ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por Inmunoabsorcin Ligado a Enzimas) es una tcnica de inmunoensayo

en cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran nmero de variables, tales como seleccin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba. La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:

En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente est enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originara un falso positivo. En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que estos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sera el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infeccin en el momento de realizar la prueba, o que estn infectadas por una cepa extraa. En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antgeno-anticuerpo.

En estos casos de diagnstico de enfermedad, es recomendable la eliminacin (mediante centrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y puedan ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquel de especificidad. Tambin, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada poblacin es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha poblacin, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro mtodo de diagnstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultneamente, frente a la misma infeccin en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes estn presentes en el sujeto frente a esa infeccin. Es entonces cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.

Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil, robusto y simple en su realizacin, mediante el uso de la fase slida, una separacin fcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre. Adems se han propuesto y desarrollado diferentes mtodos de amplificacin de la seal (luminiscentes, cascadas enzimticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

Dispositivos empleados en ELISA[editar]

Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes hasta las actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado, para aumentar su capacidad de adsorcin (en su superficie) de molculas, y con fondos de pocillo pticamente claros que permitan realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos, espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se estn desarrollando dispositivos de mayor capacidad por ejemplo, con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de screening masivo de los sistemas robotizados (HTS, High-throughput system).

Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que solo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda; son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms comnmente utilizados.

Fases de un ensayo ELISA[editar]

Las cuatro fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima o antgeno-enzima ha de producirse durante un determinado perodo de tiempo en aras de producir una solucin coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se d la reaccin, no se evidenciar ningn color, interpretndose este resultado como un falso negativo y disminuyendo la sensibilidad de la tcnica. 2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antgeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antgeno, el exceso dar lugar a una reaccin falsa negativa. 3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa, se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubacin para evitar la aparicin de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrir la interaccin antgenoanticuerpo y el color no ser evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubacin es muy baja, la formacin del complejo antgeno-anticuerpo tampoco se completar en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las protenas (antgeno y anticuerpo) se desnaturalizan y, por tanto, disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.

4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todas las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica mediante espectrofotometra.

Tipos de ensayos ELISA[editar]

Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten la cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo que las analizadas (sangre, orina...), pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado). ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimtico permiten cuantificar una gran variedad de antgenos; por eso es un mtodo ms polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisin por tener un eslabn ms con respecto al mtodo directo. La dilucin de la solucin que contiene el anticuerpo primario por ejemplo, suero sanguneo es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparicin de falsos negativos, ya que si la muestra est muy diluida, no saldr positiva si la titulacin de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los anticuerpos estn presentes, la prueba no da positivo porque la concentracin de anticuerpos especficos contra el antgeno que est pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una seal detectable.) El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn esta tcnica, protenas recombinantes de la envoltura y el ncleo del VIH se absorben como antgenos en fase slida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas vricas. En general, el ELISA

indirecto permite detectar anticuepos sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin.

ELISA sndwich (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As, pues, cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

Quimioluminiscencia[editar]

Durante determinadas reacciones qumicas, la luz generada por este fenmeno constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromgeno de las reacciones ELISA ordinarias. Tales son los casos de la oxidacin del compuesto luminol por perxido de hidrgeno y la enzima peroxidasa de rbano (HRP), que producen luz. La luz que se genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su capacidad de sensibilizar una pelcula fotogrfica. La medicin cuantitativa de la emisin de luz puede hacerse mediante el uso de un luminmetro. La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las cromgenas es la mejora de la sensibilidad. En general, el lmite de deteccin puede aumentarse al menos diez veces si se cambia un sustrato cromgeno por uno que emita luz, y ms de doscientas veces cuando se adicionan agentes potenciadores.

Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados[editar]

En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimticos ms comnmente empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos. Enzima Sustrato Tampn

HRPO (peroxidasa de rbano) OPD 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0,15 M pH 5; aadir microL de 30 % perxido de hidrgeno 30 %.

TMB 2,5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn citrato sdico 0,1 M pH 6; aadir 5 microL de perxido de hidrgeno 30 %. ABTS 60 mg/100 mL de tampn citrato sdico 0,1 M pH 6; aadir 35 microL de perxido de hidrgeno 30 %; parar con fluoruro sdico 1,25 %; leer a 405 nm. DAB 10 mg/20 mL de tampn Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y aadir 20 microL de perxido de hidrgeno 1 %. CNP 6 mg en 1 mL de metanol; aadir 10 mL de tampn Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y aadir 40 microL de perxido de hidrgeno 30 %. AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampn acetato 0,1 M pH 4,5; filtrar y aadir 50 microL de perxido de hidrgeno 30 %. ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6,0 con 1 mM NaOH y aadir 10 % por volumen de 0,05 % perxido de hidrgeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M. AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl 0,1 M pH 9,8 + 1 mM cloruro de magnesio. NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/10 ml de tampn Tris 0,05 M pH 9,2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampn Tris 0,05M pH 9,2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. BCIP 1 mg/mL en solucin AMP (2-amino-2-metil-propanol). beta-G ONPG 2,5 mg/ml en tampn fosfato sdico 0,1 M pH 7,0 + 1 mM cloruro de magnesio + 0,1 M beta-mercaptoetanol. ureasa BP 8 mg/1,48 ml de 0,01 M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; aadir 100 mg de urea y EDTA a 0,2 mM; ajustar el pH a 4,8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a 4 C. PG IS Aadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en secuencia: (A) 1 % (peso/vol) gelatina en 0,1 M tampn fosfayo pH 7,0; (B) 1 % (peso/vol) almidn en agua destilada caliente; (C) 3,04 mg/mL de benzil-penicilina en 0,1 M tampn fosfato pH 7,0 (5000 U/mL); (D) 0,01 N ioduro en 0,1 M KI solucin stock (en una botella oscura).

Prueba ELISPOT[editar]
Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar cuantitativamente el nmero de clulas en una poblacin productora de anticuerpos especficos contra un antgeno determinado o un antgeno contra el que se dispone de un anticuerpo especfico. Aqu, las placas se recubren con el antgeno reconocido por el anticuerpo de inters o con el anticuerpo especfico para el antgeno cuya produccin se valora. Seguidamente, se aade a las placas recubiertas una suspensin de la poblacin celular que se investiga e incuba. Las clulas se disponen en la superficie de la placa, y las molculas secretadas reactivas a las molculas de captura son unidas en la cercana de las clulas secretoras, producindose un anillo de complejos antgeno-anticuerpo alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters. Despus, la placa se lava y un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno secretado, o para la especie de anticuerpo

secretado, se aade y deja que se unan. El posterior revelado del ensayo mediante adicin de un sustrato cromgeno o emisor de luz adecuado indica la posicin de cada clula productora de anticuerpo (o de antgeno) como un punto de color o luz.