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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO

..
,,
ROTEIROS DE AULAS PRATICAS
BIOQUMICA
Curso de Farmcia - 2013/01
ProfJ.9 Suely Gomes de Figueiredo
REAES DE CARACTERIZAODEAMINOCIDOS
I - Reao com Ninidrina: (geral)
Solues: - Soluo de ninidrina .
- Solues amostras de aminocidos (usar Glicina e Prolina)
Procedimento: - Adicionar 2,0 m1 de soluo amostra.
- Adicionar 0,5 ml de soluo de ninidrina
- Ferver por dois minutos.
Reao Positiva - Colorao azul violcea
Obs.: Para a reao com Proiina a colorao obtida amarela.
II - Reao de Folin - caracterizao do grupamento Arnmtico.
Solues: - Soluo amostra de aminocidos (Tirosina e Glicina)
- Soluo de NaOH 10%
- Soluo Fenol reagente.
Procedimento: - Adicionar a 1,0 ml da amostra.
-Adicionar 1,0 ml de NaOH 10%.
- Adicionar 5 gotas de Fenol reagente ou reagente de Folin.
Reao Positiva - Colorao azul violcea
m - Reao de Erlich - Caracterizao do grupamento Indol.
Solues: - Soluo amostra de aminocidos (Usar Triptofano e Glicina)
- Reativo de Erlich
Procedimento: - Adicionar a 1,0 m1 da soluo amostra.
- Adicionar 2,0 ml do reativo de Erlich.
- Levar ebulio por 1 O minutos
Reao Positiva - colorao vermelho-violceo
IV - Reao Xantoproteica - Caracterizao de grupo aromtico em R'
Solues: - Soluo amostra de aminocidos ( Fenilalanina e Glicina)
- Soluo de NaOH 10%
- cido Ntrico concentrado
- Soluo padro de fenol a 0,5%
Procedimento: - Preparar 3 Lubos de ensaio l )Adicionar 1,0 mi de Fenilalanina.
2) Adicionar 1, O ml de soluo padro de Fenol
3) Adicionar 1.0ml de Glicina.
- Adicionar 0.5 ml de h"'N03 concentrado a cada um dos tubos.
- Levar ao banho fervente por 5 minutos.
- Adicionar posteriormente 4.0 ml de NaOH a l ~
Reao positiva - colorao amarela.
V - Reao de Sakaguchi - caracterizao de grupamento guanidnico
Solues: - Soluo amostra de aminocidos (Arginina e Glicina)
- Soluo e aifa-naftoi a 5% em Etanol
- Hipoclorito de sdio (gua sanitria)
- Soluo de NaOH 10%
Procedimento: - Adicionar 2,0 rnl soluo amostra de aminocido.
- Adicionar 2 gotas da soluo de alfa-naftol.
- Adicionar 5 gotas de soluo de hipoclorito de sdio.
- Adicionar 0,5 ml da soluo de NaOH a 10%.
Reao positiva - colorao vermelha.
VI - Reao para aminocidos sulfurados
Solues: - Soluo amostra de aminocidos (cistena e glicina)
- Soluo de acetato de chumbo a ~
- Soluo e NaOH a l 0%
Proceimento: - Aicionar 2,0 mi a amostra.
- Adicionar 2,0 mi de soluo de NaOH l 0%.
- Aquecer em banho de ebulio por 3 minutos.
- Adicionar 0,5 mi de acetato de chumbo a 5%
- Manter em banho fervente por mais 5 minutos
Reao positiva - precipitado preto-castanho de sulfeto de chumbo.
Testes Folio
1
Erlich 1
Xantopro
1
Sakaguchi 1
-
Para

1 Ninidrina
1 1
1
tica
'
sulfurados
Aminocios 1 Giv 1 Pro Tvr i Giy i Tro i Glv 1 Phe Glv
1
JArg 1 Glv 1 Cvs
Resultados
1 1
1
1 l
1 1 1 1
!
1
1 1 !
/ VII - Precipitao da Tirosina
1. Numerar 2 tubos de ensaio - A e B.
2. Adicionar a cada tubo amostras do aminocido tirosina (pi 5,66).
3. Adicionar aos tubos 1 ml de H
2
0. Observar a solubilidade.
4. Adicionar aos dois tubos uma gota de indicador universal.
5. Observar colorao e compar-la com escala de pH. Anotar o pH.
6. Adicionar HCI 1 N (gota a gota) ao tubo A, observando a variao de pH e a
solubilidade do aminocido.
7. Adicionar NaOH 2N (gota a gota) ao tubo B, observando a variao do pH e
a solubilidade do aminocido.
8. Interpretar os resultados.
Giv
REAO DA NINIDRINA PARA AMINOCIDOS
o

lo J e
'oH


+ R-C-COOH
1 11
NH2
+ RCHO + NH3 + C02
Q Q
,..........._,.,e, ,, e ,,..A....
NH3 J o J e- N = e, ) o 1 + 3H20
......._ /'C/ e '\.:,..J
REAO XANTOPROTICA
A) H .
- - COOH + 2HN03 -. 2H20
H NH2
8) OH OH
d o
Complexo azul - violceo
( Prpura de Ruhemann)
OH O Na
+ O,N0No, + 2NaOH ____.
. y '
R R + 2H20
Na OH
e

+ 3HN03 --+ 3H20 +
1yrN02

REAO DE SAKAGUCHI
COOH
' -C-NH2
1
{H1Ch

1
C.:NH
'
NH2
NaCJO
+ ou +
NaBrO
N01
a-nattol
H03f OH
o o
----+
COOH
1
Hy NH2
(H2fh + H20 +
NH

NH2 ""'-./,/
REAO PARA AMINOCrDOS SULFURADOS
CH, -CH -COOH
' - '
SH NH2 + HiO
Na OH
H2S + NaOH ---+ Nai S + H:O
CH:-CH-COOH
1 1
OH NHl + HzS
+ PbS
{Prec101taao ne<Jro 1
NaCJ
ou
NaBr
01. SELEO DO COMPRIMENTO DE ONDA:
- Tomar uma soluo de permanganato de potssio a 4,5mg% e em 02 tubos de ensaio
diluir como a seguir:
Tubo Sol. de KMn04 (mi) gua dest. (mi) Cone. Final
01 2,5 2,5 2,25 mg0/o
02 5,0 -
4,5 mg%
- Fazer a leitura dos tubos 01e02 nos comprimentos de onda de 400, 500, 530, 540, 550, 600 e 650
nm.
- Com os dados obtidos, construir os seguintes grficos
1 -Comprimento de onda na abscissa e absorvncia na ordenada
2 -Comprimento de onda na abscissa e transmitncia na ordenada.
- Analisar os grficos e estabelecer um comprimento de onda ideal para as leituras dessas solues.
Tubo 01 Tubo 02
nm A T A T
400
450
500
530
540
550
600
650
02. VERIFICAO EXPERIMENTAL DA LEI DE LAMBERT-BEER
-Tomar uma soluo de KMn04 a 4,5mg% (soluo padro). A partir desta soluo, preparar
as seguintes diluies:
Tubo KMn04 gua dest. Cone. Final Absorvncia Transmitncia
(mi)
(mi) (mg%)
01 1,0 ml 4,0ml 0,9
02 2,0 ml 3,0 ml 1,8
03 3,0ml 2,0ml 2,7
04 4,0 ml 1,0 ml 3,6
05 5,0 ml
-
4,5
- Sabendo-se que para esta soluo tem absoro max1ma no comprimento de onda 530nm, fazer a
leitura nesse comprimento de onda, e construir grficos colocando em abscissa as concentraes e em
ordenadas a absorvncia ou a transmitncia.
03. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE UMA SOLUO DE KMn04
DE CONCENTRAO DESCONHECIDA.
- Tomar uma soluo de KMn0
4
de concentrao desconhecida e determinar sua absorvncia
(ou transmitncia) em 530nm.
- Utilizando-se os grficos feitos no item anterior, calcular a concentrao.
15
FOTOCOLORiiVIETRIA
A Fotocolorimetria uma das metodologias mais amplamente usad;is nos laboratrios cm geral. Em
laboratrios relativos rea biomdica. sua aplicaes principais s:io:
1. Medida da concenc.ra:io de solues coradas
2. Medida da concentra5o de substncias incolores. mas que :ips reaes qu1m1cis ;:ipropriad:is
resultem em produtos corados. cuja intens icbde de cor proporcional:'.\ subst.5.ncia cm cslu! h
3. Estudo do espectto de absorio (rnrva especrra[) de subst.:incias.
4. Identificao de substncias e determinao de seu gnu de purcz..'.l.
Exemplo:
1. Solues coradas:
Hemoglobina. citocromos. pigmentos em geral. sais cor:idos, etc ...
Solues coradas aps re:ies qumicas: .
Glicose (incolor) + Ono-toluidina resulL1 n:i forma:o de glici\s;1mina de col or::i ; o verde com
Absorv:i.ncia m:<. em 630nm 1
Colesterol (incolor) + Reagente de Lieberman-Bucl1a.rd. result.:i. ech produw corJdt) verde (Am:i.\ =
. 1
3.
625 nm) Protena+ Reagente de Lowry, result.a em produto corado('.m azu l
Curva espectral, relacionando Absorvncia e Comprimento de ondaf
Absordo mclri111a. nm
Hemoglobina
;
50 e outros !
Oxiemoglobina ' 577 e ourros
Metemo;:;Iobina (cm cido)
1
630 e outros
1
..
Citocromo e fe++
!
550 e ourros
Citocromo e fe+++
1
565 e outros
Ribol.avina. FMN. FAD
1
450. 375. 260
r
NADH+ rr. NADPH+ n
!
3-W. 260
i
NAD'". NADP'"
1
260
Ubiquinona
!
275
1
Ubiquinona reduzida
i
290
1
-
Tirosina: tambm em ligao pepridica
l
, .,-
_ 1 )
-
Triptofano: tambc!m em ligao pepridica :.so
Derivados de adenina (outras purinas e pirimidinas) 260
Hb (red)
l
Hb - 01
A
1
1
1
1
A
I
t
'---+---+--+--+--+----t---t-t-+--1
50051O520 SJO 5-10 550 560 570 51!0 590 fiOO
SOO 51O520 SJD 5-tO 550 560 570 560 S'JO GOO
Hemoglobina oxidJda
A 1ni1l )
Hcmo gl obin:i. redu zid J
eu R VA s E s p E e T R A [S
0,600
o.soo
0,400
O.JOO

