CULTIVO DE PIEL

ndice:
1 Importancia Actual. 2 Clulas pertenecientes al rgano de la piel. 2.1 Queratinocitos. 2.2 Fibroblastos. 3 Medio de cultivo. 4 Biorreactores. 5 Criogenizacin. 6 Dificultades en los cultivos. 7 Innovacin y futuro. 8 Bibliografa.

Figura 1. Biorreactor con Crecimiento en estructura descelularizada.

1 IMPORTANCIA
El cultivo de clulas para formar el tejido de la piel, fue uno de los primeros en ser llevado a cabo, dada la relativa facilidad de crecimiento de los fibroblastos, a inicios de la dcada de 1970, obtenindose grandes avances en el conocimiento de su fisiologa, as como de aspectos inmunolgicos, y es que la piel no slo forma una barrera fsica protectora contra agentes nocivos y la colonizacin bacteriana, sino que desempea una funcin clave en el reclutamiento y actuacin de los mecanismos de defensa innatos y adaptativos del sistema inmune. En la actualidad el mercado para la aplicacin del producto es inmenso, esto porque existen numerosas enfermedades que deterioran y producen la necrosis del tejido epidrmico, adems de la aplicacin por antonomasia y es la de las personas afectadas por quemaduras graves, en el que han perdido un gran porcentaje de extensin de piel, y para las que un injerto inmediato es de vital importancia, dado que se encuentran vulnerables a infecciones por entidades y microorganismos patgenos de gran diversidad. Pruebas preclnicas realizadas a principios de 1980 demostraron que los tejidos cultivados de fibroblastos aparentemente no producan rechazo en los pacientes, y que adems las clulas implantadas llegaban a persistir hasta casi un mes en los animales en que se realiz la experimentacin, por tanto se realizaron las subsecuentes pruebas clnicas en humanos, que condujo al desarrollo de productos en variadas presentaciones de tejido de piel, por lo que se produjo una inmediata regulacin por parte del departamento de alimentos y drogas americano (FAD),para esta clase de productos biotecnolgicos de difcil clasificacin, mientras tanto diversas aplicaciones para pruebas in vitro y modelos fisiolgicos de piel fueron desarrollados. Existen 3 modos de crecimiento del tejido celular: en el primero las clulas crecen inmersas en un gel de colgeno, el cual acta como substrato para el crecimiento de los queratinocitos, y que en conjunto forman una estructura muy similar a la piel natural. La segunda comprende un andamiaje tridimensional compuesto por entretejidos de polmeros que no son derivados biolgicos tales como el Polilactato/Glicolato (PLGA), debemos tener en cuenta que los fibroblastos son sensibles a las seales de su medio, y por tanto responden de diferente forma a los 2 anteriores modos de cultivo y por ltimo, una tercera estructura formada por una esponja de colgeno la cual se encuentra inmersa en un medio nutritivo con suero bovino. Dado que el colgeno absorbe fibronectina y vitronectina, en estos cultivos se da una adherencia elevada a estas estructuras de los fibroblastos.

Figura 2. Injerto de Piel. En una suspensin de colgeno, los fibroblastos responden a las integrinas, las cuales son receptoras del colgeno, comportndose de manera latente y detenindose su proliferacin. Como caracterstica notable, se produce una contraccin del gel hasta aproximadamente el 10% del volumen original en 24 horas, por accin de la 11 integrina y, simultneamente, muchos genes responsables de la proliferacin celular son reprimidos, aumentando adems la sensibilidad mecnica de los fibroblastos. Cuando los fibroblastos crecen en estructuras tridimensionales polimricas, los fibroblastos proliferan rpidamente y depositan grandes cantidades de matriz extracelular. En principio las condiciones en los andamios tridimensionales no difieren mucho de las que se dan en los cultivos en monocapa, producindose absorcin continua de suero del medio circundante, sin embargo, en cuanto las clulas alcanzan una alta densidad, los fibroblastos dejan de proliferar y aumentan la generacin de sustancias extracelulares hasta casi alcanzar su propio peso por da.

