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BME
Glicerol Roth
Glutamina Sigma
HCl Merck
HEPES (cido N-(2-hidrxietil)-piperazina-N-2-etanossulfnico) Roche Diagnostics
KCl Roth
KH
2
PO
4
Merck
LPS Sigma
LPS (lipopolissacardeo) Sigma
MgCl
2
Merck
Na
2
HPO
4
Merck
NaCl Roth
NaN
3
Merck
NP-40 (Nonidet P-40) Sigma
Penicilina Roche
PMSF (fluoreto de fenilmetil sulfonil) Sigma
PNPP (fosfato de p-nitrofenila) Sigma
Poly dIdC (cido polidexiinosnico e dexicitidlico) Roche Molecular Biochemicals
RPMI 1640 (Rochester Polytechnical Medicinal Institute 1640) Gibco
SDS (dodecil sulfato de sdio) Roth
Estreptomicina Roche
TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina) Roth
TNF- (fator de necrose tumoral-) Roche
F. Ensaios biolgicos 190
Tris (tris-(hidrximetil)-aminometano) Roth
Tripsina-EDTA Gibco BRL
Tween-20 Roth
Papel Whatman 3 MM Schleicher & Schll
Zeocina Invitrogen
Tabela F2. Anticorpos, enzimas e kits utilizados nos ensaios relacionados ao NF-B.
Anticorpos, enzimas e kits Marca
Biotinylated mouse-anti-human IL-8 monoclonal antibody Pharmingen
Quick Start
FM
Bradford Protein Assay Bio-Rad
Colunas MicroSpin G-25 Amersham Pharmacia Biotech
Luciferase Reporter Gene Assay System Roche
Oligonucleotdeo para EMSA Promega
Purified mouse-anti-human IL-8 monoclonal antibody Pharmingen
Recombinant human IL-8 Pharmingen
Streptavidin-biotin alkaline phosphatase, StreptAB Complex/AP Dako
T4-Polinucleotdeo quinase Promega
Tabela F3. Materiais utilizados nos ensaios relacionados ao NF-B.
Materiais Marca
Frascos para cultura de clulas Greiner
Microplaca de 96 poos Greiner
Microplaca de F96 poos Maxisorp-Immuno Nunc
Microplaca F96 poos Lumitrac branca Greiner
Pipeta automtica Eppendorf e Gibson
Pipetador para pipeta graduada Eppendorf
Pipeta graduada descartvel Greiner
Pipeta multicanal Eppendorf
Pipeta Multistepper Brand
Placas de 6, 12 e 24 poos Greiner
Placas de Petri de 6 e 16 cm de dimetro Greiner
Tubos Eppendorf safe-lock Eppendorf
Tubos de 15 e 50 mL Falcon
Tubos de reao de 1,5 mL tipo Eppendorf Greiner
F. Ensaios biolgicos 191
Tabela F4. Aparelhos utilizados nos ensaios relacionados ao NF-B.
Aparelhos Marca
Balana analtica Mettler Toledo
Bomba de vcuo Roth
Cmara de Neubauer Sigma
Cmara par gel de eletroforese Thoma
Capela de fluxo laminar CleanAir Techniek Biohazard
Centrfuga Rotina 35 R Hettich AG
Contador de clulas Wellhfer Dosimetrie
Estufa Thermo Forma Thermo Forma Lifescience
Flambador Wartewig
Microplaca Luminometer LB 96V (Micro Lumat Plus) EG & G Bechthold
Microcentrfuga Biofuge Fresco Heraeus
Microcentrfuga Eppendorf 5417R Eppendorf
Microplaca Reader Model 550 Bio-Rad
Microscpio Nikon TMS Nikon
Misturador magntico IKAMAG RCT Jahnke & Kunkel
pH-Metro CG 825 Schott
Phosphoimager FLA-3000 Fuji Photo Film Co. Ltd.
Secador para gel de eletroforese Bio-Rad
Vortex Genie 2 Scientific Industries
2.2.2. Cultura de clulas
2.2.2.1. Linhagens celulares
- Clulas Jurkat T: clulas T de leucemia humana aguda (Schneider et al., 1977),
DSZM Nr.: ACC282;
- Clulas 293 (clulas aderentes): linha permanente de clulas embrionrias
primrias de rim humano transformadas por adenovrus humano do tipo 5 DNA
(Graham et al., 1977), ATCC Nr.: CRL1573;
- Clulas 293 estavelmente transfeccionadas (clulas aderentes): clulas 293
transfeccionadas com vetor pNF-B-Luc, com gene para luciferase, promotor para
NF-B e pZeoSV, gene de resistncia ao antibitico zeocina (Lindenmeyer et al.,
2004);
- Clulas Raw 264.7 (clulas aderentes): macrfagos leucmicos de rato induzidos
pelo vrus Abelson (Ralph e Nakoinz, 1977);
- Clulas HeLa 229 (clulas aderentes): tecido epitelial de adenocarcinoma cervical,
isoladas de Henrietta Lacks (Jones, Jr. et al., 1971), ATCC Nr.: CCL2.1.
F. Ensaios biolgicos 192
2.2.2.2. Congelamento de clulas
- As clulas devem ser soltas das paredes do recipiente, se necessrio;
- Desprezar o meio de cultura por aspirao;
- Adicionar 10 mL de novo meio de cultura e ressuspender as clulas;
- Transferir 8 mL da suspenso celular para tubo Falcon de 15 mL;
- Centrifugar por 5 min a 1.200 rpm (400 g) a 4 C;
- Desprezar o meio de cultura sobrenadante por aspirao;
- Ressuspender as clulas em 9 mL FCS e 1 mL DMSO;
- Aliquotar a suspenso celular em tubos de 1 mL e congelar a 80 C.
2.2.2.3. Descongelamento de clulas e meios de cultura
Para descongelar as clulas, basta adicionar o contedo do tubo de clulas
descongeladas ao longo de 30 min ao meio de cultura adequado: clulas Jurkat T e HeLa 229
em meio RPMI 1640 e clulas Raw 264.7, 293 e 293 estavelmente transfeccionadas em meio
DMEM. Todos os meios foram suplementados com 2 mM glutamina, 10 % de FCS, 100
IU/mL de penicilina e 100 g/mL de estreptomicina.
2.2.2.4. Clulas em suspenso
As clulas Jurkat T so cultivadas em frasco de 175 cm
2
a 37 C e 5 % CO
2
. A
densidade deve ser mantida entre 2 x 10
5
e 1 x 10
6
clulas/mL. Na diluio, realiza-se a
contagem das clulas em cmara de Neubauer. Um dado volume da suspenso transferido
para um novo frasco e adicionado meio de cultura previamente aquecido em q.s.p. cerca de
30 mL. Esse processo deve ser realizado a cada dois ou trs dias.
2.2.2.5. Clulas aderentes
As clulas 293 e 293 estavelmente transfeccionadas so cultivadas em frascos de 175
cm
2
e as clulas HeLa 229 em frascos de 75 cm
2
. J as clulas Raw 264.7 so cultivadas em
placas de Petri de 16 cm de dimetro a 37 C e 5 % CO
2
. Todas as culturas so mantidas na
posio horizontal a uma densidade abaixo de 80 % da confluncia.
As clulas 293 so soltas do frasco por shake-off, ou seja, forte agitao. A partir
disto possvel homogeneizar a suspenso e contar as clulas, para ento avaliar a
necessidade de diluio com meio DMEM geralmente em q.s.p. 30 mL.
As clulas 293 estavelmente transfeccionadas so manipuladas da mesma forma que
as clulas 293. Porm, durante o processo de cultivo, elas recebem 15 L do antibitico
F. Ensaios biolgicos 193
zeocina, com o intuito de manter apenas a linha transfeccionada e impedir que clulas
mutantes com perda da transfeco se multipliquem.
As clulas Raw 264.7 so desprendidas da placa com auxlio de uma esptula
apropriada, a suspenso ento homogeneizada com auxlio de pipeta descartvel e a 2 mL de
suspenso celular em nova placa so adicionados 8 mL de meio aquecido DMEM.
As clulas HeLa 229 so to aderentes que devem ser tratadas com tripsina para que se
soltem da parede do frasco. A tripsina uma enzima proteoltica que, juntamente com EDTA,
desnatura protenas e complexa o clcio, que responsvel pela aderncia, permitindo que as
clulas se desprendam por meio de agitao (Richter, 2003). O processo consiste em:
- Desprezar o meio de cultura e as clulas continuam aderidas;
- Adicionar 3 mL de tampo PBS* estril, para lavar;
- Desprezar o tampo PBS por aspirao;
- Adicionar 2 mL de tripsina com EDTA aquecidos a 37 C;
- Incubar por apenas 5 min a 37 C;
- Adicionar 8 mL de meio RPMI 1640 e homogeneizar;
- Transferir a suspenso celular para tubo Falcon de 15 mL;
- Centrifugar por 5 min a 1600 rpm (533 g) a 4 C;
- Desprezar o sobrenadante por aspirao;
- Adicionar 10 mL de meio RPMI 1640 e homogeneizar o precipitado de clulas;
- Adicionar a 2,5 mL de suspenso celular em novo frasco cerca de 10 mL de meio
RPMI 1640.
* Tampo PBS (10x): 80 g NaCl (1,37 mM), 2 g KCl (27 mM), 7,65 g Na
2
HPO
4
* 2H
2
O (43 mM), 2 g KH
2
PO
4
(14 mM), 1 L gua Millipore
esterilizada.
Esta mistura foi incubada por 40 min a 37 C. A purificao do produto foi realizada
por meio da coluna cromatogrfica MicroSpin G-25. A coluna foi centrifugada para ocorrer a
eluio, levando obteno de cerca de 50 L de oligonucleotdeo marcado, que foram
armazenados a 4 C.
2.2.3.3.2. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)
2.2.3.3.2.1. Gel
O gel de poliacrilamida (4 %) deve ser preparado algumas horas antes da sua
utilizao. O gel foi preparado misturando-se:
- 56,5 mL de gua Millipore
;
- 7 mL de tampo TBE* 5x;
- 10 mL de soluo de acrilamida;
- 40L de TEMED;
- 400 L APS (10 %).
* Tampo TBE 10x: 108 g Tris, 55 g cido brico, 40 mL 0,5 M EDTA pH 8 em 1 L gua Millipore
Com a adio de APS e TEMED a reao de polimerizao foi iniciada, sendo que
dentro de no mximo 5 min o gel assume sua forma definitiva. A cmara foi montada com
placas de vidro, espaadores de plstico e presilhas de metal, sendo que a placa de vidro
superior recebeu Gel Slick
;
- 1 L de oligonucleotdeo radioativo marcado com
32
P (0,5 g correspondem a ~25
fmol, ~100.000 c.p.m., Cerenkov - 3000 Ci/mmol).
A cada amostra de 5 L de extrato de protena foram adicionados 14 L de EMSA
mix. As amostras foram centrifugadas por 15 segundos e incubadas por 25 min a temperatura
ambiente.
* Tampo D
+
: 20 mM HEPES, pH 7,9; 20 % glicerol, 100 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 0,25 % NP-40, 2 mM DTT,
0,1 % PMSF
** Tampo F: 20 % Ficoll 400, 100 mM HEPES, 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1 % PMSF
2.2.3.3.2.3. EMSA
O gel foi acondicionado no suporte apropriado com tampo TBE 0,5x. Foi efetuada
pr-corrida de 10 min a 200 V. No gel foi ento aplicado um corante com bromofenol, que
serve como um marcador visual. As amostras foram aplicadas no gel e a separao das bandas
se deu a 200 V aps 90 min ou 10 cm de corrida do corante.
O gel foi tirado do suporte e da cmara, aderido a uma folha de papel Whatman 3
MM, coberto com folha de plstico e secado em secador de gel sob vcuo a 80 C. O tempo
de secagem foi de aproximadamente 50 min
Depois de seco, o gel foi exposto a um filme Phosphoimager-BAS. Depois de
exposio do gel por cerca de 24 a 48 horas, os sinais foram detectados pelo aparelho
Phosphoimager.