\
0,200
\
\
\
0, 100
\
\
\
\ 1 1
\ 1 1 1
- - - - - -1-L - ...!.. - - - -
.1J<J J40 J66
(U V)
- - - - - NAO.
---NAOHH
Curvas espectrais de NAO oxidado (NAO .. ) e NAO redubdo (NAOH + H. )
6

5
o
....

.
4
]
';(
"
3
"
=
"
2
i::
x
u
Tirosina
Fenilalanina .
240 240 2JO 240 240 :!40
Longitude d-: onda , m. (nm)
DEFL'\/lES:
1. Ener;:ia radiante - Energia de r:idia1\::; clclfomagnLic1s. O !luxo dessa Energia se constitu i de
ftons. os quais repn;sentam um qu:rntun de energia. OI' seja. a unidade de energia Esse t1uxo d,;
em:rgia de natureza ondulatria.
V
....
::: comprnncnltl o nuas
v =
Pedoda - Corresponde a um comprimento de onda que represcnt:ido pel:i letra grega . "lamb.:l".
2. Freqncia - Corresponde ao nmero de vezes em que as ondas de uma determinada rad i:i. :lo se
repetem em um intervalo de tempo (s) e represent.ada pela grega v "nu".
Comprimento de on<h e freqncia guard.a.m. entre si. relaio in versa: v = !(A. ou ainda. = cFA, onde
c a velocidade da luz (3 x 10
3
m/s) .
3 . Energia de uma radiao - d.'.J.da por E= b .v. onde h a con stante de Pl:i.nck. que igual a 6.63 x
l O J' joules.s.
Como v = cfi... , a energia dada tambm por E '" hcfi... .
14
E
l2
(e V) l O
4.
3
2
l
Gr[ico d e E= [(. )
100 350 500 l .000 5 .000
Comprimanto da ( ).. am)
Rx uv V[S [V
i
[V
i
Espectro Radiante Conjunto cfas radiaes desde radiaes de bai:<:o
comprimento de onda. como Raios Gama e Raios X, at comPicimerHo de onda longo. como Onchs
Hertezianas. i
!
Espectro de energia radiante
Raios
Gama
1 o
?--
(J')
o
cu
cr.:
10
10
Raio x
Ultra-
violeta
Vlsivel
Infra-
vermelho
Ondas
hertezfanas
100 200 300 400 500 600 700 800
. (comprimento de onda)
1 0.000
1 o.. 1 o.. 1 o... 1 o' 1
X
(J')
o
ro
cr.:
o(/)
1- cu
ulJ
-e

10
1
1 O'
1 o
1 o
o
u
CU
cr.:
1 o
1 O'
./ cm
g. v. ciclos I seg.
1 O'
aJ Espectro visive( - Faixa de 350 a 750 nm. compreendem.lo as cores fundamenL:J.is.
b) Espectro Ultravioleta - Faixa de aproximacL1111ente 100 :i 350 nm. Podemos us:u- :i exprcss:'io U1t.r:ivi okt.:i
prximo para comprimentos de onda no !ItUitos distantes do visvel (350 nm) ou lJluavioleL.1 diswnlc.
quando nos referimos a comprimentos de onda j prximos de l 00 nm.
c) Espectro infravennelho - Faixa de 750 nm at cerca de l0.000 nm. D::i mesma forma. nos rdcrir :1
[V prximo ou IV distante, conforme a proximidade do espectro visvel.
d) Espectro Herre.:iano - Correspondente s radiaes de maiores comprimentos de onda. onde lc:-nos :is ondas
de rdio e TV.
OBS : Em fotocolorimeuia. interessa part.icul:.innentc o espectro visvel .
6. Emisso de Radiaes - Fontes de luz visvel . Metais inc:i.ndescentes e luz solar so fontes de energi::i
radiante que compreendem ampla faixa do espectro radiante. qas quais uma pequena parte
percebemos como luz branca. Fazendo-se a "luz branca" incidi( sobre um prisma cm ngulo
adequado, ao atravess-lo decomposw confom1c seu . A luz fornt:cc o cham::ido
Espectro visvel formado das sele cores fundJ.ITlenc..1.is. 1
i
e o m Q fim e n (o d e lo n ci J ( l
1
Em nm Ern_A

350 a 4 o o 1 3500 a 4000
400 :l 450 4 o() o a 4500
LUZ
r anil 450 a 500 4500 a 5000
BRANCA
> verde 5 IJ o a 550 5000 a 5500
_,____
550 a 600 5500 J 6000
Prisma l:.ir:in_.a
600 J 650 6000 a 6500
vermelho 6 5 () a 700 6500 a 7 5 O:J
U n.:stc c:1so, scrliu como mon1:cromar!or 1.: J c::ida 'Jma d.::t s se(c L1i,:.1s um:i luz
monocromtica.
7. Coe - lbdiaes de:\. menores que: 350 nm ou maiores qU'.:: 750 nm. nfi'.:1 '., J.o vi:;i:i;: :; J.O o'!w lwmano.
P:;rt.:mtc. a -.:or resuila d.a conjuga5o de um tenmeno t"sco (on.J. dt'.uomag11uc:1) '.: IH''
foiolgi;;a (impulso nervoso) .

iuminosa

crtex cerebr<:1!
(impulso n12:rvos.o)
!-cnrncno ff.sico Ft!:lrneno fisi<Jlgico
(Pr:jpaga;io t'b (1-\<,:jo da iu.r. sobre pigmenttj;s
, visuai!; e ger::io de impulso ncr1o!;oj
=:- -;\ P
l - Fotoco!nfi:ncui.1 - Por coc1J: i:1 ( "} .5 0 a n:n)
2- E:lp\:clroifJt(Hnt.:tr.i;1 n:.l :l.J tJ\/ .
FOTOCOLORi iYIETRIA
r. SubsLincias que em soluo so coradas. t.J.is como meL'.lis ( vanidio, ferro, cobalto. cromo. molibdi!n io, cobre.
etc ... ) ou por subsLincas de natureza orgnica que apresentam grupos cromforos (hemoglohina. citocromos.
corantes diversos etc ... )
II. Subst5ncias incolores em soluo. mas que aps rc::i:io qumic::i especfica. resull:lm em prcxJuto cor:ido ( o
ma.is comum).
A fotocolorimeuia est baseada em leis relativas absoro de energia r;J.diJ.n!c.
Lei Fundamental d.a Fotocolorimeuia - lei de Beer.
Enunciado: " A intensidade de um feixe de luz monocromitic1 que atravessa uma solu:l corarJ:i.
decresce exponencialmenr.e medida que a espessura d::i cuba ou a co11c:::ntn:lo d.:J. solu:o.
aumenta aritmelicamente."
III. Demonstra5.o da Lei de Beer:
Sejam 4 tubos: A. B. C, e D. confom1e abaixo:
e

Io--- ... ~ [


Considere-se:
lo - Luz incidente (100%)
B
lo-W-lt
D
e ~
~ r o ---1 ... : : : : .. --_..
. .....
......
\.!.!..Y
I Luz emergente (transmitida)
a) Os tubos A, B e D tm o mesmo dimetro (mesmo caminho ptico).
b) As solues A, B e C tm a mesma concenua.o.
e) A soluo D duas vezes mais concentrada que as demais.
d) o tubo c tem dimetro duas vezes maior que os demais.
RESULTADOS E CONCLUSES:
l. A luz emergente em A e B a mesma (mesmo dimetro e mesma concentrao)
2_ A luz emcrgcnlc em C menor que em A e B (maior diimetro)
3. A luz cmergeme em D menor que em A e B (maior concentr:i5.o)
4. A luz cmcrgcnlc em C e D igual (a m:iior conet:ntrao em D compcnsacfa pelo maior diii.mctro em C)
IV. Relaes rnatern:ticas:
Absnrvni:in. dcsignatla por A. a quantidade <.k energia radiante absorvid::i ou cxtint:1. qu:.indo a lt11
nomocrom:tic:i :itravcssa uma solut> corad.a. tamht'.m designada de Den.sidadc ()plica (00).
Transmitncia. designai.ia por T, a cncrgi:i radiante que efetivamente atravbsa a solu:o.