Los fibroblastos una vez llegada esta etapa se dedican a reclutar Neutrfilos granulocitos del sistema inmune innato, los cuales tiene una importancia fundamental en la respuesta a los ms comunes ataques a los que la dermis est expuesta, que suelen ser la erosin con posterior colonizacin bacteriana. Actualmente se est siguiendo investigaciones con el fin de obtener estructuras que incorporen vasos capilares y que se adapten e interconecten adecuadamente al sistema circulatorio del paciente receptor, dado que la revascularizacin de los injertos sustitutos de piel provoca una limitacin efectiva en un uso ms amplio. Una de estas lneas consiste en realizar la perfusin descelularizante de tejido, y emplearlo como matriz extracelular idnea para el desarrollo de nuestro cultivo celular.

2 CLULAS PRESENTES EN LA PIEL

2.1 QUERATINOCITOS Los queratinocitos forman la capa impermeable o estrato crneo de la piel, y se ha pensado que presenta un mayor rol en la defensa contra la colonizacin bacteriana, activando las repuestas inmunes, por tanto han sido incluidos bien sea solos o en combinacin con otros componentes en implantes de piel. Su funcin como formador de la barrera fsica es primordial, pero es que adems tienen la facultad de generar pptidos de reconocida accin batericida como la -Defensina, psoriasina y catelicidina, as como una amplia variedad de citoquinas capaces de inducir la respuesta del sistema autoinmune. La epidermis contiene adems clulas capaces de activar los linfocitos T bajo condiciones especficas. Se ha argumentado que la mera aplicacin de un spray conteniendo queratinocitos, que seran impermeable a las clulas pero no a las protenas, a una herida, es muy beneficioso, an sin la incorporacin de las dems clulas pertenecientes al tejido de la piel. En el implante conjunto de piel es de resaltar que se produce una sinergia que provoca que los queratinocitos secreten IL-1, la cual a su vez estimula la secrecin del factor de crecimiento de queratinocitos (FGF-7) y el factor estimulante de granulocitos macrfagos (GMCSF) por parte de los fibroblastos, y que inducen la proliferacin de los queratinocitos. Estas mutuas interacciones son muy importantes durante la reparacin, cuando la proliferacin de ambos tipos de clulas es fundamental. En la prctica, los queratinocitos alognicos en los implantes de piel, parecen permanecer durante algunas semanas y luego desaparecen; dado que los queratinocitos, que se cultivan en el nmero requerido para el implante, consisten casi que enteramente de clulas transitorias que siguen un camino de diferenciacin que conduce a una forma de apoptosis, se espera as que desaparezcan del implante sin la intervencin del sistema inmunolgico, pero todo esto an no est del todo claro.

Otra forma de garantizar el desarrollo y la persistencia del tejido implantado, consiste en mezclar clulas alognicas con queratinocitos del receptor, esto permite obtener una extensin de tejido suficiente para cubrir una gran rea, con una pequea cantidad de queratinocitos obtenidos del mismo paciente. Las clulas alognicas daran la amplia cobertura, mientras que las propias clulas que contienen clulas madre, proveen la necesaria persistencia, la mayora de las alognicas se perderan, pero aun as la epidermis permanecera en su conjunto. Como se coment anteriormente, se estn realizando investigaciones en las que se aplican queratinocitos en forma de spray a las heridas, lo cual es una forma simple y rpida de aplicacin de una mezcla de clulas propias, obtenidas por ejemplo, en una suspensin aislada intraoperativamente del cuero cabelludo, con las obtenidas de un cultivo de clulas alognicas.

Figura 3. Estructura de la piel.

