos, consistem na reduo de sulfato a sulfeto com posterior oxidao de sulfeto a enxofre elementar e no stripping do sulfeto (Sipma et al., 1999; Krishnakumar et al., 2004). A maior dificuldade destes processos a de atender aos parmetros da legislao, por isso a importncia de desenvolvimento de novas tecnologias. Outra questo importante a ser lembrada que todos os processos mencionados promovem a remoo destes compostos separadamente, no associando outros metabolismos que ocorrem em um ambiente natural, quando se trata um efluente real, onde esto presentes vrios substratos passveis de metabolizao havendo necessidade de se investigar estas interaes. Mais recentemente, vem se desenvolvendo um processo que realiza a desnitrificao autotrfica do nitrognio utilizando formas reduzidas de enxofre como doadores finais de eltrons como tiossulfato, sulfeto e enxofre elementar, possibilitando a integrao dos ciclos bioqumicos do nitrognio e do enxofre. A desnitrificao autotrfica via enxofre ocorre principalmente pela atuao do microrganismo Thiobacillus denitrificans. Estudos atuais caracterizam o Thiobacillus denitrificans como anaerbio facultativo, quimioautotrfico obrigatrio, membro do -Proteobacteria (Wang et al., 2005; Beller et al., 2006). Possui a capacidade de crescer em condies aerbias, alm de, em condies anaerbias, oxidar compostos de enxofre utilizando nitrato, nitrito e xidos de nitrognio como aceptores finais de eltrons. A versatilidade metablica propicia grande aplicao em sistemas de tratamento biolgico. As condies timas para crescimento so: temperatura entre 28 e 30 C, faixa de pH entre 6 e 8 (Kelly & Wood, 2000; Wang et al., 2005). Wang et al. (2005) investigaram a cintica de desnitrificao, com cultura pura de Thiobacillus denitrificans, em processos em batelada e contnuo, utilizando sulfeto de hidrognio como doador de eltrons e nitrato como aceptor. Concluiu-se que os fatores determinantes para estabelecimento do processo so a razo S-2/NO3- (5/3 a 5/2 sendo as ideais) e a concentrao de sulfeto (< 300 mgS-2.L-1). Moon et al. (2003), utilizando o mesmo microrganismo, estabeleceram o processo de desnitrificao autotrfica via oxidao de enxofre elementar, obtendo eficincia de remoo de nitrognio de 90%. Constatou-se ainda o baixo acmulo de nitrito durante a realizao do processo. Visando a operao de reatores em escala real, h necessidade de se verificar a obteno de culturas de microrganismos mais facilmente disponveis e abundantes, capazes de realizar o processo de desnitrificao autotrfica via oxidao de compostos reduzidos de enxofre. Assim, o
34 objetivo deste trabalho foi o de adaptar uma cultura mista de microrganismos, obtida de processos convencionais de tratamento biolgico, a este processo, alm de caracterizar os seus parmetros cinticos e compar-los aos apresentados na literatura para as culturas puras de Thiobacillus denitrificans. indstria de bebidas, localizada em Santa Catarina. Os referidos inculos passaram por um tratamento preliminar, sendo o inculo Casan submetido a um sistema de peneiramento, para remoo de partculas suspensas, e o inculo anaerbio foi drenado para reduzir o teor de gua do mesmo. O inoculo inicial foi de 4g SSV.L-1 e uma proporo de 50% (m/m) de cada lodo. 2.2 Meio de cultivo O reator era alimentado diariamente com soluo sinttica contendo nitrato (N-NO3-), como fonte de nitrognio; Tiossulfato (SS2O3-2), como fonte de enxofre; bicarbonato (NaHCO3-), como fonte de carbono e tampo; alm de soluo de meio nutriente, adaptado de Campos et. al. (1999), conforme apresentado na Tabela 1.
2. Material e Mtodos
2.1 Microrganismos O inculo utilizado para estabelecer o processo de desnitrificao e oxidao do enxofre foi coletado de duas fontes distintas. Realizou-se uma coleta de lodo na Estao de Tratamento de Esgoto, sistema de Lodos Ativados, da Companhia de guas e Saneamento do Estado de Santa Catarina (Casan). Outra coleta foi realizada no sistema de tratamento anaerbio de uma
Tabela 1: Soluo de nutrientes do meio estoque. Composto EDTA .2H2O FeSO4.7H2O ZnSO4.7H2O CaCl2.2H2O MnCl2.2H2O CuSO4.5H2O (NH4)6.MoO24.4H2O CoCl2.6H2O KH2PO4 Concentrao (g/L) 55,35 4,99 21,99 7,34 5,06 1,57 1,10 1,61 0,25
Os reagentes eram adicionados ao meio sinttico a partir de duas solues estoques, uma de enxofre (10 g S-S2O3-2.L-1) e outra de nitrognio (10 g N-NO3-.L-1). O volume adicionado de cada soluo estoque variou de acordo com cada fase de operao do reator contnuo. A partir de uma soluo estoque de bicarbonato de sdio (40 g.L-1), era adicionada a fonte de carbono do meio, sendo utilizado 200 mL a cada 2L
alimentado, dosagem esta suficiente para manter o pH em torno de 8. Alm disso, adicionava-se diariamente 1,4 mL da soluo de nutrientes a cada 2 L alimentado. A contribuio de S-SO4-2 adicionado ao meio de cultivo pela adio da soluo de nutrientes foi de apenas 4,0 mg.L-1, sendo esta desprezada no computo dos resultados, uma vez que a faixa de concentrao deste on estudada foi de 100 a 500 mg.L-1.
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2.3 Reator semi-contnuo A adaptao da cultura mista de microrganismos foi feita em um reator sem mistura mecnica, com volume total de 20L, volume til de 10L, medindo 22 cm de largura, 26 cm de comprimento e 36 cm de profundidade, O sistema era completamente vedado, evitando-se a introduo de oxignio. Inicialmente o espao da fase gasosa do reator foi lavada com argnio para garantir anaerobiose. O reator anaerbio foi operado durante 211 dias temperatura ambiente, sendo alimentado com meio sinttico. A alimentao era realizada uma vez ao dia, num regime semi-contnuo, mantendo um tempo de reteno hidrulica (TRH) de 5 dias. Durante a alimentao agitava-se o contedo do reator para promover a sua homogeneizao. A retirada de lquido tratado era feita quando o reator estava em
repouso garantindo a sedimentao do lodo e retirada do sobrenadante. A operao do reator dividiu-se em trs fases, sendo cada fase correspondendo a progresses de carga de enxofre, conforme descrito na Tabela 2. A progresso de carga aplicada tinha por finalidade permitir uma adaptao gradativa da biomassa. A composio de S-S2O3-2 e NNO3- variaram de acordo com a condio de operao aplicada ao reator, sendo mantida a relao estequiomtrica de S/N, de acordo com a Equao 1 (Santana, 2006). Analisando-se a estequiometria proposta na Equao 1 observa-se uma relao de 5 moles de S2O3-2 para 8 moles de NO3-, o que implica em uma relao mssica S/N de 2,857, ou N/S de 0,35.
5S2O3-2 + 8 NO3- + H2O 10SO4-2 + 4N2 +2H+

Tabela 2 - Condies de operao do reator contnuo. Fases de operao do reator Carga mgS-S2O3-2.(L.d)-1 Concentrao mgS-S2O3-2.L-1 Concentrao mgN-NO3-.L-1 Tempo de reteno hidrulica TRH (d) Fase I 20 100 35 5 Fase II 60 300 105 5 Fase III 100 500 175 5
(1)
2.4 Ensaios cinticos de desnitrificao autotrfica Definidos os ensaios a serem realizados, o inculo era coletado retirando-se a biomassa do reator juntamente com o efluente dirio (2L). Para permitir uma homogeneidade do sistema inseria-se argnio (gs inerte) mantendo o efluente em constante agitao durante a coleta do lodo. Posteriormente
analisava-se o teor de slidos e prosseguia-se com a lavagem do lodo, isto , propiciava-se a decantao do lodo para, em seguida, extrair o sobrenadante. Este procedimento garantia a eliminao das substncias contidas no efluente, contribuindo para eliminar possveis interferncias durante os experimentos com o inculo. Baseado na anlise de slidos do efluente e na
36 concentrao desejada para o ensaio preparava-se 2,5 L (mantendo-se a concentrao celular de 2gSSV.L-1) de meio sinttico para a realizao da cintica. O referido meio era submetido a 10 minutos de argnio para garantir a eliminao de oxignio, que interfere no consumo de tiossulfato oxidando-o. Finalizado o tempo de insero de argnio, eram transferidos 150 mL de amostra do meio para dezesseis frascos de soro. Para evitar a introduo de oxignio de uma amostragem para outra, adicionava-se argnio em cada frasco, at a sua completa vedao. Na seqncia os frascos eram inseridos em um incubador rotativo a uma temperatura de 30 C (1C). De acordo com a cintica em estudo coletam-se amostras de tempos em tempos, realizando-se as anlises em questo. 2.5 Metodologias analticas O mtodo do cido saliclico, descrito por Cataldo et al. (1975), foi adaptado e empregado para a determinao de nitrato. As determinaes de slidos suspensos volteis e sulfato e tiossulfato, foram realizadas de acordo com o Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (APHA, 1995). O nitrognio amoniacal (N-NH4+) foi analisado pelo mtodo colorimtrico de Nessler segundo Vogel (1981). A determinao de oxignio dissolvido fez-se atravs de oxmetro WTW porttil, modelo OXI 340. A determinao do potencial de oxidao e reduo fez-se atravs de uma sonda marca Digimed, utilizando-se de um analisador modelo TH44. 3.1 Operao do Reator Contnuo Na Figura 1 esto apresentados os valores das concentraes de nitrato, amnio e sulfato medidos no efluente do reator nas trs fases do processo, durante os 211 dias de operao. O nitrognio na forma amoniacal, apesar de no ter sido adicionado na alimentao, foi monitorado para verificar se este poderia estar sendo formado por algum outro metabolismo. Ensaios preliminares realizados por Amim (2008), para testar as metodologias analticas de acompanhamento dos ensaios, demonstraram que h limitaes nas determinaes analticas do tiossulfato, quando adicionado ao meio de cultivo, e do enxofre elementar. Assim, a verificao da oxidao do tiossulfato adicionado d-se pela recuperao do enxofre na forma de sulfato. A operao do reator foi caracterizada por trs fases distintas, conforme descrito na Tabela 2. Observa-se que as fases I e II foram mais curtas em decorrncia do objetivo do estudo. Planejou-se atingir a concentrao de 500 mgS-S2O3-2.L-1 para realizar ensaios cinticos, garantindo-se assim uma atividade maior dos microrganismos e aproximando a concentrao de enxofre a efluentes industriais. Destaca-se ainda a elevada converso de substrato, permitindo o rpido aumento de carga, total converso de tiossulfato a sulfato, com o concomitante consumo de nitrato, e a baixa formao de amnio. Em termos de cargas aplicadas, observa-se que esta poderia ser aumentada, pois no foi atingido o limite do sistema. No houve qualquer indicao de inibio do processo pelas elevadas concentraes de nitrato e de tiossulfato aplicados.
3. Resultados e Discusso
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Figura 1: Monitoramento das concentraes dos ons durante a operao do reator contnuo, nas fases I, II e III.
Na Tabela 3 observam-se as eficincias do processo em cada etapa de operao. Nas fases I e II praticamente ocorreu desnitrificao total, e na fase III identificouse um pequeno residual de nitrato, que promoveu a reduo da eficincia. Nesta fase III houve uma oscilao maior da concentrao de nitrato no efluente devido remoo de biomassa do reator para a realizao dos ensaios cinticos,
caracterizando assim perodos com residual de nitrato e variao de sulfato, mas o processo foi capaz de se restabelecer com altas eficincias de remoo de ambos substratos. Estes esto coerentes com o estudo de Monn et al. (2003) e Wang et al. (2005) que apresentam converses similares com o cultivo de Thiobacillus denitrificans em cultura pura.
Tabela 3: Eficincia mdia do processo em cada etapa de operao do reator contnuo. Fase I II III Remoo de Nitrognio 92% 95% 88% Converso a sulfato 100% 100% 100%
O controle do pH neste processo de fundamental importncia. Os estudos realizados por Santana (2006) direcionaram os procedimentos praticados neste trabalho. Na Figura 2 observa-se a variao do pH no reator. O pH permaneceu em uma faixa de 7,70 a 8,37 e, em mdia, no valor 8,00, que,
para microrganismos como Thiobacillus denitrificans em cultura pura, considerado ideal (Kelly & Wood, 2000). A manuteno do pH foi somente devido a adio de bicarbonato no meio no havendo necessidade de se adicionar cidos ou lcalis.
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Figura 2: Variao do pH no reator contnuo
Para se chegar s velocidades de converso dos substratos e formao de produtos faz-se necessrio o balano de massa do sistema, conforme descrito a seguir. Nitrato consumido (N-NO3-)
A Equao 2 apresenta o balano de massa para o nitrognio na forma de nitrato, que est sendo convertido em nitrognio gasoso. Supe-se que todo o nitrato est sendo reduzido a N2 e no ocorra acmulo de nitrito.
d N NO3 D N NO3e D N NO3 s N X dt

Onde: N-NO3-e: concentrao de nitrognio (nitrato) na alimentao do reator (mg NNO3-.L-1); N-NO3-S: concentrao de nitrognio (nitrato) no efluente ou no reator (mg NNO3-.L-1); D: vazo especfica (d-1)
(2)
N: velocidade especfica de consumo de nitrato (mg N-NO3-.(gSSV.d)-1); X: concentrao celular (gSSV.L-1). Considerando-se um estado pseudoestacionrio para determinados perodos do reator, pode-se escrever:
d N NO3 0 dt
Assim, rearranjando a Equao 4 temos a Equao 4:
(3)
NO
3
D N NO3 e N NO3 s X
(4)
Sendo D calculado pela Equao 5:
D
Onde: Q: vazo de alimentao (2 L.d-1) V: volume do reator (10 L)
Q 2L / d 0,2 d 1 V 10 L
(5)
39
Atravs da Equao 4 pode-se calcular a velocidade especfica de consumo de nitrato de cada fase de operao do reator. Para realizao destas medidas definiu-se o perodo considerado em estado pseudo-
estacionrio, alm das concentraes mdias de nitrato afluente e efluente, e a concentrao celular mdia de cada fase, conforme apresentado na Tabela 4.
Tabela 4: Velocidades especficas de consumo de nitrato durante as trs fases de operao do reator contnuo. Fase Perodo (dias) 12-25 32-50 57-211 N-NO3-e (mg.L-1) 41,30 114,35 182,57 N-NO3-s (mg.L-1) 3,73 6,12 21,11 X (g SSV.L-1) 3,41 3,08 2,83 N (mg N-NO3-. (g SSV.d)-1) 2,20 7,03 11,41
I II III
Observando-se os resultados percebem-se os baixos valores de velocidades especficas de consumo de nitrato, isto se deve em parte ao TRH elevado, evidenciando assim a possibilidade de reduo deste e conseqentemente o aumento da atividade dos microrganismos. Entretanto, o reator tinha como principal funo manter a flora bacteriana ativa e adaptar os microrganismos ao processo de desnitrificao autotrfica via oxidao do enxofre. Demonstra-se ainda que, medida que houve um incremento na concentrao de substrato, esta velocidade
tambm aumentou ratificando a adaptao dos mesmos ao processo. Sulfato produzido (S-SO4-2) Devido ausncia de uma metodologia capaz de quantificar a variao da concentrao de tiossulfato em efluentes, o balano de massa de enxofre limitou-se a formao de sulfato. O balano de massa de sulfato foi calculado baseado na Equao 6.
d S SO42 D S SO4 2 s s X dt
Onde: S-SO4-2: concentrao de sulfato produzido no reator (mg S-SO4-2 .L-1); D: vazo especfica (d-1) s: velocidade especfica de produo de sulfato (mg S-SO4-2.(gSSV.d)-1); X: concentrao celular (gSSV.L-1).
(6)
De forma similar ao desenvolvimento das equaes para o nitrato, adotando-se as mesmas consideraes para a vazo especfica (D), o mesmo perodo de estado pseudo-estacionrio e a concentrao celular determinaram-se as velocidades de produo de sulfato, explicitadas na Tabela 5.
40
Tabela 5: Velocidades especficas de formao de sulfato durante as trs fases de operao do reator contnuo. Fase Perodo (dias) 12-25 32-50 57-211 S-SO4-2s (mg.L-1) 107,38 326,34 548,62 X (g SSV.L-1) 3,41 3,08 2,83 S (mg S-SO4-2. (g SSV. d)-1) 6,30 21,19 38,77
I II III
Assim como para as velocidades especficas de consumo de nitrato, houve um incremento nas velocidades especficas de produo de sulfato medida que foram aumentadas as concentraes dos substratos. Relao entre a produo de sulfato e remoo de nitrognio De acordo com a Equao 1, a relao entre nitrognio removido (N-N2) e sulfato produzido (S-SO4-2) de 0,35 mgN-N2.(mg S-SO4-2)-1. Para verificar se o processo de
desnitrificao via oxidao do tiossulfato de fato ocorreu segundo a Equao 1, determinou-se a relao YN/S (fator de converso do sulfato produzido em nitrognio removido) atravs da Equao 7. Este clculo baseou-se nas velocidades especficas de consumo de nitrato (ou formao de N2) e velocidades de produo de sulfato determinadas no item anterior. Na Tabela 6 esto apresentados estes valores.
YN / S
N S
(7)
Tabela 6: Relao YN/S em cada fase de operao do reator contnuo. Fase I II III N (mg N-NO3-/g SSV. d) 2,20 7,03 11,41 S (mg S-SO4-2/g SSV. d) 6,30 21,19 38,77 YN/S (mgN-NO3-/mg S-SO4-2) 0,349 0,332 0,294
Os resultados indicam que o processo estabelecido no reator anaerbio a desnitrificao via oxidao do tiossulfato, ratificada pelos valores de YN/S prximos ao estequiomtrico (0,35 mgN-NO3-/mg S-SO42 ). Salienta-se ainda que houve uma reduo do fator medida que a concentrao de substratos foi elevada. Isto pode ter ocorrido pela oxidao de tiossulfato por outros processos metablicos que a desnitrificao autotrfica, visto que aumentou a
disponibilidade de substratos e por tratar-se de uma cultura mista. 3.2 Ensaios Cinticos com a Cultura de Microrganismos Para caracterizar a cultura mista de microrganismos adaptada e enriquecida no reator foram realizados ensaios cinticos para avaliar a atividade destes microrganismos. Estes ensaios foram realizados em cada fase de operao,
41 seguindo a metodologia descrita no item 2.4. As condies do ensaio foram: manuteno da temperatura em 30C, a concentrao celular de 2 gSSV.L-1, variao da concentrao de substrato de acordo com
120,0
-1
aquelas aplicadas nas fases de operao (utilizou-se a relao estequiomtrica mssica S/N de 2,857). Nas Figuras 3, 4 e 5 pode-se observar o resultado destes ensaios.
Monitoramento da Biomassa 9,00 8,80 8,60 8,40 8,20 8,00 7,80 0 1 2 3 4 5 Tempo (h) 6 7 8 N-NH4+ N-NO360,0 40,0 20,0 0,0 SO4-2 pH
Concentrao mg.L
100,0 80,0
Figura 3 : Ensaio cintico de monitoramento da cultura de microrganismos na fase I 100 mgSS2O3-2.L-1
Monitoramento da biomassa 350,0

Concentrao mg.L -1
9,20 8,80 8,40 8,00 7,60 7,20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Tempo (h)
300,0 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0
N-NH4+ N-NO3S-SO4-2 pH
Figura 4: Ensaio cintico de monitoramento da cultura de microrganismos na fase II 300 mgSS2O3-2.L-1
42
Monitoramento da biomassa 9,20
Concentrao mg.L -1
500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Tempo (h) 8,80 8,40 8,00 7,60 7,20 N-NH4+ N-NO3S-SO4-2 pH
Figura 5 : Ensaio cintico de monitoramento da cultura de microrganismos na fase III 500 mgSS2O3-2.L-1
Observa-se, pelos dados das figuras, que medida que se aumentou a concentrao de tiossulfato na alimentao mais tempo foi necessrio para que os substratos fossem consumidos, porm, todos chegaram a sua converso mxima no perodo de ensaio. Atravs destas curvas podem ser calculadas as velocidades de consumo de substratos e, conseqentemente, as velocidades especficas de consumo de substrato. Estas velocidades foram calculadas a partir dos valores de inclinao das tangentes das
respectivas curvas de concentrao de substrato (nitrato) e produto (sulfato) com o tempo, observando-se que as variaes das concentraes de sulfato e nitrato so praticamente lineares em funo do tempo durante as primeiras 8 horas de experimento, o que permite o clculo das respectivas velocidades. As velocidades de consumo de substrato (rS) e velocidades especficas de consumo de substrato (S), foram calculadas de acordo com as Equaes 8 e 9 respectivamente:
rs
Sendo: rS= velocidade de consumo de substrato ou velocidade de formao de produto, mg.(L.h)-1
dS dT
S= concentrao, mg.L-1 T= tempo, h
(8)
s *
Onde: S= velocidade especfica de consumo de substrato ou formao de produto, mg.(gSSV.h)-1
1 dS x dT
(9)
x= concentrao celular, mgSSV.L-1 S= concentrao, mg.L-1 T= tempo, h
43 Na Tabela 7 esto representadas as velocidades especficas de consumo de nitrato e produo de sulfato, calculadas atravs das Equaes 2 e 3 para cada uma das fases. Calculou-se tambm o fator de converso de sulfato produzido em nitrognio removido (YN/S) em cada fase de operao.
Tabela 7: Resultados dos ensaios cinticos. N mgN-NO3.(gSSV.h)-1 3,156 3,616 5,387 S mgS-SO4-2 .(gSSV.h)-1 9,848 15,619 19,261 YN/S mgN-NO3(mg S-SO4-2)-1 0,32 0,23 0,28
Fases Fase I Fase II Fase III
O incremento dos valores de N e S evidencia a adaptao e o aumento da atividade biolgica com a maior concentrao de substratos. Novamente, em concordncia com o balano de massa realizado para a operao do reator semicontnuo, confirma-se que o processo realizado pela cultura mista de microrganismos desenvolvida a desnitrificao via oxidao do tiossulfato, ratificada pelos valores de YN/S prximos ao estequiomtrico (0,35 mgN-NO3-.(mg SSO4-2)-1), porm, um pouco inferiores aos encontrados na operao contnua do biorreator. As diferenas podem ser atribudas ao crescimento celular, que no est computado na estequiometria apresentada e a algum outro metabolismo menos expressivo, realizado pelos microrganismos, por tratar-se de uma flora mista. Santana (2006) obteve resultados similares estudando a eliminao autotrfica de nitrognio via integrao do ciclo do enxofre, em reator SBR, operado em distintas condies, utilizando uma cultura mista. Para uma das condies, Santana (2006) obteve velocidades especficas de consumo dos substratos de 5,39 (mgN-NO3.(gSST.h)-1) e 24,61 (mgS-SO4-2.(gSST.h)-1). Para sustentar a afirmao de que o processo tratava-se apenas da desnitrificao autotrfica utilizando o tiossulfato como
aceptor de eltrons, Amim (2008) realizou alguns ensaios complementares: o primeiro foi para verificar se a oxidao do tiossulfato poderia estar sendo promovida por alguma falha operacional com a introduo de oxignio no sistema; o segundo foi para verificar a influncia da adio da fonte de carbono autotrfica na forma de bicarbonato. Chegou-se a concluso de que no ocorre nenhuma transformao abitica na converso do tiossulfato. Concluiu-se tambm que a ausncia de bicarbonato inibe o processo, indicando que o bicarbonato deve atuar como fonte essencial de carbono e muito importante como corretivo de pH em processos de desnitrificao autotrfica e que o processo simultneo de oxidao de tiossulfato e assimilao de carbono orgnico no ocorre.
4. Concluses
A principal concluso deste trabalho foi de que possvel estabelecer o processo de desnitrificao autotrfica via oxidao de compostos reduzidos de enxofre, no caso o tiossulfato, partindo de um inculo misto e de fcil disponibilidade, como reatores de lodos ativados e anaerbios tratando efluentes industriais. A resposta da flora de microrganismos foi imediata, atingindo-se o equilbrio do processo em poucos dias de
44 operao do sistema. A converso do tiossulfato a sulfato foi de 100% e a do nitrato foi superior a 90%, exceto alguns perodos de instabilidade provocados por retirada de material celular do reator. Atravs dos ensaios cinticos com a cultura mista desenvolvida, observaram-se velocidades de consumo de nitrato e de produo de sulfato compatveis com as reportadas na literatura para culturas puras de Thiobacillus denitrificans. Assim, foram obtidos valores para o fator de converso de sulfato produzido em nitrognio removido (YN/S) prximos ao indicado pela estequiometria, indicando que o principal metabolismo ocorrido foi o da desnitrificao autotrfica utilizando o tiossulfato como aceptor final de eltrons. Os resultados mostram o grande potencial de aplicao em larga escala deste processo, porm h muito que investigar na rea. Uma das questes que devem ser abordadas, alm da melhor caracterizao e identificao da cultura mista de microrganismos, o estabelecimento de condies do processo para que oxide as formas mais reduzidas de enxofre (S-2) em enxofre elementar, para que este possa ser removido do sistema e promover um processo de eliminao conjunta de nitrognio e enxofre.
tiossulfato. Dissertao de Mestrado (Engenharia Qumica). Departamento de Engenharia Qumica, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis, SC. 176 p. APHA, AWWA, WEF. 1995. Standard methods for the examination of water and wastewater. 19th.edn. American Public Health Association. Washington, DC. Beller, H.R.; Chain, P.S.G.; Letain, T.E.; Chakichrla, A.; Larmier, F.W.; Richardson, P.M.; Coleman, M.A.; Wood, A.P.; Kelly, D.P. 2006. The genome sequence of the obligately chemolithoautotrophic, facultatively anaerobic bacterium Thiobacillus denitrificans. J Bacteriol 188, (4): 1473-1488. Boshoff, G.; Duncan, J.; Rose, P.D. 2004. Tannery effluent as a carbon source for biological sulphate reduction. Water Res 38: 2651-2658. Campos, J.L.; Garrido-Fernandes, J.M.; Mendez, R.; Lema, J.M. 1999. Nitrification at high ammonia loading rates in a activated sludge unit. Bioresource Technol 68: 141-148. Carrera, J.; Baeza, J.A.; Vicent, T.; Lafuente, J. 2003. Biological nitrogen removal of highstrength ammonium industrial wastewater with two-sludge system. Water Res 37: 42114221. Cataldo, D.A.; Haroon M; Schrader, L.E.; Youngs, V.L. 1975. Rapid colorimetric determination of nitrate in plant tissue by nitration of salicylic acid. Comun Soil Sc. Plant Anal 6: 71-80. Da Silva, A. J. 2005. Biodessulfatao com posterior oxidao parcial do sulfeto em reatores operados em bateladas seqncias. Tese de Doutorado (Engenharia Ambiental) Escola de Engenharia de So Carlos, Universidade de So Paulo. So Carlos, SP. Gadekar, S.; Nemati, M.; Hill, G.A. 2006. Batch and continuous biooxidation of sulphide by Thiomicrospira sp. CVO: reaction kinetics and stoichiometry. Water Res 40: 2436 -2446. Kelly, D. P. Wood, A. P. 2000. Confirmation of Thiobacillus denitrificans as a species of the
5. Agradecimentos
Agradecemos ao CNPq e FAPESC pelo financiamento desta pesquisa e a CAPES pela bolsa de mestrado.
6. Referncias
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45
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46 Lista e Smbolos D: vazo especfica (d-1) N-NO3-: concentrao de nitrognio (nitrato) (mg N-NO3-.L-1) N-NO3-e: concentrao de nitrognio (nitrato) na alimentao do reator (mg N-NO3-.L-1) N-NO3-S: concentrao de nitrognio (nitrato) no efluente ou no reator (mg N-NO3-.L-1) Q: vazo de alimentao (2L.d-1) rS: velocidade de consumo de substrato ou velocidade de formao de produto, mg.(L.h)-1 S-S2O3-2: concentrao de enxofre (Tiossulfatotiossulfato) (mgS-S2O3-2L-1) S-SO4-2: concentrao de sulfato produzido no reator (mg S-SO4-2L-1) S: concentrao, mg.L-1 T: tempo (h) V: volume do reator (L) x: concentrao celular, (mgSSV.L-1) X: concentrao celular (gSSV.L-1). YN/S: relao entre a produo de sulfato e remoo de nitrognio (mgN-NO3-/mg S-SO4-2) N: velocidade especfica de consumo de nitrato (mg N-NO3-.(gSSV.d)-1) s: velocidade especfica de produo de sulfato (mg S-SO4-2.(gSSV.d)-1)
Gutirrez et al., 2010. Rev latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):47-63
47 Revisin crtica
Mecanismos de interaccin con cromo y aplicaciones biotecnolgicas en hongos

