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I MICETI

1. INTRODUZIONE
Nel campo delle malattie infettive, le patologie di origine fungina hanno sempre occupato in passato posizioni di secondo piano rispetto a quelle batteriologiche. Attualmente, per, le infezioni fungine stanno acquistando sempre maggiore rilevanza e pongono una serie di problemi, sia in ambito clinico che a livello di progettazione di nuovi farmaci. I funghi si distinguono in patogeni e non a seconda della loro capacit o meno di determinare stati patologici; la maggior parte di essi sono nonpatogeni. utti i funghi appartengono ad una classe di organismi che vanno dalle strutture monocellulari, visibili solo al microscopio, a quelle pluricellulari, facilmente visibili ad occhio nudo. I funghi possono essere !saprofiti" o !parassiti". I saprofiti traggono il loro nutrimento da sostanze morte, mentre i parassiti si nutrono in genere di materia vivente. I funghi sono in grado di prosperare in un#ampia variet di ambienti; li ritroviamo nell#uomo, negli animali, sulle piante e anche nel suolo, se !arricchito" da escrementi di animali oppure da vegetazione in via di decomposizione.

2. ORGANISMI FUNGINI
2.1. LIEVITI
%saminati al microscopio, i lieviti si mostrano come organismi di forma tonda o ovale costituti da una sola cellula &unicellulari'. I lieviti si riproducono per un processo detto di gemmazione; nel corso della gemmazione il nucleo della cellula !madre" si divide, ed un nucleo !figlia" passa nel germoglio. (e cellule vengono separate con la formazione di setti, o pareti divisorie. )opo breve tempo il germoglio si stacca. *i saranno ora due microrganismi unicellulari identici dove in precedenza ce ne era solamente uno.

2.2. MUFFE
+olti funghi sono muffe o ifomiceti, cio, organismi pluricellulari composti da pi- cellule unite che formano strutture lunghe e tubulari dette ife. (e ife crescono principalmente allungandosi all#apice, anche se alcune formano delle diramazioni laterali. *rescendo, le ife si intrecciano tra loro formando un micelio; si pu formare cos. una colonia di muffe visibile ad occhio nudo. /gni rete di ife si divide in un !micelio vegetativo" che penetra nel mezzo nutritivo per fornire nutrimenti al fungo, ed un !micelio riproduttivo", che partecipa alla riproduzione della specie attraverso la formazione di

!spore", con metodi asessuati e sessuati &la riproduzione asessuata implica solo la partecipazione di una cellula madre come nella gemmazione, mentre quella sessuata prevede la partecipazione di due cellule separate'.

2.3. DERMATOFITI
I dermatofiti appartengono alla classe degli ascomiceti, sono cheratinofili e cheratinolitici, capaci di lisare le strutture cornee della cute, le unghie e i peli per mezzo dell#enzima cheratinasi e capaci di utilizzarne, come nutrimento, i prodotti di demolizione. Nei terreni di coltura i dermatofiti si riproducono per vie asessuata per mezzo di spore, dette comunemente conidi, che danno luogo allo sviluppo di un micelio tubulare semplice &tallo' che successivamente si moltiplica e si ramifica in modo dicotomico.

3. MICOSI
(e malattie fungine si possono dividere in due grandi classi, dermatomicosi, localizzate alla cute o alle mucose, da una parte e micosi profonde o sistemiche dall#altra, non tanto per ragioni microbiologiche, ma perch1 presentano dei problemi di approccio clinico completamente differenti2$3 .

Infatti, nel campo delle dermatomicosi oggi si possono ottenere rapidi successi grazie al recente sviluppo di agenti antifungini topici, altamente attivi e con appropriate caratteristiche farmacocinetiche.

3.1. MICOSI PROFONDE


Nella terapia delle micosi profonde, al contrario, si , ancora lontani dal raggiungere un definitivo successo clinico. Normalmente la cellula fungina infetta preferenzialmente tessuti poco vascolarizzati e quindi difficilmente raggiungibili da parte dei farmaci, inoltre essendo ridotte le differenze tra le cellule eucariotiche fungine ed umane si presenta un problema di selettivit d#azione del farmaco. (e micosi profonde di solito prendono il loro nome dal genere cui appartiene il microrganismo che le provoca. Ad esempio il Blastomyces e!mat" "s causa la blastomicosi, il Cocc" "o" es "mm"t"s causa la coccidioidomicosi, l##"sto$lasma ca$s%lat%m causa l#istoplasmosi ecc. . /gni singolo organo , particolarmente suscettibile ad uno specifico agente patogeno o gruppo di agenti patogeni; ad esempio la Ca& " a spesso infetta il fegato, le valvole cardiache e i polmoni nei pazienti trapiantati, mentre l#As$e!'"ll%s causa principalmente infezioni polmonari, ma pu estendersi fino al cervello. I polmoni sono inoltre il sito principale delle infezioni da C!y$tococc%s, che poi evolve in meningite, fatale quando non curata. In alcuni pazienti immunodepressi scompare questa preferenza per

particolari siti e tutti gli organi possono essere infettati da vari funghi patogeni.