F. Ensaios biolgicos 197
2.2.4. Luciferase
2.2.4.1. Produo de luciferase
Por meio de reporter gen assay possvel avaliar atividades especficas de promotores
e indutores com vistas regulao mediante fatores de transcrio. O mais utilizado aquele
destinado produo de luciferase, enzima que catalisa a oxidao de luciferin a oxiluciferin
com liberao de luz, a qual quantificada por luminmetro. Para que a produo ocorra, as
clulas devem ser transfeccionadas. Transfeco consiste em introduzir em clulas
eucariticas um DNA estranho. Para tanto, vrios mtodos foram desenvolvidos, como
mecnico, eltrico, qumico e biolgico. Por meio do mtodo qumico com lipossoma um
plasmdeo contendo o gene para luciferase, o promotor para NF-B e um gene selecionador
que confere resistncia a um antibitico, zeocina, as clulas 293 foram transfeccionadas. Os
lipossomas penetram facilmente nas clulas liberando o plasmdeo. Aps dois dias, as clulas
que assimilaram o DNA esto aptas a produzir luciferase. A presena do gene que confere
resistncia determinante para a manuteno do clone celular selecionado, por isso dito
estvel (Lindenmeyer, 2004).
Quando as clulas so estimuladas com TNF-, o NF-B liberado e migra para o
ncleo, ligando-se ao gene promotor e assim inicia-se a sntese de luciferase. Quando na
presena de uma substncia-teste no se observa a produo de luciferase, o que pode estar
ocorrendo : interferncia direta na ligao do NF-B com o DNA; que a substncia inibe a
enzima luciferase propriamente dita; que inibe a liberao do NF-B; que inibe o NF-B
diretamente; que inibe o processo de transcrio. O processo de transcrio bastante
complexo, por isso o reporter gen assay uma ferramenta importante para avaliar-se o
mecanismo de ao dos metablitos que inibem o processo normalmente desencadeado pelo
fator de transcrio NF-B.
2.2.4.1.1. Ativao do NF-B
As clulas 293 estavelmente transfeccionadas foram plaqueadas sem zeocina na
densidade de 2 x 10
5
clulas/mL em placas de 24 poos, em volume de 1 mL. Aps dois dias
deu-se incio ao experimento, quando a densidade de clulas devia estar em torno de 8 x 10
5
clulas/mL. Os poos foram marcados considerando as amostras os controles positivos ,
que receberam apenas estmulo e os negativos , que no receberam nenhum o estmulo. As
amostras foram incubadas por uma hora a 37 C com 5 % CO
2
na presena das substncias-
teste em diferentes concentraes. Aps este perodo, as amostras receberam 2 L (5 g/mL
ou 2000 U/mL) de TNF- e foram incubadas por mais trs horas.
F. Ensaios biolgicos 198
2.2.4.1.2. Extrato de protenas totais
O extrato de protenas foi preparado conforme procedimento a seguir:
- Homogeneizar as clulas j estimuladas com pipeta;
- Transferir as clulas para tubos tipo Eppendorf, acondicionados no gelo;
- Centrifugar por 10 min a 3.000 rpm (230 g) a 4 C;
- Desprezar o sobrenadante por aspirao;
- Adicionar 1 mL de tampo PBS gelado e homogeneizar;
- Centifugar por 3 min a 13.000 rpm (1.000 g) e 4 C;
- Desprezar o sobrenadante por aspirao;
- Ressuspender as clulas com 150 L de tampo de lise do kit Luciferase Reporter
Gene Assay System;
- Deixas em repouso por 15 min a temperatura ambiente para que ocorra a lise de
membranas;
- Centrifugar por 3 min a 13.000 rpm (1.000 g) e 4 C;
- Usar o sobrenadante para o ensaio com luciferina e determinao de protenas
totais.
2.2.4.1.3. Anlise da produo de luciferase
A produo da enzima luciferase foi determinada por meio do kit Luciferase Reporter
Gene Assay System. Para isso, 50 L do extrato de protenas foram pipetados em microplaca
96 poos-Lumitrac-Platte com fundo branco. O substrato luciferina foi preparado
adicionando-se 10 mL do tampo de reao do kit com o p do substrato. O substrato foi
fornecido ao aparelho luminmetro, o qual injetou automaticamente 100 L do mesmo em
cada amostra e a leitura foi feita aps 0,5 segundos com medidas de 3 segundos para emisso
de luz. O fton liberado durante a reao de transformao da luciferina em oxiluciferina foi
detectado e integrado pelo aparelho.
2.2.4.1.4. Determinao de protenas totais
A atividade da enzima foi normalizada pelo total de protenas de cada amostra,
determinado com auxlio do kit Quick Start
FM
Bradford Protein Assay. Foram pipetados 5 L
de extrato de protenas e de padro BSA em diferentes concentraes em microplaca de 96
poos. cada amostra ou padro foram adicionados 250 L do reagente Dye do kit. A
microplaca foi deixada em repouso por 30 min a temperatura ambiente e logo aps a absoro
a 595 nm foi medida em Microplate Reader.
F. Ensaios biolgicos 199
2.2.4.2. Atividade enzimtica da luciferase
A enzima QuantiLum Recombinant Luciferase (14,6 mg/mL), parte do kit Luciferase
Reporter Gene Assay System, foi dissolvida em tampo de lise com BSA (1 mg/mL) para que
a concentrao final de 1 g luciferase/15 L tampo. A luciferase foi ento incubada por
uma hora a temperatura ambiente com as substncias-teste, sendo que 0,5 L de soluo a 10
mM origina uma concentrao final de 100 M. Logo aps, 15 L da soluo de reao em
microplaca de 96 poos-Lumitrac-Platte com fundo branco receberam 50 L da soluo de
substrato sob injeo automtica do luminmetro e a leitura foi efetuada.
2.2.5. IL-8
A interleucina-8 tambm produzida em decorrncia da transcrio induzida pelo
fator de transcrio NF-B. A diferena para com o ensaio anterior est no fato da IL-8 ser
uma substncia endgena. J a luciferase produzida nas clulas estudadas atravs de um
sistema artificialmente construdo. As clulas empregadas para este ensaio so as HeLa 229.
A produo de IL-8 aps incubao das clulas com substncias-teste e estimulao
com TNF- pode ser quantificada por meio de ELISA (Fig. F12). O princpio da tcnica
consistiu basicamente em fixar um anticorpo em uma microplaca adsorvente, bloquear os
pontos adsorventes remanescentes com protenas inespecficas, fornecer um antgeno ao
anticorpo, acrescentar um outro anticorpo marcado com uma protena, formando um
sanduche, fornecer ento uma enzima que se liga protena marcadora e a seguir um
substrato para a enzima. A reao de degradao do substrato leva formao de um produto
colorido, cuja intensidade de absoro facilmente medida em espectrofotmetro. Assim, as
protenas inespecficas so as presentes no soro fetal bovino, o anticorpo inicial o anti-IL-8,
o antgeno a IL-8 produzida pelas clulas, o segundo anticorpo o anti-IL-8 marcado com a
protena biotina, a enzima a streptavidin-biotin alcalino fosfatase e o substrato o p-
nitrofenilfosfato, cuja degradao gera produto amarelo p-nitrofenila.
F. Ensaios biolgicos 200
Figura F12. Apresentao esquemtica de ELISA (http://www.activemotif.com/).
2.2.5.1. Solues
- Tampo PBS 10x (item 2.2.2.5);
- Tampo de lavagem: 1 L tampo PBS 1x, 0,5 mL Tween-20 (0,05 %);
- Soluo de ligao: 0,1 M Na
2
HPO
4
, pH 9,0;
- Tampo de bloqueio: 18 mL de tampo PBS 1x, 2 mL de FCS (10 %) preparar
no momento da utilizao;
- Tampo de bloqueio/Tween-20: 20 mL tampo bloqueio, 10 L Tween-20 (0,05
%);
- Tampo para substrato ELISA:
- 100 mg NaN
3
;
- 400 mg MgCl
2
*6H
2
O;
- 48,5 mL dietanolamina;
- pH 9,8 com HCl.
F. Ensaios biolgicos 201
2.2.5.2. ELISA
A processo requer trs dias de trabalho, como apresentado a seguir.
1
o
. Dia
- Plaquear as clulas HeLa 229 na densidade de 25 x 10
3
clulas/mL em placas de
24 poos no volume de 1 mL;
- Adicionar 30 L de mouse Anti-IL-8-Antibody a 5 mL da soluo de ligao;
- Pipetar 50 L soluo acima/poo da microplaca de 96 poos - Immunosorbant-
Platte;
- Cobrir a placa com parafina e incubar por uma noite a 4 C.
2
o
. Dia
- Trocar o meio de cultura das clulas por 1 mL de meio novo;
- Incubar clulas por 1 hora a 37 C com 5 % CO
2
na presena das substncias-teste;
- Estimular clulas por 6 horas com 2,4 L (6 g/mL ou 2.400 U/mL) de TNF- ou
por 24 horas com 0,8 L (2 g/mL ou 800 U/mL) de TNF-;
- Despejar o sobrenadante da microplaca;
- Lavar a microplaca quatro vezes com 200 L tampo de lavagem/poo;
- Bloquear com 200 L tampo de bloqueio/poo por 2 horas a temperatura
ambiente;
- Lavar trs vezes com 200 L tampo de lavagem/poo;
- Adicionar 100 L/poo de sobrenadante da cultura de clulas e de padres de IL-8:
- Padro IL-8 recombinante a 50 g/L (estoque):
- 1 L soluo estoque + 1.249 L de meio RPMI 1640 (a) - 1 g/25
L;
- 25 L de a + 1.225 L de meio (b) 800 g/mL;
- 500 L de b + 500 L de meio (c) 400 g/mL;
- 500 L de c + 500 L de meio (d) 200 g/mL;
- 500 L de d + 500 L de meio (e) 100 g/mL;
- 500 L de e + 500 L de meio (f) 50 g/mL;
- 500 L de f + 500 L de meio (g) 25 g/mL;
- 500 L de g + 500 L de meio (h) 12,5 g/mL;
- 500 L de meio (i) 0 g/mL.
F. Ensaios biolgicos 202
3
o
. Dia
- Despejar o sobrenadante da microplaca;
- Lavar a microplaca quatro vezes com 200 L tampo de lavagem/poo;
- Adicionar 5 L biotinylated mouse Anti-IL-8-Antibody a 10 mL de tampo de
bloqueio/Tween-20 (0,05 %);
- Pipetar 100 L da soluo acima/poo;
- Incubar por 1 hora a temperatura ambiente;
- Enquanto isso, preparar conjugado:
- 491 L de PBS 1x;
- 4,5 L de StreptavidinA (soluo A);
- 4,5 L de AP biotinilada (soluo B);
- Misturar em Vortex, incubar por 30 min a temperatura ambiente;
- Adicionar a estes 500 L 24,5 mL PBS 1x;
- Despejar o sobrenadante da microplaca;
- Lavar a microplaca quatro vezes com 200 L tampo de lavagem/poo;
- Pipetar 50 L conjugado/poo;
- Incubar por 1 h a 37 C;
- Minutos antes solubilizar um comprimido de PNPP em 5 mL tampo substrato
ELISA e incubar por 5 min a 37 C;
- Despejar o sobrenadante da microplaca;
- Lavar a microplaca quatro vezes com 200 L tampo de lavagem/poo;
- Pipetar 50 L de soluo de substrato/poo;
- Incubar por 20 min a 37 C no escuro;
- Medir a intensidade de absoro do produto amarelo a 405 nm em Microplate
Reader.
2.2.6. Citotoxicidade
Procedimento geral:
- Aps estimulao das clulas, adicionar 0,5 mL MTT;
- Incubar por 3 h a 37 C em estufa com CO
2
;
- Centrifugar amostras a 13.000 rpm (1000 g);
- Desprezar o sobrenadante por aspirao;
- Dissolver o precipitado formazan, produto colorido resultante da metabolizao do
MTT, por clulas vivas com 100 L DMF/SDS por 16 h a 37 C;
F. Ensaios biolgicos 203
- Misturar e transferir 100 L do sobrenadante para microplaca de 96 poos;
- Medir a absoro a 595 nm em Microplate Reader.