(100%)
Parte
Absorvida
A
Na dependncia de 3 fatores:
Caminho ptico (d).
concentrao (c)
natureza (k).
Parte
Transmitida
T
i
A== log lo - log T
A == log 100 - Iog T
(corno Io, arbitrariamente considerado cortjo 100'lo)
!
1A=2 -log T 1
EsL1 a relao matcmr.ica entre A e T.
Relao entre Absorvncia.. k. c_ d :
Sendo log lo - Iog I = k.c.d ou seja. "a luz absorvida depende do cominhtjl ptico (d) , dimetro da cubet.:l. d:.i
concentrao da soluo (e) e do coeficiente da abscr:io da
soluo (k)". l
j Assim, A= k.c.d 1
i
Considerando-se: o diirnetro da cubcta de l cm (d= lcm) , a equao resua1e-sc a A= k.c
Sendo K uma constante (coeficiente de absoro ). deduz -se que A a e
. . . 1
jAacl :
1
Obs. Quando a concentrao do soluto for expressa em termos de molaridade. la equaJ.o pode ser escrita A = E.e
onde E designado Coeficiente dr! Extino Molar, cujos valores so e tem brgo no
Laboratrio. !
Portanto, A = k.c ou A = E.e
Relao entre Transmic.ncia e Concentrao:
Seja a seguinte seqncia de tubos de mesmo dimetro e contendo a mesma soluo (mesma subscincia e
mesma concentrao), exceto o tubo l. que contm gua destilada.
; _
- ----- ----- - ----
2 3 4 5 6


{, li I4 ls 16


..
...
H,O d e l e 1 e 1 e 1 e 1
,._.,m .- - ____ ........ --- - -
Cnsi<Jer-ar1do quC um raio de luz monocromjtica ::i.tr:ivcssa a seqncia de tubos acuna e ncnbuma
"pcrdid:i" no interv:o entre os tubos, teremos
TUBOS RAIO EMERGHffE (cm T) RELAO A e T A
l (H:O d) I
1
= fo = 100% A= 2 - log 100 2-2
=o.o
2(<.:1) li= 80% dt: 1, = 80".'a A=2-log80 2-1 .903 = 0.097
3 (e!) 11 = 80'7o de 12 = 64% A= 2 - log 64 2-1.806 =0.!94
4 (cl) [, = :!09c de 13 = 51 A = 2 - 5 l.2 2- l . 707 = 0.293
5 (e l)
..
1
5
= 80% de [4 = 40.9% A= 2 - log 40,9 2-1.612 = O.JiSX
-
6 (e!) [6 = :l0% de [5 = 32.7% A= 2 - log 32.7 2-1.518 = 0,482
'"
'.J ' .. ' '-
; , .' .
T"la
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10 r
o
C1 Ci Cl C4 Cs
2 3 4 5 6 (tubos)
Relao entre Absorvncia e concentrao:
(A)
Sendo A o: e e sendo k esta constante de prpporcion:tlicbde. o grfico
Exemplo: soluo de CuSO,.
na concentrao de O a 10%
Cone. (g%) A
o o
2 0,097
4 0,194
6 0,291
8 0,388
(C)
10 0,485
Do exemplo acima:

1

! '
f
!o.:i
i
A !
i2
!.
!0.1
l. A substncia segue a Lei de B eer (pelo menos at a concentra:lo 1 Og%)
2. Determina-se a concentrao desconhecida. por regra de trs
3. C:tlcula.-se o Fator de Calibrao (Fc). por Fc = cJ A; '
4. O Fc uma constante (a substncia. segue a Lei de Be:er).
5. A concentrao de um desconhecido Cllja A= 0,242 ser igu:tl a 5g'fo.
l\llEDIDAS COLORilVITRICAS
Esquema de um colorfmetro:
A= f(c). scr:i:
1
1
1
1 S'I.
:1
2 4 6 e
01 10 20 30 40 50 60 70 80 80 100
( +)
r"\.JiJ\.f\J'.J\.,
10
7 '!.
(Tr>osmileoc,i:)
A
A=2-logT
a b e

d ()
1,5 0,9 0,7 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 o
a) Fonte de energia radi;inte (UV. VIS. [V)
b) Monocromador de luz (prisma. filtros. grade de filtrao. etc ... )
e) Cu beta de: le:itura (vidro ou quartzo, formato redondo ou quadrado. em ger:tl com l cm de caminho
tico
d) Clula fotoeltrica (ger;i.o de corrente el1.rica em funo de luz incidente)
e) Galvanmetro (escalas de leitura em Absorvncia e/ou Tra.nsmitincia)
Escolha do comprimento de onda: Baseia-se na curva espectr:tl da soluo corada final relacionando
Absorvncia e comprimento de onda. A escollia do comprirnenlo de onda
definida. pela Absorvncia mxima para cadasolujo.
A
0,7
A,
0,6
o.s
0,4
0,5
-
0,7
0,6
0,4
0,3
0,2
0, 1
o
----
----
300 400 500 600 700 800 nm
Mn :I.= 480nm
--------
0,3
0,2
0, 1
C l e C2 tratam-se da mesma soluo, onde a concentrao de C2 = 2xC 1 ,
e. Ci
No grfico 1 observa-se que a Amu para Cl e C2 em 660 nm e a Amin em 480 nm.
No grfico 2 observa-se que o comprimento de onda ideal para leitura colobmtrica deve ser preft:renternente na
regio de absoro mxima (menor erro). i
l
DOSAGENS BIOQUMICAS - Tabela para leitJras colorimtricas
DOSAGEM METODOLOGIA i .mx
Glicose Readio com orto-tolu.id.ina i 630 nm
Glicose Reao enzimca. 4- aminoantipirina (4-ANA) 505 nm
Glicose Reao enzimca. 4-aminofenazona (4-AF)
'
510 nm
Colesterol Reao de Lieberman-Burchard
'
625 nrn
l
Colesterol Reao enzimtica. 4-aminofenazoma ( 4-AF) ' 500 nm
Trigliceriueos Reao de cor com acetilacetona
i
450 nm
!
Creatinina Reao de Jaff (picrato alcalino)
i
500 nm
Protenas Reao do B iureto
i
550 nm 1
Uria Reao da Diacetilmonoxina
i
nm
Diversa.-; Reao de xido-reduo do NAD (UV)
1
3-+0 nm
i
1
!
Opel"ando com o Fotocolorimetro: Leitura usual
1 - Preenche-se a de leitura com gua destilada ou branco dai soluo a ser lida.
2 - Acerta-se o do g:.tlvanmetro (A= O ou T = 100%).
3 - Preenche-se a cubera com padro(es) de concentrao(es) conhecida(s).
4 - Preenche-se a cubeta com a soluo de concentrao desconhecida e determina-se sua Absorvncia ou
T ransmitnca.
5 - Calcula-se a concentrao da soluo desconhecida, us.ando o fator de Calibrao ou regra de t:rs
simples ( substncias que seguem a Lei de Bcer) .
.Suhst:lncias quem n:io seguem a Lei de Beer, usar o gr:fico de c.:i!ibr:iu.
,...
-
CL4SS!F!CA.Ci..O DAS ANrlUSES ESPECTROFOTOMTR!CJ.5
TIPO CARACTERSTICAS USQ LABORATORIAL
ABSOR.i\O A soluo at.ra vcss:i.a por luz bioqumic:i.s cm gcr:Ll .
monocromtica. onJc.: parte absorvili1 e hormonais. pigmentos. etc .. .
parte transmitida (UV, '{IS. IV)
EMISSO: A soluo em anlise gotcjaa ou
1. Fotometria de chama vaporizaa cm queimador de alw.
lcmpcrawra. C:cions cm icem luz Dosagem de ons:
canctc:rscic:is.
proporcion:il
N:i K . Ca-. Lt
concentrao.
2. fluorimet.ri:l A subslinci:i a ser dos:id:i c:cciw.cb por.
luz (gcralrm:ntc UV) e.: a cmitir cm Dos:igcm dc vil1minas. hormnios .
..
comprimcnlo de ornla rnprio. neurolrarlsmissorts. etc .. .
1
Precipitao por solvente orgnico:
ACETONA. 1
1 Precipitao por solvente orgnico: j
1 ALCOOL. I
Influncia da temperatura na solubi-1
liza o de orotenas. 1
Reao do Biureto
EXPERINCIA I - Precipitao por cido forte
- Colocar em um tubo de ensaio, 1,0 ml da soluo de protena a lg%.
- Adicionar lentamente pelas paredes do tubo 0,5 ml de HN03 cone.
- Interpretar os resultados
EXPERINCIA II - Precipitao salina
- Colocar num tubo de ensaio 1,0 ml de soluo de protena a lg%.
- Adicionar lentamente 2,0 ml da soluo saturada de sulfatode sdio. No agitar o tubo.
- Observar a formao de uma zona esbranquiada na parte mdia do tubo. -
- Interpretar os resultados:
EXPERINCIA III - Precipitao por solventes orgnicos
- Adicionar num tubo de ensaio 2,0 m1 de soluo de protena a lg%
- Adicionar ao tubo 3,0 ml de acetona gelftda, lentamente, pelas paredes do tubo.
- Repetir o experimento usando lcool gelado.
- Interpretar os resultados, estabelecendo a relao com a experincia II
EXPERINCIA 1 V - Precipitao por sais de metais pesados
- Adicionar a um tubo de ensaio 1,0 ml da soluo de protena 1,0g%.
- Adicionar lentamente 0,5 rnl da soluo de acetato de chumbo a 0,5%.No agitar.
- Interpretar os resultados.
EXPERINCIA V - Influncia da temperatura na solubilizao de protenas.
- A um tubo de ensaio colocar 2,0 ml de soluo de casena a lg%.
- A outro tubo de ensaio adicionar 2,0 ml de soluo de albumina a lg%.
- Levar ambos os tubos a um banho fervente por 2 minutos
- Interpretar os resultados.
EXPERINCIA VI - Reao do Biureto
- Adicionar a um tubo de ensaio cerca de 0,5 ml de soluo de protena.
- Adicionar 2,0 m1 de soluo de Biureto e agitar.
- Interpretar os resultados obtidos.
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Amostra: Mistura de aminocidos
Procedimento:
01. Preparar o sistema solvente em uma ampla de decantao, misturando n-Butanol:cido actico:gua (4: 1:5,
v/v). Usar a fase aquosa para saturao da cmara cromatogrfica durante cerca de 1 hora.
02. Marcar sobre papel de filtro (Whatman n 01) 4 pontos de aplicao de amostras (Al, A2, Pl, P2) a 2,5 cm de
uma das extremidades da fita de papel
03. Aps a saturao colocar dentro de uma placa de Petri localizada dentro da cuba contendo a cromatofolba
a fase orgnica do sistema solvente que dever ficar aproximrdamente a 1 cm abaixo do ponto de
aplicao . .
04. Para facilitar a saturao da cuba, colocar uma folha de papel de filtro embebida na fase aquosa revestindo
seu interior.
05. Desenvolver a cromatografia a temperatura na temperatura ambiente, marcando ao final da cromatografia
a frente do sistema solvente.
06. Secar a cromatofolha em estufa e revelar com soluo de ninidrina a 0,2% em acetona.
07. Submeter a aquecimento entre 70 e 8C para a reao de colorao dos aminocidos.
08. Marcar as manchas originadas e medir as distncias em cm percorridas pelos aminocidos, considerando o
centro destas manchas. Calcular os valores de Rf.
cc PP
1