3.1.1. Agenti patogeni primari ed opportunistici


6li agenti delle micosi profonde possono essere divisi in due gruppi7 i patogeni primari, come Cocco "o" es, #"sto$lasma, Blastomyces e S$o!ot!"(, che sono in grado di infettare un ospite sano e immunocompetente e i patogeni opportunistici, come As$e!'"ll%s) Ca& " a) M%co!) R*"+o$%s) A,s" "a) T!"c*os$o!%m che causano infezione solo quando la difesa immunitaria non , perfettamente funzionale
2$3

. (a maggior parte dei funghi pu essere posta in

una delle due categorie, talvolta con qualche incertezza, come nel caso del *!y$tococc%s &eo-o!ma&s, che , stato per tanto tempo classificato come patogeno primario, mentre oggi si tende a classificarlo come patogeno opportunistico 203.

4. DIAGNOSI DE

E INFEZIONI FUNGINE

8n aspetto della micologia ancora molto discusso , quello della diagnosi. Infatti, per una prova assoluta della presenza di una infezione

fungina si richiede un esame istologico, ma talvolta tale metodo risulta troppo invasivo per il paziente. 8na diagnosi rapida ed alternativa potrebbe essere rappresentata dall#uso dei metodi sierologici, ma nel campo delle micosi questi metodi presentano alcuni problemi.

(a mancanza quindi di diagnosi rapide e sicure , certamente un grande ostacolo alla battaglia contro le micosi profonde, rendendo difficile decidere quando e come la terapia debba essere iniziata. :uesto problema, associato alla mancanza di un antifungino sicuro con uno spettro d#azione ampio, ha portato ad una situazione in cui gli antimicotici molto spesso vengono somministrati solo quando l#infezione sconosciuta non risponde ad un trattamento antibatterico, ma ci per alcuni pazienti si risolve in un intervento ormai tardivo. Il fattore principale dell#aumento delle micosi sistemiche , senza dubbio la deficienza immunitaria. ;ia tra i giovanissimi che tra gli anziani e i soggetti colpiti da varie malattie, il numero di persone con il sistema immunitario indebolito o addirittura inesistente, in questi ultimi anni, , aumentato enormemente. ;ebbene i viaggi in aree endemiche siano sempre picomuni e siano sempre pi- spesso riconosciute le malattie causate da patogeni primari, l#aumento delle infezioni opportunistiche ha completamente cambiato il significato della chemioterapia antifungina. *i ha anche in qualche modo offuscato la divisione tra patogeni primari ed opportunistici, poich1 un#infezione asintomatica pu degenerare in una malattia letale in un ospite il cui sistema immunitario si sia indebolito anche alcuni anni dopo aver lasciato l#area endemica. (e infezioni fungine opportunistiche possono essere quindi suddivise in quelle che si avvantaggiano di carenze di una difesa non specifica basata su

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leucociti polimorfonucleati e quelle che si manifestano allorch1 l#immunit acquisita dalla cellula mediatrice , assente. :uesti due gruppi sono spesso trovati in quadri clinici distinti, ma in alcuni casi, per esempio soggetti granulopenici sottoposti a chemioterapia corticosteroidea e ad altre forme di chemioterapia, il pericolo viene da entrambe le categorie. Noi siamo in contatto costante con i funghi, aspiriamo migliaia di spore e accogliamo una grande variet di specie sulla nostra pelle e nel tratto gastrointestinale, e la maggior parte di noi non ne viene danneggiato. +a in quest#ultimi anni, i fattori che trasformano un saprofita in un patogeno virulento stanno diventando pi- vari e comuni. Anche se la soppressione immunitaria come conseguenza di una cura medica , diventata molto comune, , l#AI); che domina l#area delle carenze immunitarie nella cellula mediatrice
243

. I patogeni comuni della pelle causano

infezioni molto gravi ed estese nei malati di AI);, nei quali praticamente ogni tessuto ed organo pu diventare bersaglio di un attacco fungino. *irca il 9=> dei malati di AI); presenta almeno un episodio di infezione da Ca& " a e nella maggior parte dei casi si tratta di afta o esofagite. :uesto , spesso il primo segno del progredire di un#infezione da ?I@ in AI);. (a *riptococcosi , una tra le pi- gravi infezioni micotiche che comunemente affliggono questo gruppo di pazienti, poich1 essa in genere si manifesta sotto forma di meningite e non solo deve essere trattata con un efficace regime chemioterapico per ottenere la guarigione, ma richiede anche delle forme di terapia di

mantenimento, per prevenire ricadute. Anche se C!y$tococc%s e Ca& " a sono i pi- comuni, ben pi- di 9= specie di miceti sono state documentate come causa di infezioni in pazienti affetti da AI); 243. In un quadro di neutropenia, di diabete mellito grave, di uso di un#ampia gamma di antibatterici e di certi tipi di cateteri, le principali infezioni opportunistiche sono causate da Ca& " a e da As$e!'"ll%s. (a vastit del problema , testimoniata dal fatto che il 0=-4=> di pazienti con forme acute di leucemia muore per infezione da Ca& " a 253. Battori di rischio per le micosi sono stati individuati per vari gruppi di pazienti, sia quelli con gravi patologie mediche o chirurgiche che quelli affetti da tumore. *i sono ancora molte controversie nel trattare le malattie fungine in tali pazienti e questo problema probabilmente verr risolto quando saranno disponibili farmaci pi- efficaci e sicuri 293. *i che sta diventando chiaro , che alcuni microorganismi presentano maggiore affinit per particolari tipi di malattia, ad esempio la Ca& " a T!o$"cal"s e .!%se" si riscontrano con molta frequenza nei malati di leucemia, la Ca& " a /la,!ata nei malati di cancro, il M%co! micete nei pazienti con diabete mellito. Ai fattori di predisposizione gi menzionati, si possono aggiungere inoltre lunghe degenze ospedaliere, alcolismo, radioterapia, emodialisi ed ustioni gravi.