2.3. Ensaios relacionados enzima elastase
A elastase secretada por neutrfilos, clulas importantes do complexo sistema
sangneo, portanto necessrio isol-las. As clulas isoladas so tratadas ento com
citocalasina B, que promovem o relaxamento do citoesqueleto, favorecendo a exocitose. A
secreo ocorre de fato aps a estimulao das clulas, e a quantidade secretada pode ser
medida por meio de uma reao enzimtica, cujo produto colorido. Esta reao ocorre entre
a enzima elastase e um substrato apropriado, SAAVNA, e o produto amarelo a p-
nitroanilina.
2.3.1. Reagentes, materiais e aparelhos
Nas tabelas abaixo so apresentados todos os reagentes, anticorpos, enzimas, kits,
materiais e aparelhos utilizados para realizao de todos os ensaios relacionados enzima
elastase e seus respectivos fornecedores.
F. Ensaios biolgicos 204
Tabela F5. Reagentes utilizados nos ensaios realizados com elastase.
Reagentes Marca
cido ctrico Sigma
BSA fraction V (albumina srica bovina) Roth e Sigma
CaCl
2
Merck
Citocalasina B Sigma
Dextran T500 Amersham Pharmacia Biotech
DMF (N,N-dimetilformamida) Roth
DMSO (dimetilsulfxido) Roth
EtOH Roth
Ficoll-Paque
TM
Plus Amersham Pharmacia Biotech
fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina) Bachem
Giemsa Stain Fluka
Heparina-Na
+
Braun
HEPES (cido N-(2-hidrxietil)-piperazina-N-2-etanossulfnico) Roche Diagnostics
KCl Roth
KH
2
PO
4
Merck
LPS (lipopolissacardeo) Sigma
MeOH Roth
MgCl
2
Merck
MTT ((dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolio) Roth
Na
2
HPO
4
Merck
NaCl Roth
PAF (fator de agregao plaquetria) Bachem
PMA (12-miristato-13-acetato de forbol) Calbiochem
SAAVNA (Suc-Ala-Ala-Val-pNA) Bachem
Sacarose Acar comum
SB203580 Sigma
SDS (dodecil sulfato de sdio) Boehringer Mannheim
U0126 Sigma
F. Ensaios biolgicos 205
Tabela F6. Materiais utilizados nos ensaios realizados com elastase.
Materiais Marca
Agulha longa de seringa Braun
Balo volumtrico
Estantes
Lminas e lamnulas
Microplaca de 96 poos Greiner
Pipeta Multistepper Brand
Pipetas automticas Eppendorf
Pipetas de Pasteur Greiner
Ponteiras para pipeta Multistepper Brand
Provetas
Relgio
Seringas de 10 mL S-Monovette Li-Heparin e K-EDTA Sarstedt
Tubos de 15 e 50 mL Falcon
Tubos de reao de 1,5 mL tipo Eppendorf Greiner
Tabela F7. Aparelhos utilizados nos ensaios realizados com elastase.
Aparelhos Marca
Balana analtica Mettler Toledo
Banho-maria com agitao GFL
Bomba de vcuo Roth
Centrfuga Rotina 35 R Hettich AG
Estufa Thermo Forma Thermo Forma Lifescience
Microcentrfuga Biofuge Fresco Heraeus
Microcentrfuga Eppendorf 5417R Eppendorf
Microplate Reader Model 550 Bio-Rad
Microscpio Modelo Micro-Optic Nosch Zeiss
pH-Metro CG 825 Schott
Vortexer Genie 2 Scientific Industries
F. Ensaios biolgicos 206
2.3.2. Preparao de solues:
Algumas solues foram preparadas e armazenadas como solues estoque e outras
foram preparadas no mesmo dia do ensaio, denominadas solues frescas.
2.3.2.1. Solues estoque
- NaCl: 0,9 % (0,9 g em 100 mL gua Millipore
)
- Tampo PBS com/sem Ca
2+
/Mg
2+
:
- Soluo estoque PBS (concentrado 10 vezes):
80 g de NaCl (1,37 mM)
2 g de KCl (27 mM)
7,65 g de Na
2
HPO
4
* 2H
2
O (43 mM)
2 g de KH
2
PO
4
(14 mM)
1 L de gua Millipore
- Tampo PBS: diluir uma parte da soluo estoque PBS em nove
partes de gua Millipore
- Tampo PBS com Ca
2+
/Mg
2+
: diluir uma parte da soluo estoque
PBS em nove partes de gua Millipore
e adicionar:
0,9 mM CaCl
2
: 66,25 mg/500 mL
0,49 mM MgCl
2
: 49,75 mg/500 mL
- SAAVNA: 300 mM em DMSO (250 mg SAAVNA em 1735 L DMSO,
aliquotar)
- PAF: 10
2
M em EtOH (5,24 mg em 1 mL EtOH, aliquotar)*
- cido ctrico: 2 % (2 g em 100 mL de gua Millipore
)
- Citocalasina B: solubilizar 0,965 mg em 200 L DMSO e diluir com 800 L gua
Millipore
- MTT: 5 mg/mL (5 mg MTT em 1 mL de tampo PBS)
- DMF/SDS: 10 % SDS / 50 % DMF (5 g SDS em 25 mL tampo PBS, adicionar 25
mL DMF)
Variaes testadas: *fMLP: 10
2
M em EtOH (4,38 mg em 1 mL de EtOH, aliquotar).
PMA: 1 mg/mL em DMSO
LPS: 5 g/L
2.3.2.2. Solues frescas
- Dextran: 10 % (0,75 g Dextran com 7,5 g NaCl 0,9 %)
- Tampo albumina: 10 % (45 mg BSA em 45 mL de tampo PBS com Ca
2+
/Mg
2+
)*
F. Ensaios biolgicos 207
- Colocar recipiente com gua Millipore
no gelo
- SAAVNA: 45 mg de BSA em 45 mL tampo PBS com Ca
2+
/Mg
2+
(medido no
tubo Falcon), adicionar 154 L soluo estoque SAAVNA
- Tampo HEPES-sacarose:
- 10,954 g de sacarose em 80 mL de gua Millipore
- 250 L HEPES 1M
- pH 7,4
- q.s.p. 100 mL em balo volumtrico, manter a 4 C.
- PAF**:
- PAF 1: 25 L de soluo estoque PAF com 2475 L tampo
albumina
- PAF 2: 50 L de soluo 1 com 4950 L tampo albumina
- Solues de substncias-teste:
- Soluo estoque: 100 mM (massa [mg]/massa molecular* 10)* 100
= volume DMSO [L] e diluir para 50, 20, 10, 5, 2, 1 e 0,5 mM
Variaes testadas: * Roth foi usada normalmente, Sigma s para comparao
** fMLP: preparar solues 1 e 2 como acima
PMA: 100 g/mL (diluir uma parte da soluo estoque em 999 partes de tampo
albumina)
LPS: diluir 0,48 L soluo estoque em 4999 L de tampo albumina
2.3.3. Isolamento dos neutrfilos
Os neutrfilos foram isolados em trs etapas, conforme os procedimentos a seguir.
2.3.3.1. Sedimentao dos eritrcitos
- Pipetar 100 L de heparina em cada tubo Falcon*;
- Coletar duas seringas e meia de sangue de dois doadores voluntrios (25 mL
sangue de cada), verter imediatamente sobre a heparina*;
- Adicionar 3 mL de Dextran em cada tubo;
- Misturar lenta e cuidadosamente;
- Deixar em repouso por 40 min para a sedimentao dos eritrcitos e separao de
cerca de 15 mL de plasma na fase superior.
Variaes testadas: *seringa simples ou S-Monovette com Li-Heparin ou K-EDTA
F. Ensaios biolgicos 208
2.3.3.2. Separao dos neutrfilos
- Transferir o sobrenadante com auxlio de pipeta de 1 mL para outro tubo Falcon;
- Completar o volume para 40 mL com tampo PBS;
- Com auxlio de agulha longa de seringa adicionar 10 mL Ficoll-Paque
TM
Plus na
parte inferior do tubo;
- Centrifugar por 30 min a 1.500 rpm (500g) e 20 C*;
- Programar banho-maria para 37 C.
Variaes testadas: *centrifugao a 4 C
2.3.3.3. Lise dos eritrcitos remanescentes
- Programar a centrfuga para 4 C;
- Desprezar o sobrenadante dos dois tubos Falcon por aspirao;
- Adicionar em proveta 44 mL tampo HEPES-sacarose*;
- Coletar em seringa 5,5 mL gua Millipore
gelada;
- Programar 23 segundos no relgio e aos 21 segundos adicionar a gua gelada ao
precipitado de clulas, solubiliz-lo cuidadosamente;
- Aps 21 segundos adicionar o tampo HEPES-sacarose*;
- Centrifugar por 10 min a 1.500 rpm (500 g) e 4 C;
- Desprezar o sobrenadante por aspirao;
- Suspender as clulas em 5,5 mL de tampo PBS com Ca
2+
/Mg
2+
;
- Misturar cuidadosamente as suspenses de clulas dos dois doadores (10-30 x 10
6
clulas/mL).
Variaes testadas: *a) tampo PBS (hipotnico), b) tampo PBS duas vezes mais concentrado (isotnico), c)
NaCl
1,8 % e tampo PBS (isotnico), d) tampo HEPES-sacarose (hipertnico) e repouso por
0,
10, 30 e 60 min a 4 C e temperatura ambiente.
2.3.4. Secreo da elastase
Neste ensaio, foi possvel avaliar o efeito das substncias-teste sobre a secreo da
elastase. Porm o efeito de inibio relacionado apenas secreo s pde ser confirmado
aps a submisso da respectiva substncia-teste ao ensaio com a enzima isolada (item 2.3.5).
Procedimento:
- Deixar a suspenso de clulas em repouso por 30 min em banho-maria a 37 C*;
F. Ensaios biolgicos 209
- Em tubo Falcon (nmero de amostras mais um): 2,5 L citocalasina B** (5 g/mL
concentrao final), 1 L substncia-teste*** ou DMSO****, 375 L SAAVNA
(0,8 mM de concentrao final);
- Distribuir 378,5 L em cada tubo tipo Eppendorf *****;
- Adicionar 50 L da suspenso de clulas;
- Incubar por 5 min a 37 C;
- Adicionar 50 L de estimulador PAF (0,1 mM de concentrao final) nas amostras
e controles positivos ou tampo albumina nos controles negativos******;
- Incubar por 20 min a 37 C*******;
- Adicionar 125 L cido ctrico (5,2 mg/mL concentrao final);
- Centrifugar por 5 min a 2.000 rpm (500 g) e 20 C;
- Transferir 100 L do sobrenadante para microplaca de 96 poos;
- Medir absoro de p-nitroanilina (pNA), produto colorido amarelo resultante da
quebra de SAAVNA por elastase, a 405 nm em Microplate Reader.
Variaes testadas: *0 (mtodo A), 30 (mtodo B) e 60 min de repouso das clulas
**sem citocalasina B
***efeitos dos inibidores clssicos SB203580 e U0126
****curva de efeito do DMSO
*****experimento realizado em microplaca de 96 poos
******efeitos de fMLP (0,1 mM), PMA (0,1 g/mL) e LPS (1 g/mL)
*******curva de tempo X resposta
2.3.5. Atividade enzimtica da elastase
Neste ensaio, a elastase foi isolada aps estimulao dos neutrfilos. A elastase isolada
foi ento colocada em contato com as substncias-teste e seu substrato, para avaliar o efeito
das mesmas diretamente sobre atividade enzimtica de elastase. Procedimento:
- Incubar suspenso celular com citocalasina B (5 g/mL concentrao final) em
banho-maria por 5 min a 37 C;
- Adicionar PAF (0,1 mM concentrao final);
- Incubar por 20 min a 37 C;
- Centrifugar a suspenso a 500 g por 10 min e temperatura ambiente;
- Distribuir pores de 50 L do sobrenadante, que contm elastase, nas amostras
contendo 375 L SAAVNA (0,8 mM concentrao final) e 1 L substncias-teste
ou DMSO em tubos tipo Eppendorf e incubar por 30 min a 37 C;
F. Ensaios biolgicos 210
- Adicionar 125 L de cido ctrico (5,2 mg/mL concentrao final);
- Transferir 100 L do sobrenadante para microplaca de 96 poos;
- Medir absoro de pNA, produto colorido amarelo resultante da quebra de
SAAVNA por elastase, a 405 nm em Microplate Reader.