J. Flix Gutirrez Corona1*, ngeles E. Espino Saldaa1, Alejandro Coreo Alonso1,3, Francisco Javier Acevedo Aguilar2, Georgina E. Reyna Lpez1, Francisco Jos Fernndez3, Araceli Tomasini3, Kazimierz Wrobel2 y Katarzyna Wrobel2
1
Departamento de Biologa y 2Departamento de Qumica, Divisin de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Guanajuato, Campus Guanajuato. Noria Alta s/n, C.P. 36050, Guanajuato, Gto. 3 Departamento de Biotecnologa, Universidad Autnoma Metropolitana-Iztapalapa, Av San Rafael Atlixco No.186, Col.Vicentina C.P.09340 Del. Iztapalapa, Mxico, D.F.
*
Autor de correspondencia: felixg@quijote.ugto.mx
Resumen
Esta contribucin tiene como objetivo revisar los estudios realizados acerca de los mecanismos fngicos de interaccin con el cromo y las aplicaciones de dichos mecanismos en el contexto de la Biotecnologa Ambiental, haciendo nfasis en algunas de las direcciones futuras de investigacin y desarrollo tecnolgico. El cromo es considerado como un contaminante ambiental, debido a su amplio uso en distintas actividades industriales, entre las cuales se encuentran el cromado electroltico, el curtido de pieles, la fabricacin de explosivos, etc. Las formas del cromo estables en el ambiente son el cromo trivalente [Cr(III)] y el cromo hexavalente [Cr(VI)], siendo este ltimo altamente txico y mutagnico para distintas formas de vida. A esto se suma que el Cr(VI) es altamente soluble, lo que lo hace mvil en el suelo y en ambientes acuticos, con la consecuente toxicidad para los ecosistemas. La influencia negativa de la acumulacin de cromo sobre las poblaciones de microorganismos del suelo ha sido ampliamente descrita, as como la consecuente aparicin de poblaciones de organismos adaptados (tolerantes) al ambiente hostil. En el caso de los hongos, organismos predominantes del suelo que actan como eficientes biotransformadores, se han realizado estudios sobre los mecanismos de interaccin con el cromo, la mayora de los cuales se han centrado en los procesos de biosorcin, caracterizndose ste por la unin pasiva del metal con componentes de la superficie celular, y de bioacumulacin, en el cual ocurre la entrada del metal a las clulas con gasto de energa. Las especies reportadas incluyen levaduras como Saccharomyces cerevisiae, Candida sp., Pichia sp. y los hongos filamentos Aspergillus sp., Penicillium sp. y Rhyzopus sp. En estudios recientes, se han descrito cepas fngicas capaces de realizar el proceso de transformacin de Cr(VI) a especies reducidas, por un mecanismo bioqumico desconocido hasta la fecha. Dichas cepas comprenden levaduras como Candida sp., Saccharomyces cerevisiae, Lecythophora sp., Candida sp., Aureobasidium pullulans y los hongos filamentosos Aspergillus sp., Aspergillus tubingensis y Penicillium sp. Con algunos de dichos organismos se han implementado procesos biotecnolgicos de biotratamiento de efluentes industriales. Palabras clave: hongos; cromo; biosorcin, bioacumulacin, biotransformacin; biotratamiento de efluentes industriales, biorremediacin.
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Abstract
This contribution aims to review studies on the fungal mechanisms of interaction with chromium and the applications of these mechanisms in the context of environmental biotechnology, with emphasis on some future directions for research and technological development The metal Chromium (Cr) is considered an environmental pollutant due to its widespread use in several industrial activities, among them electroplating, leather tanning, manufacture of explosives, etc. The stable forms of chromium in the environment are trivalent chromium [Cr(III)] and hexavalent chromium [Cr(VI)], the latter being highly toxic and mutagenic to various life forms. Added to this, is the fact that Cr(VI) is highly soluble, making it mobile in soil and aquatic environments with toxic consequences for ecosystems. The negative influence of the accumulation of chromium on soil microbial populations has been widely described, and the consequent emergence of populations of organisms adapted (tolerant) to the hostile environment. In the case of fungi, soil predominant organisms that act as efficient bioconverters, there have been several studies on the mechanisms of interaction with chromium, most of which have been focused on biosorption processes, characterized by the passive binding of the metal to components of the cell surface, and bioaccumulation, in which case the entry of the metal to the cells occurs with energy expenditure. The reported species include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Candida sp, Pichia sp and the filamentous fungi Aspergillus sp, and Rhyzopus sp. Recent studies have described fungal strains capable of performing the transformation of Cr(VI) to reduced species by an unknown biochemical mechanism. These strains include yeasts such as Candida sp, Saccharomyces cerevisiae, Lecythophora sp, Aureobasidium pullulans and the filamentous fungi Aspergillus sp, Aspergillus tubingensis and Penicillium sp. With some of these organisms studies have been carried out to implement biotechnological processes for the clean up of industrial effluents. Key words: fungi; chromium; biosorption, bioaccumulation, biotransformation; biotreatment of industrial effluents and bioremediation.
1. El cromo en el ambiente
Entre los metales, el cromo ha atrado amplio inters pblico y de agencias regulatorias debido a la toxicidad que ejerce sobre los ecosistemas, incluyendo microorganismos y animales. El cromo es un metal de transicin localizado en el grupo VI-B de la Tabla Peridica. Aunque puede existir en varios estados de oxidacin, las formas ms comunes y estables en el ambiente son el Cr trivalente Cr(III) y el Cr hexavalente Cr(VI), las cuales poseen propiedades qumicas distintas. El Cr(VI), considerado la forma ms txica del cromo, se encuentra usualmente asociado al oxgeno en forma de cromatos (CrO42-) y dicromatos (Cr2O72-),
que debido a su gran solubilidad son altamente mviles en el suelo y en ambientes acuticos. Por otra parte, el Cr(III) se encuentra en forma de xidos, hidrxidos o sulfatos poco solubles, por lo cual es mucho menos mvil, y existe unido a materia orgnica en el suelo y en ambientes acuticos (Palmer y Wittbrodt, 1991). El Cr(VI) es un fuerte agente oxidante y en presencia de materia orgnica es reducido a Cr(III); esta transformacin es ms rpida en ambientes cidos (McGrath y Smith, 1990). Sin embargo, niveles elevados de Cr(VI) pueden sobrepasar la capacidad reductora del ambiente y puede as persistir como un contaminante. Actualmente se ha establecido que diversos compuestos de cromo, en forma de xidos, cromatos y dicromatos, son
49 contaminantes ambientales presentes en agua, suelos y efluentes de industrias, debido a que dicho metal es ampliamente utilizado en distintas actividades manufactureras, tales como cromado electroltico, fabricacin de explosivos, curtido de pieles, aleacin de metales, fabricacin de colorantes y pigmentos, etc. (Calder, 1988). aunque en altas concentraciones pueden presentar los mismos efectos txicos que los de Cr(VI) (Wong y Trevors, 1988; Katz y Salem, 1993). El Cr(III) funciona como un oligoelemento esencial para los seres humanos (Anderson, 1989).
3. Interacciones de los hongos con el cromo

Los hongos son organismos ubicuos en la naturaleza, que predominan en el suelo, poseen propiedades fundamentales como biotransformadores y juegan un papel importante en los ciclos geoqumicos de los metales (Gadd, 1993; Burford et al., 2003). La influencia negativa de la acumulacin del cromo sobre las poblaciones de microorganismos del suelo ha sido ampliamente descrita, as como la consecuente aparicin de poblaciones de organismos adaptados (tolerantes) al ambiente hostil (Cervantes et al., 2001). Las clulas fngicas interaccionan con el cromo a diferentes niveles, desde la pared celular, el periplasma y la membrana plasmtica, hasta el citoplasma y los organelos celulares. Dichos microorganismos requieren detectar y regular los niveles intracelulares de cromo a travs de sistemas de homeostasis que mantienen un balance entre la incorporacin, expulsin y captura del metal. Es comn que los microorganismos nativos de sitios contaminados con cromato muestren resistencia al in, debido a que poseen mecanismos activos o pasivos que les permiten removerlo o destoxificarlo. En ciertas especies se conocen con detalle dichos mecanismos, algunos de los cuales son de inters bsico y de importancia biotecnolgica, esto ltimo en el contexto del desarrollo de nuevas tecnologas para el tratamiento de efluentes industriales y para la biorremediacin de sitios contaminados. De manera general dichos mecanismos comprenden: (Fig. 1).
2. Toxicidad del cromo

Los efectos biolgicos del Cr dependen de su estado de oxidacin. El Cr(VI) es considerado la forma ms txica del metal, debido a que atraviesa fcilmente las membranas biolgicas y puede ser transportado activamente al interior de las clulas por medio del transportador de sulfato (Borst-Pauwels, 1981). El Cr(VI) es altamente txico para todas las formas de vida, siendo mutagnico y carcinognico en animales y mutagnico en bacterias (Losi et al., 1994). Se ha propuesto que la toxicidad del Cr(VI) se debe a que dentro de las clulas se generan intermediarios reducidos de cromo que en presencia de H2O2 funcionan como catalizadores de una reaccin tipo Fenton, generando Especies Reactivas de Oxgeno (ERO), con el consecuente dao oxidativo, produciendo peroxidacin de lpidos, oxidacin de protenas y cidos nucleicos (Ercal et al., 2001; Liu y Shi, 2001). Sumner et al. (2005) establecieron que en la levadura Saccharomyces cerevisiae la oxidacin de protenas es el principal mecanismo de toxicidad de Cr(VI), siendo las protenas glicolticas y las de choque trmico las principalmente oxidadas, adems de que la oxidacin es isoforma especfica. Hasta la fecha se desconoce si dicho mecanismo explica la toxicidad del Cr(VI) en otros sistemas biolgicos. Por otra parte, los compuestos de Cr(III) son relativamente inocuos debido a que son insolubles y no pueden atravesar las membranas biolgicas,
50 Biotransformacin de Cr(VI) a especies reducidas (reduccin qumica), que puede ser: 1) directa (enzimtica) o 2) indirecta (no enzimtica); 3) Incorporacin y bioacumulacin; 4) Biosorcin de Cr(III) y Cr(VI); y 5) Inmovilizacin.
Figura 1. Mecanismos de interaccin de los hongos con el cromo. Se ilustran los posibles modos de transformacin qumica, as como las maneras de unin e incorporacin a las clulas y la inmovilizacin mediante la formacin de complejos.
4. Biotransformacin de Cr(VI) a especies reducidas (reduccin qumica)

Dentro de las clulas microbianas el Cr (VI) puede ser reducido a Cr (III) por sistemas reductores, que pueden incluir rutas enzimticas y no enzimticas. Hace varios aos se haban descrito algunos reportes sobre hongos capaces de reducir el Cr (VI) a Cr (III) (Cervantes et al., 2001). En aos recientes dichos estudios se han incrementado; los organismos descritos incluyen levaduras como Candida maltosa (Ramrez-Ramrez et al., 2004), una cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae (Ksheminska et al., 2006), Candida sp. FGSFEP (Guilln-Jimnez, 2008), as como
Lecythophora sp. NGV-1, Candida sp. NGV-9 y Aureobasidium pullulans (Villegas et al., 2008). Entre los hongos filamentosos se han descrito cepas de Aspergillus sp. (Acevedo Aguilar et al., 2006; Fukuda et al., 2008), Penicillium chrysogenum (Pazouki et al., 2007), Penicillium sp (Acevedo Aguilar et al., 2006; Fukuda et al., 2008) y Aspergillus versicolor (Das et al., 2008). En la mayora de los casos, los organismos descritos poseen tolerancia a Cr(VI) y fueron aislados de sitios contaminados con cromato, ya sea de efluentes o licor de curtido de teneras o suelo conteniendo residuos industriales. La Figura 2 muestra la capacidad de transformacin del Cr(VI) a Cr (III) en cultivos de las cepas tolerantes a Cr(VI) Ed8
51 de Aspergillus sp y H13 de Penicilium sp.; como se muestra, dicha transformacin ocurri con muy poca unin de cromo a la biomasa ( 1.0 % del cromo total presente en el medio), lo que indic que la reduccin del Cr(VI) ocurre en el medio extracelular (Acevedo et al., 2006). Despus de 60 h, el color amarillo de los cultivos, debido a la presencia de Cr(VI), ha desaparecido completamente.
Figura 2. Reduccin de Cr(VI) a Cr(III) por las cepas Ed8 de Aspergillus sp y H13 de Peninicillium sp (A) y aspecto de los cultivos (B). Cromo total unido a la biomasa despus de diferentes tiempos de incubacin en presencia de Cr(VI) (C). Tomado de Acevedo Aguilar et al. (2006).
1) Biotransformacin directa (reduccin enzimtica) En los hongos se tiene poco conocimiento sobre los sistemas de reduccin de Cr(VI); se desconoce que tipo de sistema participa en la destoxificacin del Cr(VI), ya sea enzimtico o no enzimtico, intracelular o extracelular. Adems de las observaciones hechas con los hongos filamentosos Aspergillus sp. y Penicillium sp., mencionadas lneas arriba (Fig. 2), se ha indicado que en cepas de las levaduras Saccharomyces cerevisiae (Ksheminska et al. 2006) y Candida sp (Villegas et al., 2008) la reduccin de Cr(VI) ocurre en el medio de cultivo, con muy poca unin de Cr a la biomasa, proponindose que esto refleja que la reduccin de Cr(VI)
ocurre en el medio extracelular (Ksheminska et al. 2006). Hasta la fecha, slo en la levadura Candida maltosa se ha reportado actividad de cromato reductasa en extractos libres de clulas (Ramrez-Ramrez et al., 2004), aunque no se prob si dicha actividad es la responsable de la reduccin de Cr(VI) in vivo. Recientemente, se ha detectado actividad de cromato reductasa en extractos libres de clulas de la cepa Ed8 de Aspergillus tubingensis (Coreo Alonso, 2009), la cual es resistente a cromato y posee alta eficiencia para reducir el Cr(VI) a Cr(III) en el medio extracelular (Acevedo Aguilar et al., 2006, 2008); se desconoce el papel de esta actividad en la reduccin in vivo del Cr(VI). En varios gneros de bacterias se ha documentado la actividad de
52 cromato reductasa, proponindose que la misma puede constituir un mecanismo de resistencia a Cr(VI) por participar en su destoxificacin (Cervantes y Campos Garca, 2007); dichas enzimas poseen propiedades bioqumicas conocidas (nitrato reductasa, flavin reductasa, ferrireductasa y algunas flavoprotenas) y algunas son capaces de reducir al Cr(VI) in vitro. 2) Biotransformacin indirecta (reduccin no enzimtica) En el interior de las clulas microbianas los reductores no enzimticos mas potentes pueden ser el glutatin y la cistena; se ha propuesto que en la levadura Schizosaccharomyces pombe el glutatin puede proteger de la toxicidad del Cr(VI) por su capacidad de amortiguar al in hidroxilo producido en su presencia (Pesti et al., 2002). La reduccin extracelular de Cr(VI) por clulas fngicas podra deberse a la produccin y excrecin de molculas reductoras, las cuales se desconocen hasta ahora. En el caso de bacterias, se ha descrito que producen y excretan substancias reductoras, como el in ferroso Fe(II) y H2S, acoplando la oxidacin de molculas orgnicas y de hidrgeno a la reduccin de in frrico Fe(III) y sulfato, respectivamente (Kamaludeen et al., 2003). Tambin, recientemente, se demostr que las bacterias Shewanella oneidensis y Shewanella sp. secretan flavinas como parte de un sistema extracelular de transferencia de electrones (Marsili et al., 2008). Es factible que la reduccin extracelular de Cr(VI) observada en hongos filamentosos (Acevedo et al., 2008) y levaduras (Ksheminska et al. 2006; Villegas et al., 2008) se deba a la produccin y excrecin de molculas similares a las descritas en bacterias o bien, que produzcan molculas reductoras de Cr (VI) especficas. En el caso de la cepa industrial de S. cerevisiae (Ksheminska et al. 2006), se encontr que el Cr(III) formado por reduccin de Cr(VI) en el medio extracelular se encuentra acomplejado con, al menos, dos compuestos distintos producidos por la levadura, de naturaleza desconocida; en su momento, deber determinarse si dichos compuestos corresponden a molculas reductoras de Cr(VI). 3) Incorporacin y bioacumulacin En la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha descrito que el Cr(VI) puede incorporarse a las clulas por un transportador aninico no especfico, un sistema de permeasas que transporta diferentes aniones como sulfatos y fosfatos (Borst-Pauwels, 1981); dicho sistema es codificado por los genes SUL1 y SUL2 (Cherest et al., 1997). Se ha descrito que en la levadura S. cerevisiae la expresin de dichos genes es modulada positivamente por el regulador transcripcional MSN1; la falta de esta protena conduce a un nivel de expresin bajo en los genes de los transportadores SULI y SUL2, causa que se acumule menos cromo en las clulas y produce el fenotipo de tolerancia a Cr(VI) (Chang, 2003). La incorporacin de sulfato es un punto importante de regulacin del metabolismo del sulfato en otros hongos; dicha incorporacin esta sujeta a represin metablica por azufre, la cual afecta la expresin de los genes codificantes de las permeasas de sulfato en Neurospora crassa (Marzluf, 1997; Tao y Marzluf, 1998), Aspergillus nidulans (Natorf et al., 1993, 1998) y Penicillium chrysogenum (Van de Kamp et al., 2000). Evidencia adicional sobre el uso del sistema de transporte de sulfato para la incorporacin del cromato, se obtuvo por la observacin de que algunos mutantes resistentes a cromato de hongos filamentosos y levaduras mostraron una dramtica disminucin en el transporte de sulfato (Cervantes et al., 2001).
53 Recientemente, se ha mostrado que en el genoma de algunos hongos filamentosos, pero no en el de levaduras, existen homlogos de la protena bacteriana ChrA (Cervantes y Campos-Garca, 2007), la cual pertenece a la superfamilia de transportadores CHR, probablemente implicadas en el transporte de sulfato y cromato (Nies et al., 1998). En las bacterias Pseudomonas aeruginosa y Cupriavidus metallidurans la protena ChrA constituye un determinante de resistencia a Cr(VI), por funcionar como una bomba expulsora del in (Cervantes y Campos-Garca, 2007; Ramrez Daz et al., 2008). En hongos, la funcin de estas protenas CHR homlogas no ha sido analizada. Una vez que inicia la incorporacin del cromo, este puede ser acumulado por las clulas fngicas durante el crecimiento. La acumulacin del metal es influida por diversos factores, como el pH del medio, la concentracin inicial del metal, la especie qumica de ste y la temperatura. La Tabla 1 muestra reportes de remocin de cromo del medio por acumulacin del metal en la biomasa de distintos gneros y especies de hongos; es claro que entre los organismos que remueven el cromo a altas concentraciones iniciales de este en el medio figuran las especies de Aspergillus.
Tabla 1. Remocin de cromo por bioacumulacin/biosorcin del metal con biomasa de hongos. Concentracin inicial de metal (mg/L) 5 240 100 100 500 2150 72 Remocin (%) 97 97 80 92 75 71 78 Tiempo (h) 92 36 4 18 168 36 36
Metal Cr(VI) Cr(III) Cr(VI) Cr(VI) Cr(VI) Cr(III) Cr(VI)
Microorganismo Aspergillus foetidus Aspergillus oryzae Rhizopus nigricans Aspergillus sp. Aspergillus niger Aspergillus Nger MTCC2594 Aspergillus niger MTCC2594
pH 7.0 5.0 2.0 5.0 6.0 5.5 5.5
Referencia Prasenjit et al., 2002 Nasseri et al., 2002 Bai y Abraham, 2001 Congeevaram et al., 2007 Srivastava y Thakur, 2006 Mala et al., 2006 Mala et al., 2006
Sin embargo, se ha descrito que tanto levaduras como hongos filamentosos son capaces de acumular concentraciones elevadas de cromo en la biomasa; como ejemplo, cabe mencionar que la levadura Pichia guillermondii (Ksheminska et al., 2005) y los hongos filamentosos Aspergillus sp. (Srivastava y Thakur, 2006b) y Rhizopus sp. (Zafar et al., 2007) acumulan alrededor de 13.0, 8.2 y 4.5 mg de cromo por g de biomasa, respectivamente.
Es importante mencionar que en los reportes mencionados se usaron diferentes condiciones, que incluyen los medios de cultivo, la concentracin de cromo y la relacin metal/biomasa, que dificultan las comparaciones.
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Tabla 2. Reportes de bioacumulacin/biosorcin de cromo en hongos filamentosos y levaduras en los ltimos 5 aos. Bioacumulacin/ Organismo Bioacumulacin/ Biosorcin de Referencia Biosorcin de Cr(VI) Cr(III) Aspergillus niger1 Si Si Mala et al., 2006 MTCC 2594 1 Aspergillus sp. N.i. Si Congeevaram et al., 2007 Rhizopus sp.1 N.i. Si Zafar et al., 2007 Aspergillus sp.1 N.i. Si Aspergillus sp.1 Hirsutella sp.1 Aspergillus sp.1 Aspergillus sp.1 N2; Penicillium sp.1 N3 Aspergillus versicolor1 Candida intermedia2 Pichia guilliermondii2 ATCC 201911 Fusin de Candida2 tropicalis y Candida lipolytica2
1
Si Si N.i Si N.i. N.i. Si Si Si N.i. Si Si Fukuda et al., 2008 Si Si Si Si Si Das et al., 2008 Pas et al., 2004 Kaszycki et al., 2004 Yin et al., 2008 Srivastava y Thakur, 2006b Srivastava y Thakur, 2006a
Hongo filamentoso; 2 Levadura. N.i. No investigado.
4) Biosorcin de Cr(III) y Cr(VI) Se ha descrito la captura de cromo en la superficie de hongos filamentosos y de levaduras, como resultado de su unin con componentes de la pared celular; en esta estructura existen principalmente polisacridos, como glucanas, quitina y quitosana, los cuales pueden estar asociados con protenas, y otros componentes menores como lpidos y melaninas (Gadd, 1993; Pillichshammer et al., 1995; Cervantes et al., 2001). Esta unin del cromo a la superficie de los hongos ocurre de un modo independiente de energa, de manera similar a lo descrito con otros metales y se le ha denominado biosorcin (Volesky y Holan, 1995; Pillichshammer et al., 1995; Cervantes et al., 2001). El micelio de los hongos zigomicetos Mucor mucedo y Rhizomucor miehei tratado qumicamente
muestra alta eficiencia para unir Cr; tambin, las biomasas de Rhizomucor arrhizu, Candida tropicales, Penicillium chrysogenum y Aspergillus carbonarius NRC401121 son excelentes biosorbentes (Cervantes et al., 2001). Entre varios aislados de hongos filamentosos, la cepa de MP/92/3/4 de Mucor hiemalis mostr una eficiencia mayor para biosorber Cr(III) a su biomasa, comparado con la unin de Cr(VI) (Pillichshammer et al., 1995). En aos recientes se han incrementado las investigaciones sobre el empleo de biomasa fngica para remover cromo. La Tabla 2 muestra reportes descritos en los ltimos 5 aos, en los que se incluyen los resultados de estudios hechos en cultivos con hongos filamentosos o levaduras, predominando los realizados con los primeros. Dado que en dichos estudios se emple biomasa viva, los
55 datos obtenidos pueden deberse a los procesos de bioacumulacin y/o de biosorcin de cromo. En el reporte de Das et al., (2008), mencionado en la Tabla 2, mediante el empleo de espectroscopa fotoelectrnica de rayos X, se describe que en Aspergillus versicolor ocurre la unin de Cr(VI) a la pared celular del micelio y que los componentes de sta causan su reduccin a Cr(III), el cual une electrostticamente al Cr(VI) conduciendo a la formacin de acmulos del metal en capas sobre la pared celular. Es probable que la interaccin de los hongos con el cromo involucre dos o ms de los mecanismos mostrados en la Figura 1. Ejemplo de esto lo constituyen las recientes observaciones de Das et al., (2008), en las que se concluy que en A. versicolor ocurre reduccin de Cr(VI) a Cr(III) y tambin unin de ambos iones a la superficie celular. Otra indicacin proviene de la observacin de que la eficiencia de reduccin de Cr(VI) a Cr(III) en la cepa Ed8 de Aspergillus sp., la cual ocurre en el medio extracelular (Acevedo Aguilar et al., 2006), se estimula dramticamente por la presencia en el medio de cidos orgnicos, como citrato, salicilato o tartrato (Fig. 3; Coreo Alonso et al., 2009). Dichos compuestos son productos del metabolismo microbiano abundantes en el suelo, que actan como efectivos acomplejantes del Cr(III) unido a arcillas y otros componentes (Dubbin, 2004). Por ello, su efecto estimulatorio sobre la reduccin de Cr(VI) por la cepa Ed8, identificada como un aislado de Aspergillus tubingensis (Coreo Alonso et al., 2009), puede explicarse en base a que actan favoreciendo la reaccin de reduccin de Cr(VI), acomplejando al producto de esta. Es factible que la estimulacin de la reduccin microbiana de Cr(VI) por cidos carboxlicos tenga un papel importante en la atenuacin natural de dicho in (Coreo Alonso et al., 2009).
Figura 3. Efecto de cidos carboxlicos en la eficiencia de reduccin extracelular del Cr(VI) en la cepa Ed8 de Aspergillus tubingensis. Adaptado de Coreo Alonso et al. (2009).
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5. Tolerancia a Cr(VI)
La tolerancia a cromato ha sido descrita en cepas fngicas de laboratorio mediante induccin con agentes mutagnicos, as como en aislados nativos de sitios contaminados; en varios casos, tanto de levaduras como de hongos filamentosos, se demostr que la tolerancia al Cr(VI) se debe a la alteracin del transporte de sulfato, que conduce a una menor incorporacin de cromato (Cervantes et al., 2001). Como ya se mencion, los genes SUL, implicados en el transporte sulfato, estn sujetos a regulacin transcripcional, tanto en levaduras (Chang, 2003) como en hongos filamentosos (Marzluf, 1997; Tao y Marzluf, 1998; Natorf et al., 1993, 1998; Van de Kamp et al., 2000). En otros casos se producen fenotipos de hipersensibilidad a Cr(VI), como resultado de la alteracin de la ATPasa vacuolar o de estructuras vacuolares (Gharieb y Gadd, 1998), o bien por la alteracin de proteinas que protegen del efecto oxidativo del Cr(VI), como la alkil hidroperxido reductasa (Nguyen-Nhu y Knoops, 2002) o la Cu,Zn-superoxido dismutasa y la pptido metionina sulfxido reductasa(Sumner et al., 2005).
transformacin qumica de cromo son promisorios y de importancia prctica en el contexto de la biotecnologa ambiental, ya que pueden servir de base para el desarrollo de procedimientos limpios y econmicos para el tratamiento de aguas naturales, de efluentes industriales o para la biorremediacin de suelos contaminados. A continuacin se describen estudios realizados en hongos sobre dichos procesos.
7. Biosorcin de Cromo
En 1995 se hizo un esfuerzo para resumir el tipo y eficacia de los biosorbentes, as como los procesos de tratamiento por biosorcin (Volesky y Holan, 1995); de entonces a la fecha los estudios han continuado de manera intensiva, considerndose en muchos casos el empleo de biomasa fngica, cultivada en lote, en biorreactores o inmovilizada en diferentes matrices, para remover por biosorcin el cromo presente en medio de cultivo o en efluentes industriales. Respecto de los hongos, los organismos utilizados incluyen Rhizopus nigricans (Bai y Abraham, 2005), Penicillium chrysogenum (Deng et al., 2006), Trichoderma viride (Bishnoi et al., 2007), Aspergillus sp. e Hirsutella sp. (Srivastava y Thakur, 2006 a,b), Rhizopus cohnii (Li et al., 2008) y otros. En algunos casos, los estudios se realizan utilizando biorreactores; en la Tabla 3 se muestra que la biomasa de Aspergillus sp. incubada en un biorreactor puede utilizarse para la remocin por biosorcin del Cr presente en los efluentes de una tenera o en medio de cultivo (Srivastava y Thakur, 2006a); debido a que en los efluentes existen otros compuestos que son txicos, la eficiencia de remocin de Cr es menor a la observada en medio de cultivo.
6. Aplicaciones biotecnolgicas
Los procedimientos convencionales para la remocin del cromato de sitios contaminados son de tipo fisicoqumico e incluyen la reduccin qumica seguida de la precipitacin, intercambio inico o adsorcin sobre carbn activado, almina, kaolinita o ceniza. Sin embargo, la mayora de esos mtodos requieren de alta energa o de cantidades grandes de reactivos (Shrivastava et al., 1986). Los procesos microbianos de biosorcin y de
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Tabla 3. Remocin de Cr por biomasa de la cepa FK1 de Aspergillus sp. incubada en bioreactor. Porcentaje de disminucin de cromo presente en: Medio de Efluente cultivo* industrial** 65 30 70 48 85 60
Tiempo de incubacin (das) 1 3 5
* El cromo inicial fue de 500 ppm de Cr(VI). ** El cromo inicial presente en el efluente fue 557 ppm, determinado como Cr total. Adaptado de Srivastava y Thakur (2006a).
En otros estudios se ha considerado el empleo de biomasa fngica generada como producto secundario de fermentaciones a nivel industrial para la produccin de alimentos, bebidas o productos farmacuticos; ejemplo de esto lo constituye P. chrysogenum, utilizado para la produccin de penicilina. En este caso se ha considerado realizar modificaciones a la superficie de la biomasa micelial, mediante la adicin de cargas positivas por la insercin en la misma del polmero polietilenimina. Debido a la alta densidad de grupos amino en las molculas del polmero, la biomasa modificada mostr potencial zeta positivo as como alta capacidad de adsorber Cr (VI) (Deng et al., 2006). Otro enfoque novedoso ha consistido en la preparacin de microesferas magnticas biofuncionales para la adsorcin y recuperacin de Cr (VI); la subsecuente aplicacin de la tecnologa de separacin magntica hace el proceso ms conveniente. En este procedimiento se utiliz biomasa pulverizada del hongo Rhizopus cohni en la preparacin de las microesferas; en este caso la biosorcin ocurri en forma de Cr(VI) por efecto de la biomasa fngica (Li et al., 2008).
8. Transformacin qumica del cromo
Dado que la movilidad y la toxicidad del Cr dependen de su estado de oxidacin, las reacciones redox que involucran al Cr son importantes en la determinacin de su destino en el ambiente y el riesgo de este para la salud humana. Se puede anticipar que la reduccin del Cr(VI) en ambientes contaminados resulta de una interaccin compleja de procesos biticos y abiticos. El Cr(VI) puede ser reducido a Cr(III) en el suelo por reacciones redox con especies inorgnicas acuosas, transferencia de electrones en superficies minerales, reaccin con substancias orgnicas no hmicas, tales como carbohidratos y protenas, o reduccin por substancias hmicas del suelo (Palmer y Wittbrodt, 1991). Como ya se mencion, la actividad microbiana tambin puede contribuir a la reduccin de Cr(VI) a travs de la liberacin del in ferroso, sulfuros o intermediarios orgnicos reactivos. Algunos ligantes solubles orgnicos pueden influenciar el destino del Cr ubicado bajo las superficies a travs de complejos con la forma reducida Fe(II) u oxidada Fe(III) del Fe, as como por el acomplejamiento del Cr(III) en formas solubles (Buerge y Hug, 1998). Como ya se mencion, la eficiencia de reduccin de Cr(VI) de la cepa Ed8 de A. tubingensis se estimula por cidos orgnicos como el citrato, salicilato o tartrato (CoreoAlonso et al., 2009; Fig. 3), que provienen del metabolismo microbiano y que son abundantes en el suelo. En base a esta observacin y a la capacidad de la biomasa de la cepa Ed8 de A. tubingensis de realizar de manera sostenida la disminucin de los niveles de Cr(VI), se implement un procedimiento continuo de biotratamiento de efluentes industriales en base a ciclos de recarga de efluentes utilizando medio con agentes acomplejantes (Coreo-Alonso et al., 2009; Fig 4 A, B). Tomando en cuenta la concentracin inicial de Cr(VI) en los efluentes, de alrededor de
58 50 g/ml, y 3 ciclos de recarga de 50 g/ml cada uno, en medio con citrato se redujeron alrededor de 180 g/ml despus de 96 h (Fig. 4A). Se obtuvo una mejora adicional en la eficiencia del sistema utilizando medio suplementado con una mezcla de salicilato y tartrato, ya que despus de 3 ciclos de recarga se obtuvo la reduccin de cerca de 140 g/ml de Cr(VI) despus de 24 h (Fig. 4B). Estos resultados indican la utilidad biotecnolgica de la cepa Ed8 de A. tubingensis para el diseo de procesos de biotratamiento de efluentes industriales contaminados con Cr(VI).
Figura 4. Proceso continuo de remocin de Cr(VI) de efluentes industriales (residuos de una cromadora) por reduccin con biomasa de la cepa Ed8 incubada en medio con el acomplejante citrato (A), o una mezcla de salicilato y tartrato (B). Las flechas indican recargas de efluente con la concentracin de Cr(VI) utilizada al inicio de las incubaciones (50 mg/L). Tomado de Coreo Alonso et al. (2009).
Los reportes sobre aplicaciones de microorganismos para estudios de biorremediacin de suelos contaminados con cromato son escasos. Uno de dichos estudios incluy el empleo de bacterias no identificadas, nativas del sitio contaminado, las cuales se utilizaron en bioreactores para tratar suelo contaminado con Cr(VI). Se encontr que la reduccin mxima de Cr(VI) ocurri con el empleo de 15 mg de biomasa bacteriana por g de suelo (peso hmedo), con 50 mg de melasas por g de suelo como fuente de carbono; el bioreactor operado en esas condiciones redujo completamente 5.6 mg Cr(VI) por g de suelo en 20 das (Jeyasingh y Philip, 2004). En otro estudio se utilizaron bacterias reductoras de Cr(VI) no identificadas, nativas de un sitio contaminado, en combinacin con el hongo Ganoderm lucidum, ste ltimo utilizado para remover por biosorcin el Cr (III) formado. Los resultados obtenidos indicaron que la reduccion de 50 mg/L de Cr(VI) por
las bacterias fue mxima, de alrededor de un 80%, con 10 g/L de peptona como fuente de electrones y un tiempo de retencin hidraulica de 8 h. El Cr (III) producido fue removido utilizando una columna con el hongo Ganoderm lucidum como absorbente y exceso de donador de electrones del efluente del bioreactor; en esas condiciones, la capacidad especfica de adsorcin de Cr (III) de G. Lucidum en la columna fue de 576 mg por g (Krishna y Philip, 2005). En otros estudios se ha probado la adicin de fuentes de carbono a suelo contaminado analizado en columna; en uno de esos estudios se observ que la adicin de triptona de soya a suelo adicionado de 1000 mg/L de Cr(VI) incrementa la reduccin del in, debido a la accin de microorganismos presentes en el suelo, aunque tal accin no es observada en suelo con mayores concentraciones (10,000 mg/L) de Cr(VI) (Tokunaga et al., 2003). En otro trabajo se observ que la adicin de nitrato y de
59 melasas acelera la reduccin de Cr(VI) a Cr(III) por una comunidad microbiana nativa estudiada en microcosmos en lote o en columnas de flujo no saturado, bajo condiciones similares a las de la zona vadosa. En el caso de los microcosmos en lote, la presencia de los mencionados nutrientes caus 87% de reduccin de los 67 mg/L de Cr(VI) presentes al inicio del experimento; los mismos nutrientes, agregados a una columna de flujo no saturado de 15 cm adicionada de 65 mg/L de Cr(VI), causaron la reduccin e inmovilizacin de 10% del cromo, en un periodo de 45 das (Oliver et al., 2003). herramientas poderosas para conocer los cambios y respuestas a nivel genmico en la expresin de genes, produccin de protenas y funcionamiento de rutas metablicas, como consecuencia de la exposicin a metales. Adicionalmente, estudios complementarios de fisiologa molecular pueden permitir establecer el papel de los genes/protenas identificados como de expresin/produccin diferencial en las propiedades de resistencia a Cr(VI) y/o en la capacidad de transformarlo a formas reducidas. En estudios recientes se ha analizado a nivel genmico la respuesta a Cr(VI) y a otros metales en el modelo de laboratorio S. cerevisiae (Jin et al., 2008); se obtuvo informacin que revela los cambios transcripcionales asociados con la exposicin a los metales (transcriptoma), as como sobre la relacin entre la expresin de alrededor de 4,700 genes no esenciales y la sensibilidad a aquellos (deletoma). El anlisis de estos dos tipos de informacin revel que varias rutas de transduccin de seales conservadas parecen estar involucradas en la respuesta a la exposicin a metales. Estos estudios indican que la respuesta al estrs causado por el cromato y otros metales es compleja, posiblemente resultante de la accin de varios sistemas de regulacin transcripcional y asociada con los efectos primarios y secundarios de la interaccin de los metales con los componentes celulares. En el futuro, ser necesaria la integracin de los resultados de la combinacin de estudios de transcriptoma, protemicos y de metabolmica, a fin de lograr obtener una panormica de las respuestas celulares a nivel del organismo completo. Derivado de lo anterior, podr hacerse una seleccin y manipulacin adecuada de genes de inters para mejorar caractersticas particulares de los microorganismos con fines biotecnolgicos. Otros aspectos de importancia para una comprensin ms profunda de las
9. Nuevos enfoques y direcciones de los estudios