!.

A CE

U A FUNGINA

utti i funghi hanno una struttura cellulare caratteristica. (a conoscenza della struttura e delle funzioni di una cellula fungina tipica , importante per capire in che modo i vari agenti antifungini agiscono. (a mem"#ana $e%%&%a#e, nota anche come membrana citoplasmatica, riveste il citoplasma con tutti i suoi componenti e forma la barriera tra la cellula ed il suo ambiente. ;e la membrana non rimane intatta i componenti citoplasmatici escono dalla cellula determinandone la morte. (a membrana cellulare evita anche che elementi dell#ambiente potenzialmente dannosi entrino nella cellula. Immediatamente all#esterno della membrana cellulare c#, una pa#ete $e%%&%a#e rigida che circonda l#intera cellula e che ha il compito di darle una forma e di mantenerla. (a sostanza che forma la parte fondamentale della parete cellulare e che la rende rigida, si chiama $'itina.

0.1. IL LANOSTEROLO E L1ER/OSTEROLO


(a membrana cellulare , composta soprattutto da lipidi &fosfolipidi', uno di questi , l#E#go(te#o%o che , necessario per mantenere l#integrit della membrana cellulare. (#%rgosterolo viene sintetizzato a partire da un altro lipide, il ano(te#o%o. %ntrambi sono steroli contenenti un gruppo alcolico D/?.

6li steroli sono composti costituiti da una particolare configurazione a quattro anelli, il $i$%opentanpe#i)#o*enant#ene &A-+-C-D'.

C A +

Appartengono alla classe degli steroli gli ormoni naturali come il cortisolo, gli estrogeni, il testosterone o farmaci come il cortisone e i suoi derivati. Nella struttura del (anosterolo sono presenti gruppi metilici D*? 4 e alcolici D/?.

14

?/

ano(te#o%o

$=

5.1.1. Citocromo P450


)ei cambiamenti che hanno luogo nella struttura del (anosterolo durante la sintesi dell#%rgosterolo, quello che ci interessa principalmente , la rimozione del gruppo metilico D*? 4 &demetilazione' nella posizione *$5. (a demetilazione in *$5 si verifica in seguito all#attivit di un enzima ossodasi &14 ,)emeti%a(i' dipendente dal citocromo F59=, che separa il gruppo metilico -*?4 dal *$5 &Fig&#a 1'. Fig&#a 1

$5

14,)emeti%a(i O2. NAD/0


?/

?/

ano(te#o%o *&ng'i

)iene
-.14

mammi*e#i

$5

?/

E#go(te#o%o

?/

Co%e(te#o%o

Numerose attivit enzimatiche si collegano al sistema ossidativo basato sul citocromo F59=; fino ad ora sono stati caratterizzati oltre $9= differenti enzimi con differenze sia specie-specifiche, che organo-specifiche &citocromi

$$

steroidogenici'7 in ogni caso, caratteristica comune a tali enzimi , quella di comportarsi in massima parte come reduttasi /0 e NA)F? dipendenti. 8n#altra serie di importanti enzimi collegati al citocromo F59= sono le reduttasi del colesterolo che nei tessuti steroidogenici dei mammiferi portano alla sintesi del cortisolo e degli ormoni sessuali. In altre specie, ad esempio nei miceti, gli enzimi collegati al citocromo F59= risultano implicati nella sintesi di %rgosterolo, indispensabile alla formazione della membrana cellulare. In particolare la sintesi dell#%rgosterolo nei miceti richiede una demetilazione in posizione $5 di precursori metilati quali il (anosterolo; tale tappa richiede una ossidazione svolta da una reduttasi &$5-demetilasi' collegata al citocromo F59=; il blocco funzionale del citocromo F59= si traduce in un#inefficienza di questo sistema enzimatico con deficit di %rgosterolo nella membrana fungina che porta ad alterazione della permeabilit della stessa ed accumulo di precursori metilati nel citoplasma con vacuolizzazioni. 8n blocco selettivo del citocromo F59= fungino rappresenta il meccanismo d#azione di alcuni farmaci dotati di attivit antifungina.

$0

1. FARMACI DIS/ONI+I I /ER I DE E MICOSI SISTEMIC0E ASSOCIATI A ORO USO

TRATTAMENTO E /RO+ EMI

(a grande maggioranza dei pazienti viene trattata con Amfotericina G, 6riseofulvina, 9-Bluorocitosina, erbinafina, antifungini azolici.

