ENDOCITOSIS

Las clulas eucariticas poseen un mecanismo mediante el cual pueden incorporar molculas del exterior llamado ENDOCITOSIS, y otro mecanismo para secretar molculas al exterior llamado EXOCITOSIS.
Ambos mecanismos estn compuestos por un sistema complejo de trafico de vesculas que involucra la membrana celular y las membranas del ER (retculo endoplsmico) y el aparato de Golgi, entre muchas otras.

Verde: va biosintetica Rojo: va secretora Azul: va de recuperacin

El proceso de endocitosis involucra la internalizacin de parches de membrana plasmtica por distintos mecanismos
El destino del material endocitado depende, en parte, del mecanismo de endocitosis involucrado.

Gaitan, Cell 2003

Las clulas internalizan fragmentos de su membrana plasmtica en forma de pequeas vesculas y en un proceso continuo. Existen dos formas principales de endocitosis:

Pinocitosis: internalizacin de pequeas

macromolculas y fluidos extracelulares. (<150 nm de
dimetro)

Fagocitosis: ingestin de partculas grandes

como microorganismos o debris celular. (> 250nm de
dimetro)

Todas las clulas eucariticas estn continuamente ingiriendo fluidos y molculas por pinocitosis, solo clulas especializadas (fagocticas: macrfagos, neutrfilos) ingieren partculas grandes. La tasa de internalizacin de membrana plasmtica difiere entre clulas; los macrfagos y fibroblastos internalizan el equivalente al 100% de su membrana plasmtica cada 30 y 120 min, respectivamente.

El rea de la membrana plasmtica y el volumen de las clulas permanece constante durante el proceso activo de endocitosis, lo cual implica que es balanceado por un proceso inverso denominado exocitosis (es un proceso mediante el cual las vesculas internas de la clula se fusionan con la membrana plasmtica para secretar fluidos o material)

ENDOCITOSIS

membrana

EXOCITOSIS

membrana

PINOCITOSIS
La mayora de las clulas eucariticas incorporan continuamente fluidos y solutos por medio de pinocitosis. Gran cantidad de la membrana plasmtica de la clula es incorporada dentro de ella por endocitosis y retorna a la superficie celular por exocitosis. El tipo de pinocitosis ms estudiada es la denominada endocitosis mediada por receptor, en donde se internalizan molculas especficas selectivamente. Estas molculas se encuentran en el espacio extracelular en concentraciones bajas, como pueden ser hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos, hierro, enzimas, vitaminas y colesterol.

Las molculas especficas que son internalizadas se pegan a protenas denominadas receptores, que estn localizadas en el exterior de la superficie celular y poseen un sitio especfico de pegado a la molcula. Una vez que la molcula se pega a su receptor, estos se mueven en la membrana plasmtica y se concentran en pequeas depresiones llamadas clathrin-coated pits. Estas depresiones son invaginaciones de la membrana celular y se encuentran cubiertos por una protena denominada clatrina. Estas invaginaciones son utilizadas para la va endoctica, en donde macromolculas especficas son incorporadas dentro de la clula.

LAS INVAGINACIONES DE CLATRINA OCUPAN EL 2% DE LA MEMBRANA PLASMATICA.

LAS VESICULAS (RECUBIERTAS DE CLATRINA) SE FORMAN EN 1 MINUTO Y EN SEGUNDOS SE FUSIONAN CON LOS ENDOSOMAS TEMPRANOS.

EN FIBROBLASTOS SE FORMAN 2500 VESICULAS POR MINUTO

Cuando se desprenden las vesculas de la membrana plasmtica y se liberan al espacio intracelular, se remueve la cubierta de clatrina.

Las vesculas que aun transportan los receptores y las molculas unidas especficamente se fusionan con la membrana de otra organela denominada endosoma.

La funcin de los endosomas es empaquetar a las molculas en nuevas vesculas y enviarlas a diferentes lugares dentro de la clula.

Endocitosis mediada por vesculas cubiertas con clatrina

microscopa electrnica

Lodish et al, MCB 2004

Clatrina Protena que facilita la endocitosis de receptores en vesculas pequeas (>0.1 m de dimetro) formando y reorganizando una capa sobre la cara citoplasmtica de la membrana.