2.2 FIBROBLASTOS
Los fibroblastos son los mayores secretores de matriz extracelular, y no presentan clulas antgenas por lo que no se considera que tengan un papel importante en las interacciones con el sistema inmune. Sin embargo su habilidad para secretar neutrfilos atrayentes de

quemoquinas CXCL 1, 4, 5, y 8, y las citoquinas IL-6 y IL-11 sugieren que puede tener un papel mucho ms importante en la activacin del sistema inmune innato. Los fibroblastos no parecen producir cantidades significativas de defensinas, catelicidinas u otro tipo de pptidos antimicrobianos, su mayor actividad parece ser el centrarse en reclutar neutrfilos. Los fibroblastos expresan muchos genes responsables de la produccin de las sustancias de la matriz extracelular, tales como proteoglicanos, trombospondinas, fibulinas, fibronectina, tenascina C, lisil-oxidasa, integrinas y protenas responsables de ajustar y modificar la adhesin celular. En los sistemas en que se cultivan los fibroblastos inmersos en gel de colgeno, las seales iniciales ocurren a travs de las integrinas 11 y 21, hasta que las clulas producen otras molculas encargadas de provocar seales. Otros componentes de los tejidos cultivados son las clulas adiposas subcutneas, las cuales han recibido poca atencin, sin embargo aportan un necesario soporte vascular, adems clulas madre derivadas de tejido adiposo han sido utilizadas satisfactoriamente en la generacin de injertos que proveen ventajas a los fibroblastos. La inclusin de clulas de Langerhans tambin ha sido documentada en pruebas, aunque an no han sido aplicadas a los productos teraputicos finales, al igual que la inclusin de melanocitos para el tratamiento de enfermedades tales como el vitligo, que es un problema clnico con muchos pacientes en pases tales como la India. Otras estructuras que se estudian implantar son los folculos pilosos e incluso glndulas sudorparas.

Figura 4. Fibroblastos de Ratn. En el desarrollo de cultivos de tejido de piel existen 2 caminos posibles; uno es la produccin de tejido con clulas extradas y seguidamente cultivadas del mismo paciente, esto tiene gran cantidad de desventajas, la primera es que para disponer del tejido se necesitan mnimo 2 semanas, adems de la logstica y del elevado costo de todos los equipos necesarios para realizar este cultivo in situ, bien en el mismo hospital o en un centro cercano, la ventaja que si tendramos sera la seguridad de un nulo rechazo por parte del sistema inmune del paciente, por lo que podemos prescindir de los test de seguridad previos. En el caso del cultivo de clulas alognicas tenemos muchas ventajas: una es el punto de vista econmico, otra la menor complejidad, facilidad de escalado y estandarizacin de los parmetros del proceso,

tales como los tiempos de cultivo, composicin del medio y uso de la misma lnea celular procedente de un comprobado banco celular. Es importante tener en cuenta que los injertos as obtenidos deben ser posteriormente tratados con Dimetil sulfxido DMSO, 3 OrtoMetil Glucosa y trehalosa para su adecuada criogenizacin a -70C. El producto debe ser cuidadosamente descongelado y con el fin de obtener la ms alta viabilidad celular se realiza el cultivo en biorreactores, que adicionalmente tienen una funcin de empaquetado, con un diseo que facilita el enjuagado y el recorte preciso del injerto dada su traslucidez. Varias veces por semana se realiza la extensin del tejido de fibroblastos empleados en la obtencin de injertos, se recuperan del almacenamiento en nitrgeno lquido y expanden en botellas de cultivo, aqu se hace evidente que la proliferacin de los fibroblastos mejora sustancialmente a bajas concentraciones de oxgeno (2-6%), y adems, a estas concentraciones se evita la proliferacin de fenotipos senescentes. Es por tanto muy importante tener el control del pH, temperatura y concentracin del oxgeno en el medio.

Tabla 1. Protenas y factores presentes en la matriz extracelular.