2.1. AMFOTERICINA B
I polieni sono un gruppo di antibiotici macrolidici, prodotti principalmente da specie di St!e$tomyces. *himicamente essi sono costituiti da un anello lattonico, da un sistema di doppi legami coniugati e da una porzione idrofila2<3. Il pi- noto e importante tra questi , l#Amfotericina G, un macrolide eptaenilico costituito da un nucleo principale, contenente A doppi legami coniugati in relazione t!a&s fra di loro, che , legato per mezzo di un legame glicosidico al 4-amino-4,<-dideossimannosio &micosamina'.
?/ / /? / Am*ote#i$ina + /? /? / /? /? /? / ?4* *?4 /? *?4

?/ ?//* ?4* ?/ ?0N /? /

(a molecola ha caratteristiche anfotere a causa della contemporanea presenza di una funzione carbossilica sul nucleo principale e una funzione amminica nella micosamina, nella struttura , presente anche una funzione

$4

lattonica. (#Amfotericina G , scarsamente solubile in acqua, risulta non assorbibile per via orale ed , disponibile in preparazioni iniettabili. :uesto antibiotico possiede uno spettro di attivit antifungina molto ampio; risulta attivo contro Ca& " a al,"ca&s, C!y$tococc%s &eo-o!ma&s, Blastomyces, #"sto$lasma ca$s%lat%m, As$e!'"ll%s, To!%lo$s"s 'la,!ata, Cocc" "o" es e Pa!acocc" "o" es.

+eccanismo d#azione
:uesti antibiotici sono attivi in modo specifico contro le cellule eucariotiche, vale a dire tutte le cellule contenenti steroli nella membrana citoplasmatica. (a loro azione si basa proprio sulla *o#mazione )i $omp%e((i $on ta%i (te#o%i. p#in$ipa%mente $on %2e#go(te#o%o. :uesta interazione tra farmaco e componente lipidica della membrana ha come risultato un aumento della permeabilit della membrana stessa, che porta all#alterazione del gradiente protonico con fuoriuscita di ioni potassio. (#effetto fungistatico sembra essere collegato proprio a tale efflusso di ioni potassio, mentre l#effetto fungicida sembra possa essere imputato ad una inibizione irreversibile dell#A Fasi di membrana. I batteri non sono sensibili ai polieni poich1 la loro membrana cellulare , sprovvista di steroli. ;ebbene l#Amfotericina G presenti un maggior grado di specificit per l#ergosterolo piuttosto che per il colesterolo, la sua tossicit , un problema clinico ben conosciuto. I polieni determinano "& 3"t!o la lisi delle emazie,

$5

probabilmente perch1 la membrana dei globuli rossi contiene steroli. *i spiega perch1 uno degli effetti tossici collaterali che si osserva nella terapia nell#uomo con polieni, specialmente con Amfotericina G, , appunto una anemia emolitica.

2.2. /RISEOFULVINA
(a 6riseofulvina, prodotta da varie specie di Pe&"c"ll%m, non provoca la sterilizzazione delle strutture gi infettate al momento in cui la terapia viene iniziata, ma si accumula nelle strutture cheratiniche &strato corneo dell#epidermide, capelli e unghie' via via che queste si formano. (a 6risoefulvina , quindi presente in tali cellule quando queste vanno incontro a differenziazione, risulta strettamente legata alla cheratina rendendola pertanto resistente all#invasione fungina.
/*?4 / /*?4 / *?4/ *?4 *l G#i(eo*&%3ina

Fertanto quando le strutture pi- vecchie ed infettate si distaccano per effetto della normale crescita della epidermide, vengono lentamente sostituite da strutture che contengono un#alta quantit di 6riseofulvina. Fer questo il trattamento deve essere prolungato &settimane o mesi', specialmente nei casi

$9

in cui siano interessate le unghie. Bortunatamente la 6riseofulvina ha una scarsissima tossicit anche dopo somministrazioni prolungate. (a 6riseofulvina risulta attiva solo su diversi dermatofiti7

M"c!os$o!%m, E$" e!mo$*yto&, T!"co$*yto&; l#utilizzo terapeutico di tale farmaco risulta cos. limitato solo alle diverse forme di tinea &capitis, cruris, corporis, manuum e pedis'.

+eccanismo d#azione
Il meccanismo d#azione antimicotico della 6riseofulvina , poco noto, nelle cellule animali provoca per il )i(o#ientamento )e% *&(o mitoti$o e %2ini"izione )e%%a mo"i%it4 $#omo(omi$a ne%%a ana*a(e &effetti simili a quelli esercitati dalla *olchicina e dalla @inblastina'. H quindi probabile che il sito di azione della 6riseofulvina nelle cellule fungine sia rappresentato dai microtubuli.

2.3. 04FLUOROCITOSINA
(a 9-Bluorocitosina o Blucitosina , una pirimidina fluorurata, sviluppata dalla Ioche come possibile farmaco antimetabolita durante una ricerca su nuovi agenti citotossici2A3 .

$<

? N B N N?0

!,F%&o#o$ito(ina

(a Blucitosina , dotata di propriet fungistatiche, risulta attiva verso C!"$tococc%s &eo-o!ma&s, Ca& " a al,"ca&s e To!%lo$s"s 'la,!ata, ma pu rapidamente selezionare forme resistenti.