En pocos estudios en relacin con las respuestas a cromo se han usado modelos microbianos de laboratorio, como la levadura sensible a Cr(VI) S. cerevisiae, que ha sido ampliamente utilizada para la elucidacin de distintos procesos biolgicos fundamentales, gracias a la facilidad de su manipulacin por procedimientos de gentica molecular. En uno de dichos estudios, utilizando cepas mutantes afectadas en funciones de reparacin de dao a ADN, de lpidos o de protenas (Sumner et al., 2005) se estableci que en S. cerevisiae la oxidacin de protenas es el principal mecanismo de toxicidad de Cr(VI). Por otra parte, la caracterizacin de aislados de levaduras y de hongos filamentosos nativos de sitios contaminados con Cr(VI), que usualmente son tolerantes al in, puede revelar procesos metablicos y/o mecanismos no presentes en modelos de laboratorio, que podran ser relevantes para las propiedades de tolerancia y capacidad de destoxificacin del in. Ya sea en modelos de laboratorio o en cepas fngicas de origen ambiental, el anlisis del transcriptoma, del proteoma y del metaboloma constituyen
60 interacciones de las clulas fngicas con el cromo, es la utilizacin de tecnologas de alta resolucin tales como la microscopa electrnica de transmisin (MET) y de barrido (MEB), espectroscopa de dispersin de rayos X y de aquellas que permitan la deteccin de las especies estables del cromo, ya sea en las clulas o en el medio extracelular, como la espectroscopa fotoelectrnica de rayos X. Aspectos adicionales de mejora futura comprenden la modificacin y optimizacin de las condiciones de interaccin microorganismo-metal, que conduzcan a una mayor eficiencia en la reduccin del Cr(VI), o nuevas modificaciones qumicas de la biomasa que incrementen la eficiencia en la biosorcin del metal. Aunado a lo anterior, se requerrn de nuevos estudios en biorreactores, tanto en cultivos sumergidos como en fase slida, a fin de alcanzar mejoras en la ingeniera de los procesos de tratamiento de efluentes y de su escalamiento. De igual forma, ser de importancia incrementar los estudios sobre la implementacin de procedimientos de biorremediacin de suelos contaminados con cromo, empleando cepas fngicas seleccionadas, solas o combinadas en consorcios con bacterias, considerando tambin el empleo de condiciones ambientales y nutricionales adecuadas, que redunden en procesos efectivos y econmicos.
10. Conclusiones
Los mecanismos fngicos de interaccin con el cromo promisorios en el contexto de la Biotecnologa Ambiental son la biosorcin, la bioacumulacin y la biotransformacin; de stos, el menos entendido a nivel bioqumico es la biotransformacin. Existen escasos estudios en relacin con las respuestas a cromo en los hongos, por lo que se espera que la aplicacin de los enfoques de protemica, genmica y metabolmica contribuya al entendimiento de los cambios asociados con respuestas a la toxicidad del in y/o de importancia para la destoxificacin del mismo. A futuro, esta informacin puede servir para el desarrollo de nuevas variedades fngicas con capacidades mejoradas. Se requiere contar con un mayor nmero de estudios en bioreactores que conduzcan a mejoras en la ingeniera de los procesos para el biotratamiento de efluentes industriales y de procedimientos para la biorremediacin de sitios contaminados.
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Reconocimientos
Este trabajo se realiz con el apoyo de los proyectos CB-2005-01-51635 de CONACyT y UG-IBE-07-04 de la Universidad de Guanajuato, Mxico. A. Coreo Alonso y F.J. Acevedo Aguilar recibieron una beca de posgrado del CONACyT y del CONCYTEG, Mxico.
Referencias
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64 Revisin crtica
Arthrospira platensis como biofactora de metabolitos secundarios de inters farmacolgico: el cido pipeclico.
Leopoldo Naranjo-Briceo1*, Diego Rojas-Tortolero1, Hctor Gonzlez2, Rubn Torres Parra2, Jorge Zegarra Narro2, Luca Sena-DAnna1, y Daynet Sosa del Castillo3
1
Direccin de rea de Energa y Ambiente, Fundacin Instituto de Estudios Avanzados (IDEA). C/ Hoyo de la Puerta-Baruta, Sartenejas, Caracas 1080, Venezuela. 2 Asociacin Civil Gente de Ciencias (GDC) 3 Direccin de rea de Agricultura y Soberana Alimentaria, Fundacin Instituto de Estudios Avanzados (IDEA)
*
Autor de correspondencia: lnaranjo@idea.gob.ve
Resumen
Las cianobacterias constituyen una alternativa innovadora para ser utilizadas como factoras celulares con el fin de producir grandes cantidades de metabolitos secundarios de inters farmacolgico. El cido pipeclico est relacionado con el metabolismo de lisina en diversos organismos y es un componente y precursor importante de la biosntesis de diversos compuestos bioactivos tales como: inmunosupresores, pptidos no-ribosomales, poliqutidos y alcaloides en microorganismos y plantas. En este sentido, diversos anlisis bioqumicos han demostrado la alta capacidad de A. platensis de acumular lisina intracelularmente. En la naturaleza, la sntesis de lisina tiene lugar por medio de dos rutas biosintticas distintas; mientras que en hongos filamentosos el cido pipeclico se sintetiza va cido -aminoadpico, a travs de la ruta del aminoadipato para formar L-lisina, en plantas el cido pipeclico se sintetiza va sacaropina, a travs del catabolismo de L-lisina. Sin embargo, en ambos casos, el intermediario piperiden-6carboxlico (P6C) es el precursor inmediato del cido pipeclico. La presente revisin tiene como objetivo principal el estudio del metabolismo de cido pipeclico en diversos organismos y sus posibles aplicaciones biotecnolgicas en la industria farmacutica. Asimismo, se plantea el uso de A. platensis como factora celular para producir P6C, cido pipeclico u otros metabolitos de inters farmacolgico. Palabras clave: L-lisina, -aminoadipato, cido pipeclico, biosntesis, cianobacteria.
Abstract
The cyanobacteria are an innovative alternative to be used as cellular factories to produce large amount of secondary metabolites of pharmacological interest. Pipecolic acid is related to lysine metabolism in diverse organisms and is an important component and precursor for the biosynthesis of several bioactive compounds such as immunosuppressants, non-ribosomal peptides, polyketides and alkaloids in microorganisms and plants. In fact, several studies have demonstrated the biochemical capacity of A. platensis to accumulate lysine intracellularly. In nature, the synthesis of lysine occurs through two distinct biosynthetic pathways, whereas in
65 filamentous fungi the pipecolic acid is synthesized via -aminoadipic acid, through the aminiadipate pathway to form L-lysine, in plants pipecolic acid is synthesized via saccharopine, through the catabolism of L-lysine. However, in both cases, the piperidine-6-carboxylic acid (P6C) metabolite is the immediate precursor of pipecolic acid. The present review is focused at the study of the pipecolic acid metabolism in diverse organisms and their potential biotechnological applications in the pharmaceutical industry. Likewise, the use of A. platensis as a cell factory to produce P6C, pipecolic acid or other metabolites with pharmacological interest is disscused. Keywords: L-lysine, -aminoadipate, pipecolic acid, biosynthesis, cyanobacteria.
1. Introduccin
Arthrospira platensis es una cianobacteria filamentosa fotosinttica y alcalfila original de ambientes bicarbonatados que pertenece a la familia de las Oscillatoriaceae, Divisin Cyanophyta (Ciferri, 1983). Desde pocas ancestrales A. platensis ha sido estimada por sus propiedades medicinales y nutricionales (Ciferri, 1983; Belay et al. 1993, Belay et al. 1996; Subhashini et al. 2004; Thajuddin y Subramanian, 2005; Ramrez-Moreno y Olvera-Ramrez, 2006; Snchez et al. 2006;). Actualmente A. platensis tiene un alto inters biotecnolgico y econmico tanto para la industria alimentaria como farmacolgica. Desde el punto de vista alimentario, adems de ser fcilmente digerible (Ciferri, 1983; Jaime et al. 1996; Thajuddin y Subramanian, 2005; RamrezMoreno y Olvera-Ramrez, 2006), A. platensis constituye una fuente potencial de pigmentos, protenas, vitaminas, cidos grasos, minerales, carbohidratos, cidos nucleicos y aminocidos (Ciferri y Tiboni, 1985, Henrikson, 1989, Mosulishvili et al. 2002; Ramrez-Moreno y Olvera-Ramrez, 2006; Colla et al. 2007). Ms recientemente, el potencial biotecnolgico de A. platensis y otras microalgas se ha demostrado en una amplia gama de usos, tales como, en la degradacin de herbicidas organofosforados (Lipok et al. 2007), la fijacin de gases de efecto invernadero (de Morais, 2007), como bioacumuladoras de metales pesados (Chojnacka, 2005, Gong, 2005, Pane et al.
2007, Lodi, 2007), como biocatalizadoras en procesos de biotransformacin (Utsukihara et al. 2007), para la produccin de hidrgeno (Juantorena et al. 2007) y en la produccin de biocombustibles (Chisti, 2007), entre otros. Desde el punto de vista farmacolgico, las cianobacterias constituyen una alternativa innovadora para ser utilizadas como factoras celulares para producir grandes cantidades de metabolitos secundarios con interesantes actividades farmacolgicas tales como antibiticos, vitaminas, aminocidos, enzimas, agentes antitumorales, protenas heterlogas, entre otros (Singh, 2005; Spolaore, 2006). En este sentido, la ingeniera metablica surge como un campo interdisciplinario que apunta a mejorar las caractersticas celulares de los organismos usando la biologa molecular como herramienta para modificar las rutas metablicas y/o la regulacin de las mismas (Stafford y Stephanopoulos, 2001). Esto, con la finalidad de disminuir o incrementar la biosntesis de algn metabolito o un producto final en particular. En la naturaleza, la sntesis de lisina, un aminocido esencial requerido en la dieta diaria de mamferos, tiene lugar por medio de dos rutas biosintticas completamente distintas: i) la ruta del cido diaminopimlico y, ii) la ruta del - aminoadipato (tambin denominada ruta del cido -aminoadpico).
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Figura 1. Ruta biosinttica del -aminoadipato para la formacin de L-lisina descrita en hongos. Se muestra la ruta de conversin de cido pipeclico en lisina descrita en P. chrysogenum va -aminoadipato--semialdehdo y sacaropina. As mismo, se muestra la conversin de cido -aminoadpico en cido pipeclico, componente y precursor de numerosos metabolitos secundarios con interesantes actividades biolgicas. -AA--SA: aminoadipato--semialdehdo; P6C: cido piperiden-6-carboxlico. lys7: gen que codifica la sacaropina reductasa de P. chrysogenum.
67
Se ha descrito que los hongos y las euglenofitas utilizan la ruta del aminoadipato (Fig. 1) para la biosntesis de lisina (Vogel, 1960; Rothstein y Saffran, 1963; Lejohn, 1971; Bhattacharjee, 1985; Garrad y Bhattacharjee, 1992; Weidner et al. 1997; Casqueiro et al. 1999a, 2001; Bauelos et al. 1999, 2000; Hijarrubia et al. 2001; Naranjo et al. 2001; 2002; 2004; Teves et al. 2009). En este sentido, anlisis bioqumicos han puesto en clara evidencia la alta capacidad de A. platensis de acumular lisina intracelularmente (Ramrez-Moreno y Olvera-Ramrez, 2006). La ruta biosinttica del -aminoadipato comienza con la condensacin de cetoglutarato y acetil-CoA, y comprende siete reacciones enzimticas consecutivas para formar lisina. Adems, dicha ruta provee diversos precursores para el metabolismo secundario, tales como: el cido -aminoadpico y el piperiden-6carboxlico (P6C; en equilibrio qumico constante con su cadena abierta el aminoadipato--semialdehdo). El cido pipeclico es un importante metabolito secundario que se forma a partir del metabolismo de lisina en diversos organismos que incluye mamferos, plantas, bacterias, levaduras y hongos (Aspen y Meister, 1962; Baginsky y Rodwell, 1967; Hartline y Rodwell, 1971; Kurtz y Bhattacharjee, 1975; Wickwire et al. 1990a, Wickwire et al. 1990b; Goncalves-Butruille et al. 1996; Sim y Perry, 1997; IJlst et al. 2000; Dodt et al. 2000; Naranjo et al. 2001; 2004). Mientras que en hongos filamentosos se ha descrito que el cido pipeclico se sintetiza va cido -aminoadpico, a travs de la ruta del -aminoadipato (Aspen y Meister, 1962; Naranjo et al. 2004), en plantas, el cido pipeclico se sintetiza va sacaropina, a travs del catabolismo de Llisina (Goncalves-Butruille et al. 1996). No obstante, es importante resaltar que, en
ambos casos, el P6C es el precursor inmediato del cido pipeclico. El inters farmacolgico sobre el estudio del cido pipeclico radica en el hecho de que este inminoacido es un componente y precursor de la biosntesis de diversos compuestos bioactivos, tales como: inmunosupresores, pptidos no-ribosomales, poliqutidos y alcaloides. La presente revisin tiene como finalidad el estudio del metabolismo de cido pipeclico en diversos organismos y sus posibles aplicaciones biotecnolgicas en la industria farmacolgica. As mismo, se plantea el uso de A. platensis como biofactora y de algunas estrategias de ingeniera biosinttica del metabolismo de L-lisina para incrementar la sntesis de P6C, cido pipeclico y otros metabolitos de inters farmacolgico, tomando en cuenta sus ventajas comparativas.
2. Metabolismo del cido pipeclico