3 MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo ms empleado en el cultivo de injertos de piel es el Eagle modificado por Dulbecco suplementado con un 10% de suero bovino, amino cidos no esenciales y glutamina. Todo cultivo de clulas aisladas de tejido se encuentra originalmente libres de agentes antimicrobianos, es prioritario tener en cuenta que dichos agentes suelen enmascarar contaminaciones que podran hacerse evidentes en el momento de la aplicacin teraputica. Con el aumento de la preocupacin por la transmisin de enfermedades prinicas, ha habido gran inters en crear medios libres de suero, aunque esto es fcil para los queratinocitos, no es as fcil conseguir los medios precisos para los fibroblastos. Aunque existen medios comerciales para el cultivo de fibroblastos, que en los laboratorios han funcionado de maravilla, no ocurre igualmente cuando se realiza a escala de produccin, porque se ha visto que las clulas no crecen en una extensin adecuada al transformarse tempranamente en fenotipos senescentes, ocurriendo esto despus de duplicarse de 60 a 80 veces. Mientras esto puede obtenerse en medios con suero, en los libres de suero, el perodo de vida comprende tan slo 9 o 10 duplicaciones, esto hace de momento inviable el trabajo con medios libres de suero, que no ofrecen el suficiente potencial de proliferacin, dado que se necesitan perodos de vida en las clulas de al menos 30 duplicaciones para obtener injertos funcionales. La solucin provisional actualmente es tomar las ms extremadas precauciones con la fuente del suero, as como con su tratamiento. Por regulacin todos los materiales empleados en la manufactura de este producto biotecnolgico debe tener total trazabilidad, pero es que adems slo se permite el uso de suero que provenga de pases en los que no se ha registrado la encefalopata espongiforme, los cuales incluyen los pases de nueva Zelanda y Australia, y en los que sus cabaas ganaderas son cerradas y de reconocido historial de su pedigr y que no contenga ascendientes de fuera del pas. A parte de estas medidas el suero se irradia suficientemente para eliminar posible contaminacin vrica.

4 BIORREACTORES
El reactor es una parte fundamental del proceso de manufactura, por lo que se toman en consideracin mltiples cuestiones para su diseo: transferencia de masa, facilidad de manipulado y control, asepsia, escalado, condiciones del medio para las que las clulas y en s todo el tejido pueda crecer para formar el injerto. Otro aspecto relevante tiene que ver con la facilidad de manejo y utilizacin del producto por parte del usuario final. Los reactores adecuados para la realizacin de los cultivos de piel consisten en reactores de bolsa con 8 cavidades, cada una de las cuales contiene una lmina con la estructura tridimensional en la

que se va a realizar el crecimiento celular, as como medio nutritivo y en su caso incluso solucin criognica formando as un sistema completo. Los sistemas de reactores de bolsa, antes de ser operados son esterilizados por radiacin gamma previo a la siembra de clulas. Una vez iniciado el cultivo, las clulas son manipuladas para asegurarse su uniforme distribucin homogeneizando la solucin. El medio se reemplaza un da despus de la siembra y se renueva permanentemente cada 2 das hasta la cosecha final. El tiempo efectivo de cultivo se determina por la medida de la glucosa metabolizada y el lactato producido, midiendo diariamente el ratio fsforo-oxgeno presente en la produccin de ATP y asumiendo una medida de 3 para la fosforilacin oxidativa mitocondrial. Los valores medidos se comparan con los objetivo. Se debe tener en cuenta que el lactato originado por la degradacin de la estructura tridimensional, altera en algunos casos las medidas. Al finalizar el cultivo, se debe reemplazar el medio por la solucin criognica, que consiste en un 10% de DMSO en bffer de fosfato salino, suplementado con suero bovino. Dejando transcurrir al menos 4 horas desde la retirada del medio hasta la adicin de la solucin y procedindose a realizar la congelacin 6 horas despus de manera lenta y controlada hasta los -75C. Estos intervalos de tiempo no afectan la viabilidad de las clulas y adems parecen beneficiarlas, induciendo la sntesis de protenas que las protegen contra el posterior choque osmtico. Los injertos de piel deben cumplir unas especificaciones que incluyen esterilidad en microorganismos tales como bacterias, hongos, micoplasma y endotoxinas, as como criterios analticos de consistencia: actividad MTT Reductasa antes del congelamiento y una vez descongelado el injerto, esto para determinar la actividad metablica del producto, otra es el contenido de colgeno como medida indirecta de la cantidad y calidad de la materia extracelular y por ltimo, la determinacin de ADN que refleja el adecuado contenido intracelular. El ensayo con la MTT Reductasa es vista como una medida de la actividad mitocondrial, sin embargo el 70% de la actividad metablica en realidad es extramitocondrial y esta es la que da una medida ms fidedigna. Originalmente el ensayo de la MTT Reductasa fue desarrollado para evaluar la toxicidad y la proliferacin celular, y estos datos obtenidos eran comparados con valores de control, no obstante una gran cantidad de esfuerzo poco fructfero se ha invertido en tratar de estandarizar este ensayo para la medida precisa de la actividad metablica antes y despus de la congelacin, pero los resultados podan ser confundidos con los que se hacen para la citada toxicidad y proliferacin. Debido a que ocurren cambios en la viabilidad y la actividad metablica tres das despus de la criogenizacin a consecuencia de la apoptosis, necrosis y reparacin, los ensayos con la MTT Reductasa deben ser tomados como indicativos ms que como definitivos. La automatizacin en la ingeniera de cultivo de tejidos es un hecho notable, que aparte de reducir los costos laborales, reduce tambin el nmero de errores que tienen que ser investigados, ahorrando tiempo, dinero y esfuerzo. Aunque los errores producidos por los operadores son menos graves, por contrapartida son mucho ms numerosos y requieren una investigacin individual. Sistemas automticos con Back up pueden ser instalados con el fin de