+eccanismo d#azione
Il primo effetto dell#esposizione di funghi sensibili alla Blucitosina , quasi un#immediata ini"izione )e%%a (inte(i )eg%i a$i)i n&$%ei$i. Infatti la Blucitosina , assorbita attivamente dalla citosina permeasi, enzima responsabile dell#assorbimento di adenina, guanina, ipoJantina e citosina da parte della cellula fungina, e tali substrati naturali antagonizzano pertanto l#assorbimento della Blucitosina2C3 . All#interno della cellula la Blucitosina , immediatamente deaminata a 9-Bluorouracile &9-B8' da parte di una citosina deaminasi, un passaggio critico poich1 , proprio il 9-fluorouracile il principio attivo responsabile della morte del fungo. (a bassa tossicit della Blucitosina , dovuta infatti all#assenza della citosina-deaminasi nelle cellule dei mammiferi. Il 9-Bluorouracile per non pu essere somministrato direttamente come farmaco antimicotico poich1 l#assorbimento da parte della cellula

$A

fungina , scarso e la sua tossicit nelle cellule dei mammiferi ne preclude l#uso sistemico alle dosi necessarie per la chemioterapia.

2.5. TERBINAFINA
H un composto della classe delle allilamine somministrabile per via orale e topica e rapidamente assorbito a livello gastrointestinale.
Te#"ina*ina
N *?4 *?4 *?4 *?4

;i distribuisce estesamente nei tessuti, principalmente nella pelle e nel tessuto adiposo, a causa della sua elevata liposolubilit.

+eccanismo d#azione
Il meccanismo d#azione consiste in una riduzione della sintesi dell#%rgosterolo nella cellula fungina attraverso &n2azione ini"ito#ia (pe$i*i$a nei $on*#onti )e%%o (5&a%ene epo((i)a(i , enzima che catalizza la trasformazione dello squalene in squalene epossido, precursore

dell#%rgosterolo. (#accumulo dello squalene probabilmente aumenta la fluidit della membrana fungina, il che, unito alla mancata sintesi dell#%rgosterolo, componente fondamentale della membrana cellulare, provoca la distruzione cellulare.

$C

2.0. ANTIFUN/INI A6OLICI


6li azoli antifungini comprendono due ampie classi di derivati feniletilici a struttura imi)azo%i$a 617 o a struttura t#iazo%i$a 627 che presentano lo stesso spettro di azione antifungina e lo stesso meccanismo di azione.
I$ I0 N I
1

I$ N4 I0 N I
2

N5

6.5.1. Basi molecolari dellazione antifungina dei derivati azolici


(#attivit dei farmaci azolici , legata alla presenza dell#anello azolico &imidazolico o triazolico' non sostituito ed alla simmetria tetraedrica dell#atomo al quale tale eterociclo , legato2E3. (e molecole in esame sono prevalentemente idrofobiche 2$=3 e l#anello azolico costituisce il solo gruppo reattivo nel determinare l#interazione con il target delle cellule fungine. (e relazioni struttura-attivit, in questa classe di composti, sono state attentamente esaminate ed appare chiaro che la loro attivit "& 3"t!o , correlata alla lipofilia di queste molecole. :uesta loro caratteristica infatti pu spiegare

$E

la loro capacit di penetrare le membrane biologiche ed a rompere quindi il legame tra gli enzimi di membrana e la membrana stessa. (#opinione comune , che gli effetti fungistatici di tali derivati siano dovuti all#inibizione della sintesi degli steroli di membrana e la loro azione fungicida derivi invece dall#interazione con la membrana plasmatica, con conseguente sconvolgimento delle funzioni di barriera esplicate da quest#ultima.

1.!.1.1.

Ini"izione )e%%a "io(inte(i )eg%i (te#o%i )i mem"#ana

;tudi sulla demetilazione degli steroli in ceppi di Sacc*a!omyces ce!e3"s"ae, hanno dimostrato che sia in condizioni aerobiche che anaerobiche, nella crescita cellulare la $5-demetilazione del (anosterolo , catalizzata dal citocromo F-59=-NA)F?-reduttasi. 6li enzimi la cui attivit dipende dal citocromo F-59= sono numerosi e tra questi , importante ricordare &Fig&#a 2'7
$. l#aromatasi; 0. il progesterone $A-idrossilasiK$A,0= liasi; 4. l#enzima

preposto alla rottura della catena laterale del

colesterolo.

0=

Fig&#a 2
1 A#omata(i *?/

?/

2 /#oge(te#one 18,i)#o((i%a(i918.2: %ia(i / / /? /

3 Rott&#a )e%%a $atena %ate#a%e )e% Co%(te#o%o /? / /?

Il meccanismo d#azione pi- importante e significativo degli antifungini azolici , quello dell#inibizione della sintesi dell#%rgosterolo, che , fondamentale nel regolare la fluidit della membrana fungina e di conseguenza anche la permeabilit e le funzioni enzimatiche della membrana. Il meccanismo attraverso il quale si manifesta l#azione antimicotica dei derivati azolici prevede %2ini"izione )e%%a 14 ,meti%, ano(te#o%o,)emeti%a(i, un enzima che dipende dal sistema microsomiale del citocromo F59= fungino &Fig&#a 3'.