2.3.6. Citotoxicidade
A citotoxicidade era inicialmente determinada por colorao das clulas com Trypan
blue e contagem de clulas mortas sob microscpio; entretanto, em funo do mtodo ser
demorado, trabalhoso e pouco preciso, optou-se pelo mtodo com Thiazolblau (MTT), que
menos trabalhoso e mais preciso.
Procedimento:
- Antes da adio de cido ctrico, adicionar 1mL MTT (3,4 mg/mL concentrao
final);
- Incubar por 3 h a 37 C em estufa com CO
2
;
- Centrifugar amostras a 3200 g por 10 min a 20 C;
- Desprezar o sobrenadante por aspirao;
- Dissolver o precipitado formazan, produto colorido resultante da metabolizao do
MTT por clulas vivas, com 100 L DMF/SDS por 16 h a 37 C;
- Misturar e transferir 100 L do sobrenadante para microplaca de 96 poos;
- Medir absoro a 595 nm em Microplate Reader.
2.3.7. Contagem de eosinfilos
Os eosinfilos secretam PAF e outras molculas que podem estimular os neutrfilos.
Por isso, a estimulao basal pode ser exacerbada em amostras que possuam um nmero
maior de eosinfilos do que o normal. O nmero de eosinfilos aumenta especialmente em
casos de alergia. Por isso, realizou-se a anamnsia dos voluntrios doadores de sangue para
evitar este fenmeno.
Procedimento para contagem de eosinfilos:
- Gotejar 5 L da suspenso de clulas em lmina, secar;
- Descolorir com MeOH por 10 min; secar;
- Colorir com soluo de Pappenheim (May-Grnwald, Giemsa) por 45 min;
- Lavar abundantemente em gua; secar;
- Gotejar gua, cobrir com lamnula, gotejar leo;
- Realizar a contagem em microscpio (objetiva 10 x 100).
F. Ensaios biolgicos 211
A contagem foi realizada escolhendo-se no mnimo oito campos nas direes
horizontal, vertical e inclinada. O resultado foi dado em porcentagem relativa ao nmero de
clulas totais.
2.3.8. Anlise estatstica
Todas as anlises foram realizadas pelo menos trs vezes com triplicatas para cada
amostra e controle. Os graus de inibio foram calculados em porcentagem relativa aos
controles. As anlises estatsticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 4
Version 4.02. Os resultados so expressos considerando-se o desvio padro da mdia ( SD) e
significncia. As anlises estatsticas de significncia foram efetuadas via ANOVA com o
software Origin Version 7.0.
F. Ensaios biolgicos 212
3. RESULTADOS E DISCUSSES
3.1. NF-B
O fator de transcrio NF-B um mediador central da resposta imune e inflamatria.
NF-B constitudo pelas subunidades p50 e p65 na forma de heterodmero inativo no
citoplasma, formando um complexo com a subunidade inibidora IB. Infeces e mediadores
da inflamao levam a uma ativao do complexo IB quinase, que causa a fosforilao de
IB. Esta subunidade sofre ubiquitinao e ento destruda por uma proteasoma. O NF-B
livre migra para o ncleo, liga-se ao DNA e promove a transcrio de inmeros genes de
mediadores da inflamao, como citocinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 e TNF-), protenas da fase
aguda, molculas de clulas de adeso, cicloxigenase-II e xido ntrico sintase (Barnes e
Karin, 1997; Chen e Ghosh, 1999). Para que isto ocorra, preciso que haja modificao ps-
translacional, modificao da cromatina e modificao ps-transcricional. O processo de
transcrio complexo envolvendo a iniciao, elongao e terminao.
3.1.1. Efeito de LSTs na ligao de NF-B ao DNA
O
O
O
O
O
O
O
O
O
2
O
O
O
O
O
OH
11
O
OH
HO
H
OH
O
O
O
12
Figura F13. LSTs testadas quanto ligao de NF-B ao DNA.
No presente trabalho foram testados os efeitos das LSTs 2, 11 e 12 em clulas Jurkat T
e Raw 264.7. As clulas foram incubadas com diferentes concentraes das LSTs. As clulas
Jurkat T foram estimuladas com TNF- e as clulas Raw 264.7 com LPS. O extrato de
protenas foi preparado e analisado por meio de EMSA (Fig. F14). O fator de transcrio NF-
B ligado ao DNA radiativamente marcado migra como a primeira banda superior no gel de
eletroforese. Em trabalho anterior esta banda foi identificada como sendo do heterodmero
p50/65 por meio de comparao com anticorpo (Pahl e Baeuerle, 1995). A segunda banda
F. Ensaios biolgicos 213
2 11 12
M: 2 , 5
5
10
20
10
20
50
100
5
10
20
50
TNF - :
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ + +
+
*
#
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13
14
2 11 12
M: 2,5 5 10 20 10 20 50 100 5 1 0 20 50
TNF-:
-
+ + + +
+ +
+
+
+
+
+
+
+
*
?
#
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
devido ao complexo de DNA marcado com protenas inespecficas e a terceira constitui
apenas o DNA marcado, que migra mais rapidamente pelo gel.
A concentrao de LST necessria para inibir a ligao de NF-B ao DNA em clulas
Raw 264.7 maior do que em clulas Jurkat T (Tab. F8, Fig. F14). O grau de citotoxicidade
foi avaliado em experimento com MTT, porm tambm visvel na segunda banda do gel. Se
esta banda menor do que as bandas adjacentes, devido menor quantidade de protenas
especficas, indicando que havia um nmero menor de clulas viveis. A LST 2 citotxica
para clulas Raw 264.7 a 20 M, mas no para clulas Jurkat T. J as LSTs 11 e 12 no so
citotxicas para ambas as clulas.
Jurkat T Raw 264.7
Figura F14. EMSA mostrando o efeito das LSTs 2, 11 e 12 na ligao de NF-B ao DNA (oligonucleotdeo-
32
P) em clulas Jurkat T e Raw 264.7. As duas primeiras colunas representam os controles negativo (sem
TNF- ou LPS) e positivo (com TNF- ou LPS). Da terceira coluna em diante as clulas foram incubadas
com as LSTs por 1 h e estimuladas com TNF- ou LPS por 1 h. *NF-B + DNA radiativo; protenas
inespecficas + DNA radioativo; # DNA radiativo.
As LSTs 2 e 12 apresentam potente atividade inibidora. A LST 1, enidrina, inibe a
ativao de NF-B com um IC
100
de 10 M em clulas Jurkat T (Garcia-Pieres, 2003). A
LST 2 consideravelmente mais ativa (IC
100
= 2,5 M) do que a LST 1, apesar das estruturas
diferirem apenas quanto presena de um grupo epxido (1) e uma insaturao entre C4 e C5
(2). Este experimento indica que a ligao dupla nesta posio deve ser importante para
aumentar a atividade.
F. Ensaios biolgicos 214
A diferena de reatividade entre as LST 11 e 12 talvez se deva ao fato de 12 possuir
um ster do tipo ,-insaturado, considerado um grupo funcional importante para a
alquilao. As LSTs bifuncionais, com dois sistemas ,-insaturados, so mais ativas que as
monofuncionais quanto inibio de NF-B. A LSTs bifuncionais apresentam portanto dois
sistemas que podem sofrer adio do tipo Michael, enquanto as monofuncionais podem sofrer
esta adio em apenas um ponto. Embora o sistema conjugado presente na LST 11 parece no
contribuir para a atividade.
Tabela F8. Valores de IC
100
para a inibio da ativao do NF-B pelas LSTs 1, 2, 11 e 12.
LST IC
100
= M
Jurkat T Raw 264.7
1 10* -
2 2,5 5
11 10 20
12 5 10
*(Siedle et al., 2004)
O mecanismo de ao pelo qual as LSTs inibem o fator de transcrio NF-B j foi
elucidado (Garcia-Pieres, 2003). O aminocido cistena 38 da subunidade p65 de NF-B,
mas no da subunidade p50, alquilado pelas LSTs via adio do tipo Michael, assim
inibindo o NF-B. A alquilao d-se apenas no aminocido cistena, porm h indcios de
que in vivo tambm possa ocorrer nos aminocidos arginina e lisina. Uma vez alquilado, o
NF-B no pode se ligar ao DNA. Esta alquilao independente de o NF-B estar livre ou
ligado ao IB. Foi tambm constatado que as LSTs inibem a degradao de IB-, mas em
pequeno grau. O tipo de mecanismo est relacionado com o tipo celular (Garcia-Pieres,
2003; Garcia-Pieres et al., 2004; Rngeler et al., 1999).
F. Ensaios biolgicos 215
3.1.2. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na ligao de NF-B ao DNA
importante ressaltar que estes so os primeiros ensaios realizados com alcalides
(Fig. F15) e o fator de transcrio NF-B por meio de EMSA. Portanto ainda no existem
estudos com relao ao seu mecanismo de ao, no sendo pertinente este tipo de discusso
aqui. Os ensaios foram realizados com as clulas HeLa 229 e 293 a ttulo de comparao com
os resultados obtidos com relao produo de IL-8 e luciferase.. Apesar do comportamento
de LSTs com relao ligao de NF-B ao DNA ser teoricamente semelhante em diferentes
linhagens celulares, optou-se por trabalhar com este grupo de clulas em funo de ainda no
haver informaes a respeito deste aspecto com relao aos alcalides.
N
O
O
HO
O
H
19
N
N
O
O
20
N
N
O
HO
O
O
21
N
O
H
N
O
H
22
Figura F15. Estruturas dos alcalides de I. tinctoria testados nos ensaios biolgicos com o NF-B.
O alcalide indlico 19 (indolinona) nas concentraes de 150 e 50 M inibe a ligao
do NF-B ao DNA em clulas HeLa 229 e em clulas 293 (Fig. F16). No obstante muitos
dos alcalides sejam citotxicos, importante observar que este alcalide no , mesmo na
concentrao de 200 M.
A triptantrina, 20, um potente inibidor da cicloxigenase-II e da lipoxigenase, enzimas
importantes no processo inflamatrio e diretamente relacionadas ao fator de transcrio NF-
F. Ensaios biolgicos 216
2 0 21 22 19
M: 50 100 150 10 100 1 50 50 100 150 50 100 150
TNF - : - + + + + + + + + + + + + +
?
?
#
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
*
20 21 22 19
M:
50 100150 10 100 1 50 50 100 150 50 100 150
TNF-: - + + + + + + + + + + + + +
?
?
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
#
*
B, inibe a ativao do NF-B em clulas 293, mas induz a uma leve ativao do mesmo em
clulas HeLa 229 (Fig. F16). Tambm no apresentou citotoxicidade, mesmo na concentrao
de 150 M.
J a isaindigotona (21), um alcalide quinazolnico, tende a inibir a ativao de NF-B
em clulas HeLa 229. J a indirubina (22), alcalide indlico, inibe tal ativao. Entretanto
no foi possvel concluir qual a sua ao nas clulas 293, uma vez que a oscilao dos
resultados foi grande (Fig. F16). Em todos os casos foi possvel comprovar que estes
alcalides no apresentam citotoxicidade.
HeLa 229 293
Figura F16. EMSA mostrando o efeito dos alcalides 20, 21, 22 e 19 na ligao do NF-B ao DNA
(oligonucleotdeo-
32
P) em clulas HeLa 229 e 293. As duas primeiras colunas representam os controles
negativo (sem TNF-) e positivo (com TNF-). Da coluna 3 em diante as clulas foram incubadas com os
alcalides por 1 h e estimuladas com TNF- por 1 h. *NF-B + DNA radiativo; protenas inespecficas +
DNA radiativo; #DNA radiativo.
F. Ensaios biolgicos 217
y = 0.0004x + 0.4599
R
2
= 0.9457
0.000
0.300
0.600
0.900
1.200
1.500
0 1000 2000 3000
A
U
3.1.3. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na produo e atividade de
luciferase
Enzimas-reprter como a cloranfenicol acetiltransferase, luciferase e -galactosidase
so freqentemente usadas para estudos de atividade, regulao e expresso gnica em clulas
eucariticas (Lindenmeyer, 2004). A luciferase tem sido muito utilizada em biologia
molecular e celular por sua reao ser sensvel e relativamente simples. Vale ressaltar que, no
caso das LSTs, o uso deste mtodo no relevante porque estas substncias inibem a
atividade enzimtica de luciferase, no sendo possvel ento obter informaes a respeito da
sua influncia quanto transcrio gnica induzida por NF-B. Neste caso, o intuito
observar se os alcalides afetam este complexo processo de transcrio gnica.
