PRODUCCIN DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA) POR Bacillus sp. UTILIZANDO GLICEROL COMO FUENTE DE CARBONO.

Anala Banacore1, Guadalupe Martnez, Vernica Saravia

Departamento de Bioingeniera Instituto de Ingeniera Qumica Facultad de Ingeniera UdelaR. Julio Herrera y Reissig 565 CP 11300 Montevideo Uruguay. Tel: (+5982)7110871 Fax: (+5982)7115446

RESUMEN El actual inters en la produccin de bioplsticos, surge de la bsqueda de sustitutos de los plsticos derivados del petrleo, de manera de disminuir su impacto ambiental, reduciendo su persistencia en el medio ambiente y utilizando recursos renovables. Los PHAs son bioplsticos de origen microbiano, biodegradables y producidos a partir de fuentes renovables. En el presente trabajo de estudi la utilizacin de glicerol como sustrato para la produccin de polihidroxialcanoatos (PHA), por un Bacillus sp.a escala de matraces. Este fue capaz de crecer a partir de glicerol, obtenindose hasta una concentracin de biomasa de 2,2 g/L, para una concentracin inicial de glicerol de 5 g/L en un medio mnimo definido,con una acumulacin de PHA menor al lmite de cuantificacin.

INTRODUCCION En la actualidad el plstico es un recurso de uso diario, que a la hora de ser desechado genera un impacto ambiental importante. De aqu nace el inters a nivel mundial de sustituir los plsticos derivados del petrleo por bioplsticos. Estos presentan la ventaja de ser biodegradables y a su vez provenir de recursos renovables. Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son polmeros biodegradables, producidos por algunos microorganismos como material de reserva de carbono y energa, que son almacenados en forma de grnulos en el citoplasma celular. La acumulacin de PHA en algunas bacterias ocurre cuando existe en el medio una limitacin en un nutriente esencial como N, P, Mg, O, K o S y exceso de fuente de carbono. Tambin existen bacterias que no requieren una limitacin nutricional, ya que la acumulacin en estos casos se encuentra asociada al crecimiento (1).

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La capacidad de acumular PHA se ha detectado en varios gneros de bacterias, dentro de las cuales se encuentra Bacillus. Distintas cepas de Bacillus han mostrado caractersticas interesantes para aplicaciones industriales, como un crecimiento rpido en sustratos baratos. Sin embargo, en estas bacterias la acumulacin mxima de polmero se da justo previo a la esporulacin, degradndose a lo largo de la misma. Este hecho, es una desventaja para el desarrollo de este proceso (2) Entre los biopolmeros, los PHA son fuertes candidatos para sustituir a los plsticos derivados del petrleo, dado que poseen propiedades mecnicas similares a varios termoplsticos sintticos(3). Las propiedades del material y por consiguiente su aplicacin, varan dependiendo de la composicin del monmero. El PHB es resistente al agua, radiacin ultravioleta y es impermeable al oxgeno (4). El tiempo estimado para la degradacin de PHB vara de algunos meses (en medio anaerobio) a aos (en agua marina)(5). El polihidroxibutirato, PHB, es el ms conocido y caracterizado de los PHA. Sin embargo, el co-polmero que contiene PHB y PHV (polihidroxivalerato) es ms flexible y resistente, y por consiguiente es de mayor inters industrial (6). La gran desventaja que poseen los bioplsticos actualmente es el mayor costo de produccin de los mismos, frente a los plsticos de origen petroqumico. Con el fin de disminuir el valor de produccin de los PHA, se intenta utilizar como sustrato de produccin materiales renovables de bajo valor comercial como por ejemplo glicerol, un desecho de la industria de biocombustible. El glicerol crudo esta compuesto principalmente por glicerol, acidos grasos libres, metil esteres de acidos grasos y algunas trazas de sales (7). El objetivo de este trabajo es el estudio de la produccin de polihidroxibutirato (PHB) por Bacillus sp. a partir de glicerol como fuente de carbono. Los objetivos especficos son: la optimizacin de la concentracin de glicerol en el medio para el crecimiento de Bacillus sp. y la determinacin de la relacin C/N ms favorable respecto a la produccin de PHB.

MATERIALES Y MTODOS Microorganismo: El Bacillus sp. fue aislado de un efluente lcteo por el Departamento de Bioingeniera de la Facultad de Ingeniera y seleccionado como productor de PHA en diversas fuentes de carbono. La cepa se mantiene en TSB con 20% de glicerol a -70C. Medio de cultivo: El medio de cultivo esta constituido por: Na2HPO4 4,45 g/L, KH2PO4 1,5 g/L, MgSO47H20 0,2 g/L, (NH4)2SO4 1g/L, Citrato de Amonio y Hierro III 0.06 g/L, CaCl2H2O 0,01 g/L y 1 mL/L de metales traza. El glicerol utilizado para componer los medios fue glicerol puro para anlisis (Merck). El medio de cultivo se esteriliz en autoclave a 121C durante 15 minutos.