2.1. El cido pipeclico y su relacin con el metabolismo de lisina en diversos organismos El cido pipeclico es un iminocido de seis tomos de carbono que desempea distintas funciones metablicas en diversos organismos. Adems de ser un intermediario del catabolismo de lisina en mamferos, plantas, bacterias, levaduras y hongos, el cido pipeclico es un componente y un precursor importante de numerosos metabolitos secundarios de microorganismos y plantas. Desde el punto de vista nutricional, el cido pipeclico tiene una gran importancia ya que es capaz de complementar la auxotrofa de lisina en cepas mutantes de levaduras y hongos, tales como Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans y Rhodotorula glutinis. Esto se debe a que en estos microorganismos el cido pipeclico se convierte en L-lisina
68 utilizando -aminoadipato--semialdehdo y sacaropina como intermediarios. Con relacin a la biosntesis de cido pipeclico, en la naturaleza existen dos vas principales que son: i) la va sacaropina (a travs del catabolismo de L-lisina) y, ii) la va cido aminoadpico (a travs de la ruta del aminoadipato para la formacin de L-lisina). A continuacin se describe el metabolismo de este importante iminocido en algunos organismos. Mamferos En mamferos, la lisina puede ser catabolizada por dos vas distintas: por la ruta de la sacaropina o por la ruta del cido pipeclico (IJlst et al. 2000; Dodt et al. 2000). Aunque la lisina se cataboliza principalmente a travs de la ruta de la sacaropina en la mayora de los tejidos, en el cerebro, la ruta del cido pipeclico es la ms activa. En la ruta del catabolismo de lisina va sacaropina, la lisina se transforma en P6C a travs de dos reacciones consecutivas llevadas a cabo por la sacaropina deshidrogenasa y la sacaropina reductasa. Tal como sucede en plantas (Goncalves-Butruille et al. 1996; Tang et al. 2000; Zhu et al. 2000a, Zhu et al. 2000b), estas dos reacciones son catalizadas por una nica enzima bifuncional. Sin embargo, en el cerebro, la actividad de esta enzima bifuncional es muy baja, por lo que la lisina se cataboliza predominantemente va cido pipeclico a travs de dos reacciones enzimticas usando cido piperiden-2carboxlico (P2C) y su cadena abierta 2-ceto6-aminocaproato como intermediarios (IJlst et al. 2000; Dodt et al. 2000), tal como muestra la Figura 2. La primera pipecolato oxidasa caracterizada y purificada en mamferos fue descrita en primates por Mihalik et al. (1991). Dicha protena, un monmero amarillo, posee un peso molecular deducido de 46 kDa. En primates y humanos, Mihalik et al. (1991), demostraron que el cido pipeclico se oxida mediante dos reacciones consecutivas de deshidrogenacin para formar cido aminoadpico (Mihalik y Rhead, 1989). Los resultados obtenidos por este grupo de investigacin sugeran que la oxidacin del cido pipeclico en primates y humanos se llevaba a cabo a travs de una ruta similar a la encontrada en Pseudomonas putida (Baginsky y Rodwell, 1967). En esta bacteria, se haba descrito que el cido pipeclico se oxida inicialmente a P6C a travs de una pipecolato oxidasa (cido pipeclico + O2 P6C + H2O2). El P6C se encuentra en equilibrio qumico constante con el -aminoadipato--semialdehdo, de tal manera que el P6C se abre espontneamente al pH fisiolgico para formar -aminoadipato--semialdehdo. Posteriormente, la oxidacin del aminoadipato--semialdehdo produce cido -aminoadpico. Reuber et al. (1997), aislaron y purificaron la pipecolato oxidasa de conejos, la cual esta constituida por 390 aminocidos. Dicha enzima se caracteriza por tener en el extremo amino terminal un dominio de unin a ADP formado por una alternancia , un motivo altamente conservado en flavoprotenas. Adems, Reuber et al. (1997) establecieron que la sarcosina, el cido pipeclico y la prolina eran buenos sustratos para esta enzima.
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Figura 2. Representacin esquemtica de las dos rutas catablicas de lisina presentes en mamferos. (A) Ruta del catabolismo de lisina va sacaropina y (B) Ruta del catabolismo de lisina va cido pipeclico. Aunque la lisina se cataboliza principalmente a travs de la ruta de la sacaropina en la mayora de los tejidos, en el cerebro, la ruta del cido pipeclico es la ms activa. -AA--SA: -aminoadipato--semialdehdo; P6C: cido piperiden-6carboxlico; P2C: cido piperiden-2-carboxlico.
70 Ms adelante, IJlst et al. (2000) describieron la clonacin del gen que codifica la pipecolato oxidasa en humanos a partir de ADNc usando la informacin de la secuencia de nucletidos de genes que codifican pipecolato/sarcosina oxidasas descritas previamente en conejos y ratones. La hipottica pipecolato oxidasa de humanos present una alta homologa con la sarcosina oxidasa de ratones y algunas de las sarcosinas oxidasas monomricas descritas en bacterias. Adems, la protena deducida tambin mostraba un dominio de unin a ADP- similar a la pipecolato oxidasa de conejos. En paralelo, Dodt et al. (2000) describieron la clonacin del gen que codifica la pipecolato oxidasa de humanos por gentica reversa usando la secuencia de aminocidos de la pipecolato oxidasa purificada de primates. El ADNc clonado present un marco de lectura abierta de 1170 pares de bases que codifica una protena de 390 aminocidos con una alta identidad con todas las sarcosinas oxidasas y deshidrogenasas descritas, especialmente, con la sarcosina oxidasa monomrica de Bacillus sp. NS-129. Adems, Dodt et al. (2000) tambin demostraron que esta enzima oxidaba tanto el cido pipeclico como la sarcosina, tal como lo haban descrito previamente Reuber et al. (1997) con la pipecolato oxidasa de conejos. Con relacin a la localizacin subcelular, en humanos, ratones y primates el cido pipeclico se metaboliza en los peroxisomas (IJlst et al. 2000; Dodt et al. 2000). En conejos, perros, cerdos y ovejas la oxidacin del cido pipeclico es predominantemente mitocondrial (Singh et al. 1989; Mihalik y Rhead, 1991) mientras que, en ratas, este compuesto puede ser metabolizado tanto en mitocondrias como en peroxisomas (Rao et al. 1993). La identificacin y caracterizacin de la pipecolato oxidasa humana tiene una gran importancia en el campo de la salud humana, ya que se ha descrito que la acumulacin de cido pipeclico es una de las principales anormalidades bioqumicas asociada con pacientes que sufren un desorden generalizado en la biognesis de los peroxisomas (peroxisome biogenesis disorder o PBD), entre los que destacan: el sndrome cerebro-hepato-renal de Zellweger, una enfermedad gentica que se caracteriza por la ausencia de peroxisomas morfolgicamente distinguibles; la adrenoleucodistrofa neonatal y la hiperpipeclico acidaemia (Wanders et al. 1989, 1988; Mihalik y Rhead, 1989; Mihalik et al. 1989; Rao et al. 1993). Tambin, se ha descrito que pacientes con enfermedades crnicas, especialmente, con encefalopata heptica, presentan niveles altos de cido pipeclico en plasma sanguneo (Fujita et al. 1999). Los pacientes con PBD se caracterizan por presentar un profundo retraso mental, una migracin neuronal anormal y una degeneracin excesiva del sistema nervioso central. En los pacientes con PBD los peroxisomas se encuentran ausentes con la deficiencia concomitante de todas las enzimas peroxisomales. La acumulacin de cido pipeclico en estos pacientes se debe a una actividad deficiente de la enzima pipecolato oxidasa, lo que indica que esta enzima se encuentra fuertemente implicada en la degradacin del cido pipeclico a cido aminoadpico y que podra ser peroxisomal al menos en humanos y monos (IJlst et al. 2000; Mihalik y Rhead, 1989; Wanders et al. 1988). Aunque se ha caracterizado la pipecolato oxidasa e identificado el producto de su reaccin, el mecanismo exacto de oxidacin del cido pipeclico no est an totalmente claro. Sin embargo, se ha descrito que la pipecolato oxidasa cataliza la conversin de cido pipeclico en P6C el cual, de manera espontnea, se encuentra en equilibrio con su forma lineal el -aminoadipato--
71 semialdehdo (Kramar et al. 1989; Mihalik y Rhead, 1989; Wanders et al. 1989; Rao y Chang, 1990a; Dodt et al. 2000; IJlst et al. 2000). Posteriormente, el -aminoadipato-semialdehdo se convierte a su vez en cido -aminoadpico a travs de una reaccin de deshidrogenacin dependiente de NAD (Chang et al. 1990; Rao y Chang, 1990b). Plantas Las plantas producen una inmensa cantidad y variedad de compuestos orgnicos, de los cuales, la gran mayora parecen no estar implicados directamente con los procesos de crecimiento y desarrollo de las mismas, es decir, son metabolitos secundarios (Croteau et al. 2003). En plantas, el cido pipeclico se considera un metabolito secundario mientras que su anlogo, el aminocido prolina, se considera como un metabolito primario. En plantas, se ha descrito que el cido pipeclico deriva del catabolismo de lisina va -aminoadipato--semialdehdo (Goncalves-Butruille et al. 1996). Posteriormente, el P6C podra reducirse a cido pipeclico mediante una reaccin anloga a la catalizada por la pirrolina-5carboxilato (P5C) reductasa (EC 1.5.1.2) (Stewart y Larher, 1980; Rosenthal, 1982; Galili, 1995). Momordica charantia (bitter melon), una planta de la familia Cucurbitaceae de gran inters en la medicina tradicional china y africana contiene en sus frutos y semillas, entre otros aminocidos libres, cido pipeclico (Salawu et al. 1999). Esta planta presenta propiedades antibiticas, antimutagnicas, antioxidantes, antivirales, antitumorales, astringentes, depurativas, afrodisacas, inmunomodulares, citotxi-cas, as como actividad inmunosupresora e insecticida, entre otras (Leung et al. 1987; Romeo, 1984). Tradicionalmente, se recomienda para combatir problemas de la piel (dermatosis, quemaduras, erupciones, soriasis, etc.), la gonorrea, el reumatismo, la artritis, el lupus, la diabetes, como estimulante del apetito, para la regulacin de la fertilidad, para tratamientos gastrointestinales y como insecticida. M. charantia ha sido utilizada para el tratamiento de ciertos tipos de cncer e infecciones virales (Leung et al. 1987) y se ha encontrado que el extracto hexnico de esta planta posee actividad inhibitoria sobre amastigotes y promastigotes de diversas especies de Leishmania (Jaramillo, 2000). As mismo, el cido pipeclico es un fitoqumico que se acumula en grandes cantidades en algunos miembros de la familia Fabaceae y se ha descrito que es el principal constituyente de la reserva de aminocidos libres en el gnero Medicago (Stewart y Larher, 1980; Rosenthal, 1982). Adems, el cido pipeclico, se ha detectado en frutos inmaduros (pericarpio y semillas) de Coffea arabica y Camellia sinensis (Higuchi et al. 1995), mientras que en Sophora secundiflora, Cycas circinalis y Phaseolus vulgaris se ha identificado en semillas (Izaddoost et al. 1976; Li et al. 1996). Las plantas conviven con una comunidad depredadora muy activa constituida por bacterias, insectos, hongos y vertebrados herbvoros, por lo cual han desarrollado diversos mecanismos de defensa que le han permitido su supervivencia en este medio tan hostil (Norton, 2002). El estudio de factores txicos y anti-nutritivos en las leguminosas Albizia lebbeck y Calliandra calothyrsus permiti identificar la presencia de cido pipeclico en sus hojas (Marlier et al. 1979; Romeo, 1984; Romeo, 1988). Es importante destacar que el cido pipeclico y sus derivados que han sido aislados de las hojas de C. calothyrsus poseen propiedades insecticidas y fitotxicas (Romeo, 1984), por lo cual, estos compuestos podran tener un gran inters comercial en el campo de la industria agroalimentaria. Por otro lado, se ha observado que pequeas concentraciones de cido pipeclico inhiben el crecimiento
72 de la radcula de semillas germinadas en Astragalus sinicus y Morus alba, y se ha demostrado que la conversin de lisina a cido pipeclico induce floracin en Lemna paucicostata 151 (Fujioka et al. 1987). Tambin, se ha descrito que el cido pipeclico es un soluto asociado con la adaptacin osmtica de Ptelea sp., una planta xerfita que se desarrolla en hbitats ridos y semiridos (Steward y Larher, 1980; Romeo, 1988). Bacterias En algunas especies de Pseudomonas se ha descrito que el cido pipeclico proviene del catabolismo de lisina (Baginsky y Rodwell, 1967; Hartline y Rodwell, 1971). En P. putida, la L-lisina se convierte inicialmente en D-lisina y P2C. Posteriormente, el P2C se convierte en cido pipeclico por accin de la P2C reductasa (Payton y Chang, 1982). Por otro lado, en Streptomyces hygroscopicus, el cido pipeclico tambin deriva del catabolismo de L-lisina. Esta bacteria produce rapamicima, un inmunosupresor que contiene en su estructura una molcula de cido pipeclico (Khaw et al. 1998). Adems, se ha descrito que en el genoma de Escherichia coli existe una P6C reductasa que cataliza la reduccin de P6C en cido pipeclico. Fujii et al. (2002) demostraron con experimentos in vivo e in vitro que la actividad P6C reductasa la lleva a cabo la pirrolina-5carboxilato (P5C) reductasa (EC 1.5.1.2) codificada por el gen proC. La P5C reductasa cataliza la reduccin de P5C en Lprolina, una actividad enzimtica encontrada en una gran variedad de organismos (Leisinger, 1987). Por otro lado, se ha estudiado la capacidad osmoprotectora del cido pipeclico en E. coli (Gouesbet et al. 1994) y Sinorhizobium meliloti (Gouffi et al. 2000), donde se ha demostrado que es un compuesto efectivo capaz de optimizar el crecimiento de estos microorganismos bajo condiciones inhibitorias de osmolaridad. Hongos filamentosos y levaduras Al igual que en otros organismos, en levaduras y hongos filamentosos el cido pipeclico es un intermediario importante que se encuentra estrechamente relacionado con el metabolismo de lisina. El cido pipeclico tiene un papel nutricional importante en Aspergillus nidulans (Aspen y Meister, 1962) y Rhodotorula glutinis (Kurtz y Bhattacharjee, 1975), sin embargo, se ha descrito que no posee ninguna funcin en la ruta biosinttica de lisina de Saccharomyces cerevisiae (Glass y Bhattacharjee, 1971; Kurtz y Bhattacharjee, 1975). A continuacin se menciona el papel que desempea el cido pipeclico en el metabolismo de lisina en diferentes especies de hongos y levaduras. 2.2. Conversin de cido pipeclico en Llisina Rhodotorula glutinis La biosntesis de lisina en R. glutinis, una levadura roja aerbica obligada, se lleva a cabo a travs de la ruta del -aminoadpico como ocurre en levaduras y otros hongos filamentosos (Broquist, 1971). Kurtz y Bhattacharjee (1975), demostraron que algunos mutantes auxtrofos de lisina de R. glutinis podan crecer en medio mnimo suplementado con cido pipeclico, sugiriendo la importancia nutricional del cido pipeclico en este microorganismo. Adems, demostraron en la cepa silvestre de R. glutinis que el cido pipeclico se convierte en -aminoadipato-semialdehdo. Por otro lado, Kurtz y Bhattacharjee (1975) tambin demostraron que en S. cerevisiae, a diferencia de los resultados obtenidos en R. glutinis, el cido pipeclico no jugaba ningn papel en la biosntesis de lisina. Posteriormente, Kinzel y Bhattacharjee (1979) presentaron por primera vez evidencias genticas y bioqumicas de los pasos especficos implicados en la ruta de conversin de cido pipeclico se converta en lisina va -aminoadipato--semialdehdo y sacaropina.
73 As mismo, determinaron que, en presencia de la pipecolato reductasa, el cido pipeclico se converta en -aminoadipato--semialdehdo (en equilibrio con el P6C), un intermediario de la ruta del cido -aminoadpico para la formacin de lisina (Fig. 1). Adems, demostraron que la reaccin llevada a cabo por la pipecolato oxidasa no requera ningn cofactor externo y el producto de su reaccin, el -aminoadipato--semialdehdo, se converta enzimticamente en sacaropina y lisina. Por otro lado, Kinzel y Bhattacharjee (1979), concluyeron que el cido pipeclico era un precursor circunstancial de lisina en R. glutinis y que ste no era un intermediario de la ruta biosinttica de lisina. Posteriormente, Kinzel y Bhattacharjee (1982), describieron por primera vez la purificacin parcial y las propiedades de la pipecolato oxidasa de R. glutinis. La pipecolato oxidasa de R. glutinis presenta un peso molecular aproximado de 43 kDa, se caracteriza por ser soluble y tener un grupo sulfihidrilo esencial para su actividad. La deteccin de perxido de hidrgeno indic que la reaccin de oxidacin poda ser escrita como se indica a continuacin: cido pipeclico + O2 -aminoadipato-semialdehdo + H2O2. Adems, la capacidad que tiene la enzima purificada de oxidar el cido pipeclico in vitro indicaba que, a diferencia de la pipecolato oxidasa de Pseudomonas, no requera de aceptores de electrones internos o de una cadena transportadora de electrones. Aunque para ese momento se haba descrito que el cido pipeclico estaba implicado en la biosntesis de lisina en A. nidulans y en el alga Euglena gracilis, las bases bioqumicas, genticas y enzimticas de la conversin de cido pipeclico en lisina solamente se haban determinado en R. glutinis. Penicillium chrysogenum Naranjo et al. (2001) demostraron que P. chrysogenum es capaz de utilizar cido pipeclico para complementar los requerimientos nutricionales de varios mutantes auxtrofos de lisina (lys-). La clonacin del gen que codifica la sacaropina reductasa en P. chrysogenum (denominado gen lys7), as como la caracterizacin bioqumica y molecular de mutantes auxtrofos de lisina que eran incapaces de utilizar cido pipeclico para complementar dicha auxotrofia (lys-/Pip-), permiti determinar que en este hongo filamentoso el cido pipeclico se convierte en lisina a travs de su conversin en cido piperidn-6-carboxlico (P6C) por accin de la pipecolato oxidasa, y el P6C se convierte en sacaropina y lisina a travs de dos reacciones enzimticas consecutivas catalizadas por la sacaropina reductasa y la sacaropina deshidrogenasa respectivamente (Fig. 1). 2.3. Biosntesis de cido pipeclico va sacaropina Metarhizium anisopliae y Rhizoctonia leguminicola El inters de estudiar el metabolismo de lisina y del cido pipeclico en M. anisopliae y el hongo parsito R. leguminicola, se basa en que estos aminocidos estn implicados en la biosntesis de alcaloides octahidroindoliznicos (Sim y Perry, 1997; Wickwire et al. 1990a, Wickwire et al. 1990b). A diferencia de N. crassa, donde la D-lisina es el precursor del cido pipeclico (Fangmeier y Leistner, 1980), se ha descrito que en M. anisopliae y R. leguminicola la L-lisina es el precursor en la biosntesis de cido pipeclico (Wickwire et al. 1990a; Guengerich y Broquist, 1973; Sim y Perry, 1997). En estos hongos filamentosos, el cido pipeclico es un producto del catabolismo de lisina y un precursor inmediato para la formacin de alcaloides octahidroindolizinicos tales como: la slaframina (1S,6S,8aS-1-acetoxi-6aminooctahidroindolizina) y la swainsonina (1,2,8-trihidroxioctahidro indolizina), tal como muestra la Figura 3.
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Figura 3. Representacin esquemtica de la biosntesis de cido pipeclico va sacaropina en los hongos filamentosos Metarhizium anisopliae y Rhizoctonia leguminicola. El cido pipeclico deriva del catabolismo de Llisina y es un precursor inmediato para la sntesis de alcaloides octahidroindolizinicos. Mientras que R. leguminicola es capaz de sintetizar ambos alcaloides, M. anisopliae solamente es capaz de producir swainsonina, un metabolito secundario que tiene una potente actividad antitumoral. -AA--SA: -aminoadipato--semialdehdo; P6C: cido piperiden-6-carboxlico.
La slaframina es un alcaloide con actividad parasimpatomimtica, mientras que la swainsonina es un potente inhibidor de manosidasas que tiene una importante actividad antitumoral y es usado como agente quimioteraputico en pacientes con cncer (Sim y Perry, 1997; Goss et al. 1995; Dennis et al. 1990; Dennis, 1986; Humphries et al. 1986). Mientras que R. leguminicola es capaz de sintetizar ambos alcaloides, M. anisopliae solamente es capaz de producir swainsonina. Los resultados obtenidos por Wickwire et al. (1990a), Wickwire et al. (1990b) demostraron que en R. leguminicola el P6C se forma a partir del catabolismo de L-lisina; adems, el P6C es el precursor inmediato del cido pipeclico. Experimentos biolgicos, bioqumicos y la identificacin de los productos de las reacciones por espectrometra de masas o RMN, permitieron determinar inequvoca-
mente que el P6C, y no el P2C, se encuentra implicado en la conversin de L-lisina en cido pipeclico en R. leguminicola. Por otro lado, Wickwire et al. (1990a), Wickwire et al. (1990b) tambin demostraron en R. leguminicola que la conversin de sacaropina en P6C no era catalizada por la accin de una sacaropina reductasa dependiente de NADP como se esperaba, sino que se llevaba a cabo por accin de una flavoenzima no descrita anteriormente a la que denominaron sacaropina oxidasa. La reaccin llevada a cabo por la sacaropina oxidasa se resume a continuacin: Sacaropina + O2 P6C + Glutamato + H2O2. 2.4. Biosntesis de cido pipeclico va cido -aminoadpico Hongos filamentosos
75 Se ha descrito en varios organismos que el cido pipeclico se forma a travs del catabolismo de lisina. Sin embargo, Aspen y Meister (1962) demostraron en A. nidulans que el cido pipeclico deriva de la ruta biosinttica de lisina (va anablica) y no de su catabolismo (Fig. 1). Estos autores, identificaron algunas mutantes auxtrofas de lisina de A. nidulans que eran capaces de acumular cido pipeclico cuando crecan sobre medio mnimo con cantidades limitantes de lisina y que este proceda mayoritariamente del cido -aminoadpico. Es interesante resaltar, que esta fue la primera evidencia descrita en hongos filamentosos de que el cido pipeclico deriva de la ruta biosinttica de lisina. Ms recientemente, Naranjo et al. (2004) demostraron que P. chrysogenum es capaz de sintetizar cido pipeclico a partir del cido -aminoadpico. El gen lys7 que codifica la sacaropina reductasa en P. chrysogenum fue interrumpido de manera dirigida por la tcnica de la doble recombinacin homloga. La cepa interrumpida (denominada P. chrysogenum SR1-) carece de actividad sacaropina reductasa, la cual, se recupera despus de la transformacin de dicha mutante con el gen lys7 intacto presente en un plsmido de replicacin autonma. La cepa P. chrysogenum SR1- es auxtrofa de lisina y acumula P6C. Cuando el mutante P. chrysogenum SR1- se crece con L-lisina como nica fuente de nitrgeno y se aade cido D, L--aminoadpico al medio de cultivo, se acumulan intracelularmente niveles altos de cido pipeclico. La comparacin de la cepa SR1- con una cepa interrumpida en el gen lys2 que codifica la -aminoadipato reductasa, demostr que P. chrysogenum sintetiza cido pipeclico a partir del cido -aminoadpico y no a partir del catabolismo de lisina (Fig. 1). En P. chrysogenum la ruta de biosntesis de cido -aminoadpico es muy activa, por lo tanto, este mutante podra ser utilizado para producir metabolitos secundarios de importancia farmacolgica que contengan cido pipeclico.
3. Algunas aplicaciones biotecnolgicas del cido pipeclico en la industria farmacolgica