Formacin de vesculas cubiertas con clatrina en la membrana celular

Secuencia de eventos moleculares durante la endocitosis mediada por vesculas de clatrina

Protenas adaptadoras se asocian a la membrana, reclutan protenas cargo y clatrina. Dinamina media la fisin de la vescula con hidrlisis de GTP. Protenas accesorias desensamblan la cubierta en un proceso que depende de la hidrlisis de ATP.

ATP hidrlisis

GTP hydrolysis

Gundelfinger, NRMCB 2003

Protenas adaptadoras reconocen seales de endocitosis en el tallo citoslico de protenas de transmembrana

seales reconocidas por protenas adaptadoras citoslicas

AP2 AP2 AP2 Eps AP2

NPXY ej. integrinas, receptor de LDL YXX ej: receptores de transferrina, M6P LL ej: caderinas, receptor de Fc ubiquitina ej: EGFR, E-caderinas
X representa cualquier aminocido representa un residuo hidrofbico

N: Asn P: Pro

Y: Tyr L: Leu

Distintos compartimientos o "estaciones" del flujo vesicular endoctico

La distincin de endosomas tempranos y tardos se basa en el tiempo post internalizacin, localizacin subcelular, pH, y en la presencia de protenas marcadoras.
Las molculas internalizadas pueden reciclar tanto a partir de endosomas tempranos como tardos. Los cuerpos multivesiculares se forman por la invaginacin de la membrana de los endosomas tardos.

MT

pH6

pH5

El transporte endoctico depende de microtbulos (MT)

pH4.5

Sorkin & Zastrow, NRMCB 2002

Destino de las protenas endocitadas

reciclado de receptores reciclado de receptores y sus ligandos desensibilizacin y reciclado de receptores degradacin en lisosomas almacenamiento temporario
La diferencia en los receptores incorporados en la clula mediante el proceso de endocitosis mediada por receptor es que una vez que liberan las molculas que transportaron y que abandonan el endosoma pueden dirigirse a diferentes destinos. No como ocurre durante la fagocitosis en donde todo el material que entra a la clula termina en los lisosomas para su degradacin

Reciclado de receptores
Un ejemplo de endocitosis mediada por receptor es la incorporacin de colesterol en clulas de mamferos.

Este descubrimiento fue realizado por Michael Brown y Joseph Goldstein, quienes estudiaban la internalizacin del colesterol en clulas del torrente sanguneo. Dicho estudio fue galardonado con el Premio Nobel en Medicina en el ao 1985.

El colesterol sanguneo es transportado en complejos lipoproteicos = partculas de LDL (low density lipoprotein)

Cuando las clulas necesitan colesterol para la sntesis de membrana, sintetizan el receptor de LDL que es una protena de transmembrana. Estos receptores se localizan en las invaginaciones (pits) de clatrina y al unir LDL comienza la endocitosis.
Una fraccin de la membrana endocitada retorna a la superficie (reciclado). El receptor de LDL es reciclado mas de 100 veces antes de ser degradado. Cada ciclo dura ~10-20 min.

Reciclado de receptores

Las partculas de colesterol LDL se unen a receptores de LDL en la superficie de las clulas y son endocitadas en vesculas de clatrina. El receptor LDL posee la seal de endocitosis NPXY la cual es reconocida por partculas AP2 y clatrina. Los receptores endocitados se disocian de las partculas LDL en el medio cido de los endosomas tardos y son reciclados a la superficie.

N: Asn P: Pro

Y: Tyr

Las partculas de LDL son transportadas al lisosoma en donde enzimas digestivas las degradan en aminocidos, colesterol y cidos grasos. Luego el colesterol es liberado al citoplasma donde es utilizado para la sntesis de membrana nueva. Cuando se acumula colesterol en la clula se apaga la sntesis del receptor LDL dentro de la clula.

Aderem, Alan, and David M. Underhill. "Mechanisms of Phagocytosis in Macrophages." Annual Review of Immunology 17 (1999): 593623. Alberts, Bruce, et al. Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Publishing, 2000. Mukherjee, Sushmita, Richik N. Ghosh, and Frederick R. Maxfield. "Endocytosis." Physiological Reviews 77 (1997): 759803. Schmid, Sandra L. "Clathrin-Coated Vesicle Formation and Protein Sorting: An Integrated Process." Annual Review of Biochemistry 66 (1997): 511548.