Optimizacin de fuente de carbono: Las concentraciones de glicerol ensayadas fueron: 1, 5, 10, 20 y 30 g/L. Se realizaron los cultivos por duplicado, en matraces de 2 L (300 mL) en un agitador orbital a 250 rpm y 35C, pH inicial 7. Se tomaron muestras a diferentes tiempos y se determinaron las concentraciones de glicerol remanente y de biomasa. Optimizacin de relacin carbono/nitrgeno (CN): Para la concentracin de glicerol ptima, se ensayaron las relaciones CN: 2, 5, 11 y 17, manteniendo la composicin del medio salvo la concentracin de (NH4)2SO4, que se modific para cumplir con las relaciones mencionadas. Los cultivos fueron realizados en matraces de 2 L, (300 mL) en un shaker orbital a 250 rpm y 35C. Se tomaron muestras a diferentes tiempos y se determinaron las concentraciones de glicerol y sulfato de amonio remanentes, biomasa y PHA. Procedimientos analticos: Cuantificacin de Biomasa: La densidad celular se determin mediante medidas de turbidometra a 600nm en espectofotmetro (Unico). Cuantificacin de glicerol: Las muestras se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para la determinacin de la concentracin de glicerol residual mediante HPLC (Cromatografa lquida de alto rendimiento) con un equipo Shimadzu con una columna Shodex sugar KS-801 (8 mm x 300 mm) a 55C, utilizando agua MilliQ como eluente, a un caudal de 0.7 mL/min. Cuantificacin de PHA: Los pellets obtenidos se secaron y se sometieron a un proceso de hidrlisis y propanlisis basado en el mtodo prouesto por Riis et al. (8) para la posterior cuantificacin de los propil-esteres mediante cromatografa gaseosa, con un GC Shimadzu, equipado con una columna Agilent DB-WAX (30m x 0,25mm x0,5 m) y detector FID. El gas carrier utilizado fue H2 y el volumen de inyeccin 1L. Se utilizaron PHB y PHBV (Sigma) como estndares. Cuantificacin de amonio: La concentracin de amonio residual fue realizada mediante un mtodo potenciomtrico con un electrodo de ion selectivo de amonio (Orion) y se expresa como g/L de (NH4)2SO4. RESULTADOS Y DISCUSIN Evaluacin de la concentracin ptima de glicerol Se realizaron ensayos preliminares en placa observndose que el Bacillus sp era capaz de crecer utilizando glicerol como fuente de carbono y presentaba acumulacin de PHA

(tincin con Negro Sudn), por lo que se propuso realizar el estudio cultivando el Bacillus sp. en matraces agitados con concentraciones de glicerol de: 1, 5, 10, 20 y 30 g/L. En las figuras 1 y 2, se muestran los valores obtenidos de biomasa producida y concentracin de glicerol residual, respectivamente, para cada una de las condiciones ensayadas. Como se observa en la Figura 1, cuando la concentracin inicial de glicerol fue de 1g/L, se obtuvo el menor crecimiento, observndose un leve aumento de la biomasa a las 20 horas llegando a 0,4 g/L. El crecimiento observado, est de acuerdo con la disminucin del glicerol a las 20 horas, llegando a una concentracin prxima a 0 a partir de ese tiempo, como se muestra en la Figura 2. Para el ensayo con una concentracin inicial de 5 g/L de glicerol, se alcanz a las 36 horas un crecimiento de1,6 g/L de biomasa que coincide con una concentracin de glicerol remanente prxima al lmite de deteccin del mtodo de cuantificacin.

Figura 1: Concentracin de biomasa a lo largo del tiempo para las concentraciones de glicerol inicial ensayadas.

Figura 2. Concentracin de glicerol remanente a lo largo del tiempo para las concentraciones de glicerol inicial ensayadas.

En los ensayos a concentraciones de 10, 20 y 30 g/L, se observa una velocidad de crecimiento menor,dado que a las 20 horas se obtienen concentraciones de biomasa menores que para el caso de 5g/L de glicerol. A partir de las 36 horas no se observan diferencias significativas, salvo para el caso de mayor concentracin de glicerol que alcanza el nivel de biomasa mxima a las 50 horas de cultivo. En la Figura 2, se observa que para las concentraciones iniciales de glicerol mencionadas, siempre existi glicerol residual, registrndose un consumo de 5, 7 y 10 g/L de glicerol respectivamente. Los rendimientos de produccin de biomasa en funcin del glicerol consumido (Yx/s) para cada uno de los ensayos, se presentan en la tabla 1. El mayor rendimiento de biomasa (0,25 g/g) se obtuvo para la concentracin 5 g/L de glicerol en el medio de cultivo.
Tabla 1. Rendimientos de produccin de biomasa respecto al consumo de sustrato