minimizar el impacto de un fallo mecnico.

Figura 5.Reactor con sistema de perfusin.

Figura 6. Sistema de Biorreactor para tejidos de vaso.

5 CRIOGENIZACIN
El almacenamiento a -70C es un compromiso entre una solucin ideal y practicidad y ha resultado tener muchos beneficios. Si la meta es tener un 100% de viabilidad celular y una indefinida vida de almacenamiento, el camino es probablemente el depsito en temperaturas tan bajas como las del nitrgeno lquido, empleando un procedimiento de vitrificacin en el cual las altas concentraciones de crioprotector y la alta velocidad de congelacin se emplea para evitar la formacin de cristales que rompan las clulas. En tanto que las dificultades del rpido sobreenfriamiento de una til estructura teraputica y los problemas de la fragilidad de los plsticos a tan bajas temperaturas pueden ser superadas, el mtodo entraa el transporte en nitrgeno lquido y problemas de seguridad. La criopreservacin a las temperaturas del hielo seco proveen un adecuado tiempo de vida y permite distribuirlo en containers capaces de mantener una temperatura de -65C por 4 das, esto facilita su distribucin alrededor del mundo soportando incluso retrasos de hasta 2 a 3 das. A parte de las ventajas logsticas, la induccin de la produccin de protenas debido al estrs producido en las clulas por el procedimiento de criogenizacin, en combinacin con la recuperacin de la subptima viabilidad, significa que los restos de las clulas necrticas, incluyendo las protenas generadas por el choque trmico, son liberadas de las clulas rotas. Tales protenas activan los macrfagos a travs de CD91 y otros receptores. Un punto importante que no hemos discutido es el proceso de descongelacin, en el transcurso suele ser necesario ir retirando la solucin criognica e ir reemplazndola por otra ms adecuada y menos txica para las clulas, este proceso suele ser delicado y requiere varias horas en la mayora de los casos. En el proceso de congelamiento, cuando la mayora del agua desplazada osmticamente ha sido removida las clulas alcanzan el punto eutctico y se congelan. Mientras gran parte del material intracelular forman una masa vtrea, pequeos ncleos de hielo pueden formarse, y luego producirse un lento crecimiento de estos cristales a -70C, lo que probablemente suele limitar el tiempo de almacenamiento. Durante el descongelamiento tambin tenemos el riesgo de la formacin de estos cristales, que si llegan a crecer fuera de control, ocasionan la muerte al romper las membranas celulares, por tanto lo que debemos hacer es atravesar esta fase crtica tan rpidamente como sea posible, lo que podemos conseguir empleando un bao de agua tibia (37 C) termostatizado, que nos genera un rpido intercambio de calor. Debemos saber adems que unos pocos segundos del vial fuera del congelador en el aire basta para reducir la viabilidad celular drsticamente.