Foram empregadas clulas 293 estavelmente transfeccionadas com plasmdeo
contendo gene para luciferase, promotor para NF-B e gene para resistncia ao antibitico
zeocina. As clulas foram tratadas com as substncias-teste, estimuladas para ativao do NF-
B com TNF- e ento a produo de luciferase foi determinada por meio do kit com
substrato luciferina. Uma vez que o substrato degradado oxiluciferina, ocorre liberao de
luz, que detectada por um luminmetro.
Os resultados foram normalizados com o nmero de protenas totais, determinado para
cada amostra com base na curva de calibrao do padro de BSA (Fig. F17)
Figura F17. Curva de calibrao do padro de BSA.
A indolinona (19) tambm inibe a produo de luciferase em clulas 293 estavelmente
transfeccionadas (IC
50
28,86 5,65M; Fig. F18). Este alcalide no inibe a atividade
enzimtica da luciferase, o que indica que sua ao est realmente relacionada inibio da
F. Ensaios biolgicos 218
0 50 100 150 200
0
20
40
60
80
100
Indolinon (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
p
r
o
d
u
o
d
e
l
u
c
i
f
e
r
a
s
e
(
%
)
liberao de NF-B ou inibio da sua ligao ao DNA. Porm, no caso destes efeitos serem
reversveis, o que pode ocorrer ainda que a indolinona iniba a maquinaria de transcrio.
Figura F18. Efeito da indolinona (19) na produo de luciferase por clulas 293 estavelmente
transfeccionadas. As clulas foram incubadas com indolinona por 1 h e estimuladas com TNF- por 1 h a
37 C e CO
2
. A produo de luciferase foi medida por reao luminescente.
Os resultados relativos produo de luciferase so insuficientes para proposies
acerca do efeito da triptantrina (20). Foi possvel apenas observar que a substncia no inibe a
atividade enzimtica.
Os alcalides isaindigotona (21) e indirubina (22) no apresentaram efeito sobre a
produo de luciferase. Os resultados obtidos no permitem concluir que estes causem
inibio ou ativao da sua produo, corroborando com os resultados obtidos no experimento
com EMSA, em que as substncias no foram capazes de inibir NF-B em clulas 293. Estes
alcalides tambm no tm efeito significativo sobre a atividade enzimtica de luciferase.
Nenhum dos alcalides apresentou citotoxicidade para as clulas 293 estavelmente
transfeccionadas quando submetidos ao ensaio com MTT.
N
O
O
HO
O
H
19
F. Ensaios biolgicos 219
3.1.4. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na produo de IL-8
Uma vez que o NF-B promove a transcrio de muitas citocinas, interessante
observar se h realmente reduo na produo das mesmas no caso de inibio de NF-B, o
que permite tambm avanar no estudo do mecanismo de ao das substncias-teste. Uma das
citocinas produzidas em decorrncia da ativao do fator de transcrio a IL-8, que por sua
vez ativa vrias clulas, em especial os neutrfilos, no intuito de desencadear o processo
inflamatrio e fagocitrio. As LSTs inibem a produo de IL-8, uma vez que inibem o NF-B
de forma irreversvel. Como foi possvel provar que alguns dos alcalides so capazes de
inibir a ligao de NF-B ao DNA, resolveu-se testar qual a extenso deste efeito no processo
de transcrio. No caso de inibio reversvel do fator de transcrio, a produo das
citocinas, mais especificamente de IL-8, poderia no ser afetada.
Por meio do mtodo ELISA foi possvel determinar o grau de inibio da produo de
IL-8. As clulas foram incubadas com as substncias-teste, ento estimuladas com TNF-, e o
sobrenadante contendo IL-8 exocitada foi analisado em ELISA. O tempo de estimulao das
clulas foi avaliado no intuito de diminuir o tempo de exposio s substncias-teste, o que
poderia eventualmente aumentar os riscos de citotoxicidade, e ainda reduzir o tempo de
anlise, uma vez que o tempo de exposio original era de 24 h. Portanto, foi construda uma
curva de tempo versus concentrao de IL-8 (Fig. F19) para avaliar qual o tempo e a
concentrao de TNF- mais apropriados para obteno da mesma resposta. Quanto maior o
tempo de estimulao, menor a concentrao de TNF- necessria; por exemplo, para 24 h
so necessrios 2 g e para quatro horas de 8 a 10 g de TNF-. Os resultados levaram a se
fazer a opo por estimular as clulas por apenas 6 h, utilizando para tal 6 g de TNF- por
amostra.
O experimento foi realizado apenas com amostras controle, sendo que o efeito
citotxico de cada concentrao de TNF- foi concomitantemente testado via MTT. Porm,
mesmo 10 g de TNF-, quantidade usada para quatro horas de estimulao, no
apresentaram efeitos citotxicos.
A mudana no tempo de estimulao foi testada para a dexametasona, um corticide
conhecido por inibir a produo de IL-8 quando as clulas so estimuladas por 24 h com 2 g
de TNF-, sendo que a alterao no tempo no provocou alterao significativa no resultado.
Esse procedimento tambm foi realizado com os alcalides e os resultados foram comparados,
no havendo diferenas significativas.
F. Ensaios biolgicos 220
0
1000
2000
3000
4000
4 h 6 h 8 h 24 h
horas
I
L
-
8
(
p
g
/
m
L
)
2,4,6,8 ng TNF-
2,6,8,10 ng TNF-
y = 0 .0 0 0 5 x - 0 .0 4 7 4
R
2
= 0 . 9 9 4 7
-0 .1 0 0
0 .0 0 0
0 .1 0 0
0 .2 0 0
0 .3 0 0
0 .4 0 0
0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0
Pa dr o de I L -8 ( pg/ mL )
A
U
Figura F19. Curva de tempo versus concentrao de IL-8 produzida aps estimulao com diferentes
concentraes de TNF-. As amostras foram estimulados por 4, 6, 8 e 24 h com 8 ou 10, 6 ou 8, 4 ou 6 e 2
g de TNF-, respectivamente para cada tempo. A produo de IL-8 foi determinada por ELISA.
A quantidade de IL-8 produzida foi determinada com base em curva de calibrao para
o padro de IL-8 humana recombinante (Fig. F20), realizada em paralelo a todos os
experimentos.
Figura F20. Curva de calibrao do padro de IL-8 humana recombinante. As solues-padro foram
submetidas ao mtodo ELISA.
A indolinon (19) tambm inibe a produo de IL-8 em clulas HeLa 229 (IC
50
13,80
5,46 M, Fig. F21). Este resultado confirma a ao do alcalide, que impede a liberao do
NF-B, a ligao do fator ao DNA ou o complexo processo da transcrio.
F. Ensaios biolgicos 221
0 10 20 30 40 50 60
0
25
50
75
100
Indolinon (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
p
r
o
d
u
o
d
e
I
L
-
8
(
%
)
Figura F21. Efeito da indolinona (19) na produo de IL-8 por clulas HeLa 229. As clulas foram
incubadas com indolinon por 1 h e estimuladas com 6 g de TNF- por 6 h a 37 C e CO
2
. A produo de
IL-8 foi medida por reao colorimtrica com o mtodo ELISA.
Surpreendentemente, contrastando com resultado acima descrito, o alcalide
triptantrina (20), por sua vez, estimulou a produo de IL-8 (Fig. F22). Este resultado
confirma o obtido no experimento com EMSA, onde ocorreu a tendncia de aumento da
ligao de NF-B com o DNA radiativo.
Figura F22. Efeito da triptantrina (20) na produo de IL-8 em clulas HeLa 229. As clulas foram
incubadas com triptantrina por 1 h e estimuladas com 6 g de TNF- por 6 h a 37 C e CO
2
. A produo
de IL-8 foi medida por meio de reao colorimtrica com o mtodo ELISA.
Quanto isaindigotona (21) e indirubina (22), no foi possvel obter resultados
satisfatrios para a avaliao dos seus efeitos na produo de IL-8. Todos os experimentos
com NF-B, luciferase e IL-8 foram realizados diversas vezes e todas as substncias foram
submetidas ao mesmo tempo s mesmas condies. Porm, o grau de variao dos dados no
permite avaliao estatstica segura, sendo que os valores distribuem-se ao longo do eixo
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
-175
-150
-125
-100
-75
-50
-25
0
25
Tryptanthrin (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
p
r
o
d
u
o
d
e
I
L
-
8
(
%
)
N
O
O
HO
O
H
19
N
N
O
O
20
F. Ensaios biolgicos 222
horizontal, variando entre valores positivos e negativos com relao ao eixo vertical. Uma das
hipteses que estas substncias no sejam aptas para a realizao deste ensaio. Alm disto,
apresentaram tambm problemas de solubilidade no meio de cultura durante o processo de
incubao.
interessante observar que a indolinona (19) apresenta atividades importantes no que
concerne a inibio de processos inflamatrios. J a triptantrina (20) tende sua ativao. Os
dois outros alcalides, estruturalmente uma mistura dos dois primeiros (Fig. F23), no
apresentam efeitos definidos.
N
O
O
HO
O
H
19 indolinona
(3-(3,5-dimetxi-4-hidrxibenzilidenil)-indolin-2-on)
N
N
O
O
20 triptantrina
(indolo-(2,1-b)-quinazolina-5,12-diona)
N
N
O
HO
O
O
21 - isaindigotona
N
O
H
N
O
H
22 - indirubina
Figura F23. Alcalides de Isatis tinctoria.
F. Ensaios biolgicos 223
3.2. Elastase
3.2.1. Secreo de elastase
Neutrfilos so os agentes de primeira linha de defesa contra microrganismos e so
tambm clulas cruciais tanto para a imunidade inata quanto humoral (Burg e Pillinger, 2001).
Entretanto, desequilbrios resultam em danos srios dos tecidos normais adjacentes a
processos inflamatrios. Por isso de grande interesse encontrar substncias que inibam a
secreo das enzimas que causam esta destruio tecidual.
Baseado em um ensaio previamente publicado, otimizou-se o mesmo no sentindo de
selecionar substncias com atividade inibidora da secreo de elastase por neutrfilos
(Johansson et al., 2002; Siedle et al., 2003). O ensaio foi transferido para tubos tipo
Eppendorf e para microplacas de 96 poos, evitando assim o consumo de tempo em funo do
uso de cubetas para medidas de absoro na regio do UV. Alm disso, o ensaio pode ser
usado para o estudo do efeito diretamente sobre a enzima elastase isolada. A incubao dos
neutrfilos com as substncias teste e sua estimulao foram realizados em tubos tipo
Eppendorf usando 65 x 10
4
clulas/amostra. Medidas fotomtricas da pNA, resultado da
quebra do substrato SAAVNA pela elastase, foi realizada em microplaca de 96 poos aps
separao das clulas por centrifugao. Este procedimento tem a vantagem de ter disponvel
um grande nmero de clulas. Nos ensaios realizados inteiramente na microplaca de 96 poos
houve problemas quanto reprodutibilidade dos resultados, devido ao pequeno nmero de
clulas em cada poo, o que acarreta um aumento da probabilidade de erro. Usando tubos tipo
Eppendorf, assim como microplacas de 96 poos, o experimento tem a vantagem de usar um
grande nmero de clulas no comeo do experimento e mesmo assim permitir medida
automtica rpida do resultado.
Alm disso, o mtodo ainda foi otimizado para suprimir o fenmeno de ativao dos
neutrfilos na ausncia de estimuladores clssicos. interessante notar que esta estimulao
basal, como o fenmeno foi denominado, raramente mencionada, considerada ou discutida
na literatura (Junger et al., 1998; Partrick et al., 2000). Quando a secreo basal de elastase
muito alta, os estimuladores clssicos falham, no havendo estimulao adicional suficiente
para aumentar a secreo. Alm disso, quando a secreo basal negligenciada, os valores
calculados para IC
50
para uma dada substncia correspondem no apenas a uma via de
ativao, como por exemplo, quela estimulada por PAF, mas tambm a outras no
consideradas.