Reciclado de receptores y ligandos

Las clulas incorporan hierro a travs de la endocitosis mediada por receptor de ferro-transferrina. En el medio cido de los endosomas tardos el hierro se disocia y se exporta al citosol. La apotransferrina y su receptor permanecen unidos y son reciclados a la superficie, donde se disocian.

Desensibilizacin y reciclado de receptores

EGF

auto phosphorylation

Los receptores unidos al EGF se autofosforilan y activan vas de sealizacin intracelulares. Los receptores se endocitan en vesculas con clatrina. En los endosomas tempranos una fraccin de los receptores son defosforilados y reciclados a la superficie.

dephosphorylation

EGF: epidermal growth factor

Sorkin & Zastrow, NRMCB 2002

Transporte de receptores y ligandos a lisosomas

Endosomas tempranos que transportan protenas endocitadas (azul) y vesculas que transportan protenas lisosomales desde el trans-Golgi (rojo y verde) se fusionan con endosomas tardos. Las protenas a ser degradadas se internalizan por invaginacin formando cuerpos multivesiculares. Eventualmente, los cuerpos multivesiculares se fusionan con lisosomas.

la internalizacin de receptores tirosina kinasas (EGFR) en los cuerpos multivesiculares impide su reciclado y termina la sealizacin.

citosol
Sorkin & Zastrow, NRMCB 2002

La mono-ubiquitinilacin acta como una seal de direccionamiento mie al lisosoma

Receptores tirosina kinasa activados (ej. EGFR), E-caderinas, erinas etc. pueden ser monoubiquitinados por E3-ubiquitina ligasas (ej. Cbl). Esto constituye una seal que es reconocida por protenas adaptadoras (ej. Eps15, Hrs, STAM) que contribuyen a concentrar los receptores en cuerpos multivesiculares (MVB) y a su degradacin en lisosomas.

Mosesson / Yarden, IMAJ 2006

FAGOCITOSIS
La fagocitosis es un tipo de endocitosis en donde se
ingieren partculas grandes o microorganismos enteros. Es un proceso mediado por actina. Extensiones de la membrana plasmtica envuelven el material ingerido formando vesculas grandes llamadas fagosomas. Eucariontes unicelulares (Protozoa) se alimentan a travs de este medio, mientras que los animales superiores poseen clulas especializadas para tal fin como los macrfagos o neutrfilos. Estas clulas ingieren microorganismos y tambin estn involucradas en la limpieza de clulas apoptticas o senescentes.

Neutrfilos: se encuentran en gran cantidad en sangre, pueden entrar rpidamente a los tejidos y fagocitan patgenos durante una inflamacin aguda. Macrfagos: estn fuertemente relacionados con los monocitos en sangre, estas clulas predominan en inflamaciones crnicas. Clulas dendrticas y linfocitos B: la fagocitosis en estas clulas es importante durante la elaboracin de una respuesta inmune especfica y no durante la destruccin directa del patgeno

La fagocitosis consiste en la ingesta de partculas grandes a partir de la formacin de pseudpodos

Microscopa electrnica de barrido de un macrfago fagocitando dos eritrocitos. Las flechas sealan los bordes de las extensiones citoplasmticas ricas en actina denominadas pseudpodos, que engolfan los eritrocitos.

Alberts et al., MBC 2002

Microscopa electrnica de un neutrfilo fagocitando una bacteria, que est en proceso de divisin.

Existe fagocitosis de: Microorganismos Partculas insolubles Clulas daadas o muertas Debris celular Diferentes etapas durante la fagocitosis Quimiotaxis Adherencia Formacin de pseudpodos Formacin del fagosoma Formacin del fagolisosoma

Factores importantes que ayudan a destruir microorganismos en los fagolisosomas

Protenas NADPH oxidasa: estn en las membranas de los
fagolisosomas y generan radicales oxgeno que reaccionan con protenas, lpidos y otras molculas biolgicas.

Oxido ntrico: reacciona con radicales oxgeno y generan molculas que

daan otras molculas biolgicas.