I ['
A,A,p,p,
....
z-+
A,A,p, p,
2 1
CC - Cuba cromatogrfica
PF - Papel de filtro (suporte)
AI ,A2 ,PI ,P2 (pontos de aplicao de amostras e padres)
1 - Fase aquosa de saturao (Polar)
2 - Fase orgnica de cromatografia (Apoiar)
X - Frente de migrao do solvente
Z - Pontos de aplicao das amostras e padres
A Distancia percorrida pelo solvente
B, C, - Distncia percorrida pelos padres
Rf = Distncia (cm) percorrida pelas amostras
Distncia (cm) percorrida pelo solvente
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Amostra: Mistura de aminocidos
Procedimento:
01. Preparar o sistema solvente em uma ampla de decantao, misturando n-Butanol:cido actico:gua (4: 1:5,
v/v). Usar a fase aquosa para saturao da cmara cromatogrfica durante cerca de 1 hora
02. Marcar sobre papel de filtro (Whatman n 01) 4 pontos de aplicao de amostras (Al, A2, PI, P2) a 2,5 cm de
uma das extremidades da fita de papel
03. Aps a saturao colocar dentro de uma placa de Petri localizada dentro da cuba contendo a cromatofolha
a fase orgnica do sistema solvente que dever ficar aproximrdamente a 1 cm abaixo do ponto de
aplicao . .
04. Para facilitar a saturao da cuba, colocar uma folha de papel de filtro embebida na fase aquosa revestindo
seu interior.
05. Desenvolver a cromatografia a temperatura na temperatura ambiente, marcando ao final da cromatografia
a frente do sistema solvente.
06. Secar a cromatofolha em estufa e revelar com soluo de ninidrina a 0,2% em acetona.
07. Submeter a aquecimento entre 70 e 80"C para a reao de colorao dos aminocidos.
08. Marcar as manchas originadas e medir as distncias em cm percorridas pelos aminocidos, considerando o
centro destas manchas. Calcular os valores de Rf.
cc PP
1