F. Ensaios biolgicos 224
O nmero de publicaes que descrevem a busca por inibidores da secreo da
elastase (Johansson et al., 2002; Siedle et al., 2003) muito menor do que aquelas que
concernem a busca por inibidores da atividade enzimtica de elastase (Becker et al., 2003;
Bernstein et al., 1994b; Bernstein et al., 1994a; Copp et al., 1987; Daels-Rakotoarison et al.,
2003; Damewood, Jr. et al., 1994; DelVal et al., 2002; Dryden et al., 1992; Kokot et al., 1987;
Krantz et al., 1990; Loser et al., 2000; Melzig et al., 1999; Melzig et al., 2001a; Mitaine-Offer
et al., 2002; Odagaki et al., 2001; Ohbayashi, 2002a; Partrick et al., 1999; Reed e
Katzenellenbogen, 1991; Tamura et al., 2002; Vicentini et al., 2001; Ying et al., 1991). Em
geral, as publicaes que relatam investigaes a respeito de secreo de enzimas ou
superxido de neutrfilos discutem aspectos fisiolgicos e patolgicos relacionados a eles. As
discusses so freqentemente relacionadas ativao dos neutrfilos usando diferentes
primers associados a estimuladores clssicos e inibio ou reduo desta ativao, porm
no h discusses sobre a estimulao basal destas clulas. Foi observado em vrias
publicaes que a diferena na quantidade de elastase secretada das clulas estimuladas e no
estimuladas relativamente baixa (Brown et al., 2003; Junger et al., 1998; Partrick et al.,
2000; Tamura et al., 2002), sendo algumas vezes de apenas 5 %. Em outras, a absoro
relativa ao produto de quebra de substrato fica em 0,195 para clulas estimuladas e em 0,150
para as no estimuladas (Junger et al., 1998; Tamura et al., 2002). Na realidade, a quantidade
de elastase secretada por controles estimulados resultado de dois estmulos, um que
compreende um estimulador desconhecido e outro um estimulador clssico, como fMLP, PAF
ou PMA. Nos experimentos aqui realizados, foi observada uma diferena to pequena entre
controles positivos e negativos que se decidiu estudar as vias de ativao envolvidas com um
pouco mais de detalhes.
Na literatura, os resultados que concerniam busca por inibidores da degranulao so
calculados em relao a apenas controles positivos. Isto significa que no est claro se estes
compostos inibem apenas as vias clssicas ou ainda as vias no conhecidas, ou seja, a basal. O
interesse na estimulao basal aumentou ainda mais quando se constatou que as LSTs inibem
tambm a secreo basal de elastase.
F. Ensaios biolgicos 225
Alm disso, tambm foram examinados vrios parmetros que podem influenciar este
fenmeno, como o solvente das solues-estoque das substncias-teste, tempo de estimulao,
estresse mecnico e qumico. Como o DMSO foi usado para a solubilizao das substncias
teste, foi realizado um estudo para avaliar sua influncia na secreo de elastase. A figura F24
mostra que o DMSO inibe a secreo de elastase de forma dose dependente. Portanto, a sua
concentrao deve ser mnima em cada amostra e igual em todas, inclusive nos controles.
Apesar de 0,25 % de DMSO causar 20 % de inibio da secreo, esta foi a concentrao de
escolha, pois uma quantidade menor no foi suficiente para a realizao do ensaio.
Figura F24. Efeito de DMSO na secreo de elastase estimulada com o PAF. Os controles
compreendem amostras sem DMSO com e sem estmulo.
0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
20
30
40
50
60
70
80
90
I
n
i
b
i
o
d
a
s
e
c
r
e
o
d
e
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
DMSO (%)
F. Ensaios biolgicos 226
A secreo da elastase pode ser induzida por diversos fatores, como por exemplo
estresse, radiao UV e choque trmico (Schwenger et al., 1998). Os estimuladores mais
utilizados so o fMLP e o PAF. Porm, havia falta de estudos com relao ao tempo de
estimulao que induza o mximo de secreo. A curva de tempo versus estimulao com o
PAF e o fMLP revelou que a maior diferena entre os controles negativos e positivos ocorre
com 20 min de estimulao (Fig. F25) Interessante o fato de que com o passar do tempo a
secreo de elastase aumenta mesmo nos controles negativos, ou seja, sem estmulo. Este
experimento deixou evidente o fenmeno da estimulao basal.
Figura F25. Efeito do tempo (min) na estimulao de neutrfilos para a secreo de elastase. As amostras
compreendem clulas, SAAVNA, citocalasina B e fMLP ou PAF. Controles negativos sem estmulo.
Ficou comprovado ainda que a diferena de temperatura de 4 a 20 C durante o
processo de centrifugao das clulas pode influenciar, mas no determinante no fenmeno
da estimulao basal.
A via clssica envolvida na secreo de elastase compreende a cascata de MAPK, a
qual ativa as quinases p38 MAPK e ERK1/2 (Fig. F9). O PAF e o fMLP so ativadores
dependentes de receptor, levando fosforilao de p38 MAPK e ERK1/2, respectivamente. O
fMLP tambm pode ativar a via p38 MAPK, mais especificamente a MEKK-X por meio da
PKC. A exposio ao fMLP resulta num grande nmero de respostas funcionais, incluindo o
influxo de clcio e exocitose de enzimas (Nick et al., 1997). Alm de ativar o mensageiro
secundrio PLC com subseqente gerao de IP3 e DAG, seguida pelo aumento da
concentrao de clcio intracelular, o fMLP tambm ativa a protena Ras, que seguida pela
ativao das vias p38 MAPK e ERK1/ERK2 (p42/44). O fosfolipdeo PAF afeta apenas
levemente a via p42/44 MAPK, mas mais fortemente a via p38 MAPK (Nick et al., 1997;
Partrick et al., 2000). Esta a razo pela qual a estimulao mais efetiva quando se usa PAF
0 5 10 15 20 25 30
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
A
b
s
o
r
o
4
0
5
n
m
min
fMLP
PAF
sem estmulo
F. Ensaios biolgicos 227
*
*
**
**
*
**
**
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
sem
est .
sem
est .
SB
sem
est . U
fMLP fMLP
SB
fMLP
U
PAF PAF
SB
PAF
U
PMA PMA
SB
PMA
U
A
b
s
o
r
o
4
0
5
n
m
como primer e fMLP como estimulador. o PMA ativa diretamente a PKC, que por sua vez
ativa ambas as vias descritas acima e tambm liga-se ao clcio intracelular, aumentando assim
a secreo de elastase (Kokot et al., 1987). Isto explica porque a estimulao com PMA
mais eficiente do que com PAF ou fMLP. Embora tenha sido sugerido que a PKC
desempenha um papel pouco importante na secreo de elastase (Cabanis et al., 1996),
existem tambm vrios relatos que comprovam que o PMA mais eficiente do que o fMLP e
o PAF (Daels-Rakotoarison et al., 2003; Junger et al., 1998; Partrick et al., 2000; Tamura et
al., 2002).
Foi possvel demonstrar que os inibidores da p38 MAPK, SB203580, e da MEK1/2,
U0126, reduzem a secreo de elastase causada pela estimulao basal (Fig. F26). Estes
resultados evidenciam que as vias p38 MAPK e MEK1/2 so induzidas por um estimulador
inespecfico. Estes compostos tambm inibem a exocitose de elastase induzida por fMLP,
PAF e PMA, confirmando que as quinases p38 MAPK e MEK1/2 participam de todas as vias
(Junger et al., 1998; Partrick et al., 2000). No que concerne o envolvimento da p38 MAPK, os
resultados obtidos com o emprego do LPS concordam com os relatos de que o LPS ativa p38
MAPK, mas as respostas funcionais no incluem o influxo de clcio ou degranulao (Nick et
al., 1996).
Figura F26. Efeito do SB203580 (SB) e U0126 (U) na secreo da elastase em clulas estimuladas e no
estimuladas. As clulas foram incubadas com SB (10 M) e U (10 M) por 30 min. Controles negativos
no recebem estimulador. Valores de p < 0,05 versus respectivos controles so considerados significativos e
designados por *. p < 0,005 por **; est. = estmulo.
F. Ensaios biolgicos 228
No sentido de evitar este problema, os efeitos da heparina e do EDTA como
anticoagulantes na coleta do sangue foram comparados. Para tanto, foram utilizadas seringas
S-Monovette
o
d
a
s
e
c
r
e
o
d
e
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
Partenolido (M)
BSA Sigma
BSA Roth
F. Ensaios biolgicos 230
**
**
*
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
sem est . PAF fMLP 0.5 1 5 10 20 50
A
b
s
o
r
o
4
0
5
n
m
a
*
a'
b
*
b'
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
sem estmulo LPS fMLP LPS+fMLP
A
b
s
o
r
o
4
0
5
n
m
sem est. basal com est. basal
O LPS considerado um primer fraco de neutrfilos e por vezes mencionado at
como um estimulador fraco (Bishop et al., 2003; Norgauer et al., 1991; Ottonello et al., 1997).
Portanto, deve ser levado em conta que a contaminao com bactrias gram-negativas poderia
induzir a estimulao basal dos neutrfilos, uma vez que o experimento realizado em
condies no estreis. Concordando com esta hiptese, o LPS foi testado como estimulador e
o ensaio foi realizado em condies estreis. A figura F29 mostra que LPS em concentraes
de 0,5 50 g/mL tem apenas um leve efeito na secreo da elastase, em contraste com o
PAF (0,1 mM) e o fMLP (0,1 mM), ambos usados como controles positivos. Quando o LPS
foi empregado como primer para fMLP subseqentemente adicionado como estimulador, as
clulas, cujos controles negativos apresentaram uma pequena estimulao basal, secretaram
quantidade consideravelmente maior de elastase do que quando o fMLP foi empregado
sozinho como estimulador (Fig. F30). Por isso a contaminao por LPS no pode ser
considerada como causadora da estimulao basal, o que exclui a necessidade de se realizar o
ensaio sob condies
estreis.
Figura F29. Comparao da secreo de elastase entre os estmulos LPS (0,5 50 g/mL), PAF (0,1 mM) e
fMLP (0,1 mM) mtodo A. Valores de p < 0,05 versus controle negativo (sem estmulo) so considerados
significativos e designados por *. p < 0,005 por **; est. = estmulo.
Figura F30. Efeito de LPS como iniciador e fMLP como estmulo da secreo da elastase mtodo A.
Valores de p < 0,05 para diferenas entre a-a e b-b so considerados significativos e designados por *.
est. = estmulo.
F. Ensaios biolgicos 231
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
sem estmulo fMLP PAF
A
b
s
o
r
o
4
0
5
n
m
doador A doador B A + B
A estimulao basal no ocorre em cada experimento, o que indica que este fenmeno
pode estar relacionado aos doadores de sangue. Isto pode estar relacionado s caractersticas
individuais ou apenas ao estado de sade do doador. extremamente difcil determinar qual
tipo de estresse no doador poderia induzir a estimulao basal dos neutrfilos. Para explorar
este aspecto, foram comparados os resultados obtidos com clulas misturadas de dois
doadores com aqueles dos dois doadores em separado. Existe a possibilidade de que as clulas
de dois doadores poderiam se estimular mutuamente. Apesar de que todos os doadores
estavam aparentemente saudveis, complicado saber se um voluntrio tinha alguma pequena
inflamao ou desordem que causasse o fenmeno. Foi observado que quando clulas de
determinados doadores eram empregadas, ocorria a estimulao basal e com clulas de outros
isto raramente ocorria. A figura F31 mostra que a quantidade de elastase secretada por clulas
de dois doadores corresponde mdia da quantidade secretada pelas clulas de cada doador
em separado. Portanto, a mistura dos granulcitos de dois doadores no resulta em problemas
de incompatibilidade ou de estimulao mtua. Isto sugere que o problema da estimulao
basal pode ser causado por meio de estresse mecnico durante a coleta e isolamento das
clulas, quando as clulas foram endogenamente primadas, mas se isso no ocorreu, ento os
estresse mecnico no suficiente para induzir a estimulao celular.