Protenas antimicrobianas: proteasas, elastasas. Son esenciales para

eliminar varias bacterias. Otra protena antimicrobiana es la lisosima que acta sobre la pared celular de algunas bacterias gram positivas.

Pptidos antimicrobianos: defensinas y otros pptidos. Atacan la

membrana celular de la bacteria.

Transportadores de hidrgeno: acidifican el fagolisosoma provocando la

eliminacin de varios microorganismos. Tambin activan proteasas

La fagocitosis se inicia por el pegado de partculas (material inerte, microorganismos o clulas muertas) a receptores en la superficie celular, posiblemente a extensiones cortas, pseudopodos, presentes en la superficie de clulas como pueden ser los macrfagos.

Posteriormente los eventos rpidos de sealizacin promueven la reorganizacin del citoesqueleto (mayoritariamente actina) y como consecuencia la extensin de los pseudopodos. A pesar que la mayora de los modelos de fagocitosis proponen a la membrana plasmtica como la principal fuente de membrana para la formacin de los fagosomas (proceso de invaginacin) (Aa) se ha demostrado que otras endomembranas tambin contribuyen a este proceso.

Los endosomas reciclados, que son reclutados a la superficie celular mediante el proceso denominado exocitosis (Ab), han sido identificados como potencial fuente de membrana para la formacin de los fagosomas.

Tambin se ha demostrado que otra importante fuente de membrana que est involucrada en la fagocitosis es el retculo endoplsmico (ER), en un proceso denominado fagocitosis mediada por ER (Ac). Existen muchos trabajos en donde se muestra que las protenas que usualmente estn en la membrana plasmtica o en los endosomas reciclados (Rab4 y Rab11) y en ER (calreticulina y calnexina) tambin estn presentes en los fagosomas indicando la potencial participacin de estas membranas en la fagocitosis.

En algunos casos se demostr que los lisosomas tambin se fusionan con la membrana plasmtica durante la fagocitosis (Ad). Se pudo observar que en algunos fagosomas se encuentran asociadas protenas lisosomales (LAMP) y protenas reticulares (calnexina) lo que indica que ambas organelas participaron en la contribucin de membrana para la biognesis de dicho compartimiento.

Luego de su formacin, los fagosomas maduran en fagolisosomas mediante una serie de eventos de fusin con endosomas tempranos (EE), endosomas tardos (LE) y lisosomas (Ly). Este proceso de maduracin permite a los fagosomas adquirir propiedades microbicidas y la habilidad de procesar antgenos.

Algunos patgenos intracelulares que han coexistido durante largos perodos de tiempo con su husped han desarrollado diversas estrategias para escapar a los mecanismos defensivos de sus huspedes, como por ejemplo la degradacin en fagolisosomas.

- mycobacteria, Salmonella y la forma promastigote de Leishmania alteran la maduracin del fagosoma inhibiendo la fusin con LE y Ly (no hay degradacin ni muerte de los microorganismos). -Coxiella y la forma amastigote de Leishmania sobrevive dentro de los fagolisosomas. - Brucella y Legionella pueden inducir fusin de la membrana plasmtica del fagosoma con elementos de la va biosintetica permitiendo su replicacin en compartimientos con caractersticas de ER.

Endocitosis independiente de clatrina

Microscopa electrnica de caveolas
membrana plasmtica

100 nm

vescula con clatrina

caveolas

Las caveolas estn presentes en la mayora de las clulas. Se forman en dominios especializados de la membrana plasmtica ricos en colesterol, glicoesfingolpidos y protenas unidas por GPI (glico fosfatidil inositol) denominados "lipid rafts". Caveolina: es la principal protena estructural de las caveolas. La seleccin del cargo esta determinada por la composicin lipdica de la membrana de la caveola. La funcin de las caveolas no es clara pero intervienen en mecanismos de transduccin de seales que activan Ras.