3.1. Obtencin de cido pipeclico y sus derivados por biotransformacin La industria qumica fina (Fine Chemicals Industry) ha tenido un gran auge durante los ltimos aos, sobre todo en el rea biofarmacutica y de la agricultura (Stinson, 2000; Thayer, 2008). Mercian y Lonza, entre otras, son dos compaas farmacuticas que se dedican a manufacturar qumicos finos, entre ellos cido pipeclico. El proceso de obtencin de cido pipeclico que emplea la compaa Mercian es un claro ejemplo del poder enantioselectivo de las bacterias. Este proceso se basa en utilizar una cepa recombinante de E. coli y L-lisina como iniciador para llevar a cabo la biotransformacin de L-lisina a cido pipeclico. Para lo cual, Fujii et al. (2002), insertaron en E. coli JM109 el gen lat de Flavobacterium lutescens que codifica la Llisina-6-aminotransferasa (LAT) descrito previamente por Fujii et al. (2000). En este sistema, la LAT convierte L-lisina en P6C y ste se reduce a cido pipeclico por accin de la P5C reductasa presente en el genoma de la bacteria. Los resultados obtenidos por Fujii et al. (2002), demostraron que ambas enzimas son necesarias para llevar a cabo la bioconversin de L-lisina a cido pipeclico en E. coli. Por otro lado, el proceso de obtencin de cido pipeclico que emplea la compaa Lonza consiste en utilizar picolinonitrilo como iniciador de la biotransformacin, el cual se convierte sucesivamente en picolinamida, pipecolamida racmico y finalmente en cido pipeclico. El mtodo usado en el
76 ltimo paso de la conversin es la fermentacin con especies de Pseudomonas. Un aspecto que se debe considerar se refiere al desarrollo del denominado P6C World usando biotransformacin (Asano y Ito, 2002). Aunque la actividad enzimtica implicada en la reduccin de P6C a cido pipeclico ha sido encontrada en varios microorganismos, no se ha podido caracterizar la enzima que cataliza dicha conversin, ya que su sustrato, el P6C, es un compuesto qumicamente inestable (Fujii et al. 2002). No obstante, la compaa farmacolgica Mercian (Fujii et al. 2002; Asano y Ito, 2002) actualmente esta explorando el P6C World y obteniendo una coleccin de productos qumicos tiles para la farmacologa derivados del P6C usando biotransformacin, entre dichos productos se encuentran: el cido aminoadpico y el cido pipeclico. La ruta del -aminodipato para la biosntesis de lisina de P. chrysogenum es muy activa ya que el cido -aminoadpico, un intermediario de la ruta, es un precursor esencial para la biosntesis de penicilina. Adems, se conoce que cepas de P. chrysogenum interrumpidas en el gen lys2 que codifica la -aminoadipato reductasa acumulan niveles altos de cido aminoadpico (Casqueiro et al. 1998; 2001; 2002). Por otro lado, se ha descrito que la cepa de P. chrysogenum SR1-, interrumpida en el gen lys7 que codifica la sacaropina reductasa, acumula niveles altos de P6C y de cido pipeclico, por lo que podra utilizarse para producir metabolitos secundarios de importancia farmacolgica que contengan cido pipeclico (Naranjo et al. 2004). 3.2. El cido pipeclico como osmoprotector Osmoprotectores son aquellos compuestos que son capaces de optimizar el crecimiento celular bajo condiciones inhibitorias de osmolaridad. Los mecanismos de osmoregulacin son muy similares en todos los organismos vivos, incluyendo plantas, animales y bacterias. En respuesta a la elevada osmolaridad del ambiente, ellos acumulan concentraciones intracelulares relativamente altas de iones inorgnicos y solutos compatibles. Los solutos compatibles son molculas orgnicas de bajo peso molecular recin sintetizadas, entre los se encuentra el cido pipeclico. Luego de haber disminuido la osmolaridad ambiental, los compuestos compatibles pueden ser liberados al ambiente y subsecuentemente ser utilizados como osmoprotectores por otros organismos que se encuentren bajo estrs hiperosmtico (Gouffi et al. 2000; Bayles y Wilkinson, 2000). En bacterias, la capacidad osmoprotectora de cido pipeclico ha sido solamente estudiada en E. coli (Gouesbet et al. 1994) y Sinorhizobium meliloti (Gouffi et al. 2000), donde se ha demostrado que la osmoproteccin de las clulas al estrs salino solamente es efectivo cuando estn presentes los dos ismeros del cido pipeclico, mientras, que otros estudios sealan que es preferible usar un slo enantimero de la molcula como osmoprotector. En plantas, se ha descrito que el cido pipeclico y sus derivados estn relacionados con la adaptacin osmtica en algunas leguminosas y especies xerfitas que se desarrollan en hbitats secos y alcalinos, sometidas a altas temperaturas y a severas y prolongadas pocas de sequa (Stewart y Larher, 1980; Romeo, 1988). 3.3. El cido pipeclico como precursor de alcaloides octahidroindoliznicos En R. leguminicola y M. anisopliae se ha descrito que el cido pipeclico es un intermediario del catabolismo de lisina y un precursor inmediato en la sntesis de alcaloides octahidroindoliznicos (Sim y Perry, 1997; Wickwire et al. 1990a; Wickwire et al. 1990b). Estos alcaloides tienen interesantes aplicaciones en el campo
77 de la salud humana, como la swainsonina, que tiene una potente actividad antitumoral. En este sentido, se ha demostrado experimentalmente que inhibe la tasa de crecimiento de melanomas y metstasis humanos produciendo una mnima toxicidad cuando es administrada en pacientes con cncer (Sim y Perry, 1997; Goss et al. 1995; Dennis et al. 1990; Dennis, 1986; Humphries et al. 1986). En estos hongos filamentosos, el catabolismo de lisina procede va sacaropina (Fig. 3). Se ha observado que la adicin de L-lisina a los caldos de cultivo de M. anisopliae incrementa significativamente la produccin de swainsonina, lo cual indica que modificaciones genticas en la ruta biosinttica de lisina podran inducir un aumento de la sntesis de dicho alcaloide en este microorganismo. Con el objetivo de monitorizar el efecto que producen los cambios en las condiciones de cultivo o las provocadas por modificaciones genticas sobre la produccin del metabolito secundario swainsonina, Sim y Perry (1997) desarrollaron mtodos analticos mediante HPLC con los que es posible estudiar los niveles intracelulares de cada uno de los metabolitos precursores de la swainsonina: lisina, sacaropina, cido -aminoadpico y cido pipeclico. 3.4. El cido pipeclico como sustrato de pptidos sintetasas no-ribosomales (NRPS) Los pptidos sintetasas no ribosomales son protenas que estn organizadas en unidades funcionales interactivas denominadas mdulos, los cuales catalizan un conjunto de reacciones catalticas que llevan a la formacin de un pptido (Doekel y Marahiel, 2001). La arquitectura modular entre los pptidos sintetasas no ribosomales (NRPS) y los poliqutidos sintasas (PKS) presenta una fuerte analoga. De hecho, ambos sistemas se han encontrado combinados de manera natural (NRPS-PKS), representando biofactoras que permiten obtener una diversidad estructural ampliamente extendida de productos naturales (Cane y Walsh, 1999). La primera mezcla NRPS-PKS fue identificada en la agrupacin de genes biosintticos de rapamicina en Streptomyces hydroscopius (Schwecke et al. 1995; Molnar et al. 1996). Esta mezcla NRPS-PKS consiste en un mdulo de NRPS para la incorporacin de cido pipeclico integrada en un PKS. Una organizacin anloga ha sido encontrada en la agrupacin de genes biosintticos de FK506 en Streptomyces sp. MA6548 (Motamedi y Shafiee, 1998). Se ha descrito que S. hydroscopius es capaz de sintetizar cido pipeclico a partir de L-lisina (Paiva et al. 1993). Adems, se ha descrito en este microorganismo que el cido pipeclico es un precursor de la rapamicina (Molnar et al. 1996; Cheng y Demain, 1995). La adicin de L-lisina a los caldos de cultivo de S. hydroscopius incrementa la produccin de rapamicina en un 150 %, lo cual, puede ser debido a su conversin en cido pipeclico. En la actualidad, el cido pipeclico se utiliza como sustrato de algunas PKS en S. hydroscopius con los que se obtienen metabolitos secundarios (anlogos de la rapamicina) con nuevas o incrementadas actividades farmacolgicas, tales como: inmunosupresores, antitumorales y antifngicos (Reynolds y Demain, 1997). Por otro lado, Nielsen et al. (1991), han descrito en S. hydroscopius var. ascomyceticus una enzima que activa cido pipeclico que se encuentra implicada en la biosntesis de la inmunomicina, un inmunosupresor relacionado con FK506 en este microorganismo. En los ltimos aos se ha incrementado el nmero de secuencias descritas de NRPS. Basados en estos datos y en estudios bioqumicos avanzados, se puede obtener una slida interpretacin sobre los principios bsicos de organizacin y arquitectura de los NRPS. El potencial de la
78 maquinaria biosinttica se ha visto desarrollado por la reciente identificacin de dominios enzimticos integrados (Doekel y Marahiel, 2001). El estudio del principio de los mecanismos que integran los NRPS podra permitir la modificacin racional de sus multi-dominios, lo cual, abrira un camino lleno de posibilidades para redisear productos naturales existentes y ampliar la complejidad qumica que nos ofrece la naturaleza (Doekel y Marahiel, 2001). Todo ello, permitira enriquecer las alternativas teraputicas actuales en la lucha contra las enfermedades en general. microalgas coinciden en el hecho de que el perfeccionamiento de la tecnologa asociada a los sistemas de cultivo a cielo abierto lleg a su lmite. La baja densidad celular obtenida en estos sistemas origina varios inconvenientes que incluyen: la baja productividad, fcil contaminacin, costosa recuperacin del producto de medios diluidos y la dificultad en el control de la temperatura. Adems de los inconvenientes asociados a los sistemas de cultivo a cielo abierto, los fotobiorreactores cerrados presentan una serie de ventajas que incluyen: el cultivo en altas densidades, mayor control de las condiciones y mantenimiento de un cultivo puro, facilidad para la cosecha y un menor costo de inversin (Contreras-Flores et al. 2003). Sin embargo, y a pesar del consenso entre los biotecnlogos de microalgas de que la produccin fotoautotrfica de metabolitos secundarios de alto valor industrial requiere del uso de fotobiorreactores cerrados y de su operacin exitosa a nivel experimental, su utilizacin a nivel comercial es escasa y limitada a unas pocas especies (Olaizola, 2003). Un aspecto que debe ser considerado en la produccin microalgal masiva es la existencia de restricciones en el sistema costo-productividad de biomasa. En este sentido, el factor costo de la tierra es determinante tanto para el establecimiento de un sistema de produccin microalgal abierto o cerrado. El costo por este recurso debe ser bajo por lo que generalmente se escogen sitios de bajo valor comercial, econmico y agronmico, tales como: zonas desrticas, con baja fertilidad natural, tierras impactadas por la actividad antrpica o tierras baldas. Por lo tanto, independientemente del sistema de produccin, el costo por este recurso deber ser bajo. Por otro lado, se conoce que en los sistemas abiertos existen costos asociados al establecimiento y operacin (transferencia de masa y agitacin) que suelen ser ms
4. A. platensis como biofactora para producir P6C, cido pipeclico y otros metabolitos secundarios de inters farmacolgico
Uno de los principales problemas con el desarrollo de compuestos bioactivos a partir de fuentes naturales es el hecho de que estas proveen un suministro limitado. A pesar de que las microalgas ofrecen ventajas comparativas en la denominada fase de descubrimiento de nuevos compuestos de inters biolgico, la disponibilidad de procesos estandarizados se ve restringida (Olaizola, 2003). Se han investigado y propuesto diferentes aproximaciones fisiolgicas y tecnolgicas para maximizar la productividad del cultivo masivo de microalgas (Chaumont, 1993; Grobbelaar, 2000; Richmond 1996; 2000). En este sentido, los sistemas de produccin de microalgas han sido clasificados en dos grandes grupos, i) los sistemas abiertos, los cuales, son principalmente canales de poca profundidad tipo pista de carreras en los que el cultivo est expuesto a la atmsfera y, ii) los sistemas cerrados (fotobiorreactores y biorreactores del tipo fermentadores), en los cuales el contacto con la atmsfera es limitado o nulo (Contreras-Flores et al. 2003). En el primer caso, biotecnlogos de
79 altos, mientras, que los sistemas cerrados poseen costos menores aguas abajo, por alcanzar mayores densidades de cultivo. En cualquier caso, la consecuencia lgica es que la productividad volumtrica de biomasa tanto en los sistemas cerrados como abiertos debe ser lo suficientemente alta como para compensar estos costos. Ms all, los fotobiorreactores parecen ser la va ms prometedora para el futuro de la produccin de microalgas a gran escala (para una revisin ver Olaizola, 2003). Otros investigadores, por lo contrario, afirman que las cantidades producidas por unidad de rea, tanto en fotobiorreactores como en sistemas abiertos, son comparables. Lee (2001) reporta que la principal limitacin del crecimiento de microalgas a cielo abierto podra no estar en la captura de la energa lumnica, sino en los pasos para la conversin del carbono fotosintticamente fijado en biomasa estructural. Por tanto, el diseo de fotobiorreactores podra estar alcanzando su lmite en lo que se refiere a la reduccin de los costos de produccin. Una aproximacin propuesta para lograr el aumento de la productividad es la combinacin de sistemas de cultivo que combinen distintas formas de nutricin (fototrfica, heterotrfica, mixotrfica) de forma cclica, dependiendo de los productos especficos que se requieran y de la duracin de los ciclos de luz y oscuridad. Por ltimo, Lee (1990; 2001) afirma que el sistema fotosinttico y el metabolismo postfotosinttico requiere ser modificado genticamente para vencer la limitacin en la utilizacin de la energa lumnica para el crecimiento y formacin de productos. La utilizacin de las cianobacterias como factoras celulares para producir metabolitos secundarios con importantes actividades biolgicas tales como antibiticos, vitaminas, aminocidos, enzimas, agentes antitumorales, osmoprotectores, protenas heterlogas, entre otros, representa un especial inters para la industria farmacolgica. En este sentido, Olaizola (2003) describe que el proceso para la produccin de compuestos bioactivos contempla al menos dos etapas: 1) la identificacin de nuevos compuestos, as como el mejoramiento de los ya identificados y; 2) desarrollo de sistemas de produccin adecuados que permitan el escalamiento a nivel industrial. No obstante, el autor advierte que aunque las microalgas poseen una alta productividad primaria, muchos compuestos qumicos de inters son producto del metabolismo secundario, este ltimo activado en condiciones no conducentes al crecimiento rpido. Este hecho ha sido corroborado en la obtencin de pigmentos de inters a partir de A. platensis (Rojas, comunicacin personal). Aunado al aumento de la productividad volumtrica a nivel de fotobiorreactores, el incremento de la produccin de compuestos qumicos a partir de microalgas requiere de la obtencin de nuevas cepas con caractersticas fisiolgicas y bioqumicas mejoradas orientadas a incrementar: la velocidad de crecimiento, la tolerancia al estrs abitico y el flujo metablico de productos bioqumicos. Ms all, la ruta biosinttica asociada a un determinado compuesto podra ser transferida a un organismo ms fcilmente cultivable. La superproduccin de metabolitos secundarios ha sido abordada habitualmente por mutagnesis clsica de las cepas de produccin. Este mtodo, aunque es muy laborioso, ha sido generalmente muy efectivo sobre todo para incrementar la produccin de antibiticos en diversos hongos filamentosos (Gutirrez et al. 2000). No obstante, los adelantos biotecnolgicos proporcionan una va mucho ms racional y vanguardista para incrementar la eficiencia de los programas de mejora de cepas a travs del uso de la ingeniera metablica. Las tendencias de investigacin ms recientes
80 consideran que para mejorar la produccin de un determinado compuesto hay que actuar, no slo sobre la ruta de biosntesis de dicho compuesto, sino adicionalmente sobre otras rutas que indirectamente pudieran afectar la primera, tales como rutas de secrecin, transporte, regulacin gnica, etc. (Gutirrez et al. 2000). Unas de las estrategias ms utilizadas en ingeniera metablica son: i) el incremento del nmero de copias de los genes de la ruta biosinttica de inters y, ii) el incremento de la expresin de genes mediante el cambio de sus regiones promotoras por promotores de genes constitutivos o de genes de expresin fuerte del metabolismo secundario. Por otro lado, si se requiere modificar el flujo metablico en alguna ruta biosinttica con la finalidad de inducir la acumulacin de algn metabolito de inters, se procede a la interrupcin dirigida del gen asociado a su conversin enzimtica mediante diversas tcnicas moleculares tales como de recombinacin simple o doble recombinacin homloga (Casqueiro et al. 1999b; Liu et al. 2001; Naranjo et al. 2004; 2005). En este caso, para incrementar el flujo metablico hacia la acumulacin de P6C y biosntesis de cido pipeclico en A. platensis, se propone la utilizacin de la tecnologa del ADN recombinante. Se ha reportado que el cido pipeclico se forma a partir del metabolismo de lisina en diversos organismos incluyendo mamferos, plantas, hongos, levaduras y bacterias. En hongos, el cido pipeclico se sintetiza va cido aminoadpico a travs de la ruta del aminoadipato (Aspen y Meister, 1962; Naranjo et al. 2004), mientras que en plantas el cido pipeclico se sintetiza va sacaropina, a travs del catabolismo de Llisina (Goncalves-Butruille et al. 1996). Partiendo del caso de que A. platensis posea una ruta similar a la del -aminoadipato para biosintetizar lisina y de que el cido pipeclico se sintetice va cido aminoadpico (Fig. 1), la desviacin del flujo metablico para la biosntesis de lisina hacia la acumulacin intracelular de P6C y cido pipeclico podra llevarse a cabo mediante la interrupcin dirigida del gen que codifica la sacaropina reductasa; enzima dependiente de NADPH que cataliza la conversin de P6C y glutamato a sacaropina en la ruta del aminoadipato (Johansson et al. 2000a; 2000b; Bhattacharjee, 1985; Naranjo et al. 2001; 2004). Dicha interrupcin gnica provocara la acumulacin de P6C, intermediario inmediato anterior a la sacaropina y precursor directo del cido pipeclico (Fig. 1). As mismo, el suministro ajustado de cido -aminoadpico a los caldos de cultivo podra incrementar la acumulacin de P6C y de cido pipeclico. Por otro lado, partiendo del caso de que A. platensis posea una ruta similar a la del cido diaminopimlico para biosintetizar lisina y de que el cido pipeclico se sintetice va sacaropina, a travs del catabolismo de L-lisina (Fig. 3), sera aconsejable incrementar el nmero de copias de los genes estructurales que codifican la sacaropina deshidrogenasa, la sacaropina reductasa o ambos, a la vez que se suministre concentraciones ajustadas de Llisina o sacaropina a los caldos de cultivo. Esto se debe a que dichos genes son responsables de las dos primeras reacciones enzimticas de la ruta catablica de L-lisina descrita tanto en plantas como en hongos filamentosos, donde la L-lisina se cataboliza en sacaropina y P6C mediante dos reacciones consecutivas llevadas a cabo por la sacaropina deshidrogenasa y sacaropina reductasa, respectivamente. Posteriormente, el P6C podra reducirse a cido pipeclico mediante la accin de la pipecolato reductasa (Fig.1). En este sentido, Naranjo y Moret (2008), llevaron a cabo el primer reporte sobre la identificacin parcial de genes biosintticos de lisina en cianobacterias. Para ello, se
81 amplific por PCR un fragmento de ADN interno del gen que codifica hipotticamente la sacaropina reductasa de la cepa A. platensis Lefevre 1963/M-132-1 (No. Acceso GenBank FJ798612) empleando los oligonucletidos SR-F (5GACTTGGTGAT(C/T)TCGCTGAT(C/T)3) y SR-R (5CTCGAACTTGTGCTGGAGCAT-3). Dichos oligonucletidos se disearon tomando en cuenta las secuencias aminoacdicas de hongos y levaduras depositadas en el GeneBank, tales como: Penicillium chrysogenum (NCBI CAC87475; 449 aa); Neurospora crassa (NCBI CAC28679; 448 aa); Magnaporthe grisea (NCBI AAF91081; 450 aa); Saccharomyces cerevisiae (NCBI P38999; 446 aa); y Schizosaccharomyces pombe (NCBI Q09694; 450 aa), y el uso de codones reportado para A. platensis (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=118562). Los resultados obtenidos revelaron la existencia de una secuencia nucleotdica de 653 pb (No. Acceso GenBank FJ798613) en el genoma de A. platensis cepa Lefevre que muestra un 40% de identidad con los genes lys7 y lys3 que codifican la sacaropina reductasa de los hongos Ascomycetes P. chrysogenum y M. grisea, respectivamente. As mismo, la bsqueda de secuencias de ADN homlogas a la clonada en A. platensis contra genomas de diferentes hongos depositados en Bases de Datos de acceso pblico, mostr la existencia de un marco abierto de lectura con una identidad de 40% en el genoma de Neurospora crassa (Broad Institute; ORF; No. Acceso XM_956002) que codifica una hipottica sacaropina reductasa. La figura 4 muestra un rbol filogentico obtenido por MEGA 3.1 (mtodo Neighbour-Joining con Bootstrap de 2.000 repeticiones y el modelo Jukes Cantor) basado en el alineamiento mltiple de secuencias nucleotdicas parciales de los genes que codifican la sacaropina reductasa de: Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, P. chrysogenum, M. grisea, Gibberella zea, N. crassa, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y la secuencia obtenida a partir del ADN genmico de la cepa A. platensis Lefevre. El rbol obtenido muestra dos grupos claramente definidos constituidos por las 6 especies de hongos filamentosos y las 2 especies de levaduras, los cuales de separan visiblemente entre s y de A. platensis Lefevre. Tomando en cuenta que las secuencias de ADN estudiadas pertenecen a dos tipos celulares radicalmente diferentes, los hongos y levaduras (Eucariota) y la cyanobacteria en estudio (Procariota), es de esperarse la discriminacin de estos debido a su evidente distancia evolutiva. Sin embargo, el porcentaje de identidad obtenido con los genes que codifican la sacaropina reductasa reportada en hongos y levaduras podran sugerir que: i) el fragmento de ADN clonado corresponde a una regin interna del gen que codifica la sacaropina reductasa de A. platensis y; ii) la existencia de una ruta similar a la del -aminoadipato descrita en hongos presente en el genoma de esta cianobacteria.
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Figura 4. rbol filogentico de fragmento de ADN clonado de A. platensis Lefevre y secuencias nucleotdicas internas de los genes que codifican sacaropinas reductasas en diversos hongos y levaduras. Ntese la presencia de 2 grupos bien diferenciados correspondientes a los hongos y las levaduras, separados entre s y de la cianobacteria. Aspfl: A. flavus, Aspfu: A. fumigatus, Penic: P. chrysogenum, Magna: M. grisea, Gibbe: G. zea, Neuro: N. crassa, Schiz: S. pombe, Sacch: S. cerevisiae, Arthr: A. platensis Lefevre.
No obstante, se debe tomar en cuenta que en plantas y animales se ha descrito que el catabolismo de L-lisina tiene lugar va sacaropina a travs de dos reacciones enzimticas consecutivas llevadas a cabo por la sacaropina deshidrogenasa (SDH) y la sacaropina reductasa (SR), las cuales son sintetizadas a partir de un nico gen que codifica un polipptido bifuncional (Epelbaum et al. 1997; Tang et al. 2000; Zhu et al. 2000a, b). As mismo, se ha descrito que existe una gran similitud entre las protenas bifuncionales SR/SDH y las protenas mofuncionales SR y SDH; y que en las protenas bifuncionales SR/SDH los dominios SR y SDH se encuentran localizados en el extremo carboxilo terminal y en el extremo amino terminal de la protena, respectivamente (Kemper et al. 1999). En este sentido, el alineamiento de la protena monofuncional SR de P. chrysogenum con protenas bifuncionales SR/SDH de plantas (Zea mays y Arabidopsis thaliana) y animales (Homo sapiens y Mus musculus), revel un porcentaje de identidad
considerable con la regin carboxilo terminal de las protenas bifuncionales estudiadas (28, 26, 31 y 31%, respectivamente) (Naranjo, 2003). Por lo tanto, los resultados obtenidos preliminarmente debern confirmarse a travs de slidos experimentos moleculares y bioqumicos para determinar si el fragmento de ADN clonado en A. platensis corresponde realmente al gen que codifica la SR monofuncional en la ruta del aminoadpico para la biosntesis de lisina o, por el contrario, se trata de un gen que codifica una protena bifuncional SR/SDH asociada al catabolismo de la lisina, tal como ocurre en las plantas y animales (GoncalvesButruille et al. 1996). Por otra parte, desde el punto de vista productivo, existen ventajas comparativas de la utilizacin de A. platensis como posible factora celular para producir P6C, cido pipeclico u otros metabolitos secundarios de inters farmacolgico, las cuales se resumen a continuacin (Olgun, 2003; Olaizola, 2003; Hallmann, 2007):
83 Fcilmente cultivable y cosechable a niveles industriales, tanto en sistemas abiertos como en cerrados, Ciclo de vida corto, con posibilidad de ser cultivada axnicamente, Cultivable en medios de bajo costo (inclusive aguas residuales), Alta productividad volumtrica, Capacidad de acumular compuestos de alto valor agregado y la fcil extraccin de los mismos, Capacidad de crecer a valores de pH elevados, lo cual aumenta la probabilidad de mantener los cultivos monoalgales, Capacidad de algunas cepas de crecer bajo condiciones heterotrficas y mixotrficas, Capacidad de soportar altas temperaturas, Sumidero de gases que acompaan al CO2 en los sistemas tpicos de combustin (en caso de que sean usados para el cultivo y el secuestro de carbono), tales como los del tipo SOx y NOx, Presenta mltiples usos para la biomasa una vez extrados los compuestos de inters. Ha sido ampliamente investigada desde mltiples puntos de vista (molecular, bioqumica, fisiolgica y ecolgca).
Reconocimientos
Este trabajo de investigacin fue financiado por el Sub-Proyecto BID-FONACIT No. 2006000537 Desarrollo y optimizacin del cultivo de microalgas promisorias en la nutricin animal (aves, porcinos, peces y camarones) y creacin de la Red Venezolana de Investigacin en Microalgas, Ministerio del Poder Popular para la Ciencia, Tecnologa e Industrias Intermedias de Venezuela. Los autores agradecen a la Lic. Moret por su apoyo tcnico.
Referencias
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5. Conclusiones
El inters farmacolgico sobre el estudio del cido pipeclico radica en el hecho de que este inminoacido es un componente y precursor de la biosntesis de una amplia diversidad de compuestos biolgicamente activos. En la presente revisin se propone la utilizacin de A. platensis como posible factora celular para producir P6C, cido pipeclico u otros metabolitos secundarios con interesantes actividades farmacolgicas, tales como antibiticos, vitaminas, aminocidos, enzimas, agentes antitumorales, protenas heterlogas, entre otros, los cuales tendran una aplicacin importante en el campo de la salud humana y animal.
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91 Revisin crtica
Las microalgas oleaginosas como fuente de biodiesel: retos y oportunidades