I [

A,A,p,p,
.... ,_
A,A,p, p,
2 1
CC - Cuba cromatogrfica
PF - Papel de filtro (suporte)
AI ,A2 ,PI ,P2 (pontos de aplicao de amostras e padres)
1 - Fase aquosa de saturao (Polar)
2 - Fase orgnica de cromatografia (Apoiar)
X - Frente de migrao do solvente
Z - Pontos de aplicao das amostras e padres
A Distancia percorrida pelo solvente
B, C, - Distncia percorrida pelos padres
Rf = Distncia (cm) percorrida pelas amostras
Distncia (cm) percorrida pelo solvente
6
IDENTIFICAO DE CARBOIDRATOS
OBJETIVOS:
a) Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento dos pnnc1pa1s
glicdios.
b) Conhecer o significado dos testes de benedict, Seliwanoff, Iodo, Biai , Barfoed e etc ..
c) Aplicar os testes acima para identificao de glicdios desconhecidos.
NOTA: Cada grupo de estudantes receber vrios acares tais como: glicose, frutose,
sacarose, amido, maltose, lactose e ribose e um acar para ser identificado, usando os
testes abaixo. Cada teste deve ser realizado com todos os acares recebidos inclusive com
o desconhecido. Os resultados devem ser lanados no quadro abaixo
RESULTADOS DOS TESTES (+ou-)
CH Molisch Benedict Seliwanoff Barfoed Biai Iodo Obs.
Glicose
Frutose
Sacarose
Amido
Maltose
Lactose
Ribose
Desco-
nhecido
PROCEDIMENTOS:
l) Reao de Molisch: uma reao geral e de caracterizao para os carbohidratos. a
partir de pentoses.
Colocar em um tubo de ensaio:
- 2,0 ml de soluo do acar a ser identificado
- 3 gotas de soluo alcolica de alfa-naftol a 10%.
- Misturar bem.
- Adicionar 2 ml de H
2
S0-1 concentrado (ateno no pipetar), inclinando o tubo
lentamente de modo que os dois lquidos no se misturem. No agitar o tubo.
Notar o aparecimento de um anel prpura ou violeta no limite da separao dos dois
lquidos, resultante da condensao do furfural ou hidroximetilfurfural com alfa-naftol.
2) Reao de Benedict: Ions cpricos estabilizados em soluo por agentes complexantes
so reduzidos pelos grupos carbonila (livres ou potencialmente livres) das aldoses e cetoses.
Colocar em um tubo de ensaio:
- 1, O m1 de reativo de Benedict.
- 0,5 ml de soluo do accar a ser identificado.
- Ferver durante 1 minuto em banho-maria e deixar esfriar espontaneamente.
Observar a reduo notando o precipitado vermelho-tijolo que se forma. O precipitado
vermelho tijolo que se forma de xido-cuproso.
3) Reao de SeliwanofT: O teste diferencia aldoses de cetoses, a reao se processa mais
rapidamente com as cetoses do que com as aldoses. Solues concentradas de aldoses
podero dar resultado falsamente positivo.
Colocar em um tubo de ensaio:
- 0,5 m1 de sol. do acar a ser identificado.
- 1,0 m1 do reativo de Seliwanoff Cuidado! no aspirar.
- Colocar o tubo em banho-maria fervente durante 5 minutos, observando o tubo a
intervalos de 30 segundos.
O aparecimento imediato de colorao vermelha indica teste positivo para cetoses.
4) Reao de Barfed: Reao que se distingue monossacarideos de dissacardeos
redutores pela velocidade com que se forma Cu20 a partir da reao entre o acetato cprico
e o carboidrato. Os dissacardeos reagem mais lentamente com o reativo de Barfed do que
os monossacardeos.
Colocar em um tubo de ensaio:
- 1,0 m1 do reativo do Barfed.
- 1,0 ml de soluo do acar a ser identificado.
- Levar o tubo em banho-maria fervente por 5 minutos.
Observar a formao de um precipitado de xido cuproso.
5) Reao de Biai: Caracterstica para Pentoses. As pentoses e nucleotdios que as contm,
quando aquecidos com cido diludo, produzem furfural. Este se condensa com o orcinoL
produzindo um produto de cor azul.
Colocar em um tubo de ensaio:
- 1,0 ml do acar a ser identificado.
- 0,5 ml do reativo de Bial.
- 1 ml de HCI concentrado (no pipetar).
- Misturar bem e levar o tubos em banho-maria fervente por 1 O minutos.
Reao positiva se caracteriza por formao de produto corado em azul (ou azul
esverdeado).
6) Teste do Iodo: Formao do complexo Amido-Iodo (e sua reverso pelo calor). Iodo em
soluo produz reao colorida com polissacardeos, com o amido produz colorao azul e
com o glicognio colorao vermelha.
Colocar em um tubo de ensaio:
- 2,0 ml da soluo do acar a ser identificado.
- Adicionar 2 ou 3 gotas de soluo de iodo (Iugol).
Notar o aparecimento de colorao azul , o que caracteriza teste positivo para o amido.
7) HIDRLISE CIDA DOS DISSACARDIOS
-Tomar 4 tubos de ensaio e colocar: Tubo 1: 1 ml de maltose+ 1 ml de HCl 2N
Tubo 2: 1 mI de sacarose + 1 ml de HCl 2N
Tubo 3: 1 ml de maltose + 1 mi de H
2
0
Tubo 4: 1 mI de sacarose+ 1 ml de H
2
0
- Ferver por um minuto em banho-maria.
- Neutralizar os tubos 1 e 2 com 1,0 ml de NaOH 2N
- Adicionar 1,0 mI de H20 aos tubos 3 e 4.
- Acrescentar a cada tubo 1,0 ml do reativo de Benedict.
- Levar os tubos ao banho-maria fervente por 1 min.
- Interpretar os resultados
ELETROFORESE DE PROTENAS PLASMTICAS
01. Retirar as tits de cellogel da soluo conservadora (metanol a 40%), enxug-las entre duas folhas de
papel de filtro e mergulh-las em soluo tampo apropriada por aproximada.mente 10 minutos.
02. Retirar as fitas d.a soluo tampo, coloc-las entre duas folhas de papel de filtro a fim de retirar o
excesso de tampo. Coloc-las na cuba eletrofortica com o lado absorvente para cima, convenientemente
estirada.
03. Ligar a fonte e aguardar alguns minutos para que haja estabilizao da corrente eltrica
(aproximada.mente 3 minutos).
04. Aplicar o soro com aplicador especial aproximadamente a 1,0 cm da dobra da fita a parr do polo
negativo.
05. Ligar a fonte de corrente contnua e aguardar a corrida eletrofortica que dever ser 30 a 40 minutos com
uma ddp de 200V.
06. Aps a corrida, r:erirar as fitas e coloc-las num recipiente contendo o corante que dentre outros, p<Xier ser uma
soluo a 0,5% de vermelho Ponceau em cido tricloroactico a 5%.
07. Retirar as fitas do corante aps 5 minutos e coloc-las na soluo descorante (cido actico a 5%).
Renovar a soluo descorante por vrias vezes at que as fraes estejam suficientemente evidenciadas e
a fita apresente o fundo branco completamente descorado.
08. Desidratar com metanol durante 01 minuto e em seguida colocar as fitas na soluo transparentizante
(metanol-cido actico-glicerol, 78,0 ml; 20,0 ml; 2,0 ml). Aps 01 minuto na soluo transparentizante
as fitas so aquecidas em estufa at completa transparncia.
09. Aps a transparentizao as fitas estaro prontas para ser desenvolvida a quantificao de cada frao
proteica separada (eluio ou densitomecria direta).
Eluio: Cortar a fita em pores correspondentes s vrias fraes proteicas e coloc-las em tubos de ensaio
identificados.Adicionar 3,0 ml de acetona a cada tubo.
Cada frao ser assim eluda e a intensidade da cor transmitida ao meio ser medida em colormetro
em 550 nm, utilizando-se um tubo branco contendo acetona. Calcular o percentual relativo de cada
frao e construir o perfil eletrofortico correspondente.
OlOl
t t 1' t t
/11 11
o
A - Vista superior
B - Vista perfil

/!1111/
1111111111
e
E
C - Distribuio das fraes
D - Eluio
E - Densitometria
Migra:i9o
Plo
: A: (+} - -
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1
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1, 1
'1'
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()
Oelk>camento eu F ran
t
Instrumental da Eletroforese. A) Vista superior: Cmara de Separao, compartimento catdico e andico, com
duas fitas suporte. B) Vista lateral - Cmara de separao. C) Fraes de soro sanguneo humano separadas e
reveladas por corance especial. D) Quantificao das Fraes. As faixas so cortadas no pontilhado e dissolvidas
em cido actico, a Absoro lida em espectrofocmetro. E) Densitmetro. A fita corada deslizada numa fenda
milimtrica de luz, e a Absoro medida por fotoclula. Um computador analgico fornece traado proporcional
quantidade de protena, e o percentual de cada frao, lida automaticamente. Este mtodo exige o densitmetro
que um espectrofotmetro especial.
Consiste separao dos componentes de um sistema atravs da aplicao de um campo eltrico. um dos
mtodos mais usados no laboratrio, tanto na forma como nas variantes. Tem inmeras aplicaes.
Princpio do Mtodo - Substncias em soluo que possuem carga eltrica livre, deslocam-se quando submetidas
a um campo eltrico de sentido invarivel. A migrao faz.se de acordo com a lei de Coulomb (Fig. 1).
Plo
(+)
-o-
- -
- -
- -
-1 -
Origem