6 PROBLEMAS USUALES EN LOS CULTIVOS DE INJERTOS DE PIEL

Durante el desarrollo del cultivo a gran escala, a menudo surgen inconvenientes que no suelen tener anlogos en cultivos de laboratorio a pequea escala, o de investigacin, y es difcil determinar el origen inequvoco de tales desvos; primero por el elevado coste y escala, segundo por el tiempo que sera necesario invertir,

por ende, cuando nos enfrentamos a este tipo de inconvenientes debemos reunir todas aquellas valiosas ideas, analizando el incidente respecto de los cambios efectuados en el habitual proceso (Modificacin de los medios y materias primas usuales, nuevos procedimientos diferentes del estndar, etc), priorizando posibles soluciones, realizndose usualmente las menos agresivas y ms econmicas, implementndolas simultanea e inmediatamente. Esto significa que si el problema remite, lo que a menudo ocurre, ser difcil saber qu medida ha logrado corregir el desvo, en todos los casos siempre debe primar el sentido comn. Un ejemplo de tales incidentes es, por ejemplo; el deterioro ocasionado al medio, y por extensin al cultivo, por la luz fluorescente. Es sabido desde antao que la exposicin de algunos medios a la luz solar o a la fluorescente degrada algunos componentes muy sensibles, sin embargo tales situaciones no suelen presentarse en los laboratorios, donde los frascos que contienen los medios suelen almacenarse en cmaras oscuras refrigeradas, por el contrario en operaciones a escala industrial, a veces es necesario preparar las soluciones de medio unas semanas anticipadamente y almacenadas en cmaras fras, que si se encuentran iluminadas por este tipo de luces malogran nuestro medio. Es muy recomendable entonces emplear luz amarilla para evitar esta clase de incidencia. En un laboratorio de investigacin, las clulas almacenadas en nitrgeno lquido, son manipuladas muy raramente, como mucho un par de veces al ao, por el contrario, en el banco celular de un cultivo a gran escala los viales son requeridos muchas veces en una sola semana, mientras un vial es identificado y extrado, los restantes aumentan su temperatura, notando, al cabo de unos aos, que el perodo de vida de los fibroblastos decrece notablemente, esto puede ser atribuido a la recristalizacin de los ncleos de hielo durante los continuos intervalos en que sufren aumento de temperatura, entre los 90-120C, as es necesario proyectar un mtodo de extraccin de los viales seleccionados que ocasione el mnimo impacto en los restantes por este motivo. Otro problema de gran significancia tiene que ver con el rechazo del implante, como fue establecido claramente en el ao 1940 por Medawar, el trasplante de rganos enteros inevitablemente origina una reaccin inmunolgica que desemboca en el rechazo final, sin embargo la experiencia con algunos tipos de cultivos de tejidos, indican que el rechazo manifestado suele ser insignificante. En el caso de los injertos de piel, miles de pacientes han sido tratados, y en algunos casos muchas veces se han realizado varios implantes al mismo paciente, sin un solo caso de respuesta de rechazo inmunolgica. Los fibroblastos se encuentra que persisten en la zona rehabilitada hasta 6 meses despus de realizado el injerto. Existen dos formas mayoritarias de rechazo; la directa y la indirecta. La directa involucra el reconocimiento de la histocompatibilidad de los antgenos del donante (HLA) por el sistema inmune del husped, que conduce a un rechazo agudo cerca