Glicerol (g/L) 1 5 10 20 30

YX/S (g/g) 0.09 0.25 0.23 0.18 0.15

A partir de este grupo de ensayos, se puede concluir que no existe una inhibicin del crecimiento al aumentar la concentracin de glicerol inicial. Debido a que la fuente de carbono est en exceso en los ensayos con concentraciones superiores a 5 g/L, el crecimiento obtenido podra estar limitado por algn otro nutriente que no se encuentra en la cantidad suficiente en el medio definido presentado en la seccin anterior. Hay que considerar que el medio formulado es un medio mnimo, por lo que para lograr mayores rendimientos, sera necesario complementarlo, por ejemplo con medios complejos (3, 5 y 6). Dado que se observaron diferentes consumos de glicerol para los ensayos de 10, 20 y 30 g/L de glicerol, y se obtuvo una concentracion de biomasa similar, se podra inferir que el flujo de carbono se dirige por vas metablicas que no implican la produccin de biomasa. Para estudiar la acumulacin de PHA por parte del Bacillus sp., se tom la concentracin de 5 g/L de glicerol, ya que a dicha concentracin se obtuvo el mayor Yx/s, es decir el mejor aprovechamiento de sustrato para la mxima produccin de biomasa. Evaluacin de relacin CN Varios trabajos con bacterias del gnero Bacillus han reportado la importancia que la relacin CN tiene en la capacidad de acumular PHA (4, 5). .Para evaluar la influencia de la relacin CN para el Bacillus sp, se ensayaron las siguientes relaciones CN: 2, 5, 11 y 17.

En las Figuras 3, 4 y 5, se presentan la biomasa producida , el glicerol y sulfato de amonio remanentes, respectivamente.

Figura 3: Contenido de biomasa en los matraces en el tiempo de cultivo para las relaciones de CN: 2, 5 11 y 17.

Figura 4: Contenido de glicerol residual en los matraces en el tiempo de cultivo para las relaciones de CN: 2, 5 11 y 17.

La relacin CN 2, es aquella en que se tiene la mayor concentracin de amonio inicial. El crecimiento obtenido es menor al registrado en los ensayos anteriores, lo cual no se explicara por limitacin de nutrientes, ya que el N est en exceso y el resto de los componentes se mantuvieron en las concentraciones especificadas. La concentracin de sulfato de amonio fue 5 veces mayor con respecto a la que se utiliz en los ensayos anteriores. Esta concentracin podra ser inhibitoria, explicando de esta forma el

comportamiento observado. Aunque la concentracin mnima inhibitoria de

crecimiento de fuente de nitrgeno depende del orgen de la fuente y de cada microorganismo, la inhibicin por sulfato de amonio ya ha sido reportada con anterioridad en Bacillus. Sabra et. al.(9) report que concentraciones de amonio mayores a 0,4 g/L inhiben el crecimiento y puede ser responsable del comienzo de la fase estaconaria de Bacillus megaterium.
Al aumentar la relacin CN a un valor de 5, es decir disminuir la concentracin de N con respecto al C, se obtuvo la mxima cantidad de biomasa formada, llegando a valores de 2,2 g/L, con una remocin del 83% del glicerol (figura 4). El consumo de sulfato de amonio a las 40 horas fue de 0,45 g/L.

Figura 5: Contenido de sulfato de amonio residual en los matraces en el tiempo de cultivo para las relaciones de CN: 2, 5 11 y 17.

En las figuras 3 y 4, se observa que las relaciones de CN 11 y 17, presentan un comportamiento similar en lo que respecta a la formacin de biomasa y el consumo de amonio. En ambos casos se llega a una concentracin de biomasa mxima a las 20 horas de cutlivo, con valores de 1,7 y 1,1 g/L, para CN 11 y 17 respectivamente. A dichos tiempos tambin se observa la mxima remocin de amonio, permaneciendo la concentracin residual sin variacin hasta el final del tiempo de cultivo. El consumo mximo de amonio fue de 0,7 g/L y 0,65 g/L respectivamente. Al aumentar la relacin CN, la cantidad de N agregado es menor, pero el porcentaje de nitrgeno removido es mayor, lo que hace suponer un cambio en la composicin celular o en el metabolismo del microorganismo. La fuente de nitrgeno se comport como sustrato limitante para las relaciones CN 11 y 17. En el caso de la relacin CN2, el sulfato de amonio podra haber actuado como inhibidor del crecimiento. La relacin CN que permiti alcanzar una mayor concentracin de biomasa fue la de 5 g/L .