Maribel M. Loera-Quezada y Eugenia J. Olgun*
Red de Manejo Biotecnolgico de Recursos. Instituto de Ecologa, A.C. (INECOL) Km. 2.5 Carretera Antigua a Coatepec No. 351, Congregacin El Haya. Xalapa, Veracruz 91070, Mxico.
*
Autor de correspondencia: eugenia.olguin@inecol.edu.mx
Resumen
La presente revisin proporciona informacin actualizada con relacin a los principales retos cientfico-tecnolgicos que se deben enfrentar y resolver para lograr producir biodiesel a partir de microalgas a un costo competitivo. Se discute el entorno ambiental que ha generado la necesidad de este tipo de producto, haciendo nfasis en el cambio climtico, los gases efecto invernadero (GEI) y la produccin de Bioenergticos. Se detallan las ventajas que ofrece la produccin de biodiesel a partir de microalgas, tales como: a) Las microalgas tienen un rendimiento de aceite mucho mayor que cualquier cultivo convencional; b) Slo este bioenergtico tiene una verdadera huella ecolgica pequea; c) En contraste con otros bioenergticos, se requiere una superficie muy pequea para cubrir la demanda actual de diesel de petrleo; d) Las microalgas oleaginosas pueden ser cultivadas en agua de mar, en agua salobre o en aguas residuales, disminuyendo as la presin sobre el agua dulce requerida para la produccin de alimentos; e) Las microalgas son excelentes captadoras de CO2 ; f) Con relacin a la emisin de gases invernadero, es de los bioenergticos que muestran un valor negativo. Sin embargo, la tecnologa para la produccin de biodiesel a partir de microalgas, an enfrenta grandes retos para lograr una produccin a escala comercial y de manera rentable. Entre los ms importantes destacan: a) seleccin de cepas con mayores productividades de biomasa y de lpidos, mejores perfiles de lpidos y mejor adaptabilidad a condiciones de cultivo a gran escala, b) estrategias de cultivo muy efectivas para lograr el mximo posible de productividad de lpidos y de biomasa al menor costo. Entre dichas estrategias, destacan el uso de condiciones de estrs fisiolgico y el uso de aguas residuales para reemplazar agua destinada al uso agrcola; c) seleccin del tipo de reactor o de una combinacin de ellos para lograr mxima produccin de biomasa al mnimo costo y d) optimizacin de los mtodos actualmente disponibles para extraccin de lpidos y transesterificacin de cidos grasos para disminuir sus altos costos e impactos ambientales negativos. Se concluye que existen diversas oportunidades en cada uno de los retos a vencer y que se deben combinar el conocimiento cientfico ms avanzado con las actividades y capacidades empresariales que estn emergiendo en busca de procesos competitivos. Las ventajas de este bioenrgetico de segunda generacin y el escenario actual de precios del petrleo al alza, sugieren proyecciones optimistas para lograr avances en el corto y mediano plazo que permitan producirlo a un costo competitivo. Palabras clave: bioenergticos, cambio climtico, triacilglicridos, fotobioreactores, lagunas abiertas. microalgas oleaginosas, lpidos,
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Abstract
This review provides current information regarding the scientific and technological challenges to be addressed and solved in order to enhance the cost-effectiveness of the integral process for producing biodiesel from microalgae. Global warming, greenhouse gases and production of bioenergy are discussed primarily to provide a general framework. Several advantages of microalgae compared to other sources of biodiesel are also discussed: a) microalgae produce a significantly higher yield of lipids, compared to conventional crops for biodiesel production; b) this bioenergy source shows the smallest ecological print; c) a smaller territorial surface is required for fulfilling the current diesel from petrol demand, compared to the land surface required by other bioenergy sources; d) microalgae can be cultivated either in sea water, brackish water or wastewater, avoiding the pressure of the use of fresh water for food production; e) microalgae perform excellent at CO2 capture; f) biodiesel from microalgae shows a negative release of greenhouse gases. However, despite all the advantages shown by microalgae to produce biodiesel, there are still several scientific and technological challenges to solve before large scale production at competitive cost can be accomplished. Among the more important are: a) selection of the best performing strains, concerning the highest biomass productivity and highest oil yield, the best lipid profile and the best adaptability to large scale production; b) to design very effective culture strategies to achieve high biomass and lipid productivity at a competitive cost. Among the most important culture strategies, research on induction of higher lipid content by physiological stress and successful cultivation in wastewater, is still full of opportunities; d) selection of the best performing reactor design or a combination of various types, in order to accomplish the highest biomass and lipid productivity at a minimum cost and e) optimization of currently available processes for lipid extraction and transesterification of fatty acids to decrease their high costs and negative environmental impacts. It is concluded that there are several opportunities in each of the challenges to confront and a combination of scientific knowledge and entrepreneur skills are required for the design of competitive processes. The several advantages that this second generation bioenergy source possess and the international scenario of fossil oil prices rising once again, suggest optimistic projections for achieving production of biodiesel from microalgae at competitive prices in the medium and long term. Keywords: Bioenergy sources, global warming, oleaginous microalgae, lipids, triacylglicerides, photobioreactors, raceways, open ponds.
1. Introduccin
Indudablemente, el cambio climtico es uno de los grandes desafos del siglo XXI ya que sus impactos son globales y cada vez ms severos, afectando la estabilidad econmica y social del planeta, adems de la ambiental. Entre los efectos ms graves destacan los aumentos observados del promedio mundial de la temperatura del aire y del ocano, el deshielo generalizado de glaciares, las modificaciones en los patrones de preci-
pitacin, los cambios en la intensidad o frecuencia de eventos climticos extremos y el aumento del promedio mundial del nivel del mar, entre otros. Desde hace dcadas, se conoce la estrecha relacin entre el aumento continuo de emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) y el cambio global (IPCC, 2007). Como respuesta a esta problemtica del cambio global en los ltimos aos, las polticas ambientales han favorecido un incremento en el uso de biocombustibles a
93 nivel mundial, principalmente para sustituir los combustibles fsiles utilizados en el transporte vehicular. Estos nuevos desarrollos tecnolgicos, estn recibiendo atencin y apoyo debido tanto a la preocupacin por la disminucin de las reservas mundiales del petrleo, as como a un esfuerzo para mitigar las emisiones de los GEI. La tendencia mundial es reducir al mximo el uso de combustibles fsiles y reemplazarlos con biocombustibles que sean renovables, no contaminantes y carbono neutrales. Actualmente, los biocombustibles en los que se ha invertido ms esfuerzo son el etanol a partir de caa de azcar y del maz y el biodiesel a partir de aceite de soya, canola, girasol, palma de aceite. Sin embargo, la sustentabilidad de la produccin de estos biocombustibles se ha visto fuertemente cuestionada, principalmente porque la gran demanda de ellos requiere la conversin del uso del bosques o reas naturales en superficies agrcolas o incluso el uso de superficies actualmente utilizadas para produccin de alimentos (Majer et al., 2009). Para lograr una sustentabilidad econmica y ambiental, se requiere que el proceso de produccin de biocombustibles no slo sea renovable, sino que tambin contribuya al secuestro de CO2 atmosfrico (Schenk et al., 2008). Las microalgas oleaginosas, consideradas como fuente de biocombustibles de segunda generacin, contribuyen de manera importante a la fijacin de CO2 y pueden ser utilizadas para producir una amplia gama de biocombustibles, tales como el biodiesel, bioetanol, biometano y biohidrgeno, adems de que producen metabolitos secundarios con aplicacin en la industria farmacutica, para complementos nutricionales, acuicultura, cosmetologa. (Rosenberg, et al., 2008; Schenk et al., 2008). Considerando que una de las limitaciones actuales en la produccin masiva de microalgas es todava el alto costo de produccin, su cultivo para la produccin de biodiesel utilizando a las aguas residuales como fuente de nutrientes, es una alternativa bastante promisoria y ambientalmente sustentable. Existe amplia experiencia en el uso de microalgas para el tratamiento de aguas residuales, ya que son eficaces en la remocin de nutrientes, materia orgnica, metales pesados y de xenobiticos, entre otros (Hernndez y Olgun, 2002; Olgun, 2003; Muoz y Guieysse, 2006). Sin embargo, existen muy pocos reportes con relacin al uso de agua residual para el cultivo de microalgas oleaginosas y la produccin simultnea de biodiesel. Otra limitacin importante en este tipo de desarrollo, es que aunque muchas especies de microalgas son capaces de producir grandes cantidades de lpidos, con frecuencia las concentraciones altas de lpidos se obtienen cuando las algas son sometidas a condiciones de estrs impuestas por estmulos fsicos y/o qumicos (Hu et al., 2008), lo que con frecuencia est asociado a condiciones de limitacin de nutrientes y por lo tanto, a baja productividad de biomasa y de lpidos. Por lo anterior, algunos de los mayores retos en el desarrollo de procesos para la produccin de biodiesel con microalgas, consisten en seleccionar las mejores cepas y establecer estrategias de cultivo para que se logre el mximo posible de productividad de biomasa y de lpidos, a pesar de las condiciones de estrs fisiolgico. Asimismo, lograr este cultivo utilizando agua residual con el objeto de evitar la competencia del uso del agua para fines agrcolas, es de primordial importancia y representa un gran reto cientfico y tecnolgico. La presente revisin est enfocada a discutir las ventajas del uso de microalgas como fuente de materia prima para la produccin
94 de biodiesel, adems de las ventajas ambientales que ello conlleva, tales como las altas tasas de fijacin de CO2 y el tratamiento de aguas residuales, sin dejar de lado la discusin de algunos de los retos a nivel de proceso que an se deben resolver, como los antes mencionados. No pretende ser una revisin exhaustiva, dado que este tema es muy actual y cada da se genera mucha informacin. Sin embargo, el objetivo general es proporcionar informacin actualizada con relacin a los principales retos tecnolgicos que se deben enfrentar y resolver para lograr producir biodiesel a partir de microalgas a un costo competitivo. El dixido de carbono (CO2) es el GEI antropognico ms importante. Sus emisiones anuales aumentaron aproxima-damente un 80% entre 1970 y 2004, de tal manera que en la era preindustrial el valor era de aproximadamente 228 ppm y actualmente es de 385 ppm. Las emisiones de CO2 originadas por actividades humanas proceden de diversas fuentes, en su mayor parte de la combustin de combustibles fsiles utilizados en la generacin de energa, en el transporte vehicular, en los procesos industriales tales como la fabricacin de cemento. La combustin de biomasa y la deforestacin tambin juegan un papel muy importante (Jain, 2008; IPCC, 2005; IPCC, 2007) (Fig. 1). En Mxico, la combustin de energticos es responsable de poco ms del 61% de las emisiones de CO2 y del 46% de los GEI (Alarco, 2006). Debido a esta problemtica, la tendencia mundial es reducir al mximo el uso de combustibles fsiles y reemplazarlos con biocombustibles que sean renovables, no contaminantes y carbono neutrales.
2. Aumento de los Gases de Efecto Invernadero (GEI) en la atmsfera

Las emisiones mundiales de los GEI por efecto de actividades humanas han aumentado desde la era preindustrial, registrndose un aumento de aproximadamente 70% entre 1970 y 2004.
Figura 1. Emisiones mundiales anuales de GEI antropognicos entre 1970 y 2004 (IPCC, 2007)
95 El aumento de los GEI en la atmsfera ha resultado en el aumento de la temperatura ambiental, tanto del aire como del ocano, generando deshielo de los casquetes polares y el aumento promedio del nivel del mar. De acuerdo al documento tcnico V del IPCC (IPCC, 2002), la temperatura media de la superficie de la Tierra ha aumentado en 0.6C durante los ltimos 100 aos, siendo el ao 1998 el ms clido y la dcada de los 90, muy probablemente la dcada ms clida. El aumento de la temperatura tambin afecta a las actividades agrcolas (Morton, 2007), forestales (Kirilenko y Sedjo, 2007), a la salud humana (Ebi, 2008), a las actividades humanas en la regin rtica (IPCC, 2007) y a algunos organismos terrestres particularmente vulnerables (Deutsch et al., 2008). El impacto del calentamiento global en organismos y ecosistemas marinos ha sido ampliamente discutido por Brierley y Kingsford (2009). del producto, los niveles requeridos de agua, fertilizantes y plaguicidas para el cultivo de la materia prima y la cantidad de energa requerida para cultivar y refinar la materia prima, son considerados tambin parte de la huella ecolgica de un biocombustible (Groom et al., 2008). Las mejores alternativas parecen ser los biocombustibles de segunda generacin, es decir, aquellos que contribuyen en la reduccin del uso de tierra debido a su potencial en rendimiento de energa por hectrea, que no requieren tierras cultivables y que no son empleados para consumo humano. Dentro de esta categora se encuentran los residuos ligno-celulsicos, residuos agrcolas, la Jatropha curcas y especialmente las microalgas (Mata, et al., 2010). 3.1 Biodiesel a partir de plantas El biodiesel es una mezcla de steres monoalqulicos de cidos grasos de cadena larga derivados de recursos renovables tales como aceites vegetales o grasas animales (ASTM, 6751-09). Esta definicin tambin es aceptada por las especificaciones de la Unin Europea (estndar EU 14214). Puede usarse en su forma pura (B100) o en mezclas con diesel fsil que pueden ser del 2% (B2), 5% (B5) y 20% (B20). Las propiedades del biodiesel varan de acuerdo a la materia prima y entre las ms sobresalientes y atractivas estn su biodegradabilidad y no toxicidad, comparado con el diesel fsil. Frecuentemente, se considera que el balance de carbono en la produccin de biodiesel a partir de plantas es neutral. Sin embargo, para mayor precisin, se debe tomar en cuenta el carbono utilizado en todo el ciclo de produccin, respecto al liberado durante la combustin (Schenk et al., 2008). La razn principal por la cual los aceites vegetales no se pueden utilizar directamente en los motores diesel es por su alta viscosidad la cual est relacionada a su estructura qumica. Conforme aumenta la
3. Bioenergticos
Los bioenergticos de primera generacin son una fuente sustentable de energa slo cuando los insumos se cultivan de manera sustentable mediante prcticas agrcolas amigables con la biodiversidad y slo se deberan promover los bioenergticos con la menor huella ecolgica. La huella ecolgica de un pas es el rea total requerida para producir el alimento y fibra que consume, absorber los desechos de esa energa consumida y suministrar espacio para infraestructura (WWF, 2004). En el caso de los biocombustibles, la huella ecolgica est en funcin de algunos factores, tales como eficiencia energtica o balance neto de energa (energa generada/energa requerida) del ciclo de vida del bioenergtico, combinado con su rendimiento por hectrea. Asimismo, las emisiones de los gases de efecto invernadero durante el ciclo de vida
96 longitud de la cadena carbonada de los lpidos, mayor es la viscosidad. Sin embargo, la viscosidad disminuye cuando aumenta el nmero de enlaces dobles (grado de insaturacin). Existen cuatro procesos qumicos que se utilizan para resolver el problema de viscosidad: dilucin, microemulsificacin, pirlisis y transesterificacin, siendo este ltimo el ms recomendado y preferido (Canakci y Sanli, 2008; Shales, 2007). La reaccin de transesterificacin es la transformacin de un triglicrido en un ster alqulico de cidos grasos, en presencia de un alcohol (metanol o etanol) y un catalizador (un lcali o un cido), obteniendo glicerol como subproducto. Las molculas lineales del ster resultante reciben el nombre de biodiesel y estn formadas por el ster del cido graso y el alcohol. La reaccin de transesterificacin requiere de 3 moles de alcohol por cada mol de triglicridos para producir 1 mol de glicerol y 3 moles de metil steres (biodiesel). El biodiesel obtenido tiene menor viscosidad, menor masa molecular, menor intervalo de ebullicin y menor punto de inflamacin que el triglicrido original (Canakci y Sanli, 2008; Vasudevan y Briggs, 2008). En los procesos industriales se usan 6 moles de metanol por cada mol de triglicridos para asegurar la produccin de metil steres o biodiesel (Fukuda et al., 2001). La figura 2 muestra un diagrama general de los procesos de produccin de biodiesel. La produccin de biodiesel a partir de plantas tiene algunas limitaciones, como por ejemplo: a) est en conflicto con la utilizacin de aceites para alimento y b) su uso se ve limitado por las grandes extensiones de terreno necesarias para la produccin de semillas oleaginosas. Adems, para la produccin de biodiesel slo se emplea la semilla de la planta y el resto de la biomasa se desecha; adems, los cultivos son dependientes de la estacin del ao y su ubicacin geogrfica (Adamczak et al., 2009).
Figura 2. Diagrama de flujo de los procesos para produccin de biodiesel.
97 3.2 Microalgas como fuente de biodiesel Se ha reportado que diversos microorganismos tales como las levaduras Cryptococcus curvatus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Trichosporom pullulan y Yarrowia lipolytica y bacterias del grupo actinomicetos tales como Mycobacterium spp., Rhodococcus spp. y Nocardia spp., son capaces de sintetizar triglicridos intracelulares, bajo ciertas condiciones de cultivo, hasta en un 80% de su peso seco utilizando diversas fuentes de carbono (azcares, cidos orgnicos, alcoholes y aceites entre otras) y diferentes subproductos y/o residuos industriales o agrcolas (suero de leche, hidrocarburos, aceites vegetales, melazas de caa de azcar, salvado de trigo, desechos de frutas y verduras.) (Li et al., 2008a; Adamczak et al., 2009). El problema al utilizar este tipo de microorganismos, es el costo de produccin, dado que requieren un alto consumo de oxgeno. En contraste, en las ltimas dcadas se ha destacado que las microalgas representan una alternativa ms conveniente que cualquier otro tipo de organismo para la produccin de triacilglicridos y su conversin a biodiesel, ya que algunas especies oleaginosas, siendo organismos fotosintticos, slo requieren energa solar, agua, CO2 y algunas sales para producir muy altos rendimientos de biomasa rica en lpidos (Li et al. 2008a). De hecho, son los organismos fotosintticos ms eficientes, absorben ms CO2 y liberan ms O2 que cualquier planta, crecen extremadamente rpido y llegan a acumular grandes cantidades de diversos productos. Algunas microalgas doblan su biomasa en 24 h y el tiempo de duplicacin de biomasa durante la fase exponencial puede ser tan corto como 3.5 h (Chisti, 2007). De manera ms especfica, los beneficios que se obtienen al
usar microalgas para la produccin de biodiesel son: a) Las microalgas tienen un rendimiento de aceite mucho mayor que cualquier cultivo convencional. Es de 10 a 20 veces mayor que el derivado del aceite de palma y de 200 a 400 veces mayor que el derivado del aceite de soya (Fig. 3). b) Slo este bioenergtico tiene una verdadera huella ecolgica pequea, dado que requiere una superficie de 1-2 rdenes de magnitud menores en comparacin a los cultivos convencionales o los rboles. Requiere de 1.5 a 3.2 millones de hectreas (M has) para satisfacer el 50% de las demandas de energticos de transportacin en U.S.A. (Chisti, 2007). En contraste, la soya, principal fuente de biodiesel en U.S.A. requiere de 330 a 450 M has para un propsito similar. En Mxico, se ha estimado que slo se requiere el 1% de la superficie total del pas, para cubrir el 100% de la demanda actual de diesel de petrleo (Garibay et al., 2009). c) Con biodiesel de microalgas cultivadas en lagunas abiertas (LA), slo se requieren 200,000 has para producir 1 quadrilln de BTU (Sheehan et al., 1998). En contraste, se requieren aproximadamente 40 millones de has si se utiliza etanol derivado de maz o 20 millones de has si se utiliza biodiesel derivado de frijol de soya. d) Las microalgas oleaginosas pueden ser cultivadas en agua de mar o en agua salobre, disminuyendo as la presin sobre el agua dulce requerida para la produccin de alimento. Algunas otras especies aisladas de agua dulce, pueden crecer en aguas residuales, tambin eliminando la competencia por el uso de agua para la agricultura. e) Las microalgas son excelentes captadoras de CO2. Por cada 100 ton de microalgas producidas, se consumen 183 ton de CO2 (Chisti, 2007).
98 f) Con relacin a la emisin de gases invernadero, es de los pocos bionergticos con un valor negativo. Es decir, no se produce CO2 durante el ciclo de vida de produccin y el valor de este parmetro para microalgas (-183 kgCO2/MJ) es el ms negativo respecto a los otros bionergticos con valores negativos (etanol a partir de pastos o de residuos celulsicos). En contraste, el diesel a partir de fuentes fsiles produce 83 kgCO2/MJ y el etanol a partir de maz produce 81-85 kgCO2/MJ (Chisti, 2007).
Productividad de aceite (L/Ha)

Microalgas (2) Microalgas (1) Palma de aceite Coco Jatrofa Canola Cacahuate Girasol Grasa amarilla Mostaza Soya Algodn Maz 0 5,950 2,689 1,892 1,190 1059 952 907 572 446 325 172 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 58,700 136,900
Figura 3. Productividad de aceite de las microalgas en comparacin con los cultivos convencionales (Gao et al, 2009; Schenk et al., 2008; Chisti, 2007) (1) 30% de aceite en biomasa (con base a peso seco); (2) 70% de aceite en biomasa (con base a peso seco)
4. Retos y oportunidades en la produccin de biodiesel con microalgas