de 15 das despus de realizado el injerto. Esta respuesta es mediada por molculas de las cuales las ms importantes pertenecen al tipo HLA-DR y otras adicionales que tambin se encuentran presentes como las del grupo CD40 y CD80. Estas molculas no son normalmente expresadas por los fibroblastos, sin embargo en los cultivos monocapa, la presencia de -interfern, el cual puede estar presente en heridas crnicas, puede inducir la expresin de estas molculas y de los genes responsables de la funcin fisiolgica de reconocimiento de los antgenos. En cultivos tridimensionales, muchas de las clulas ensean una respuesta selectiva al -interfern que excluye la induccin de las anteriores molculas. La respuesta indirecta de rechazo involucra la exhibicin por parte de los pptidos antignicos de las clulas del husped (Macrfagos, clulas del endotelio, etc) Esto origina un rechazo crnico que puede causar la entera destruccin del injerto en cuestin de semanas; aunque esto ltimo no se puede asegurar 100% que no ocurra, la evidencia clnica ensea que estos casos extremos no se han presentado. El rechazo agudo es primariamente un ataque en las clulas del endotelio del sistema vascular, las cuales presentan clulas antignicas que expresan las molculas HLA, CD40 y CD80, y es probable que la ausencia de rechazo para con los tejidos cultivados est relacionado con su no presencia, de hecho, al adicionar clulas con respuesta antignica, en este caso linfocitos B, a tejidos o construcciones elaboradas, restauran la susceptibilidad inmunolgica. La comprensin del mecanismo de accin de un producto, requiere el entendimiento de la patologa subyacente que el producto va a tratar; en el transcurso de muchos aos los mecanismos de sanacin y restauracin de las heridas, no han sido cabalmente entendidos. Muchos problemas han sido observados, particularmente en el caso de las heridas crnicas. El problema se clasifica en cmo se relacionan unos con otros; cuales son etiolgicos y cuales sintomticos; la diferencia entre causa y respuesta. Estos problemas no son tan acuciantes en el caso de productos de accin temporal, como los sprays de queratinocitos de los que antes hemos hablado. En las heridas crnicas se observan cambios en comparacin con la piel sana, estos son; ausencia de migracin en los queratinocitos, actividad de la proteasa, deficiencia en la activacin de los macrfagos, disminucin del abastecimiento capilar, y senescencia temprana de los fibroblastos. Una primera aproximacin en la solucin de estos aspectos, fue abordar el abastecimiento vascular y la migracin de los queratinocitos. Muchos estudios llevados a cabo en las respuestas a los injertos realizados mostraron que el tejido produca VEFG y el factor de crecimiento de hepatocitos, tambin se mostr el aumento del suministro de sangre en el caso de las lceras en pacientes diabticos, empleando simultneamente tcnicas con lser Doppler. La elevada actividad proteasa observada en heridas crnicas, en combinacin con la falta de migracin de los queratinocitos, se emple para lanzar la hiptesis de

que la matriz extracelular se encuentra tan degradada hasta tal punto, que carece del necesario substrato de migracin. De hecho, se demostr que la fibronectina era degradada por la elastasa neutrfila. Durante la examinacin de los genes inducidos por el cultivo tridimensional, se encontr que el ms notoriamente regulado es el IL-8 y la quemoquina ELR CXC. Esto ha conducido al estudio de la secrecin de estas protenas y que los cambios en su produccin pueden estar relacionados a la etiologa de las heridas crnicas. Las monocapas de fibroblastos secretan CXCL-1, CXCL-5 y CXCL-6 (gro-, ENA-78 y GCP-2 respectivamente) los cuales son quemoatractivos para los neutrfilos y los aciva a un fenotipo bactericida. Al mismo tiempo se ha observado que sustancias bacterianas, tales como los polisacridos; inhiben la migracin de los queratinocitos. Esta hiptesis conduce al hecho de que, en el contexto de una herida, los fibroblastos se encargan del reclutamiento de los leucocitos neutrfilos que destruyen la colonizacin bacteriana, y el fallo de este sistema en las heridas crnicas origina la contaminacin bacteriana que ocasiona el fracaso de la repitelizacin. Es conocido que los fibroblastos en las heridas crnicas manifiestan un fenotivo senescente, que crece muy lentamente y adems es insensible a los factores de crecimiento. Esta condicin de senescencia prematura, inducida por estrs, est probablemente relacionada con la escasa irrigacin sangunea (isquemia) presente en las heridas, anormalidad metablica y condicin inflamatoria de la herida crnica. Se ha demostrado que la produccin de las protenas CXC-1, CXC-5, CXC-6 y CXC-8 decrecen los fibroblastos senescentes. As, en las heridas crnicas, un deterioro de la capacidad de los fibroblastos de reclutar y activar los neutrfilos, permite la colonizacin bacteriana y el posterior bloqueo de la migracin de los queratinocitos que cerraran y por ende sanaran las heridas, es decir; se ocasiona una detencin de la curacin en el estadio de la inmigracin de los neutrfilos. Por esta hiptesis tenemos que una de las principales funciones de los injertos es, proveer a la zona herida, de fibroblastos perennes con la adecuada secrecin de quemoquinas atrayentes de neutrfilos. En el caso de algunos tipos de implantes oclusivos transitorios, la formacin de una especie de cuerpo extrao en forma de cpsula, que recubre el injerto, evita el posterior crecimiento hacia dentro y as se facilita su remocin una vez finalizada su tarea. Una caracterstica notable de los implantes drmicos es que no parecen incrementar la vulnerabilidad a las infecciones, de hecho, la experiencia general es una disminucin notoria en su incidencia. Las preparaciones con queratinocitos se conoce que generan la secrecin de pptidos antimicrobianos, pero esto no se sabe que ocurra con los fibroblastos,La ms plausible explicacin es la combinacin de la secrecin de quemoquinas neutrfilo atrayentes por parte de los fibroblastos y la aportacin de un substrato de matriz celular por la migracin de leucocitos.