Acoplamiento entre exocitosis y endocitosis en el terminal pre-sinptico

1. Los neurotransmisores (rojo) son almacenados en vesculas sinpticas que se acumulan ancladas a la membrana. La fusin de membranas es prevenida por la protena sinaptotagmina. 2. En respuesta a potenciales de accin, se abren canales de calcio, sinaptotagmina une calcio y altera su conformacin, permitiendo la fusin de las vesculas y la liberacin de los neurotransmisores al espacio sinptico. 3. Endocitosis acoplada recicla los transportadores de neurotransmisores. 4. Recarga de las vesculas con neurotransmisores. Lodish et al, MCB2004

Coordinacin de eventos de endocitosis y exocitosis

La unin de insulina a su receptor genera seales intracelulares que promueven la translocacin de endosomas especializados conteniendo GLUT4 a la membrana plasmtica. La expresin del GLUT4 en la superficie promueve la captacin de glucosa.

adipocito o clula muscular

GLUT4

GLUT4

endosoma de reciclado

Autofagocitosis

Autofagocitosis o Autofagia es el trmino que se utiliza para la degradacin de componentes citoplasmticos en los lisosomas.

Pasos secuenciales de la autofagia

Secuestro de material
(transporte a los lisososmas)

Degradacin Generacin de aminocidos / pptidos

(utilizacin de los productos obtenidos)

Cada uno de estos pasos cumple diferentes funciones de acuerdo en el contexto celular en el que se encuentre.

Existen tres tipos principales de autofagia

- Microautofagia - Macroautofagia -Autofagia mediada por chaperonas

Microautofagia: es la invaginacin directa de materiales a los lisosomas. Macroautofagia: es el secuestro de organelas o de protenas en
una vescula de doble membrana llamada autofagosoma o vacuola autofagica (AV) dentro de la clula. La membrana externa del autofagosoma se fusiona con el lisosoma en el citoplasma para formar el autofagolisosoma o autolisosoma en donde se degrada su contenido a partir de las hidrolasas lisosomales.

Autofagia mediada por chaperonas (CMA): es el trmino que se

utiliza para describir la degradacin de protenas citoslicas especficas que contienen una secuencia peptdica determinada. Las chaperonas se unen a estas protenas y las transportan a los lisosomas por medio de un receptor. (este es un proceso selectivo y slo involucra protenas, no transportan organelas, contrariamente a la autofagia en donde el sistema de degradacin es en general no selectivo).

Protena 31Atg

Half-life of AV ~10min

Mizushima N. et al 2007

Mizushima N. et al 2007

Uno de los principales factores que es considerado como disparador del proceso de autofagia es la reduccin de nutrientes. Levaduras: falta de nitrgeno es el principal estimulo para inducir autofagia. Plantas: falta de nitrgeno y carbono. Mamferos: sistema altamente complicado. Deplecin total de aminocidos. Efecto individual de los aminocidos. Depende el tipo de clula.
Aun no se conoce como censan la falta de alguno de los aminocidos. (candidato: GCN2, protena kinasa de pegado a tRNA)

Mizushima N. et al 2007

Otra postura es la que considera que la autofagia debera estar regulada por un sistema altamente organizado. Se cree que el sistema endocrino, en particular la insulina, regula la autofagia in vivo. (Autofagia en hgado es suprimida por insulina y aumentada por glucagon). Tambin contribuyen a la regulacin de la autofagia otras hormonas y factores de crecimiento.

Mizushima N. et al 2007

DEGRADACIN y REUTILIZACIN Una vez que el material es degradado en los lisosomas / vacuolas, las unidades monomricas (ej. Aminocidos) son exportados al citosol para ser reusados.

Atg22 (levaduras) Avt3, Avt4 (levaduras) SLC36A1 / LYAAT-1 transportador lisosomal de aminocidos (mamferos).

Aun no se conoce contribucin de la autofagia para la reutilizacin de lipidos y carbohidratos.

Autofagia es una va de degradacin lisosomal que es escencial para la sobrevida, la diferenciacin, el desarrollo y el mantenimiento de la clula. Autofagia cumple principalmente un rol adaptativo de proteger a los organismos de diversas patologas, como pueden ser infecciones, cancer, enfermedades neurodegenerativas.

Sin embargo, esta funcin puede ser destructiva o nociva para el organismo. Excesiva degradacin por autofagia causa muerte celular.

Control de calidad Eliminacion de exceso de organelas no necesarias (peroxisomas, mitocondrias) Streptococcus, Shigella, Mycobacterium. Algunos microorganismos (Brucella, Legionella) utilizan la via autofagica para sobrevivir. (vacuolas protectivas)