Algunos de los parmetros claves que afectan la factibilidad econmica de la produccin de biodiesel a partir de microalgas son: la productividad de la biomasa microalgal, el contenido celular de lpidos y sobre todo, la productividad de lpidos (especialmente los triacilglicridos). Este ltimo parmetro determina el costo del proceso de cultivo, mientras que la concentracin de la biomasa en el cultivo y el contenido celular de los lpidos, afectan significativamente el costo de los procesos
de extraccin y transformacin. Por lo tanto, un proceso ideal debera permitir la produccin de lpidos a la ms alta productividad celular, con el contenido ms alto posible en las clulas (Li et al., 2008b). Desafortunadamente esta situacin ideal es muy difcil de encontrar en la prctica, dado que las clulas con alto contenido de lpidos son producidas bajo condiciones de estrs fisiolgico, el cual est asociado a condiciones limitantes de nutrientes y por lo tanto, de baja productividad de biomasa y de lpidos. Por lo anterior, los mayores retos en el desarrollo de procesos para la produccin de biodiesel con microalgas consisten en:
99 a) seleccionar las mejores cepas, en trminos de mximo contenido de lpidos y mxima productividad, mejor perfil de lpidos y adaptabilidad al tipo de agua a utilizar y a las condiciones ambientales; b) establecer estrategias de cultivo adecuadas que permitan lograr la mxima productividad de lpidos y de biomasa; c) lograr el uso de aguas residuales, evitando contaminaciones; d) seleccionar el tipo de reactor ms adecuado o una combinacin de ellos, para mxima produccin de biomasa al mnimo costo; e) lograr abatir los costos de cosecha, y f) lograr una extraccin de lpidos y su conversin a biodiesel, mediante estrategias de mnimo costo.
Figura 4. Algunas de las especies de microalgas que se pueden emplear para la produccin de biodiesel. Fotos de Dunaliella salina, Botryococcus braunii, Chlorella minutissima y Monodus subterraneus (Culture Collection of Autotrophic Organisms (CCALA) http://www.butbn.cas.cz/ccala/index.php); fotos de Nannochloris sp. Nitzchia sp. y Dunaliella tertiolecta (Plancton Oceanique Station Biologique of Roscoff http://www.sbroscoff.fr/Phyto/RCC/); foto de Chlorella vulgaris (Culture Collection of Algae, Charles University in Prague (CAUP) http://botany.natur.cuni.cz/algo/caup-gallery.html) y foto de Nannochloropsis sp. (Ben-Amotz, 2009).
4.1 Seleccin de la especie de microalgas con mejores atributos La eleccin de la especie es el primer paso para el desarrollo de un proceso de produccin, ya que el xito depende principalmente de ello. La especie debe tener
las caractersticas adecuadas para condiciones de cultivo muy particulares para obtener productos especficos. Entre las principales caractersticas deseables para cultivos a gran escala estn: crecimiento rpido, alto contenido de productos de alto
100 valor agregado, desarrollo en ambientes extremos, clulas grandes en colonias o filamentos, gran tolerancia a condiciones ambientales, tolerancia a niveles altos de CO2 (15% o ms), a contaminantes y al efecto fsico de la agitacin o turbulencia. Adems, no debe excretar autoinhibidores (Griffiths y Harrison, 2009) (Fig. 4). El Departamento de Energa de Estados Unidos financi de 1978 a 1996 un programa para desarrollar combustibles renovables a partir de algas. El objetivo principal del programa, denominado Programa de Especies Acuticas, fue la produccin de biodiesel a partir de algas con alto contenido de aceite, cultivadas en estanques al aire libre utilizando el CO2 liberado de centrales termoelctricas que usaban carbn como combustible. Aislaron ms de 3,000 especies con especial inters en cepas productoras de lpidos; finalmente no se hizo ninguna recomendacin en cuanto a la mejor especie, pero si se report que el rendimiento por acre de aceite de microalga es aproximadamente 200 veces mayor que el mximo rendimiento de cualquier cultivo oleaginoso (Sheehan et al., 1998) Posteriormente, se han descrito listas numerosas de cepas de origen marino o dulceacucolas que muestran un alto contenido de lpidos (Chisti, 2007) y existen diversos estudios con especies del gnero Chlorella (Liu et al., 2008; Xiong et al., 2008), con especies de Dunaliella (Takagi et al., 2006), de Nannochloris (Takagi et al., 2000) y con Botryococcus braunii (Li y Qin, 2005) por mencionar algunos de ellos. Nannochloris y Dunaliella son especies marinas con buenas ventajas para ser cultivadas en zonas costeras. La tabla 1 muestra las diferencias del contenido de aceite en algunas especies de microalgas.
Tabla 1. Contenido de aceite de algunas especies de microalgas. Contenido de aceite (% del peso seco) 60a 60a 56a ~ 42a 41.14a 43b 38c 28.7c 27c 30.7c 67c 21.3c 50.3d 21d 73e Productividad de lpidos (mg L-1 d-1) NR 204 13.22 12.77 82 NR 133 90 127.2 151 33.5 82 NR 54 NR
Especie Parietochoris incisa (d) Nannochloropsis sp. (m) Neochloris oleoabundans (d) Chlorella vulgaris (d) Crypthecodinium cohnii (m) Scenedesmus obliquus (d) Neochloris oleoabundans (d) Nannochloropsis sp. (m) Chlorella vulgaris (d) Nanochloropsis oculata (m) Dunaliella (m) Choricystis minor (d) Chlorella protothecoides (d) Chlorella vulgaris (d) Scenedesmus rubescens (m)
a
Referencia Solovchenko et al. (2008) Rodolfi et al. (2009) Gouveia et al. (2009) Widjaja et al. (2009) Mendoza et al. (2008) Mandal y Mallick (2009) Li et al. (2008c) Gouveia y Oliveira (2009) Francisco et al (2010) Chiu et al. (2009) Takagi et al. (2006) Mazzuca-Sobczuk y Chisti (2010) Xiong et al. (2008) Liang et al (2009) Matsunaga et al (2009)
Cultivo bajo supresin de nitrgeno; b Cultivo bajo deficiencia de nitrgeno; c Cultivo con suficiencia de nutrientes; d cultivo heterotrfico; e Ausencia de nutrientes. m = marina y d = dulceacucola; NR = no reportado
101 Recientemente, Rodolfi et al. (2009), investigaron 30 especies para seleccionar aquellas con alta productividad en biomasa y alto contenido de lpidos, encontrando que Nannochloropsis sp., una especie marina, es particularmente promisoria para la produccin de aceite. De igual manera, Gouveia y Oliveira (2009), investigaron 6 especies de microalgas tanto marinas como dulceacucolas para elegir en trminos de cantidad y calidad de aceite la mejor materia prima para la produccin de biocombustibles. Neochloris oleoabundans (dulceacucola) y Nannochloropsis sp. (marina) fueron las que mostraron mayor contenido de lpidos (29 y 28.7%, respectivamente), lo cual las sita como adecuadas para tal fin. ltimamente, varios grupos de investigacin han incursionado en la lnea de investigacin para generar cepas genticamente mejoradas. Aunque la aplicacin de la ingeniera gentica para mejorar la produccin de lpidos en fenotipos de eucariontes, se encuentra en etapas muy tempranas, ya se han desarrollado herramientas de manipulacin gentica en ciertos sistemas modelo para manipular el metabolismo central del carbono en estos organismos (Radakovits et al., 2010). Sin embargo, es posible que los resultados de esta estrategia sean de mediano y largo plazo, considerando que se ha enfatizado que todava se requiere generar mucho conocimiento para posteriormente lograr manipular el metabolismo de lpidos en algas (Greenwell et al., 2010.) 4.2 Induccin del aumento de la productividad de lpidos Las microalgas sintetizan cidos grasos como precursores para la sntesis de varios tipos de lpidos, los cuales varan dependiendo de la especie: lpidos polares, lpidos neutrales, ceras, esteroles, fosfolpidos, glicolpidos, carotenoides, terpenos, tocoferoles, quinonas (Hu et al., 2008). Sin embargo, slo los lpidos neutrales son adecuados para la produccin de biodiesel y de stos, los triacilglicridos. El contenido total de los lpidos en las microalgas puede variar desde 1 hasta 90% del peso seco, dependiendo de la especie y de las condiciones de cultivo (Spolaore et al., 2006; Chisti, 2007). Cuando las microalgas se someten a condiciones de estrs impuestas por estmulos ambientales qumicos y fsicos, solos o en combinacin, ocurre sntesis y acumulacin de grandes cantidades de triglicridos, acompaada por considerables alteraciones en la composicin de los lpidos y cidos grasos. Los principales estmulos qumicos son la deficiencia de nutrientes (nitrgeno, fsforo, azufre y silicio), la salinidad y el pH del medio de cultivo; los fsicos son la temperatura y la intensidad luminosa. La deficiencia de nitrgeno es, con respecto a los nutrientes, el factor que ms afecta el metabolismo de los lpidos (De et al., 1999; Li et al., 2008c; Hu et al., 2008; Mendoza et al., 2008; Solovchenko et al., 2008; Gouveia y Oliveira, 2009; Rodolfi et al., 2009). Adems de estos factores, la fase de crecimiento y la edad del cultivo tambin afectan al contenido y composicin de los cidos grasos, observndose un mayor contenido de lpidos en la fase estacionaria con respecto a la fase logartmica (Spolaore et al., 2006; Hu et al., 2008). Con respecto a la fase de crecimiento, Bigogno et al. (2002) reportaron que en Parietochloris incisa se observ un alto contenido de triacilgliceroles (43% del total de cidos grasos) en la fase logartmica, el cual aument hasta 77% en la fase estacionaria. La influencia de la deficiencia de nitrgeno sobre la sntesis de lpidos fue descrita primero en algas verdes (Shifrin y Chisholm, 1980), aunque estudios posteriores tambin lo han demostrado con cianobacterias. Olgun et al., (2001), reportaron que el contenido de lpidos totales de Spirulina sp. (Arthrospira) aument de 8% a
102 28.6% del peso seco, cuando se someti a una limitacin por N y adems se cultiv a una intensidad luminosa muy baja (66 mol fotn m-2 s-1) en un medio com-plejo. En relacin a microalgas verdes, en el gnero Dunaliella, se ha descrito que su principal lpido de reserva son los triglicridos y que bajo condiciones de limitacin de nitrgeno y con 1% de CO2, stos aumentaron del 1% al 22%, respecto a los lpidos totales (Gordillo et al., 1998). Asimismo, Neochloris oleoabundans puede acumular hasta el 80% de sus lpidos totales en forma de triglicridos y la mayora de sus cidos grasos son saturados en el rango de 16 a 20 carbonos, bajo condiciones de estrs (Tornabene et al., 1983), lo cual la coloca como una de las especies con mayor potencial para la produccin de biodiesel. Tambin se ha reportado que la adicin de 2% de CO2 estimul la acumulacin de cido eicosapentanoico (EPA, 20:5n-3) en la microalga marina Nannochloropsis sp. (Hoshida et al., 2005). Entre otros estudios relacionados tambin a la induccin de lpidos del tipo TAG (triacilglicridos) bajo condiciones de limitacin de nitrgeno, destacan los realizados con Parietochloris incisa (Trebuxiophyceae) por el grupo de Cohen en Israel. En uno de sus trabajos, encontraron que P. incisa, acumula cido araquidnico (AA) (20:4) y que hasta el 90% del total del AA est depositado en forma de TAGs. Bajo condiciones de deficiencia de nitrgeno, el contenido de cidos grasos alcanz el 35% del peso seco y el AA excedi el 60% de los cidos grasos (Khozin-Goldberg et al., 2002). Recientemente, se describi que a una alta intensidad luminosa, se alcanzaron los ms altos contenidos de cidos grasos totales y que bajo deficiencia de nitrgeno, aument de manera significativa el contenido de AA respecto al total de cidos grasos (Solovchenko et al., 2008). Finalmente, muy pocos estudios sobre la induccin de lpidos por limitaciones de nutrientes se han realizado en condiciones exteriores con reactores a escala piloto. Despus de hacer crecer bajo condiciones limitantes de nitrgeno a dos cepas marinas y a dos cepas de agua dulce, Rodolfi et al., (2009), seleccionaron a Nannochloropsis sp por haber acumulado el 60% de lpidos bajo estas condiciones. En experimentos realizados con fotobiorreactores (FBRs) de 110 litros, se compararon las productividades tanto en medio suficiente de nitrgeno, como en medio deficiente. Se encontr que en el primer medio, esta microalga marina contena 32 % de lpidos, con una productividad de biomasa de 0.36 g L-1 d-1 y una productividad de lpidos de 117 mg L-1 d-1. En contraste, en condiciones limitadas de nitrgeno, el contenido de lpidos aument al 60% y la productividad de lpidos a 204 mg L-1 d-1, aunque la productividad de biomasa disminuy a 0.3 g L-1 d-1. Los autores sealaron que se pueden obtener entre 20 y 30 ton de lpidos por hectrea, aunque estos datos deben considerarse con reserva, dado que la unidad experimental utilizada para generarlos fue de un volumen de 110 litros. Con respecto a la temperatura, se ha observado en muchas algas y cianobacterias que la insaturacin de los cidos grasos se incrementa cuando desciende la temperatura y viceversa, cuando la temperatura aumenta, aumenta la saturacin de los cidos grasos. Con relacin al efecto de la intensidad luminosa, sta influye notablemente en la composicin qumica en general, el contenido de pigmentos y en la actividad fotosinttica. Generalmente, una intensidad luminosa baja induce la formacin de lpidos polares (fosfolpidos y glucolpidos), los cuales estn funcional y estructuralmente asociados a las membranas celulares (Hu et al., 2008).
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En contraste, las altas intensidades luminosas influyen en la disminucin del contenido total de lpidos polares con el concomitante incremento de la cantidad de lpidos de almacenamiento, principalmente triglicridos (Olgun et al., 2001; Khotimchenko y Yakovleva, 2005; Solovchenko et al., 2008). 4.3 Uso de las microalgas como estrategia para la mitigacin del CO2 y el tratamiento de aguas residuales La capacidad de las microalgas para fijar el CO2 es de 10 a 50 veces mayor que la de las plantas terrestres, por tal motivo, las microalgas consumen la mayor cantidad de CO2 en todo el planeta (Wang et al., 2008). Aproximadamente la mitad de la biomasa en peso seco de las microalgas, es carbono derivado del CO2, por lo tanto, por cada tonelada producida de biomasa algal (peso seco), se consumen de 1.3 a 1.8 toneladas de CO2 (Chisti, 2008). La mitigacin del CO2 con microalgas puede ser econmicamente ms rentable y ambien-
talmente sustentable cuando el proceso se combina con otro como el tratamien-to de aguas residuales (Harmelen y Oonk, 2006; Wang et al., 2008). La combinacin del tratamiento de aguas residuales y la fijacin del CO2 con el cultivo de microalgas provee un incentivo adicional debido a la reduccin de compuestos tales como nitratos y fosfatos, ya que las microalgas son capaces de remover eficientemente el nitrgeno y el fsforo as como algunos metales pesados (Mallick, 2002; Olgun, 2003; Larsdotter, 2006; Powell et al., 2008). Por lo tanto, la combinacin del cultivo de microalgas con el tratamiento de aguas residuales incrementa el beneficio ambiental de la mitigacin del CO2, resultando adems en la preservacin de los valiosos recursos hdricos, ya que en muchas ocasiones, el agua residual sin tratar, rica en nitrgeno y fsforo, se vierte a los cuerpos de agua, resultando en la eutrofizacin de ros y lagos y el surgimiento de microalgas nocivas (Wang et al., 2008; Wogan et al., 2008) (Fig. 5).
Figura 5. La produccin de biodiesel a partir de microalgas puede contribuir a la mitigacin de CO2 y al tratamiento de aguas residuales en un proceso rentable y ambientalmente sustentable.
104 El uso de microalgas para tratamiento de diversos tipos de aguas residuales, ha sido objeto de estudios en la ltima dcada (Phang et al., 2000; Grnlund, 2002; Olgun et al., 2003; Olgun, 2003; Bcares, 2006; Hu y Sommerfeld, 2004; Asplund, 2008; Gonzlez et al., 2008; Powell et al., 2008) y ms recientemente con el doble propsito de tratarlas y de producir biomasa algal para la produccin de biocombustibles (Bhatnagar et al., 2010; Johnson y Wen, 2010; Li et al., 2010). Sin embargo, en este ltimo caso, debe tomarse en cuenta que pueden presentarse problemas adicionales tales como contaminacin del cultivo y toxicidad de algunos compuestos presentes en las aguas residuales. 4.4 Seleccin del tipo de reactor ms adecuado para el cultivo de microalgas oleaginosas La produccin de microalgas oleaginosas con el objeto de obtener biodiesel se puede realizar tanto en reactores cerrados, generalmente llamados fotobiorreactores (FBRs) o en reactores abiertos, conocidos como raceways o Lagunas Abiertas (LA) que tienen el mismo diseo que las Lagunas de Oxidacin de Alta Tasa (LOATs) (Fig.6).
Figura 6. Tipos de reactores para el cultivo masivo de microalgas. a) FBR tubular (http://www.ebri.org.uk/index.html); b) FBR tubular (http://www.oilgae.com/); c) Vertical Algae Technology (VAT) (http://www.valcent.net/s/Home.asp); d) FBR tipo placa (http://biofuels.asu.edu/biomaterials.shtml) y e) Lagunas abiertas (LA) tambin conocidas como raceways (http://www.aurorabiofuels.com/).
105 Las LOATs y las LA son de forma elipsoidal con una separacin central que permite formar canales poco profundos en forma de circuito cerrado; se mantienen en agitacin mediante paletas giratorias y en ocasiones, cuentan con mecanismos para suministrar CO2 y nutrientes. Las principales ventajas son el bajo costo de construccin, de operacin y de produccin de biomasa. Sin embargo, tienen varias desventajas: requieren de grandes reas de terreno, sufren importantes prdidas de agua por evaporacin, y de CO2 por difusin a la atmsfera, el sistema de mezclado es deficiente lo que origina una baja concentracin celular, la cual a su vez, origina una baja productividad. sta ltima tambin resulta afectada por contaminacin con otras algas y/o por organismos que se alimentan de microalgas; costosa recuperacin del producto de medios diluidos y dificultad para el control de la temperatura y el pH. Estas desventajas de las lagunas abiertas estimularon el desarrollo de diversos tipos de fotobiorreactores, los cuales son sistemas cerrados que permiten un control ms preciso de las condiciones de cultivo, (Chisti, 2007; Wogan et al., 2008; Ugwu et al., 2008), el cultivo de una sola especie por tiempos prolongados, la obtencin de una alta productividad de biomasa y se puede evitar la contaminacin (MolinaGrima et al., 1999; Ugwu et al., 2008). La mayora de los FBRs expuestos a condiciones ambientales exteriores se caracterizan por tener grandes reas de iluminacin y desde este punto de vista, los tipo placa plana y los tubulares horizontales inclinados son los mejores, excepto por la dificultad de escalamiento, mientras que los de columna de burbujeo, los airlift y el tipo tanque agitado son de fcil escalamiento, pero tienen reas de iluminacin menores respecto al resto de los FBRs (Ugwu et al., 2008). La figura 7 muestra una comparacin de diversos parmetros de diseo y costo entre los fotobiorreactores de tipo placa plana y tubulares, as como de las LA o raceways.
Figura 7. Algunas caractersticas de las Lagunas Abiertas (LA) y los fotobiorreactores de placa plana y fotobiorreactores tubulares (Molina Grima y Acin (2009), comunicacin personal)
106 Por otro lado, es importante mencionar que existen numerosos reportes en la literatura sobre el uso de FBRs para la produccin de microalgas, aunque la mayora son experiencias a nivel laboratorio y muy pocas a nivel de planta piloto (Rodolfi et al., 2009). Las revisiones sobre este tema son diversas. Chisti (2007) favorece el uso de FBRs y sin embargo otros expertos que han tenido aos de experiencias de cultivo de microalgas a escala comercial defienden ampliamente el uso de las lagunas abiertas o raceways (Ben-Amotz, 2009; Benneman, 2008). El debate se centra fundamentalmente en dos aspectos: los FBRs son mucho ms productivos que las LA y permiten controlar mejor las posibles contaminaciones y sin embargo, son mucho ms costosos, lo que impide un costo adecuado de produccin de biomasa (ver seccin de factibilidad econmica). El resultado de esta situacin es que los procesos desarrollados en reactores cerrados no son rentables todava a gran escala y algunas experiencias comerciales de este tipo han fracaso en los ltimos aos (ejemplo: planta en Alemania del Dr. Otto Pulz). De hecho, todas las plantas de produccin de microalgas a gran escala operando actualmente, utilizan LA para la produccin de astaxantina, ferredoxina, beta caroteno y ficocianina (Carvalho et al., 2006) y tambin para produccin de biomasa de Spirulina (Arthrospira) grado consumo humano y acuicultura (Belay, 1997). La figura 8 muestra la produccin de Nannochloropsis sp. a escala comercial para la produccin de biodiesel por la empresa Seambiotics Ltd. (Israel), utilizando lagunas abiertas.
Figura 8. Cultivo de Nannochloropsis sp. en lagunas abiertas (LA) para la produccin de biodiesel en Israel (Seambiotic Ltd.). a) Nannochloropsis sp., b) cultivo en laboratorio, c) cultivo en LOATs, d) co-bio-floculacin, e) cosecha de biomasa, f) Nannochloropsis sp. seca y g) biodiesel. (Ben-Amotz, 2009)
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Tabla 2. Ventajas y desventajas de las lagunas abiertas y los fotobiorreactores para produccin de biomasa algal (Ma, 2009). TIPO DE REACTOR Lagunas Abiertas VENTAJAS Sencillos y baratos de construir Fciles de operar y mantener Alta productividad Menor contaminacin, menor uso de agua y menor prdida de CO2 Mejor utilizacin de la luz y mejor mezclado Control en las condiciones de cultivo DESVENTAJAS Utilizacin deficiente de la luz Luz y temperatura difciles de controlar Contaminacin y evaporacin Costosos y complejos Difcil control de la temperatura Dao celular por turbulencia Deterioro de materiales Deterioro de equipo por corrosin biolgica Acumulacin de oxgeno
Fotobiorreactores
En resumen, las ventajas y desventajas de ambos tipos de reactores se muestran en la tabla 2 (Ma, 2009). Una manera de evitar algunas de las principales desventajas del uso de las lagunas abiertas y de los fotobiorreactores, es optar por un cultivo que integra ambos sistemas, el sistema de cultivo hbrido (Schenk et al., 2008). La combinacin de ambos sistemas es probablemente la eleccin ms adecuada para obtener la mayor productividad tanto de biomasa como de lpidos, ya que la mayora de las microalgas no acumulan biomasa ni producen lpidos de manera simultnea. Este sistema se realiza en dos etapas, en la primera se incrementa la densidad celular y en la segunda se incrementa la acumulacin de lpidos. La primera etapa se lleva a cabo en sistemas cerrados (FBRs), que pueden ser desde simples bolsas de plstico hasta FBRs de alta complejidad. El objetivo en esta etapa, es obtener la mayor densidad celular posible y minimizar el riesgo de contaminacin, bajo condiciones de suficiencia de nutrientes. La segunda etapa se realiza en lagunas abiertas usando el inculo producido en el primer paso y se estimula la biosntesis de lpidos bajo condiciones de limitacin de nutrientes. El resultado esperado es una alta densidad celular y un alto contenido de aceite (Ryan, 2009). Este sistema fue adaptado exitosamente para el cultivo a escala
comercial (2 ha) de Haematococcus pluvialis para la produccin de astaxantina y aceite (Huntley y Redalje, 2007). 4.5 Cosecha de biomasa celular y extraccin de lpidos Se conoce ampliamente que uno de los cuellos de botella y retos a vencer ms importante respecto a la produccin de biomasa microalgal y de metabolitos en particular, consiste en la cosecha y extraccin de los mismos. Incluso, en procesos de tratamiento de aguas con microalgas, el costo de la cosecha determina la viabilidad econmica de todo el proceso (Olgun, 2003). Se considera en general que los problemas bsicos son: a) el tamao de las microalgas (entre 3 y 30 m); b) el que los cultivos tienen una densidad celular relativamente baja, especialmente en las lagunas abiertas (< 0.5 kgm-3 de biomasa seca) y se requiere cosechar grandes volmenes de lquido y c) que el costo de la cosecha contribuye de una manera muy importante (del 20 al 40%), al costo total de produccin de la biomasa. En el caso de algunos metabolitos o nutracuticos de alto valor agregado como el cido eicosapentanoico (EPA en ingls), el costo de recuperacin asciende a 60% del costo total de produccin (Molina Grima et al., 2003).
108 Los mtodos ms comunes de cosecha de la biomasa algal incluyen centrifugacin (especialmente en el caso de las microalgas unicelulares), filtracin cuando se han formado flculos o se trata de microalgas o cianobacterias relativamente grandes o filamentosas y en algunos casos, sedimentacin por gravedad, flotacin o tcnicas de electroforesis. Sin embargo, la centrifugacin es el proceso ms costoso y generalmente se aplica slo cuando se recuperan metabolitos de alto valor agregado (Uduman et al., 2010). En consideracin a que la mayora de las microalgas oleaginosas son pequeas o no filamentosas, la filtracin no es un mtodo fcilmente aplicable a la produccin de biodiesel a partir de microalgas. En contraste, en la actualidad, la floculacin con ciertas modificaciones a la floculacin tradicional que utiliza sales metlicas que contaminan la biomasa, est siendo investigada por diversos grupos de investigacin. La recuperacin de biomasa microbiana por floculacin, se basa en el hecho de que la superficie de todas las bacterias, cianobacterias y microalgas estn cargadas negativamente debido a la presencia de polisacridos extracelulares (Lee et al., 2009). En el caso de las cianobacterias, se ha determinado que los polisacridos extracelulares son heteropolmeros aninicos complejos que en su mayora contienen cido urnico y otras molculas peptdicas, radicales acetilo, pirvico o derivados sulfatados (De Philippis et al., 2001). Sin embargo, la mayora de los mtodos de floculacin no son adecuados para la cosecha de biomasa algal para la produccin de un bien de bajo costo como el biodiesel, y algunos de ellos muestran interferencia con el agua de mar (Lee et al., 2009). En consideracin a estos aspectos, se desarroll un proceso para la recuperacin de la microalga marina Pleurochrysis carterae, del grupo de los cocolitofridos, en el que se utilizaron compuestos carbonados de fcil disponibilidad, tales como el acetato, el glicerol y la glucosa para cultivarla y promover la formacin de polisacridos extracelulares y la floculacin de las clulas. El proceso es prometedor dado que se encontraron buenos porcentajes de recuperacin de ms del 90% y un factor de concentracin de 226 (Lee et al., 2009). Por otro lado, Vandamme et al. (2010), reportaron que el uso de almidn catinico fue muy eficiente para flocular microalgas de agua dulce (Parachlorella, Scenedesmus) pero no para flocular microalgas marinas (Phaeodactylum, Nannochloropsis). Adems, encontraron que de los floculantes de tipo de almidn catinico disponibles en el mercado, el Greenfloc 120 fue ms eficiente que el Cargill C*Bond. Por otro lado, se ha recomendado el uso de otros procesos no convencionales para la recuperacin a bajo costo de Chlorella para produccin de biodiesel. Johnson y Wen ( 2010) reportaron el cultivo de esta microalga sobre una superficie de espuma de poliestireno, logrando una productividad de biomasa de 25.65 gm-2 en base seca y un rendimiento de cidos grasos de 2.31 gm-2 a escala laboratorio. Aunque este mtodo no convencional parece prometedor, faltan estudios a mayor escala en los que se resuelva de manera viable el raspado de las placas de poliestireno que se colocan en la base de las superficies de cultivo. En relacin a la extraccin de los lpidos intracelulares, este proceso se puede realizar con o sin rompimiento celular previo. El rompimiento celular puede llevarse a cabo por mtodos tradicionales como el uso de la prensa francesa que utiliza altas presiones o por un mtodo ms moderno que es la electroporacin, en el cual se aplica un campo elctrico a las clulas para lograr perforaciones en su pared celular. La extraccin de los lpidos se puede realizar con solventes qumicos en una o dos etapas
109 (Schenk et al., 2008). Tran et al. (2009), evaluaron cinco mtodos diferentes ya descritos en la literatura y concluyeron que el ms adecuado para extraer los lpidos de Botryococcus braunii y de Synechocystis sp., fue un mtodo de un solo paso con derivatizacin para formar metil steres in situ. Recientemente, se describi el uso exitoso de solventes de polaridad intercambiable (switchable-polarity solvents (SPS) para extraer los lpidos de Botryococcus braunii (Samori et al., 2010). La mezcla DBU/octanol mostr los rendimientos de recuperacin ms altos, tanto de clulas liofilizadas como de muestras lquidas (16% and 8.2% respectivamente), en comparacin con extraccin con n-hexano (7.8% y 5.6%, respectivamente). Es importante mencionar que la extraccin con solventes no es amigable con el ambiente, especialmente por las emisiones a la atmsfera y por la disposicin final del mismo. En consideracin a lo anterior, se han desarrollado mtodos alternativos de extraccin tales como el Proceso de Extraccin Acuosa (AEP en ingls), el cual ofrece las ventajas de una inversin menor de capital, una operacin ms segura y una produccin simultnea de aceite y de fracciones ricas en protena con menos dao. Ms an, se han utilizado diversas enzimas para mejorar la extraccin de lpidos en este tipo de proceso, alcanzando porcentajes de recuperacin hasta del 90% (de Moura et al., 2008). Por otro lado, en relacin a las reacciones de transesterificacin por va enzimtica, se ha descrito que el uso de lipasas comerciales (Novozymes) de origen microbiano y en especial la lipasa N435 obtenida de Candida antarctica e inmovilizada en soporte hidrofbico, fue la ms eficiente tanto en el sistema libre de solvente como en el sistema con terbutanol como solvente, para la transesterificacin de cidos grasos de origen animal (Rivera et al., 2009).
5. Factibilidad econmica de la produccin de biodiesel a partir de microalgas