Tabla 2. Tejidos drmicos e injertos presentes en el mercado actual.

7 INNOVACIN Y FUTURO
La principal direccin en el desarrollo de injertos drmicos se dirige hacia sistemas ms simples y no viables. La inclusin de clulas vivas entraa muchas dificultades, tales como el uso de material alognico, la criopreservacin, distribucin, inconvenientes a los clientes (por ejemplo el descongelamiento) y problemas de manufactura (Con los reactores por ejemplo), de aqu que se han iniciado estudios para explorar posibilidades que, aunque menos efectivas, sean mucho ms econmicas y accesibles. Es un principio general que se puede obtener un gran beneficio explotando la tecnologa base tan lejos como sea posible. El principal producto de los fibroblastos es el colgeno, que como producto no viable es extrado de la matriz extracelular depositada por los fibroblastos y usado en inyecciones para el tratamiento de las arrugas. Una alternativa a la criopreservacin que ha sido explorada, es la posibilidad de almacenamiento por desecacin; muchos sistemas naturales como semillas de plantas, levaduras, etc han desarrollado la habilidad de sobrevivir a la desecacin, y en esa condicin sobrevivir a condiciones extremas tales como altas temperaturas, vaco, radiacin y largos perodos de tiempo. Muchos factores

parecen estar involucrados en esta habilidad, pero uno que merece una especial atencin es la trehalosa, que es 1,1,, diglucosa, que es producida en grandes cantidades por muchos microorganismos resistentes a la desecacin. Se ha descubierto que algunas clases de injertos pueden ser secados en presencia de trehalosa e irradiados a 25-40 Grays para esterilizarlos, y posteriormente rehidratados, recuperando su previa estructura y conservando su capacidad de adhesin. Similares resultados pueden ser obtenidos por una cuidadosa liofilizacin. Mientras un relativo xito ha sido obtenido en el mantenimiento de la viabilidad de las clulas humanas desecadas, an no es posible prolongar el tiempo de almacenamiento requerido para las aplicaciones de estos tejidos. Adems se cuestiona si el tratamiento con radiacin, que es posible con productos no viables, sera realizable en injertos de clulas vivas, adicionalmente un empaquetamiento y secado asptico tendra que ser diseado. Hasta ahora, las aplicaciones teraputicas de los tejidos drmicos, han abarcado heridas agudas y crnicas, y engloban componentes drmicos simples y otros ms complejos con estructuras epidrmicas adicionales. En el futuro es ms que probable que se adicionen estructuras anexas. Notable xito en esta direccin se ha alcanzado con los folculos pilosos, que se ha encontrado que clulas inducidas de estos folculos puedan ser cultivadas de manera que retengan sus propiedades para que, mezcladas y aplicadas con queratinocitos derivados de los mismos folculos, generen cabello. Destacable de todo esto es la generacin del rgano completo, compuesto por glndulas sebceas, folculos pilosos, y msculos erectores de pili, lo que constituye uno de los pocos ejemplos de organognesis observada empleando clulas adultas.

Tabla 3. Composicin De la matriz extracelular de Transcyte (Injerto).

8 BIBLIOGRAFA

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