0$

Fig&#a 3

$5

14,)emeti%a(i O2. NAD/0


?/

?/

ano(te#o%o *&ng'i

)iene
-.14

mammi*e#i

$5

?/

E#go(te#o%o

?/

Co%e(te#o%o

:uesto enzima , coinvolto nella via biogenetica che porta dal (anosterolo all#%rgosterolo, uno sterolo componente fondamentale della membrana citoplasmatica dei funghi. Imidazolo e triazoli, impedendo la biosintesi dell#%rgosterolo, portano ad un accumulo di $5-metilsteroli; questi steroli in eccesso possono distruggere la struttura compatta dei fosfolipidi di membrana, bloccando cos. l#accrescimento dei funghi. 8n#analisi approfondita del sito enzimatico indica che il (anosterolo si lega al sito attivo dell#enzima ancorandosi con l#ossidrile in *-4 per formazione di un legame ad idrogeno con un amminoacido del sito attivo, e

00

disponendo il *-$5 -metile, che subir l#ossidazione, verso l#atomo di Berro del sistema del citocromo F59= &Fig&#a 4'.

Fig&#a 4

O ; 0

14

Be ;

$it /4!:

;tudi recenti sul meccanismo molecolare attraverso il quale si ottiene l#inibizione della $5--demetilasi sembrano indicare che l#atomo di azoto delle strutture azoliche, N-4 per i derivati imidazolici e N-5 per i derivati triazolici, sia necessario per la complessazione e la stabilizzazione dello ione ferrico dell#eme2$$3 &Fig&#a !'; inoltre anche altre porzioni molecolari presenti sulla struttura N-feniletilica, come i gruppi I e I $, sono importanti per l#attivit antifungina perch1 coinvolte nelle interazioni di !binding" 2$03 con specifiche regioni di riconoscimento dello stesso enzima.

04

Fig&#a !

binding I N N L binding

I$

Be *Ms ;

III

binding LN *?, imidazoli LN N, triazoli

ra gli antifungini imidazolici ricordiamo l#%conazolo e il +iconazolo, il ioconazolo e il Benticonazolo, il *hetoconazolo, l#/ssiconazolo

quest#ultimo ormai superato &Fig&#a 1', tra gli antifungini triazolici di recente acquisizione ricordiamo il Bluconazolo, il 6enaconazolo, il @oriconazolo, l#Itraconazolo e il ;aperconazolo &Fig&#a 8'.

05

*l

*l

Fig&#a 1

N / IO

E$onazo%o ION? Mi$onazo%o ION*l *l *l *l N

*l

*l N / *l ; Tio$onazo%o

; Fenti$onazo%o N N / *?0 / *l

*?4*/ N

/*?0 ? C'eto$onazo%o

*l

*l

*l

/ N N

*l

*l O((i$onazo%o

09

Fig&#a 8
B N /? N N N
F%&$onazo%o

N N

N N N

+e /? ;/0+e B N

N N

+e B /? N BN

B Gena$onazo%o

B <o#i$onazo%o /

+e N N N

%t

N N +e N N N / / *l It#a$onazo%o *l / N N / B Sape#$onazo%o B N N / / N N N %t

0<

6.5. . C!etoconazolo
Anche se non , stato il primo azolo disponibile per il trattamento delle micosi sistemiche, il *hetoconazolo , stato la rivelazione di questa classe di composti e fino ad oggi ha mantenuto un posto preminente tra i farmaci antifungini. ;i sospetta un#assenza di azione fungicida a causa delle frequenti ricadute dopo il trattamento ed un elevato dosaggio spesso necessario. (a necessit di usare un alto dosaggio di *hetoconazolo in diverse indicazioni ha portato a notevoli problemi di tossicit
2$43

, anche se non dello stesso ordine di

grandezza di quelli associati all#uso dell#Amfotericina G. (a tossicit endocrinologica, dovuta all# interferenza con il metabolismo steroideo, , reversibile entro breve tempo dal termine della terapia; questi ultimi effetti sono stati adoperati per avere dei vantaggi in alcuni casi, come nel trattamento della sindrome di *ushing e in pazienti con carcinoma della prostata
2$53

Anche l#epatotossicit , un problema potenziale il suo manifestarsi , molto grave anche se raro.

6.5.3. "enaconazolo
Il 6enaconazolo , un triazolo che risulta attivo sia se somministrato per via orale, parenterale che topica. Numerosi studi microbiologici hanno dimostrato come tale triazolo sia pi- attivo del Bluconazolo contro

0A

#"sto$lasma ca$s%lat%m e in vari modelli di meningiti prodotte da C!$tococc%s. +entre contro le infezioni indotte da Ca& " a la sua attivit sembra paragonabile a quella dell#Amfotericina G. %ntrambi i composti hanno per mostrato di indurre carcinoma e adenoma epatocellulare in ratti e topi dopo prolungata esposizione &$C-05 mesi'2$93.

6.5.4. #aperconazolo
Anche il ;aperconazolo, come il precedente derivato, ha ricevuto recentemente molte attenzioni in quanto possiede una notevole azione antifungina caratterizzata da un largo spettro d#azione. Nonostante sia un composto estremamente liposolubile sono riusciti tuttavia a somministrarlo per endovena usando le -ciclodestrine come carrier.