En lo que respecta a la produccin de PHA, se observ que los valores obtenidos por cromatografa gaseosa fueron muy bajos,. encontrndose por encima del nivel de deteccin pero por debajo del nivel de cuantificacin. En algunas de las muestras, se constataron dos picos a tiempos de retencin que corresponden a los esteres proplicos de butirato y valerato. Esta capacidad de produccin de PHB-co-HV por parte de un Bacillus sp.a partir de glicerol, ya ha sido reportada con anterioridad (10) Debido a la baja proporcin de PHA, no es posible una cuantificacin certera. El mayor porcentaje de acumulacin de PHA se determin en la relacin CN 5, siendo de 5 % . Las relaciones de CN menores, producen incluso menor acumulacin de PHA. A lo largo de todos los cultivos se verific presencia de esporas mediante la tincin de frotis con verde malaquita. Wu et al (2), mostr que a diferencia de los cultivos estndar para la produccin de PHA con altas relaciones CN (por ejemplo Ralstonia eutropha, Pseudomonas putida,etc.), en Bacillus sp. era difcil promover la acumulacin de PHA, dado que esas situaciones inducen la esporulacin. Por todo lo anterior, la concentracin de PHA producida por esta bacteria, bajo las condiciones estudiadas es muy reducida, por lo que se debe seguir estudiando otras condiciones que afectan el crecimiento y acumulacin de PHA. La confirmacin de la estructura molecular del PHA almacenado por este microorganismo podra incremenentar el inters por el desarrollo de un sistema de produccin, en caso que se confirme la presecia de PHV.

CONCLUSIN El Bacillus sp. fue capaz de crecer a partir de glicerol. Se obtuvo una concentracin de biomasa de 2,2 g/L para la concentracin de glicerol de 5 g/L, en un medio mnimo definido. Se determin que para la relacin CN 5 se obtiene mayor acumulacin de PHA, que corresponde a un 5%. Se evidenci que el Bacillus sp. podra llegar a acumular dos monmeros distintos de PHA.

REFERENCIAS 1-Dbora Jung Luvizetto Faccin, Ivana Martins, Nilo Srgio Medeiros Cardozo, Rosane Rech, Marco Antnio Zchia Ayub, Tito Lvio Moitinho Alves, Rossano Gambetta and Argimiro Resende Secchi: Optimization of C:N ratio and minimal initial carbon source for poly(3-hydroxybutyrate) production by Bacillus megaterium. J Chem Technol Biotechnol 2009, 84:1756-1761. 2-WuQ, HuangH, HuG, ChenJ, HoKP and ChenGQ, Production of poly-3hydroxybutyrate by Bacillus sp. JMa5 cultivated in molasses media. Antonie van Leeuwenhoek 80:111118 (2001). 3- S.P. Valappil, S.K. Misra, A.R. Boccaccini, T. Keshavarz, C. Bucke, I. Roy: Large scale production and efficient recovery of PHB with desirable material propierties, from

the newly characterized Bacillus cereus SPV. Journal of Biotechnology 132 (2007) 251258. 4- Shilpi Khanna, A.K. Srivastava: Computer simulated fed-batch cultivation for over production of PHB:A comparison of simultaneous and alternate feeding of carbon and nitrogen. Biochemical Engeneering Journal 27(2006) 197-203. 5-Nisha V Ramadas, Sudheer Kumar Singh, Carlos Ricardo Soccol and Ashok Pandey: Polyhydroxybutyrate Production using Agro-industrial Residue as Substrate by Bacillus sphaericus NCIM5149. Braz. Arch. Biol. Technol. V.52 n.1:pp.17-23, Jan/Feb 2009. 6- Prakash M. Halami: Production of polyhydroxyalkanoate from starch by the native isolate Bacillus cereus CFR06. World J Microbiol Biotechnol 2008, 24:805-812. 7- John A. Posada, Javier M. Naranjo, Jimmy A. Lopez, Juan C. Higuita, Carlos A. Cardona: Design and analysis of poly-3-hydroxybutyrate production processes from crude glycerol.Process Biochemistry 46 (2011) 310-317. 8- V. Riis, W. Mai, 1988. Gas chromatographic determination of poly- -hydroxybutyric acid in microbiol biomass after hydrochloric acid propanolysis. J. Chromatogr. 445, 285 289. 9-W, Sabra y D.M. Abou-Zeid, Improving feeding strategies for maximizing polyhydroxybutyrate yield by Bacillus megaterium, Research Journal of Microbiology (2008), 3 (5), 308-318 10-S. Vishnuvardhan Reddy, M. Thirumala, S. K. Mahmood, A novel Bacillus sp. accumulating poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) from a single carbon substrate, J Ind Microbiol Biotechnol (2009) 36:837843.

Analia Banacore, estudiante de Licenciatura en Ciencias Biolgicas opcin Biotecnologa y Licenciatura en Bioqumica. Estudiante de tesina de grado en el Departamento de Bioingeniera de Facultad de Ingeniera.