Figura F31. Secreo de elastase em clulas de dois doadores; mtodo A, separadas (A, B) e
misturadas (A + B).
Outra razo para a estimulao basal poderia ter origem em processos alrgicos dos
doadores, como rinite alrgica, por exemplo. Os processos alrgicos so geralmente
acompanhados por um aumento do nvel de eosinfilos, que podem estimular os neutrfilos a
liberar produtos enzimticos (Moy et al., 1990). A protena MBP (major basic protein)
presente nos grnulos dos eosinfilos ativa os neutrfilos para a degranulao de proteases e
superxido. Este fato aumentado ainda pelo sinergismo entre MBP e PAF, que tambm
secretado por eosinfilos em quantidades significativas. PAF funciona como um mediador na
F. Ensaios biolgicos 232
fase tardia do processo alrgico (Moy et al., 1990). Esta afirmao poderia explicar a
estimulao basal, mesmo que a diferena na quantidade de eosinfilos no fosse to grande
entre experimentos com ou sem a estimulao basal. Apesar de ainda no estar claro se h
alguma correlao entre o estresse mecnico e a liberao de MBP e PAF, os eosinfilos
podem ser muito evasivos e facilmente ativados. A elastase, por exemplo, causa degranulao
de eosinfilos num mecanismo parcialmente dependente de clcio e filamentos de actina (Liu
et al., 1999). Normalmente os eosinfilos compreendem cerca de 1 a 2 % dos granulcitos.
Ao corar as clulas isoladas, foi possvel observar que a quantidade de eosinfilos aumenta
quando os neutrfilos esto basalmente estimulados, chegando a 4 ou 5 %. Supe-se que esta
diferena de 2 a 4 % possa ser significativa na causa da estimulao basal de neutrfilos,
porm estudos adicionais so necessrios para confirmar a hiptese.
A presena de citocalasina B decisiva para a degranulao de elastase. Se as clulas
esto basalmente estimuladas e entram em contato com esta substncia, a degranulao ocorre
imediatamente. Porm, se a estimulao basal no estiver ocorrendo, a citocalasina B no
pode causar a degranulao, pois h a necessidade de um estmulo externo. O controle sem a
citocalasina B apresentou absoro de, por exemplo, 0,043, e os controles com esta substncia
apresentaram absoro de 0,645 e 0,683, respectivamente para os estimuladores fMLP e PAF.
Isso comprova que na ausncia desta substncia no h secreo de elastase.
Estudos mostraram que solues salinas hipertnicas podem suprimir a ativao de
neutrfilos via interceptao de vrios sinais dependentes de receptor, como por exemplo os
sinais originados quando o receptor para fMLP ativado (Junger et al., 1998). Quando a
sinalizao desencadeada por PMA, ao invs de fMLP, a adio de salina hipertnica
aumenta a degranulao por amplificao da via p38 MAPK. Alguns autores sugerem
inclusive que a salina hipertnica pode prevenir a ativao de neutrfilos por agentes
quimiotticos (Junger et al., 1998). O isolamento dos granulcitos envolve a lise de eritrcitos
com gua gelada, o que resulta em um estresse qumico para os neutrfilos, o que poderia
induzir a sua ativao. No mtodo original, a adio de gua seguida pela adio de tampo
fosfato para restabelecer a tonicidade, mas a soluo resultante era hipotnica, uma vez que a
gua no era removida. A soluo hipotnica poderia tambm ser um estresse qumico.
Portanto, resolveu-se estudar qual a tonicidade ideal para os neutrfilos. Assim realizou-se a
comparao entre as solues hipotnica (tampo PBS 1x), isotnica (tampo PBS 2x e
soluo salina) e hipertnica (tampo HEPES com sacarose). Com o uso da soluo
hipertnica, a estimulao basal foi mais freqente e eficientemente suprimida (Fig. F32).
Entretanto, em alguns casos de estimulao basal, mesmo o tampo hipertnico no foi capaz
F. Ensaios biolgicos 233
0
0.2
0.4
0.6
0.8
sem estmulo fMLP PAF PMA
A
b
s
o
r
o
4
0
5
n
m
hipotnico isotnico hipertnico
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 min 30 min 60 min
A
b
s
o
r
o
4
0
5
n
m
sem estmulo fMLP PAF PMA
de suprimi-lo. Adicionalmente foram testados os efeitos dos estimuladores fMLP e PAF
concomitantemente ao uso das solues de diferentes tonicidades. Como os efeitos de fMLP e
PAF no foram to eficientes quando o tampo hipertnico foi utilizado, resolveu-se testar
outro estimulador. O PMA um estimulador inespecfico, independente de receptor que
apresentou a maior taxa de estimulao quando o tampo hipertnico foi empregado (Fig.
F32).
Figura F32. Efeito da tonicidade do tampo no isolamento dos neutrfilos na presena da estimulao
basal e efeito de fMLP, PAF e PMA na secreo de elastase.
Embora o uso de soluo hipertnica tenha otimizado o ensaio, algumas vezes a
estimulao basal voltava a ocorrer. O problema foi efetivamente resolvido quando as clulas
isoladas foram deixadas em repouso antes do incio do ensaio por 30 ou 60 min a 37 C em
tampo fosfato com clcio e magnsio (Fig. F33). Novamente os estimuladores fMLP, PAF e
PMA foram testados sob estas condies. O PAF e o PMA provaram ser os mais eficientes.
Deixar os granulcitos em repouso por 60 min no apresentou vantagens com relao ao
repouso de 30 min.
Figura F33. Efeito de tempo de repouso (0, 30 e 60 min) dos neutrfilos em PBS com Ca
2+
/Mg
2+
na
estimulao basal e na secreo de elastase estimulada por fMLP, PAF, PMA em meio hipertnico.
F. Ensaios biolgicos 234
Por fim, foi possvel mostrar que o mtodo est apto para a seleo de compostos com
atividade de inibio da secreo da elastase. A combinao do uso de tampo hipertnico e
de repouso de 30 min antes do incio do ensaio provou ser a melhor maneira de solucionar o
problema da supra regulao dos neutrfilos.
F. Ensaios biolgicos 235
3.2.2. Efeito de LSTs na secreo e atividade enzimtica de elastase
Dez LSTs foram testadas quanto ao efeito sobre a exocitose de elastase por neutrfilos
humanos, as quais so mostradas na figura F34.
Figura F34. LSTs testadas quanto secreo da elastase por neutrfilos humanos.
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
1
O
O
O
O
O
O
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O
O
2
O
O
O
O
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OH
11
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
O O
10
O
OH
HO
H
OH
O
O
O
12
O
O
O
HO
O
O
O
13
O
O
O
O
O
O
14
O
O
O
O
O
O
O
OH
15
O
O
HO
O
16
O
O
H
17
O
O
O
18
F. Ensaios biolgicos 236
As curvas de inibio da secreo de elastase so apresentadas na figura F35. Na
tabela F9 so apresentados os respectivos valores de IC
50
. Alm dos controles normais, foram
empregados controles negativos para as substncias-teste, ou seja, para cada concentrao
foram feitas triplicatas sem estmulo. Assim, observou-se que as mesmas tambm inibem a
estimulao basal, como por exemplo, 1 que apresenta valor de IC
50
igual a 11,75 1,87.
10 20 30 40 50 60 70 80 90
-25
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
1 (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
s
e
c
r
e
o
d
a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
2 (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
s
e
c
r
e
o
d
a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
0 50 100 150 200 250
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
12 (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
s
e
c
r
e
o
d
a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
25 50 75 100 125
-20
0
20
40
60
80
100
fMLP
PAF
13 (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
s
e
c
r
e
o
d
a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
-10 15 40 65 90
-10
10
30
50
70
90
110
fMLP
PAF
14 (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
s
e
c
r
e
o
d
a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
0 20 40 60 80 100
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
15 (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
s
e
c
r
e
o
d
a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
0 20 40 60 80 100
-10
10
30
50
70
90
110
fMLP
PAF
16 (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
s
e
c
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e
o
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a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
0 25 50 75 100 125
-10
10
30
50
70
90
110
fMLP
PAF
17 (M)
I
n
i
b
i
o
d
a
s
e
c
r
e
o
d
a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
50 100 150 200
-25
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
18 (M)
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l
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(
%
)
Figura F35. Efeito das LSTs na secreo de elastase. As clulas foram incubadas a 37 C com citocalasina
B, SAAVNA e LSTs por 5 min e ento estimuladas com PAF ou fMLP por 20 min em banho com agitao
mtodo A. A reao foi parada com cido ctrico, as amostras foram centrifugadas, o sobrenadante
transferido para microplaca de 96 poos e a absoro medida a 405 nm. Os controles compreendem
amostras com e sem estmulo.
11
17
16
15
14
13
12
F. Ensaios biolgicos 237
Tabela F9. Valores de IC
50
(M) desvio padro da mdia
para a inibio da secreo de elastase por
LSTs.
GraphPad Prism 4 Version 4.02
Siedle et al., 2003 demonstraram que LSTs bifuncionais, ou seja, aquelas que possuem
dois grupos carbonila ,-insaturados, so mais ativas do que aquelas monofuncionais. Ainda
foi demonstrado que a ocorrncia da estrutura -metileno--butirolactona no pr-requisito
para a atividade, mas sim o nmero de ocorrncia de grupos carbonila ,-insaturados. A LST
mais ativa o furanoeliangolido trifuncional 14. A LST 15, bifuncional com um ster em C15
e sem -metileno--butirolactona, menos ativa que 14, corroborando a informao de que o
nmero de estruturas funcionais relevante para a atividade. Embora 13 seja estruturalmente
similar a 14, apresenta atividade semelhante a 15, o que talvez possa ser explicado pela
diferena de reatividade do ster quanto adio do tipo Michael, pois em 13 existe o ster
angelato e em o 14 metacrilato.
O partenolido (18), uma LST do tipo germacrolido isolada de Tanacetum parthenium,
considerado uma pr-droga, mesmo sendo monofuncional. Isto deve-se ao fato de que em
meio cido o epxido entre C4-C5 do partenolido pode formar um intermedirio catinico,
que reage facilmente com nuclefilos (Siedle et al., 2003). Assim como o partenolido, o
melampolido 1 tambm possui um grupo epxido entre C4 e C5, o que pode explicar sua
maior atividade em relao a 2. Alm disto, ele tambm possui um outro grupo epxido no
ster da cadeia lateral. O germacrolido 12 bifuncional, porm no possui nenhum grupo
epxido e sim trs grupos hidroxila. Apesar de se tratar de outro tipo de esqueleto, a menor
reatividade da LST 12 em relao LST 2 poderia ser indcio da importncia de um grupo
epxido para esta atividade. J a LST 11, tambm um germacrolido, muito pouco ativa,
porm trifuncional. As LSTs 1, 2, 12 e 18 pertencem classe dos germacranolidos,
caracterizados por possurem um anel de dez membros com grande flexibilidade
conformacional. Porm a flexibilidade de 11 um pouco mais restrita devido presena do
sistema de duplas com a carbonila em C3, o que pode justificar a diferena de atividade.
LST fMLP PAF
1 12,46 2,64 12,32 1,99
2 18,36 1,97 22,66 4,44
11 93,62 10,52 84,52 12,84
12 27,45 1,24 23,28 1,37
13 16,83 1,96 11,84 1,62
14 5,98 0,91 9,21 1,21
15 15,11 0,81 10,94 0,59
16 15,57 1,46 12,28 0,63
17 67,28 4,38 78,33 8,66
F. Ensaios biolgicos 238
Apesar do pseudoguaianolido 16 no possuir a mesma flexibilidade que os germacranolidos,
apresenta uma atividade similar da LST 1. O elemanolido 17, alm de no ser flexvel,
apenas monofuncional e no apresenta estruturas como um grupo hidroxila ou epxido, o que
esclarece os elevados valores de IC
50
que foram obtidos.
Para avaliar se o efeito das LSTs est relacionado apenas secreo da enzima,
investigou-se inclusive sua ao diretamente sobre a atividade enzimtica. Curiosamente
observou-se que as duas nicas LSTs do tipo germacrolido (11 e 12) inibem diretamente a
enzima elastase (Tab. F10). O dmero 10 tambm foi testado e no inibe a atividade
enzimtica de forma significativa.