Plo
H
1. Componentes de carga negativa migram para o plo positivo.
2. Componentes de carga positiva migram para o plo negativo.
CELMGEL
FlLMEDEAGAROSEGERAL
Filmes de agarose para separao eletrofortica de protenas e lipoproteinas.
Somente para uso "in vtro".
Artigo N 1801 10 x 1 O Determinaes
1. PROTEINOGRAMA
INTRODUO i
A anlise do quadro protico-plasmtico importante, pois se podem diagnostidar
vrias alteraes patolgicas. Entre os mtodos de qualificao e quantificao
dessas protenas destaca-se a eletrororese, que se tem tornado um importante m$io
auxiliar de diagnstico na maioria dos laboratrios clinicas. A eletroforese permite
uma avaliao aproximada das concentraes de vrias protenas importantes, cujas
alteraes, seja de regulao de suas snteses, ou de seu maior consumo, podem
refletir nas suas mobilidades eletroforticas ou nas suas concentraes.
AMOSTRA
Usar soro fresco livre de hemlise por at 3 dias mantidos em geladeira (2 a 8C)10
congelamento desaconselhvel.
PROCEDIMENTO
1) Colocar 80 mL de tampo tris pH 9,5 gelado (2 a SC) , na cuba.
2) Aplicar 0,4 L de cada soro no filme de agarose.
3) Colocar o filme de agarose no porta-filme coincidindo os plos negativos l:lo
i lme com a cuba.
4) Colocar o porta-filme na cuba e tamp-la. Deixar por 20 minutos a 100 volts.
5) Retirar a tampa da cuba e o porta-filme, colocando-a sobre uma folha de pai)el
de fi ltro para eliminar o excesso de tampo das bordas do filme.
6) Retirar o filme do porta-filme.
7) Mergulhar o filme em 200 mL de corante por 5 minutos sem agitao.
8) Retirar o filme do corante e colocar em 200 mL de descorante por 5 minutos. t
9) Retirar o excesso de descorante do filme e coloc-lo a 60C (55C a 65C), t
que o mesmo fique completamente seco. Sugerimos o uso de secador e
cabelos com aquecimento.
1 O) Colocar o filme de agarose no descorante at o fundo ficar transparente. e
necessrio, trocar o descorante.
11) Secar a 60C (55C a 65C) novamente. ~
12) Ler no scanner ou no densitmetro 520 nm. Pode-se ainda fazer a eluio d s
bandas com NaOH 2% (2 g NaOH em 100 mL H20): recortar cada fra e
colocar em 2 mL do eluente. Aps a dissoluo, ler a absorbncia em 580 nm.
No reutilizar o tampo ,
Materiais necessrios no fornecidos: i
Corante - Negro de Amido (Amido Black 10-8 - art. 1810 - CELM) 0,1% em c i ~ o
actico a 5%. (
Descorante - cido aclico a 5%.
=CELM'
Reviso: P&D - Maio/2003
VALORES DE REFERNCIA
% q/dl
Albumina 53,70 a 62,9 3,60 a 4,20
Alra-1 3,30 a 5,20 0,20 a 0,40
Alfa - 2 7,20 a 11,20 0,50 a 0,80
Beta 10.40 a 14,70 0,70 a 1,00
Gama 10,80 a 19,70 0,70 a 1,40
... ~
Recomenda-se que cada laboratrio estabelea seus prprios valores de rererncia.
ILUSTRAO DA SEPARAO DE PROTENAS PLASMTICAS
= CELM
[i\me-:-Paciente I F _ Cone. [3I]
raoes %
~
0,5
57,8
3,5
7,9
13,6
16,5
0,031
3,552
0,217
0,487
0,838
1,015
Grfico obtido no aparelho DS-35 Grfico obtido no sistema SE-250
Observaes
1. Em mulheres usurias de contraceptivos orais e gestantes, os valores de albumina e gama-
globulina apresentam-se ligeiramente inferiores aos intervalos apresentados. Pela mesma
razo, as fraes alfa-1-globulina, alfa-2-globulina e beta-globulina apresentam valores
ligeiramente superiores aos intervalos citados (vide referncia bibliogrfica 2 no verso desta
pgina).
CELM Cla. Equipadora de Laboratrios Modernos
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Fone: (11) 4191-1647 -Fax: (11) 4195-5390
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li. LIPIDOGRAMA
INTRODUO
As lipoproteinas do plasma sangineo so complexos macromoleculares
constitudos de protenas e lipdeos, como triglicerideos, colesterol e seus
steres. Pela tcnica de eletroforese possvel separar quatro fraes
principais de lipoproteinas: quilomcrons, beta, pr-beta e alfa.
AMOSTRA
Usar soro fresco livre de hernlise, colhido em, no mximo, 12 horas. Deve-se
evitar o congelamento da amostra, pois pode ocorrer degradao das
lipoprotenas sricas, em especial se sua concentrao estiver
aumentada.
PROCEDIMENTO
1) Colocar 90 mL de tampo tris pH 9,5 gelado (2 a SC ), na cuba.
2) Aplicar 0,5 L de cada soro ou plasma recm-colhido livre de hemlise no
filme de agarose. Aguardar alguns segundos para que o soro penetre no
filme e aplicar mais 0,5 ~ de amostra.
3) Colocar o filme de agarose no porta-filme coincidindo os plos negativos do
filme com a cuba. Colocar o porta-filme na cuba e tamp-la. Deixar por 14
minutos a 100 volts.
4) Retirar a tampa e o porta-filme. colocando-o sobre uma folha de papel de
filtro para eliminar o excesso de tampo das bordas do filme.
5) Retirar o filme do porta-filme.
6) Colocar o filme de agarose a 60"C (55C a 65C), at que o mesmo fique
completamente seco. Sugerimos o uso de secador de cabelos com
aquecimento. Este procedimento deve ser realizado antes da colorao do
filme.
7) Colocar o filme de agarose seco sobre uma folha de papel de filtro e. com o
auxilio de uma pipeta, colocar sobre o filme de agarose 5 mL de corante
soluo trabalho. No tocar a superfcie da agarose com a ponta da pipeta.
8) Deixar corando de 2 a 3 minutos, at que o corante comece a precipitar e
se torne azulado.
9) Mergulhar o filme de agarose no descorante (metanol 70%) at que o fundo
se torne rosa claro (alguns segundos).
1 O) Retirar o filme de agarose do descorante e colocar numa soluo de
glicerol a 2% por 15 segundos, SEM AGITAO.
11) Secar a 60C (55C a 65C) novamente.
12) Ler no scanner ou no denstmetro 520 nm. Pode-se ainda fazer a
eluio das bandas com gua/metanol/acetato de etila (2,5 I 7,0 I O, 5. v/v):
dissolver cada uma das fraes recortadas em 2 ml do eluente e ler a
absorbncia em 530 nm.
* No reutilizar o tampo.
Materiais necessrios no fornecidos:
Corante - Fat Red 7 - B (art. 0775 - CELM) - 0.225 gil em metanol
(soluo estoque).
Soluo trabal ho - 10 ml da soluo estoque + 2 ml de NaOH O, 1 N
Descorante - Metanol 70%
VALORES DE REFERNCIA
Alfa - 20,0 a 35,0 %
Pr-beta - 10,0 a 25,0 %
Beta - 45,0 a 65,0 %
p.a.[
Recomenda-se que cada laboratrio estabelea seus prprios valores de
referncia.
ILUSTRAO DA SEPARAO DE LIPOPROTENAS
C cELM
[No-me: Paciente 1 Fraes %
[l
Grfico obtido no aparelho
DS-35
Grfico obtido no sistema SE-250
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Naoum, P.C. Eletroforese - Tcnicas e Diagnsticos. 2 ed. So
Paulo -
Livraria Santos Editora, 1999.
2. Rancharam, S., Sponzilli, E.E. e Wingerd, J.C. Serum protein
fractions.
Effects of oral contraceptives and pregnancy. Obstet Gynecol,
48(2):211-5, 1976 AUG.
OBJETIVOS - a) Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento das
principais propriedades dos lipdios mais comuns.
b) Aplicar os testes acima para identificar lipdios desconhecidos.
01. PROPRIEDADE DOS CIDOS GRAXOS.
Os resultados dos procedimentos abaixo podem ser sintetizados no
quadro resumo no final do presente roteiro.
a) Em 03 tubos de ensaio colocar:
Tubo 1 - 3 gotas de cido actico
Tubo 2 - 3 gotas de cido oleico
Tubo 3.,. fragmentos de cido esterico (3 gotas)
- Verificar o cheiro e o aspecto fsico de cada um.
- Adicionar l,Oml de gua destilada a cada tubo e agitar, verificar ento a solubilidade em
gua de cada substncia acima.
b) - Retirar uma gota de cada soluo e coloca-la sobre papel indicador para verificar o pH
aproximado de cada tubo acima.