6.5.5. $ffetti secondari degli antifungini azolici


/ltre all#inibizione della $5-metil-(anosterolo-demetilasi sono state ipotizzate molte altre interazioni dei derivati azolici con la cellula fungina. ;embra infatti che l#effetto fungicida sia correlato alla loro azione sull#integrit e sulla funzionalit della membrana. Iisulta che tali derivati agiscono alterando le funzione di membrana, interagendo per mezzo della loro porzione idrofobica con la doppia fase lipidica delle strutture membranose, provocando cos. la perdita dei costituenti cellulari
2$<3

. Accanto a questa azione

, stata identificata anche un#inibizione specifica sull#up-taPe di particolari

0C

sostanze nutrienti, in ceppi di Ca& " a Al,"ca&s. H stato provato, anche, che ad alte dosi il +iconazolo interferisce con i componenti della catena respiratoria mitocondriale inibendo l#up-taPe dell#ossigeno 2$A3.

6.5.6. Attivit% antitumorale degli antifungini azolici


(#attivit degli antifungini imidazolici pu essere molteplice ed in tal senso va ricordata l#azione inibitrice sull#aromatasi. (#aromatasi &estrogeno sintetasi' , un complesso enzimatico

responsabile della conversione degli androgeni &* $E' in estrogeni &*$C' nello stadio finale della biosintesi degli ormoni steroidei ed , coinvolto nella riproduzione, nello sviluppo e differenziazione sessuale, in alcune funzioni cerebrali e nella crescita di tumori ormono-dipendenti. :uesto complesso enzimatico , legato al reticolo endoplasmatico della cellula ed , costituito da due grandi proteine7 una , il citocromo F59= AI/+, una emoproteina che converte l#androstenedione in estrone, la seconda proteina , una NA)F?-citocromo-F59= reduttasi, una flavoproteina che trasferisce gli equivalenti di riduzione al citocromo F59= AI/+ 2$C-0=3. (#aromatasi &AI' converte gli androgeni in estrogeni attraverso tre successivi stadi di ossidazione, ognuno dei quali richiede una molecola di ossigeno e NA)F?20$3 &Fig&#a -'. I primi due stadi comportano l#ossidrilazione del gruppo metilico in posizione $E per dare un diolo geminale

0E

che riarrangia ad aldeide e poi viene eliminato come acido formico ulteriore ossidazione. Fig&#a / ?/ / ?/

2003

per

/ /?

NA)F? /0
/ /

NA)F? /0
/

An)#o(tene)ione

/ /

?0/
/

NA)F?; /0 ?0/; *?/0?


/

E(t#one

:uesto enzima si ritrova in numerosi tessuti come la placenta, il tessuto adiposo, le cellule della granulosa ovarica, le cellule testicolari di ;ertoli, le cellule testicolari di (eMdig, nel fegato e nel cervello 204,053. 6li estrogeni hanno un importante ruolo nella malattie ormonodipendenti, come il tumore della mammella o quello dell#utero; l#inibizione dell#aromatasi pu essere quindi utile nel trattamento di queste patologie. *i sono due gruppi principali di inibitori dell#aromatasi, quelli steroidei e quelli non steroidei. ra gli inibitori a struttura non steroidea, gli azoli, sia imidazolici che triazolici, hanno mostrato di possedere una buona capacit di inibizione.

4=

Il loro meccanismo d#azione si basa sulla coordinazione di un atomo di azoto dell#imidazolo o del triazolo con il ferro del gruppo eme dell#aromatasi
2093

. (#%conazolo, un potente azolo antifungino, inibisce anche altri

citocromi F59= oltre a quello presente nei funghi; esso ha mostrato una buona inibizione dell#aromatasi nei microsomi della placenta umana, ma purtroppo manca di selettivit 20<,0A3. Il gruppo di ricerca %li-(illM ha studiato il rapporto struttura-attivit del *lotrimazolo e analoghi e ha confermato l#importanza dell#anello

dell#imidazolo per l#inibizione dell#aromatasi 20C3. ;tudi sul *hetoconazolo hanno risolto il problema sull#attivit dei suoi diastereoisomeri verso l#aromatasi
20E3

e il diastereoisomero- &2S)5S' , risultato

il pi- attivo come inibitore reversilbile dell#aromatasi, da qui il suo uso come antitumorale nel trattamento del cancro alla mammella. Il *hetoconazolo ha mostrato buoni risultati anche nel trattamento di tumori ormono-dipendenti, quale quello della prostata, agendo in questo come inibitore del complesso enzimatico progesterone $A -idrossilasiK$A,0=-liasi, un altro enzima la cui attivit dipende dal citocromo F59=; i substrati di questo enzima sono il progesterone eKo il pregnenolone 24=3.

4$

?/

/#oge(te#one 62:7

/#egneno%one 6217

)iversi ricercatori hanno riportato studi su inibitori della $A idrossilasi


24$3

e hanno dimostrato che gli azoli imidazolici come il Gifonazolo

e il *hetoconazolo sono potenti, il +iconazolo e l#%conazolo meno potenti e il +etronidazolo , inattivo contro questo enzima.