Tabela F10. Efeito das LSTs sobre a atividade enzimtica de elastase ( desvio padro da mdia).
LST M Inibio (%)
1 75 8,0 5,8
2 75 6,6 3,3
10 50 12,9 7,2
11 200 42,0 9,0
12 100 52,7 26,1
13 100 6,0 9,3
14 50 -1,4 8,8
15 100 0,4 9,0
16 75 3,7 4,7
17
150 3,3 3,5
Constatou-se ainda que a maioria das LSTs no citotxica para os neutrfilos. Porm
2 levemente citotxica (27 % a 75 M), enquanto 17 citotxica a 200 M, matando cerca
de 50 % dos neutrfilos.
No obstante algumas consideraes a respeito do comportamento das LSTs j terem
sido feitas, o mecanismo de ao ainda no est claro. Algumas etapas j foram esclarecidas,
por exemplo, j sabido que o partenolido no capaz de inibir a MAPK p38 (Lindenmeyer,
2004). Entretanto, foi comprovado que o partenolido inibe a fosforilao desta mesma
quinase, assim como impede a fosforilao de enzimas que ativam a MAPK quinase-3/6 em
clulas dendrticas (Uchi et al., 2002). O partenolido tambm capaz de inibir a fosforilao
de MAPK p42/44 em clulas microgliais primrias de rato (Fiebich et al., 2002). O
germacrolido costunolido (o mais simples dos germacrolidos) tambm inibe a fosforilao de
MAPK p38 em clulas Raw 264.7 (Kang et al., 2004). O pseudoguaianolido helenalina, por
sua vez, no inibe a PKC (Powis et al., 1994). Apenas duas enzimas ainda no foram
estudadas com relao s LSTs: a PLC e a MEKK-X. Portanto, possvel concluir que as
LSTs provavelmente inibem a secreo de elastase por inibirem a atividade de MEKK-X (Fig.
F. Ensaios biolgicos 239
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
fMLP PAF PMA sem estmulo
A
b
s
o
r
o
4
0
5
n
m
controles 1 10 20 50 75 100 M
F9). Porm, h ainda a possibilidade de que inibam tambm a PLC (Nick et al., 1997). Uma
vez que os testes com estas duas enzimas sejam realizados, acredita-se que o exato
mecanismo de ao das LSTs seja elucidado.
As LSTs foram investigadas quanto inibio da secreo de elastase estimulada por
PAF e fMLP. A enidrina (1) foi a selecionada para ser avaliada tambm quanto secreo
estimulada por PMA e se os efeitos do meio hipertnico e do repouso de 30 min das clulas
influenciam nos valores de IC
50
. A figura F36 mostra que a secreo basal foi suprimida. A
enidrina (1) um inibidor tambm para clulas estimuladas com PMA (30,03 2,99), porm
necessria uma concentrao consideravelmente maior da mesma do que quando as clulas
so estimuladas por fMLP (9,03 2,26 M) e PAF (12,80 1,73 M). Isto pode ser
explicado pelo fato de que o PMA tambm induz a secreo de elastase por meio da ativao
da via de clcio, a qual no pode ser totalmente inibida pelas LSTs (Siedle, 2003).
Recentemente, relatos tem mostrado que o PMA no promove o aumento do clcio citoslico
em neutrfilos, mas que a afinidade da PKC pelo clcio visivelmente aumentada, o que ativa
esta enzima (Kokot et al., 1987). A enidrina foi submetida ao ensaio com PMA sob as
condies do mtodo com tampo hipotnico e sem repouso das clulas e o valor de IC
50
(38,22 1,37) ainda maior do que no segundo caso de repouso e meio hipertnico (30,03
2,99). Esta diferena nos valores de IC
50
nos dois casos (8,19 M) no muito significativa
porque deve ser levado em conta que mais de uma via estava sendo ativada, uma vez que o
repouso das clulas pode influenciar na afinidade da PKC pelo clcio intracelular. Os valores
de IC
50
obtidos aps estimulao com fMLP e PAF no diferem significativamente daqueles
obtidos para os mesmos estimuladores em outras condies, sem o repouso e em meio
hipotnico, o que comprova que a estimulao basal no interfere nos resultados obtidos e
que, alm disso, ela ocorre por meio da ativao das vias clssicas.
Figura F36. Efeito da enidrina (1) utilizando o mtodo B na secreo da elastase.
F. Ensaios biolgicos 240
0
20
40
60
80
100
1 5 10 20 50
(mg/mL)
I
n
i
b
i
o
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a
e
n
z
i
m
a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
gel de arnica extrato de arnica gel
3.2.3. Efeito do gel e da tintura de Arnica montana na secreo e atividade
enzimtica de elastase
Preparados de flores de A. montana so utilizados para tratamento de
doenas inflamatrias na medicina tradicional h muito tempo. Os princpios
ativos so as LSTs do tipo pseudoguaianolido. O principal pseudoguaianolido a
helenalina (16), j conhecida por sua atividade inibidora da ligao de NF-B ao
DNA, isso , exerce importante funo no processo antiinflamatrio (Merfort,
2003). Dando continuidade aos estudos com relao atividade antiinflamatria, um produto
da indstria de fitoterpicos e seu principal metablito secundrio, helenalina (16), foram
investigados quanto secreo de elastase por neutrfilos humanos. Foram empregados os
trs estimuladores da degranulao fMLP, PAF e PMA.
O gel de A. montana na concentrao de 50 mg/mL inibe 88,6 % da atividade
enzimtica de elastase (Fig. F37) e a mesma concentrao inibe 91,2 % da secreo da enzima
por neutrfilos (Fig. F38). Isto significa que o gel de A. montana praticamente no tem efeito
sobre a secreo da enzima, mas sim sobre a sua atividade enzimtica e de forma dose
dependente. Entretanto, este efeito no est relacionado presena da LST helenalina (16),
que inibe a secreo da enzima (Fig. F35) e no sua atividade enzimtica (Tab. F9). A tintura,
principal componente do gel de A. montana, tambm foi testada, e 50 mg/mL inibem 85,6 %
da atividade enzimtica (Fig. F37). O gel base desta formulao (atrogel), na mesma
concentrao, inibe apenas 14,8 % da atividade enzimtica (Fig. F37). Estes resultados
indicam que a inibio da atividade enzimtica provavelmente no se deve presena de
LSTs, que aparecem em pequena concentrao no extrato etanlico, mas sim presena de
compostos fenlicos, presentes em maiores concentraes. Esta afirmao corrobora os
resultados encontrados para flavonides e derivados de cido cinmico, que inibem a
atividade enzimtica da elastase (Melzig et al., 1999; Melzig et al., 2001a).
O gel de A. Montana no citotxico para os neutrfilos.
F. Ensaios biolgicos 241
-10 0 10 20 30 40 50
-25
0
25
50
75
100
PMA
fMLP
PAF
Gel de arnica (mg/ml)
I
n
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s
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c
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d
e
H
N
E
(
%
c
o
n
t
r
o
l
e
)
Figura F37. Efeitos do gel e da tintura de A. montana e do gel base (atrogel) na atividade enzimtica de
elastase. Os controles negativos receberam cido ctrico ao mesmo tempo que SAAVNA.
Figura F38. Efeito do gel de A. montana na secreo de elastase por neutrfilos estimulados com fMLP
(IC
50
= 4,40 0,30), PAF (IC
50
= 4,16 0,423) e PMA (IC
50
= 6,52 0,63).
F. Ensaios biolgicos 242
3.2.4. Efeito do extrato de Harpagophytum procumbens na secreo e
atividade enzimtica de elastase
O extrato seco de H. procumbens empregado no preparo de formulaes de uso
externo para o combate artrite reumatide e artrose. Seu principal metablito secundrio, o
iridide harpagosdeo, possui atividades analgsicas, mas sua ao contra processos
inflamatrios ainda no foi comprovada. Por isso, a avaliao quanto ao efeito do extrato na
secreo de elastase e na atividade enzimtica vem a contribuir com o processo de estudo
deste vegetal, que h muito utilizado na medicina tradicional na frica e Europa.
Os resultados mostraram que 750 g/mL de extrato de H. procumbens inibem 64,6 %
da atividade enzimtica da elastase. Por isso, uma curva dose-resposta foi construda (Fig.
F39), havendo ento a comprovao de que o extrato inibe a atividade enzimtica de forma
dose dependente. No experimento relativo secreo da elastase foi possvel observar o
mesmo efeito, ou seja, a diminuio da intensidade de absoro conforme aumento da
concentrao (Fig. F40). Apesar de se entender que o efeito se deva principalmente inibio
da atividade enzimtica, possvel observar na curva sobre a secreo que o extrato tambm
capaz de inibi-la, sendo que 750 g/mL de extrato inibem cerca de 75 % da secreo de
elastase. O extrato de H. procumbens no citotxico para os neutrfilos.
Como os princpios ativos que exercem a atividade antiinflamatria ainda no so
conhecidos, pressupe-se que os responsveis pela inibio enzimtica sejam os flavonides,
tambm presentes no vegetal. Esses resultados respaldam, pelo menos em parte, o uso
tradicional deste vegetal, que inclusive vem sendo largamente comercializado na Europa.
0
20
40
60
80
100
50 100 300 500 750
Extrato de Harpagophytum procumbens (g/mL)
I
n
i
b
i
o
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n
z
i
m
a
e
l
a
s
t
a
s
e
(
%
)
F. Ensaios biolgicos 243
Figura F39. Efeito do extrato de H. procumbens na atividade enzimtica de elastase. Os controles
negativos receberam cido ctrico ao mesmo tempo que SAAVNA.
Figura F40. Efeito do extrato de H. procumbens na secreo de elastase por neutrfilos estimulados com
fMLP (IC
50
= 563,7), PAF (IC
50
= 427,2) e PMA (IC
50
= 443,7).
I
n
i
b
i
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d
a
s
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c
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e
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e
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a
s
t
a
s
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(
%
)
Extrato de Harpagophytum procumbens (g/mL)
F. Ensaios biolgicos 244
0 25 50 75 100
0
20
40
60
80
100
fMLP
PAF
Indolinon (M)
I
n
i
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i
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s
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e
e
l
a
s
t
a
s
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(
%
)
5 10 15 20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
PAF
Tryptanthrin (M)
I
n
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s
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a
e
l
a
s
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a
s
e
(
%
)
3.2.5. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na secreo e atividade
enzimtica de elastase
Isatis tinctoria, conhecida como ndigo, utilizada h muito tempo na China e Europa
para produo de corante para tecidos e tambm na medicina tradicional como
antiinflamatrio. No intuito de avanar um pouco no aspecto da atividade biolgica, quatro
alcalides isolados da planta foram submetidos aos ensaios relacionados enzima neutroflica
elastase.
O alcalide 19, indolinona, inibe a secreo de elastase (IC
50
PAF = 5,62 2,36 M;
IC
50
fMLP = 14,35 2,82M; Fig. F41), porm no inibe a atividade enzimtica. O alcalide
no apresentou citotoxicidade.
Figura F41. Efeito da indolinona na secreo de elastase por neutrfilos estimulados com fMLP e PAF.
O alcalide 20, triptantrina, inibe apenas levemente a secreo de elastase (Fig. F42),
no inibe a atividade enzimtica e no citotxico.
Figura F42. Efeito da triptantrina na secreo de elastase por neutrfilos estimulados com PAF.
N
O
O
HO
O
H
20
N
N
O
O
21
F. Ensaios biolgicos 245
Quanto aos alcalides 21, isaindigotona, e 22, indirubina, no foi possvel obter
resultados satisfatrios para a avaliao dos seus efeitos sobre a secreo de elastase. Todos
os experimentos foram realizados diversas vezes e todas as substncias foram submetidas ao
mesmo tempo s mesmas condies. Porm, os dados no permitem avaliaes estatsticas
seguras, sendo que os valores distribuem-se ao longo do eixo horizontal, variando entre
valores positivos e negativos com relao ao eixo vertical.
F. Ensaios biolgicos 246
4. BIBLIOGRAFIA
Ainbinder, E.; Revach, M.; Wolstein, O.; Moshonov, S.; Diamant, N.; Dikstein, R., 2002.
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