- Colocar na extremidade de cada um dos trs tubos, um pedao de papel
indicador.
- Aquecer cada tubo e verificar por meio de papel indicador aqueles que so volteis ou
fixos.
c) Adicionar a cada tubo
- Uma gota de fenolftalena
- Completar o volume para 5,0 ml com gua destilada (adicionar 4,0ml de gua
destilada).
- Adicionar NaOH l N, gota a gota, at o aparecimento de colorao rsea.
- Aquecer e observar a formao dos sais de sdio dos respectivos cidos graxos.
Consideram-se sabes aqueles que por agitao formam espuma.
d) - Completar o volume de cada tubo para cerca de 10,0ml com gua destilada.
- Dividir o contedo de cada tubo em 3 partes aproximadamente iguais, conforme
esquema abaixo.
1 2
/ l ~
A B e A B e A
3
I'
~ ~
B e
Neste ponto teremos 9 tubos aos quais adicionaremos as seguintes solues:
tubos IA; 2A; 3A -)- 3 gotas de CaCh 0,5%
tubos lB; 2B; 3B -)- algumas gotas de HCl 2 N (at recuperar o cido graxo).
( 3 gotas)
tubos 1 C; 2C; 3C -)- algumas gotas de NaCl em soluo saturada ( 3 gotas).
(interpretar os resultados obtidos)
Caracteres Gerais Reao Propriedades dos
Lipdio Cheiro Aspecto pHem Volati- Solub. com com
Fsico gua lidade em NaOH CaCl2
gua
02. TESTE PARA CIDOS GRAXOS NO SATURADOS
a) Reao de Halogenao:
Numerar 5 tubos de ensaio e colocar em cada um respectivamente
Tubo 1 - 1 gota de cido oleico.
Tubo 2 - pequenos fragmentos de cido esterico
Tubo 3 - 1 gota de leo de algodo
Tubo 4 - 1 gota de leo de linhaa
Tubo 5 - 1 gota de banha de porco
Sabes
com
HCL
Obs. Se alguma das gorduras citadas no estiver presente, use outra qualquer.
A cada um dos 5 tubos adicionar:
- 4 mi de lcool etlico.
- Agitar e aquecer rapidamente.
- l gota de soluo de bromo.
- Agitar e observar se houve descoramento.
com
NaCl
- Nos tubos em que houve descoramento continuar adicionando soluo de bromo
gota a gota at o aparecimento de uma colorao ligeiramente amarelada e persistente
- Anotar o nmero de gotas que foi gasto em cada caso.
(interpretar os resultados obtidos)
.\'mm: c.011111111
. dt/11; ..
Sut11ratlt1.'i
Frmico
Actico
Propinico
Butrico
Valrico
C:wrico
Enntico
Caprilico
Pclargmico
Cprico
lJndcc:mico
L:1urico
-
Mirslico
Palmtico
Esterico
A numidico
J.J.gnocrico
Certico
lmut11rutlo.'> - lcitlo.<J...
Olico
Linolico
Linolnico
A nu111idmico
[icosa11enluenico
Dorns:iexaenico
Lcl:endus:
Nomes, estruturas, propriedades e ocorrncia de alguns cidos carboxlicos mais comuns
.\'ome IUPIC E<Jtrutura
Acit10 ...
mctanico HCOzH
ctanico Cff3C02H
propanico C"3CH2C02H
butanico Cff3(Cllz)zC02H
pentanico Cll3(CH1)3C01H
hexanico CH3{CH2 )4C02H
hcptanico CH1Cllz)sC01H
octunico CH1(CH2)6C02H
nonanico CH1(CH2)1C02H
1
decanico CH3(CH2 lsCOzH
undecanico C"3(CHzl9COzH
dodecanic() CH3(CH2)10C02H
tridecanico CH3(CH1)11C02H
tetradecanico Cff3(CH1 l12C02H
hexadecanico Cff3(Cf)uC02H
octadecanico Cff3(Cff2)16C02H
CH1(CH1l1sC01H
CH1(CH2)22C02H
Clh(CH2luC02H
CH1(CH2)1C'=C'(CH2)1C02H
CH1CH2MCH=CH-CH2)2(Cff2)6C02H
C"3CH2(CH=CH-CH2)2(CH2)6C02H
CH1<CH2MCH=CH-CH2MCH2)2C02H
CH1CH2(CH=CH-CH2 )s(CH2 )zC02H
CllJCHz(CH=CH-CH2)GCH2C02H
i, s, ps, ms - insol\'cl, sol\el, pouco solvel, muito solvel
sobrescrito - temperatura cm C
chi, Bi - clorofrmio, benzeno
P.F.('C)
8,4
16,6
-20,8
-4,2
-33,8
-2,0
-7,5
16,5
12,2
31,5
28,6
44,0
45,0
54,0
63,0
72,0
75,0
84,0
-
13
-5
-to
-50
-
-
P.E("C) Sol11b. Sol11b.
11!11a Et111111l
100,7 ao ao
118,2 ao 00
140,9 00 ao
163,5 5,6'
1
00
186
3,716
00
205
0,415
s
223 0,24
15
s
239,3 0,25
100
00
255 ps
-
270 ps s
280 i PS
i 26, 13-1
11
236
- -
250 i 44,9
11
390 i
9,320
360 1 s
- i
-
-
i
-
-
i
-
Sol11b. Ocorr211cia
ter, etc
oo, ter Formic:as
oo, ter Vinac:re (0,S a 2%)
ao ter
.
ao, ter Manteic:a
ao, ter
-
s, ter Mantchrn
s, ter
-
oo, ter Manteic:a
s, ter,
-
chi
s, ter Manteic:a, leo de coco
s ter
-
ms,ter louro, coco
s. bz
-
ps ter coco
s. ter e:orduras animais e vee:etais
ms, ter e:orduras animais e Vet!etnis
-
leo de amendoim
- tecido nenoso cerebral
-
cera de abelhas
Gordura animal e vegetal
(azeite)
leos Vet!etals Oinhaca)
leo de linhaa
Tecido nen'oso
leo de peixe
Crebro, leite humano
leo de peixe
1. FUNDAMENTO:
A saliva incubada com o substrato (amido), em condies timas de
temperatura, pH e concentrao de cloretos. A atividade amilsica medida pelo
tempo mnimo necessrio digesto total do amido, o que se revela pela reao
negativa com iodo (ponto acromtico). Alm da avaliao da atividade amilsica,
faz-se- um estudo sobre o efeito de alguns fatores, tais como pH, temperatura,
concentrao do substrato, concentrao de enzima e presena de ion ativador e
inibidor.
2. REAGENTES E SOLUES:
2.1-Soluo aquosa de amido solvel a 1%; 0,2% e 2,0%.
2.2-Soluo tampo de fosfato de pH 7,0; pH 4,0 e pH 9,0
2.3-Soluo aquosa de cloreto de sdio a 1 %
2.4-Soluo de lugol (Soluo de iodo)
2.5-Soluo de fluoreto de sdio a 2%.
2. 6-Saliva diluda a 1: 100 em gua destilada
3. OPERAES:
3.1 - PRELIMINARES
- Diluir 1,0 mi de saliva no filtrada com gua destilada para volume final de
1 OOml, utilizar um balo volumtrico. (Diluio da saliva 1 100).
- Preparar uma srie de tubos contendo 0,5ml de lugol (soluo de iodo).
3.2- PREPARO DO MEIO DE INCUBAO.
Colocar em um tubo de ensaio:
a) 5,0ml de soluo de amido a 1 %
b) 2,0ml de soluo de cloreto de sdio a 1 %
c) 2,0ml de tampo de pH 7,0.
d) Pre incubar (Manter a mistura por 2 a 3 minutos em temperatura 37C).
e) 1,0ml de saliva diluda a l: 100. Neste momento voc tem o ponto zero da
reao.
De minuto em minuto (ou tempos mais adequados), pipetar uma amostra de 2 gotas
do material em incubao e adicionar estante preparada em 3. 1 contendo uma
srie de tubos com soluo de iodo, at que no se obsorve colorao (ponto
acrmico ), exceto a prpria cor da soluo de lugol. Marcar o tempo. Se for
inforior a 5 ou superior a 20 minutos, repetir a operao com diluio diferente de
saliva de modo que a digesto total do amido se faa em tomo de 1 O minutos.
5. ESTUDO DAS VARI VEIS QUE INFLUEM NA ATIVIDADE DA ENZA
AMILASE.
5.1. EFEITO DA VARIVEL pH:
- A incubao descrita em 3.2 ser efetuada em solues tampes pH 4,0;
pH 7,0 e pH 9,0.
- Anotar os resultados na tabela abaixo.
pH Tempo de ponto acromtico
4.0
7.0
9.0
5.2. EFEITO DA VARIVEL TEMPERATURA.
- A incubao descrita em 3 .2 ser efetuada nas seguintes temperaturas: O C
(banho de gelo); temperatura ambiente ( C); 60 C e 100 C.
- Anotar os resultados na tabela abaixo.
Tcmocratura Tempo de nonto acromtico
O"C
Temo. amb. (
''C)
60 "C
1 ()() "C
5.3. EFEITO DA VARIVEL CONCENTRAO DE SUBSTRATO.
- A incubao descrita em 3 .2 ser efetuada utilizando-se solues de amido
nas seguintes concentraes: 0,2 %; 1,0 % e 2,0 %.
- Anotar os resultados na tabela abaixo.
r s 1
Temoo de oonto acromtico
0,2%
LO%
2.0%
-~ . ~ - - -- ------- ----- ------- ---- - .
5.4. EFEITO DA VARIVEL CONCENTRAO DA ENZIMA.
- A incubao descrita em 3.2 ser efetuada utilizando-se solues de
saliva diluda emgua nas propores: 1: 10; 1: 100 e 1;1000.
- Anotar os resultados na tabela abaixo.
El Tempo de ponto acromtico
1:10
1:100
1:1000
5.5. EFEITO DE DIFERENTES IONS NO MEIO DE INCUBAO.
- A incubao descrita em 3 .2 ser efetuada nas seguintes condies: a) em
presena de gua; b) em presena de cloreto de sdio e c) em presena de
fluoreto de sdio.
- Anotar os resultados na tabela abaixo.
IONS Tempo de ponto acromtico
Ausncia
c1 -
F-
INTERPRETAR OS RESULTADOS
J