6.5.&. 'elazione struttura(attivit% degli antifungini azolici

Nelle molecole di tutti gli antifungini a struttura azolica , sempre presente una porzione $-fenetilimidazolica o $-fenetiltriazolica sostituita in posizione 0 &Q' con raggruppamenti di varia natura come ad esempio gruppi ossimeterei &NN-/-I' come nell#/ssiconazolo, o gruppi eterei &/-I' come nell#%conazolo, nel +iconazolo, nel ioconazolo e nel Benticonazolo, o

ancora gruppi ossidrilici &/-?' come nel Bluconazolo e nel 6enaconazolo e infine gruppi chetalici come nell#Itraconazolo e nel ;aperconazolo. *ome sostituenti sul fenile del gruppo $-azolil 0-feniletilico sono presenti alogeni come il *l e il B che si trovano sempre in posizione 0#, 5#.

40

In generale gli antifungini azolici sono dei fungistatici e diventano fungicidi solo ad alte concentrazioni. ali farmaci, eccetto il *hetoconazolo, sono scarsamente solubili in acqua e le loro interazioni con i funghi sensibili sono influenzate in modo determinante dalle condizioni ambientali &p?, mezzo di coltura', le quali possono rendere conto delle differenze di sensibilit dei funghi a questi composti e da ci si deduce una difficolt ad ottenere dei valori di +I* riproducibili. Inoltre vanno ricordati problemi tossici che ne limitano l#impiego sistemico. ;tudi recenti2403 hanno messo in relazione le caratteristiche

tridimensionali presenti nello scheletro del (anosterolo con porzioni molecolari presenti in alcuni dei nuovi potenti e selettivi antifungini azolici. In particolare sono stati condotti studi di diffrazione ai raggi L e calcoli di meccanica molecolare su strutture simili al Bluconazolo &Fig&#a ='.

44

N N N B

/?

Fig&#a =
N N N

B F%&$onazo%o N N +e /? 5 N $ 0
4

I0 / N I N N B
$

N N4 B N N $ 0 B

/ N
4 5

/
0

N
4

I /

+e

I$

I$ N ?, *?4 I0 N ?, /?

)a questi studi , stato visto che , possibile rispettare, sulla porzione molecolare *$-*0-*4-+e, la stessa geometria della porzione del frammento +e-*$5-*$4-+e dello scheletro del (anosterolo2403 &Fig&#a 1:'. Fig&#a 1:
ca. $A= R

*?4
$4

$5

*?4 ano(te#o%o B
ca. $A0R

*?4
4

B N4 ?

ca. $4A R

*?4 ?
4 0

/ N

B I

ca.$<< R

*?4 / ?
4 0

? B r

B r *?0
$

B r *?0
$

*?0
$

& r N $,0,5-triazolo'

45

In tale condizione il gruppo metilenico *$ e metilico *5 dei triazoli presi in esame vengono a trovarsi in una relazione spaziale del tutto analoga a quella dei corrispondenti gruppi metilici legati alla porzione *$5-*$4 del (anosterolo mentre le altre due porzioni farmacoforiche, difluorofenile e ossigeno, sul *0 occupano zone spazialmente corrispondenti alle porzioni cicliche del (anosterolo. Il raggruppamento azolico & r' responsabile della complessazione del Be dell#eme presente nel citocromo F-59=, viene a trovarsi in tale modo costretto nelle immediate adiacenze della regione del corrispondente +e in *$5 del (anosterolo, che rappresenta il punto di attacco ossidativo del sistema enzimatico.

6.5.). Attivit% *iologica degli antifungini azolici


In tabella sono riportate le concentrazioni minime inibenti &+I*' rispettivamente il E9> e l#C=> della crescita fungina di tre antifungini, l#Amfotericina G, il Bluconazolo e l#Itraconazolo, nei confronti di Ca& " a Al,"ca&s &C.A.' e di As$e!'"ll%s F%m"'at%s &A.F.'.

49

?/ ?//* ?4* ?/ ?0N /? /

?/ / /? / /?

/? / /? /? /? / ?4* *?4 /? *?4

Am*ote#i$ina +
/

+e N N N

%t

N N N N N / / *l N *l N N /? B / N N N B

It#a$onazo%o

F%&$onazo%o

Ta"e%%a MIC 6 g9m%7 C.A. A.F. E9> C=> E9> C=#> Am*ote#i$ina + F%&$onazo%o It#a$onazo%o =.09 =.$0 =.==C =.09 S$09 =.09

)ai valori in tabella si pu notare l#elevata attivit dll#Amfotericina G rispetto agli antifungini azolici; il poliene infatti mostra una inibizione totale dell#accrescimento fungino &E9>' con discreti livelli di +I* &gKml'.

4<

6li antifungini azolici, Bluconazolo e Itraconazolo, invece mostrano solo una parziale inibizione dell#accrescimento fungino &C=>'; per questi ultimi i valori di +I* evidenziano che l#introduzione di una porzione polare nella catena feniletilica, come nel caso dell#Itraconazolo, determina un aumento di attivit. ali farmaci costituiscono un prezioso contributo alla chemioterapia antifungina, tanto che molte industrie farmaceutiche hanno investito e stanno ancora investendo nella ricerca di nuovi antifungini azolici, i quali potrebbero diventare nel prossimo futuro un#alternativa effettiva nella chemioterapia antimicotica.

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