La factibilidad econmica de este producto est en funcin del precio del petrleo, dado que el diesel del petrleo es el principal producto con el que tiene que competir. Los costos del barril de petrleo han sido muy variables en los dos ltimos aos puesto que han estado sujetos a las presiones de la economa internacional. La OPEP ha previsto que el consumo de crudo se mueva al alza, tras 2 aos consecutivos de descensos y alcance los 85.13 millones de barriles por da y ha insistido en considerar aceptable un precio de 75 a 85 dlares por barril para el 2010. De hecho, el precio del petrleo crudo de Texas alcanz los $ 82.50 dlares por barril el 18 de Marzo del 2010 (Preciopetroleo.net). Dentro de este escenario, en el que los precios del petrleo estn al alza, la viabilidad del biodiesel a partir de microalgas es ms factible. Sin embargo, la limitante principal contina siendo el costo de la produccin de biomasa como lo han indicado previamente varios autores (Chisti, 2008; Schenk et al., 2008; Rodolfi et al., 2009; Garibay et al., 2009). Esta es la razn por la cual ninguna de las 50 empresas que han surgido para producir este tipo de biodiesel, lo producen an a escala comercial y a costos competitivos (Pienkos y Darzin, 2009). Dentro de este contexto, la mayora de los trabajos que han evaluado esta situacin a nivel internacional (revisado por Milledge, 2010), coinciden en dos puntos como requisitos esenciales para que este proceso sea competitivo: a) El costo de produccin de la biomasa debe ser menor a $ 1.00 dlar/kg de biomasa microalgal.
110 b) Se deben producir simultneamente una serie de co-productos de alto valor agregado a partir de la biomasa residual que queda despus de la extraccin del aceite, del tipo de los nutraceticos, fertilizantes y metano. Esto favorece el concepto de Biorefinera en la que se generan varios co-productos, adems del biodiesel. Finalmente, se recomiendan los siguientes aspectos a tomar en cuenta tanto en el diseo de procesos, como en la evaluacin de su factibilidad econmica: a) Utilizar datos reales resultados de la experimentacin con relacin al contenido de lpidos en la cepa a utilizar. Es muy comn encontrar en la literatura, especialmente en la de divulgacin y de mercadotecnia de empresas, cifras no realistas con relacin a este parmetro. b) No realizar proyecciones de gran escala utilizando datos de pequea escala a nivel laboratorio. Por lo anterior, deben favorecerse los financiamientos para llegar a produccin de planta piloto o de gran escala. c) Considerar que a gran escala, los fotobiorreactores presentan numerosos problemas de operacin. En contraste, los cultivos a escala comercial de las tres especies de microalgas que ya se han explotado desde hace algunas dcadas Spirulina (Arthrospira), Dunaliella y Chlorella, se realizan en lagunas abiertas (Borowitzka, 2006). d) Considerar que los fotobiorreactores (FBRs), todava no son una opcin rentable de acuerdo al estudio de factibilidad econmica de la produccin de biodiesel a partir de microalgas realizado por Gao et al. (2009). En dicho estudio se compararon los costos de produccin de la biomasa tanto en fotobiorreactores (FBRs) cerrados como en lagunas abiertas (LA) y se consideraron una serie de variables que permiten disminuir los costos de produccin del biodiesel como producto final, incluso el uso del incentivo de produccin de biodiesel que se ofrece en los Estados Unidos (biodiesel tax credit). La conclusin fue que la produccin en FBRs cerrados, an con consideraciones de altsimos rendimientos de biomasa (60% por arriba de los actuales reportados), una disminucin del 50% en el costo de inversin y otra de 50% por reciclar el hexano utilizado durante la transesterificacin, es 16.5 veces ms costoso que la opcin ms competitiva de produccin de biodiesel utilizando LA. En esta ltima, se consider un 30% de aumento en la productividad de la biomasa respecto a los sistemas actuales y que el costo del CO2 es mnimo ($0.2 dlares/kg). En estas condiciones, el costo del galn de biodiesel en trminos de equivalentes de energa fue de $ 0.94 dlares (Tabla 3).
Tabla 3. Costo de biodiesel de microalgas en distintos escenarios, utilizando dos sistemas de produccin: fotobiorreactores cerrados (FBRs) y lagunas abiertas (LA) o raceways (Gao et al., 2009) Aumento del Costo del Tipo de sistema Rendimiento Costo del CO2/kg biodiesel algal actual (%) EE1 $/gal Cerrado (50% costo de inversin, 50% 60 n.a. 16.54 recuperacin de hexano) Abierto 15 n.a 4.46 Abierto 20 n.a 3.24 Abierto 30 n.a 2.02 Abierto 0.0 $0.2 2.29 Abierto 20 $0.2 1.61 Abierto 30 $0.2 0.94 1 n.a. no aplica; EE: Equivalentes de Energa
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6. Comentarios finales
La produccin de biodiesel a partir de microalgas ha pasado por diversas etapas desde hace varias dcadas. El auge acadmico que mostr desde los aos ochentas se ha incrementado en la ltima dcada, atrayendo cada vez a un mayor nmero de investigadores de todo el mundo. Por otro lado, el surgimiento de numerosas compaas privadas interesadas en invertir en este nuevo tipo de bioenergtico es reciente, aunque registra un crecimiento intenso y cada ao existen numerosos foros y reuniones para promover la inversin en la investigacin y desarrollo de este tipo de biodiesel. Los retos cientficos y tecnolgicos que se requieren vencer para lograr disminuir los costos de produccin de biomasa algal, as como de produccin de biodiesel a costos competitivos, estn relacionados a dar respuestas creativas y rentables para lograr: a) aumentar la productividad de biomasa microalgal con el mayor contenido de lpidos del perfil adecuado; b) lograr mayores rendimientos de biomasa microalgal en reactores que ofrezcan costos de inversin y de operacin competitivos; c) disear nuevos procesos de cosecha de biomasa por medio de biofloculacin o uso de cepas con capacidades intrnsecas de autofloculacin; d) optimizar mtodos de extraccin de lpidos y de su transesterificacin, que permitan mayores rendimientos a menores costos; e) disear nuevos procesos para la generacin de co-productos de alto valor agregado. Finalmente, an falta mucho por recorrer en el campo de la verdadera vinculacin para que los empresarios, tanto nacionales como extranjeros, inviertan en grupos de investigacin de pases en vas de desarrollo. El apoyo de las entidades gubernamentales ms relacionadas a esta temtica se hace
imprescindible para lograr que los grupos de investigacin avancen en sus desarrollos y se puedan llevar a cabo evaluaciones tcnicoeconmicas a una escala piloto o semiindustrial. Tambin sera muy deseable que las compaas que buscan aprovechar las condiciones climticas favorables de pases en el continente americano al sur de Estados Unidos, estn dispuestas a compartir la propiedad intelectual con los investigadores latinoamericanos. Otro factor de gran importancia que debe surgir, es la generacin de nuevas polticas pblicas a nivel nacional e internacional para el fomento de la I & D no slo en la produccin de biodiesel, sino de biodiesel a partir de microalgas.
Agradecimientos
Maribel M. Loera-Quezada es becaria del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, CONACYT-Mxico para realizar su Doctorado en Ciencias en el INECOL, A.C., Eugenia J. Olgun agradece el apoyo del INECOL, A.C. para realizar esta lnea de investigacin.
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Spirulina (Arthrospira) platensis en la prevencin del fotodao celular producido por luz ultravioleta en ratones CF1
Luca Lpez-Agero1, Mnica M. Storni1, M. Cristina Zaccaro1, Ana M. Stella2 y Gloria Zulpa1*.
Laboratorio de Fisiologa Vegetal y Biologa de Cyanobacteria, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Intendente Giraldes 2620 CP 1428, Ciudad Autnoma de Buenos Aires, Argentina. 2 Laboratorio de Ecoporfirinas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET)
* 1
Autor de correspondencia: cyanob@bg.fcen.uba.ar
Resumen
El fotoenvejecimiento ocurre por exposicin a radiaciones solares de longitudes de onda del ultravioleta (UV), debido a la liberacin de un exceso de radicales libres, los cuales pueden producir la ruptura del DNA, daar los lpidos de las membranas celulares e interferir con el funcionamiento celular. En la bsqueda de compuestos bioactivos capaces de reducir el aumento en la produccin de radicales libres, originado por el estrs medioambiental, se ha sealado a las cianobacterias como fuente de numerosas sustancias bioactivas. El objetivo del presente trabajo ha sido evaluar el efecto protector de Spirulina (Arthrospira) platensis en ratones expuestos a luz UVC. Ratones hembras adultas CF1, fueron tratados con S. (Arthrospira) platensis como complemento dietario y aplicacin sobre la piel del extracto crudo etanlico de biomasa, e irradiados diariamente. Los ratones se pesaron semanalmente y al final de los tratamientos se extrajo sangre en la cual se determin la actividad de creatina cinasa (ATP creatina Nfosfotransferasa, EC2.7.3.2) en plasma heparinizado y se realizaron cortes histolgicos de la piel para evaluar el dao celular. La actividad de creatina cinasa, que aument por efecto del UVC, disminuy un 49.44% con respecto al control, cuando se aplica a la piel con 100 L de extracto crudo etanlico de S. (Arthrospira) platensis. En tanto que administrada como complemento dietario, disminuy la actividad de creatina cinasa en un 27.21%. En conclusin, ambos tratamientos disminuyeron el fotodao manteniendo la integridad de la epidermis e incrementando el nmero de folculos pilosos que en algunos casos dan origen a pelos dobles o triples lo cual indica que S. (Arthrospira) platensis es una fuente promisoria de productos naturales con efecto antienvejecimiento. Palabras clave: cianobacteria, Spirulina (Arthrospira) platensis, creatina cinasa, ratones, fotodao.
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Abstract
Exposition to solar light may cause photoaging, due to the production in excess of free radicals, responsible for the DNA molecule rupture, cellular membrane lipid damage and cellular metabolism interference. In the search of new bioactive compounds capable of reducing the free radicals produced by environmental stress, Cyanobacteria have been cited as a source of a variety of promising substances. The aim of this work is to evaluate the protective effect of Spirulina(Arthrospira) platensis on mice exposed to UVC light. Female adult mice CF1 were given S. (Arthrospira) platensis as dietary supplement or treated with biomass ethanolic crude extract topical formulation, and were daily irradiated. Mice were weighted every week. In order to evaluate the cellular damage, at the end of the experiment, creatin kinase (ATP creatin kinase N-phosphotranferase, EC 2.7.3.2) activity was determined in heparinized plasm and histological slices of the skin were prepared. Creatin kinase activity increased with UVC radiation and decreased by 49.44% compared with the control when the skin was treated with 100 S. (Arthrospira) platensis ethanolic crude extract. Given as dietary supplement, S. (Arthrospira) platensis decreased creatin kinase activity by 27.21%. Both treatments decreased the photodamage keeping the epidermal integrity and increasing the number of hair follicles which occasionally produced double or triple hairs indicating that S. (Arthrospira) platensis is a promising source of natural compounds with anti-aging effect. Keywords: Cyanobacteria, Spirulina (Arthrospira) platensis, creatin kinase, mice, photodamage.
1. Introduccin
Los rayos ultravioleta lesionan los queratinocitos, melanocitos y fibroblastos cutneos porque provocan la liberacin de radicales libres, los cuales pueden producir la ruptura del ADN, daar los lpidos de las membranas celulares e interferir con el funcionamiento celular (Herschenfeld y Gilchrest 1998). En consecuencia, la exposicin repetida a la luz solar produce daos en la piel tales como arrugas, manchas y textura engrosada, y tambin alteraciones enzimticas, dando como resultado su envejecimiento. Este fotoenvejecimiento ocurre por exposicin a radiaciones solares ultravioleta (UV) que se clasifican en ultravioleta A (UVA) de 320 a 400 nm, ultravioleta B (UVB) de 280 a 320 nm y ultravioleta C (UVC) de 100 a 290 nm. Las longitudes de onda entre 340 y 400 nm tienen efecto a nivel de dermis y actan sinrgicamente con los rayos UVB en el fotoenvejeci-miento y en la carcino-
gnesis. El UVC es el principal agente de la carcinognesis, y puede producir adems quemaduras severas. La radiacin UVC puede ser un problema para las personas que viven a gran altura sobre el nivel del mar, o en zonas con alta polucin donde la capa de ozono est disminuida (Ke et al., 2008). Existe un especial inters por encontrar una fuente natural que produzca compuestos bioactivos capaces de reducir el aumento en la produccin de radicales libres originado por el estrs medioam-biental, en particular por luz UV. En la bsqueda de este tipo de compuestos se ha sealado a las cianobacterias como fuente de numerosas sustancias bioactivas, tales como fitorreguladores con actividad de citocininas (rdg y Pulz, 1996) que ejercen efecto antienvejecimiento y regulan la divisin celular (Kieber, J. 2006). Tal es el caso de la citocinina sinttica cinetina, que agregada a cultivos de piel humana, retrasa la aparicin de caractersticas asociadas con el envejecimiento celular, evitando el dao oxidativo y
119 glioxidativo de las protenas y el ADN (Arcuri, 2001; Hipkiss, 2001; Rattan, 2002). El objetivo del presente trabajo ha sido evaluar el efecto protector de Spirulina (Arthrospira) platensis (Cianobacteria) bajo la forma de complemento dietario o aplicacin cutnea, en ratones expuestos a luz UVC. 2.2 Ratones CF1 Hembras adultas crecidas y mantenidas en el Bioterio de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (Universidad de Buenos Aires). 2.3 Diseo experimental 36 ratones CF1 de 6 meses (31.31 2.21 g cada uno), se dividieron en 6 grupos de 6 ratones cada uno y se alojaron en jaulas individuales. Fueron alimentados durante 30 das con producto comercial balanceado con/sin complemento dietario y agua ad libitum segn correspondiera, recibiendo diariamente los siguientes tratamientos: I. Dieta Comercial (DC) II. DC+ irradiacin con UVC. III. DC+ irradiacin con UVC+flancos derecho e izquierdo depilados (1 cm2) IV. DC+ irradiacin con UVC+flancos derecho e izquierdo depilados (1cm2) +aplicacin cutnea de cada flanco con 100 L de extracto etanlico de S. platensis. V. DC+1.5 mg de S. platensis como complemento dietario VI. DC+1.5 mg de S. platensis como complemento dietario+irradiacin con UVC En los tratamientos con irradiacin (5 minutos) se utiliz una lmpara Philips, 4W/G4 T5 Holland., = 280 nm, colocada a 20 cm de distancia de los animales. 2.4 Parmetros morfolgicos y bioqumicos Los ratones se pesaron semanalmente. Para evaluar el dao celular al finalizar los tratamientos se extrajo sangre por puncin ocular y se dos la actividad de creatina cinasa (CC): ATP creatina Nfosfotransferasa, EC2.7.3.2 en plasma heparinizado, por el mtodo UV optimi-zado (CC-NAC: creatina cinasa activada por Nacetil cistena), con reactivos Wiener Laboratorios SAIC-Argentina. 2.5 Cortes histolgicos A los 30 das de tratamiento los ratones fueron anestesiados con ter etlico y luego
2. Materiales y mtodos
2.1 Cepa cianobacteriana y obtencin de biomasa Spirulina (Arthrospira) platensis (Cianobacteria) pertenece a la coleccin de cultivos del Laboratorio de Fisiologa Vegetal y Biologa de Cyanobacteria, depositada en Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, adquirida comercialmente. Fue cultivada en un fotobiorreactor de 2 L de capacidad bajo un sistema semi-continuo, en medio Zarrouk (1966). El cultivo fue mantenido con luz fluorescente a 45 mol fotn m-2 s-1 (Quantum Radiometer Photometer, modelo LI-185B; Li-Cor, Lincoln, Nebraska 68504, USA), y un fotoperodo de 12:12, aireacin estril y a temperatura controlada a 37C. Cada 15 das se retir 1L de cultivo y se complet el nivel con adicin de medio fresco. Para corroborar que el material biolgico
se encontraba en el mismo estado fisiolgico se hicieron evaluaciones bioqumicas y de crecimiento. Valores promedio: densidad
ptica promedio a 620 nm: 0.168+0.003; peso fresco promedio en g/100 mL de cultivo: 10.00+1.476; peso seco promedio en g/100 mL de cultivo: 0.829+0.001 y protenas totales en mg/mL de cultivo 0.175
+ 1.60.
La biomasa de S. platensis obtenida fue separada del medio de cultivo por filtracin, secada al aire, pulverizada y fraccionada en dosis para ser usada como complemento dietario. Con una alcuota de biomasa fresca se prepar el extracto crudo etanlico (Zulpa de Caire et al., 1990, modificado).
120 sangrados. Para el estudio de cortes histolgicos seriados se obtuvieron muestras de piel de todos los tratamientos (de la parte depilada en el caso de los trata-mientos 3 y 4). Dichas muestras fueron fijadas con formaldehdo 4% en (solucin amortiguadora) 0.1M fosfato para realizar cortes de cristato, coloreados con el Tricrmico de Masson (Ibaez et al., 2007) y posteriormente observadas al microscopio ptico (20x). 2.6 Anlisis estadstico El diseo experimental fue completamente aleatorio con las repeticiones correspondientes en cada caso (n=6). Los datos fueron sometidos a un anlisis de varianza (ANOVA) y para detectar diferencias entre tratamientos y entre diferentes tiempos se us la prueba de Tukey HDS (p<0.05). izquierdo depilados (1cm2) + aplicacin cutnea en cada flanco con 100 L de extracto etanlico de S. platensis), con respecto a los controles irradiados (II y III). En el tratamiento V (DC+1.5 mg de S. platensis como complemento dietario), la actividad de creatina cinasa no muestra diferencia significativa con respecto al tratamiento I; mientras que en el tratamiento VI (DC+1.5 mg de S. platensis como complemento dietario + irradiacin con UVC), la actividad de creatina cinasa disminuye un 27.21% con respecto al tratamiento II. Los estudios histolgicos muestran que en el tratamiento I la piel est completamente recubierta por la epidermis (Figura 1). Los folculos pilosos son cortos, no pasan al celular subcutneo, encontrndose posiblemente en la fase de catagen o telogen (Cotsarelis, 2006). En contraste, la irradiacin con UVC (tratamiento II) provoca la prdida de epidermis, observndose zonas de dermis desnuda. Los folculos pilosos se encuentran en una etapa aparentemente regresiva, muchos incluso carecen de pelo (Figura 2). En el tratamiento III, que difiere del II por los flancos depilados, se observa lo mismo que en el caso anterior (Figura 3). En el tratamiento IV en el que la piel depilada est protegida por una aplicacin con extracto de S. platensis, la epidermis est conservada a pesar de la irradiacin mostrando ms folculos que en los especmenes no tratados. El extremo basal del folculo parece tener una forma diferente y se aproxima al celular subcutneo; lo cual podra ser el comienzo de anagen. Se observan folculos con pelos dobles o triples (Figura 4). Los animales que recibieron S. platensis como complemento dietario no mostraron diferencias con el tratamiento I (Figura 5). La epidermis est conservada. Los folculos pilosos son cortos, no pasan al celular subcutneo, en tanto que en el tratamiento VI donde los
3. Resultados
Los tratamientos aplicados durante los 30 das del experimento no modificaron el peso corporal de los ratones adultos CF1 verificndose solamente alteraciones en el metabolismo y en la piel. Para evaluar el dao celular se determin la actividad de creatina cinasa en plasma de sangre heparinizada de los ratones para cada tratamiento (Tabla 1). La actividad de la enzima aument un 28.59% en el tratamiento II (DC+irradiacin con UVC) respecto del control I (DC). El dao celular medido por la enzima creatina cinasa fue mayor, con un 41.86%, en el tratamiento III (DC+irradiacin con UVC+flancos derecho e izquierdo depilados, 1 cm2) con respecto al control I (DC). La depilacin de los flancos derecho e izquierdo acenta en un 10.32% el aumento de la enzima con respecto al tratamiento II no rasurado. Por otra parte, la actividad de creatina cinasa disminuye un 44.23 y 49.44% en el tratamiento IV (DC+ irradiacin con UVC+flancos derecho e
121 animales son irradiados con luz UVC, los folculos se encuentran en fase de crecimiento (anagen), son ms largos y tienen un bulbo muy desarrollado, adems de mostrar una epidermis completa (Figura 6).
Tabla 1: Actividad enzimtica de creatina cinasa (U/L) en plasma heparinizado de ratones bajo tratamientos del I al VI. TRATAMIENTOS III IV 69.23+0.45 c 35.00+0.35 a
I 48.80+0.35a
II 62.75+0.50 b
V 44.71+0.46 a
VI 45.67+0.28 a
Tratamientos: I. Dieta Comercial DC; II. DC+5 min diarios de irradiacin con UVC; III. DC+5 min diarios de irradiacin con UVC con flancos derecho e izquierdo depilados; IV. DC+5 min diarios de irradiacin con UVC con +flancos derecho e izquierdo depilados + aplicacin cutnea en cada flanco con extracto etanlico 100 L de S(Arthrospira) platensis ; V. DC+1.5mg de S.(Arthrospira) platensis como suplemento dietario; VI. DC+1.5mg de S. (Arthrospira) platensis como suplemento dietario+5 min diarios de irradiacin con UVC. Diferentes letras indican diferencias significativas (p< 0.05).
Figura 1. Corte histolgico de piel de ratones CF1 del Tratamiento I.
Figura 2. Corte histolgico de piel de ratones CF1 del Tratamiento II.
Figura 3. Corte histolgico de piel de ratones CF1 del Tratamiento III.
Figura 4. Corte histolgico de piel de ratones CF1 del Tratamiento IV.
122
Figura 5. Corte histolgico de piel de ratones CF1 del Tratamiento I.
Figura 6. Corte histolgico de piel de ratones CF1 del Tratamiento IV.
4. Discusin
Se sabe que niveles altos de creatina cinasa indican una alteracin del funcionamiento celular que puede darse por diversos factores tales como la edad, el gnero, la raza, la masa muscular, la actividad fsica y la condiciones ambientales (Brancaccio et al., 2008). Si bien en la bibliografa consultada no se consignan datos referentes a la relacin entre los niveles de CC y tratamientos con S.(Arthrospira) platensis, hemos obser-vado, en las condiciones de nuestro experimento, que tanto la ingesta de S. (Arthrospira) platensis como la aplicacin de sus productos intracelulares protegen contra el fotodao. Este efecto podra deberse a la presencia en S. (Arthrospira) platensis de sustancias con actividad biolgica, tales como: reguladores del crecimiento vegetal, carotenos, vita-minas, etc. (Zulpa de Caire et al., 1979; Kapoor y Mehta, 1993). El efecto benfico se verifica tambin en los estudios histolgicos realizados, que muestran resultados similares a los inferidos por actividad de la CC.
contra el fotodao, medido por la actividad de la enzima CC indicadora de dao celular. As, S. (Arthrospira) platen-sis produce sustancias con efecto benfico dando proteccin a la epidermis y favore-ciendo el incremento del nmero de folculos pilosos que en algunos casos dan origen a pelos dobles y triples. Finalmente, los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigacin indica que S. (Arthrospira) platensis es una fuente promisoria de productos naturales con efecto antienvejecimiento.
Reconocimientos
Dra ngela Suburo, Universidad Austral, Argentina. (CONICET), por la realizacin e interpretacin de los cortes histolgicos. Wiener Laboratorios SAIC-Argentina, por la gentil donacin de los reactivos utilizados en la determinacin de la actividad enzimtica. Este trabajo ha sido realizado en el marco del subsidio UBACYT X844, de la Universidad de Buenos Aires, Argentina.
Referencias 5. Conclusiones
Tanto la ingesta de S. (Arthrospira) platensis como la aplicacin cutnea con extracto crudo etanlico de la biomasa protegen
Arcuri, A.M. 2001. N6 furfuryladenina. Dermac 1:42-43. Brancaccio, P., Maffulli, N., Buonauro, R., Limongelli, F.M. 2008. Serum enzyme
123
monitoring in sports medicine. Clinical J Sports Medicine 27(1):1-18. Cotsarelis, G. 2006. Epithelial stem cells: A folliculocentric view. J Invest Dermatol 126:1459-1468. Herschenfeld, R.E., Gilchrest, B.A. 1998. The accumulative effects of ultraviolet radiation on the skin: photoageing. In: Hawk, J.L.M. (Ed) Photodermatology. Oxford University Press. New York, USA. pp 69-87. Hipkiss, A.R. 2001. On the struggle between chemistry and biology during aging. Implications for DNA repair, apoptosis and proteolysis, and a novel route of intervention. Biogerontology 2(3):173-178. Ibaez, J., Sosa, F., Vern, G., Vadillo, C., Aguirre, J., Navarro, S., Acevedo, S. 2007. Falso seudoaneurisma del ventr-culo izquierdo. Rev Argent Cardiol 75(5):21-23. Kapoor, R., Mehta, U. 1993 Utilization of carotene from Spirulina platensis by rats. Plant Food Hum Nutr 43:1-7. Ke, M.S., Camouse, M.M., Swain, F.R., Oshtory, S., Matsui, M., Mammone, T., Maes, D., Cooper, K.D., Stevens, S.R., Baron, E.D. 2008. UV protective effects of DNA repair enzymes and RNA lotion. Photochem Photobiol 84(1): 180-184. Kieber, J. 2006. Cytokinins: Regulators of cell division. In: Taiz, L., Zeiger, E. (Eds.) Plant Physiology. Sinauer Associates, Inc., Publishers, Sunder-land, Massachusetts. pp. 543-569. rdg, V., Pulz, cytokinin-like Arthronema determined by 82:57-67. O. 1996. Diurnal changes of activity in a strain of africanum (Cyanobacteria), bioassay. Algological Studies
Rattan, S.I.S. 2002. N6-Furfuryladenine (kinetin) as a Potential Anti-Aging Molecule. J AntiAging Med 5(1):113-116. Zarrouk, C. 1966. Contributin ltude dune Cyanophyce. Influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthse de Spirulina maxima (Setch et Garner) Geitler. Tesis PhD Universidad de Pars, Francia. 198 p. Zulpa de Caire, G., Zaccaro de Mul, M.C., Storni de Cano, M. 1979. Productos extracelulares de Nostoc muscorum Ag. (cepa 79 a) obtenidos en medios con y sin nitrgeno combinado. I: sus efectos sobre plntulas de arroz. Int J Exp Bot(Phyton) 37(1):1-13. Zulpa de Caire, G., Storni de Cano, M., Zaccaro de Mul, M.C., Halperin, D.R. de. 1990. Antimycotic products from the Cyanobacterium Nostoc muscorum against Rhizoctonia solani. Int J Exp Bot (Phyton) 51(1):1-4.

02 Revista Latinoamericana de Biotecnologia Ambiental y Algal

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Cdula de integracin No. 00000-354. Folio No. 00000-355 Reserva 04-2009-062211101200-102

Revista Latinoamericana de Biotecnologa Ambiental y Algal RELBAA

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Gloria Snchez Galvn

Ever Morales Avendao

Hugo Moreira Soares

Mara Elizabeth Hernndez Alarcn

Juan Jos Pea Cabriales

Bertha Olivia Arredondo Vega

Adriana Matiz Villamil

scar Monroy Hermosillo

Mnica Cristina Rodrguez Palacio

Jorge Luis Folch Mallol

Marcia Morales Ibarria

Jorge Gmez Hernndez

Leopoldo Naranjo Briceo

Mariano Gutirrez Rojas

Adela Irmene Ortiz Lpez

Produccin Editorial R.E. Gonzlez-Portela y M.M. Loera-Quezada

REVISTA LATINOAMERICANA DE BIOTECNOLOGA AMBIENTAL Y ALGAL // INSTITUTO DE ECOLOGA, A.C.

Revista Latinoamericana de Biotecnologa Ambiental y Algal RELBAA

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Artculos originales de investigacin

Author of correspondence: pacheco@uabcs.mx

2. Materials and methods

118.4 4.8 1000.0 gL

59.2 2.4 500.0 gL

29.6 1.2 250.0 gL

8.6 19.6 44.0 20.0 360.0 126.0 mg L

4.3 9.8 22.0 10.0 180.0 63.0 mg L

2.1 4.9 11.0 5.0 90.0 31.5 mg L

8.6 19.6 44.0 20.0 360.0 126.0 mg L

4.3 9.8 22.0 10.0 180.0 63.0 mg L

2.0 2.0 40.0

1.0 1.0 20.0

0.5 0.5 10.0

2.0 2.0 40.0

1.0 1.0 20.0

Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 10

Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 11

29.04 bc 0.41 ab 0.47 a 4.69 34.61

32.15 ab 0.37 b 0.19 b 1.09 b 33.80

36.11 a 0.18 b 0.08 c 0.13 c 36.51

27.98 bc 0.65 ab 0.18 b 0.81 a 29.62

33.39 ab 0.29 b 0.06 c 0.17 c 2.11 a 36.02

27.85 bc 0.14 b 0.46 b 28.45

3.96 a 5.50 ab 1.07 0.23 c trace 4.06 e 4.06

3.30 b 4.35 b 0.17

1.04 c 0.81 c 1.11

2.21 b 6.77 0.52 4.80 b 4.80

1.58 c 3.95 b 0.44

0.73 c 0.89 c 1.14 a 0.43 b 0.18 a 0.13 d 1.12 f 1.25 4.62

0.71 a trace 1.24 b 7.41 a 8.65

0.34 bc 0.03 b 0.50 c 0.99 d 1.49

0.95 a trace 0.26 c 4.58 c 0.94 5.78 12.70

Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 12

Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 14

Pacheco et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):6-15 15

Perez et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):16-30

16 Artculo original de investigacin

Autor de correspondencia: aaperez@sinectis.com.ar

Perez et al., 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal 1(1):16-30