,, BloTe t=ntc a

BIOTECNOLOGIA AVANADA
GLICOSE
Mtodo Enzimtico Colorimtrico
FINALIDADE
Kit destinado determinao da Glicose no Soro, Plasma e Lquor.
PRINCPIO DO MTODO
A enzima glicose oxidase catalisa a oxidao da glicose existente na
amostra, em presena de oxignio, produzindo perxido de hidrognio. A
enzima peroxidase catalisa a oxidao do fenol pelo perxido de
hidrognio formado, em presena de 4-aminoanlipirina produzindo um
composto rseo-avermelhado (quinonimina), que apresenta um mximo
de absoro em 505 nm. A intensidade de cor proporcional
concentrao de glicose na amostra.
glicoso oxid;:i sa .
Glicose+ 02 + H20 --------------------> Acido Glucnico + H
2
0
2
poroxidase
2H202 + 4-Aminoantipirina + Fenol --------------> Quinonimina + 4 H20
COMPOSIO DOS REAGENTES
1- Reagente: Tampo fosfato 182,42 mmol/L pH 7,0; GOD - Glicose
Oxidase > 15000 U/L; POD - Peroxidase > 1200 U/L; 4-aminoantipirina 0,3
mmol/L; fenol 10 mmol/L.
2- Padro: Soluo de glicose (valor do padro: vide no rtulo do frasco) .
CONDIES DE ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
Estabilidade: Estvel at a data de validade do kit que est
impressa no rtulo da embalagem.
No usar reagentes cuja data de validade tenha expirado.
Conservar de 2 a 8 c.
Os reagentes devem permanecer fora da temperatura especificada
somente o tempo necessrio para a realizao dos testes.
No congelar e manter ao abrigo da luz.
MATERIAL NECESSRIO NO FORNECIDO
Espectrofotmelro ou lotmetro para leituras a 505 nm (490-510).
Pipetas de vidro e/ou automticas.
Relgio ou cronmetro
Tubos de ensaio.
CUIDADOS E PRECAUES
O kit destina-se somente para uso diagnstico in vitro.
Os procedimentos higinicos normais para o manuseio de materiais
bioqumicos devem ser observados.
As amostras a serem analisadas (soro ou plasma) devem ser
tratadas como material potencialmente infeclante.
Utilizar os EPl 's de acordo com as Boas Prticas de Laboratrio
Clnico.
Descartar as sobras das reaes de acordo com as Boas Prticas de
Laboratrio Clinico em local prprio para materiais potencialmente
infectantes.
Em caso de ingesto procurar atendimento mdico.
As informaes de Descarte, Segurana e Primeiros Socorros esto
descritas na Ficha Individua/ de Segurana de Produtos Qumicos
(FISPQ) deste produto.
No misturar diferentes lotes de reagentes.
Usar pipetas de vidro e ponteiras descartveis separadas para cada
amostra, controle, padro/calibrador e reagente.
No trocar as tampas dos frascos dos reagentes, a fim de evitar
contaminao cruzada.
No usar o reagente quando este mostrar-se com sinais de
contaminao.
O nvel de gua do banho-maria deve ser superior ao dos tubos de
ensaio que contm as reaes.
AMOSTRA - PREPARO E ESTABILIDADE
Soro e plasma (l luoreto): obtido no mximo duas horas aps a coleta
para evitar a gliclise.
A glicose estvel por 3 dias de 2 a B C ou 2 meses a -20 c.
Liquor
Utilizar amostra centrifugada.
PROCEDIMENTO TCNICO
A) PREPARAO DOS REAGENTES
Reagentes prontos para uso.
B) PROCEDIMENTO
1. Pioetar em tubos d ..... ..... . " ... """ "
Branco Padro Amostra
1 Padro - 10 uL
1 Amostra - 10 L
1 Reaoente 1,0 mL 1,0mL 1,0mL
2. Homogeneizar bem e incubar os tubos durante 10 minutos a 37
2
C.
3. Medir a absorbncia (Ap) do Padro e (Aa) da Amostra frente ao Branco
a 505 nm. A cor estvel durante 1 hora.
PROCEDIMENTOS DE CALIBRAO/CLCULO
Clculos
t\A Amostra x Concentrao do Padro = mg/dl glicose
t\A Padro
Com Fator:
Fator Calibrao (Fc) = Concentraco do PadrQ
Absorbncia Padro
Glicose (mg/dL) = Absorbncia da amostra x Fc
Exemplo:
Abs. amostra = 0,219
Abs padro = 0,302
Concentrao padro = 100 mg/dL
LINEARIDADE
glicose (mg/dL) = !
t
glicose (mg/dL) =
A linearidade da reao de 400 mg/dl. Para valores sur.
a amostra com NaCI 150 mM (0,9%). realizar nova
mulliplicar o resultado obtido pelo fator de diluio.
LIMITAES DA TCNICA
Hemlise, lctericia e Upemia
0,2 g/dL
Bilirrubina 40 mg/dL
Triglicrides 400 mg/dL
cido 5 mg/dL
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
Todo laboratrio clinico deve manter um programa de con
qualidade que defina claramente os objetivos, procedimer
critrios para limites de tolerncia, aes corretivas 1
atividades. Ao mesmo tempo, deve ser mantido um sistem
monitorar a variabilidade analtica que ocorre em tod
medio.
O uso de controles para avaliar a impreciso e a r
determinaes deve ser prtica rotineira no laboratrio. Sug
controle na faixa de referncia ou no nvel de deciso e outr
valor em outra faixa de significncia clnica. A aplicao
regras mltiplas de Westgard para avaliao do estac
tambm recomendvel.
O laboratrio deve participar de programas de contra
qualidade, a exemplo daqueles oferecidos pela SBA
Brasileira de Anlises Clinicas) e SBPC (Sociedade Brasilei
Clnica).
VALORES DE REFERNCIA
Glicemia de ie
Plasma
(jejum de B horas) 1 100: _1_2s 1 Glicemia de jej
Provvel DiabE
Uouor Glicemia de ie
Estes valores so unicamente orientativos, sendo recomem
laboratrio estabelea seu prprio intervalo de referncia.
Converso para Unidade do Sistema Internacional (SI): rmnc
Glicose (mg/dL) x 0,0556
Reviso
Data
03/04
07/04
10/04
14/04
17/04
24/04
05/05
08/05
12/05
15/05
19/05
22/05
26/05
29/05
02/06
05/06
09/06
12/06
16/06
26/06
30/06
03/07
-
07/07
10/07
14/07
17/07
21 /07
24/07
28/07
31 /07
04/08
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO
Fisiologia Humana - Curso de Farmcia - Perodo 2014/1
Professores: Prof! Dr3 gata Lages Gava (Coordenadora) - Prof Dr Roger Lyrio dos Santos
Prof Horrio Assunto
Agata 08-12h Apresentao da disciplina
Transporte atravs das membranas celulares
Bioleletrognese do nervo - potencial de repouso, potencial de ao, propagao do potencial de
a co
Agata 14-17h Fisiologia das sinapses, classificao e funes das fibras nervosas
Contrao do msculo esaueltico e do msculo liso
Agata 08-12h Sistema somatossensorial - fisiologia dos receptores, codificao da informao sensorial , vias
aferentes, crtex somatossensorial
Bases fisiolaicas da dor
Roger 14-17h Orgos especiais dos sentidos: fisiologia da audio e viso
rios especiais dos sentidos: fisioloaia do olfato e austaco
Roger 08-12h Funes motoras da medula espinhal e arcos reflexos
Crtex motor, tronco cerebral e sistema vestibular
Roger 14-15:30h Aula prtica: Reflexos (turma 1)
15:30-17h Aula prtica: Reflexos (turma 2)
Roger 14-17h Funes motoras dos gnglios da base e cerebelo
Sistema nervoso autnomo e a medula supra renal
Agata 08-12h Bioeletrognese cardaca
Acoplamento excitaco contraco do msculo cardaco e contratilidade miocrdica
Roger 14-17h
AVALIAAO DE NEUROFISIOLOGIA
Agata 08-12h Ciclo e dbito cardaco
Biofsica da circulaco
Roger 14-17h Microcirculao e trocas
Funces do sistema arterial e venoso
Aiata 08-12h Regulao da circulao
Agata 14-17h Aula prtica: medida da presso arterial
Roaer Aula prtica: reatividade coronariana
Agata 08-12h
AVALIAO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR
Roger 14-17h Mecnica respiratria, espao morto e ventilao alveolar
Trocas iasosas e transporte de iases
Roger 08-1 Oh Aula prtica: Volumes e capacidades pulmonares (turma 1)
10-12h Aula prtica: Volumes e capacidades pulmonares (turma 2)
Roger 14-17h Princpios gerais da funo do TGI e motilidade do TGI
Secrees do TGI
Roger 08-12h Digesto e absoro de micro e macronutrientes
Funes Hepticas
Agata 14-17h Formao da urina pelos rins: filtrao glomerular, fluxo sanguneo renal e processamento tubular
do filtrado glomerular
Controle da excreco renal de sdio e aua: reaulaco do volume e da osmolaridade plasmtica
Agata 08-12h Controle da excreo renal de sdio e gua: regulao do volume e da osmolaridade plasmtica
Equilbrio renal de potssio, clcio, fosfato e mainsio
Agata 14-17h Mecanismos de concentrao e diluio da urina
Reaulaco do eauilbrio cido-base
Roger 08-10h Aula prtica: Diurese no homem (turma 1)
10-12h Aula prtica: Diurese no homem (turma 2)
Agata 08-12h
AVALIAAO DE FISIOLOGIA RESPIRATORIA, RENAL E DIGESTORIA
Agata 08-12h Mecanismos gerais de sntese e ao hormonal e eixo hipotlamo hipfise
Hormnio do crescimento
Rogar 14-17h Fisiologia dos hormnios sexuais masculinos e femininos
Hormnios do crtex da adrenal
Agata 08-12h Hormnios da tireide
Metabolismo do clcio e fosfato
Agata 14-17h Regulao da glicemia
Hormnios reauladores do apetite e saciedade
Agata 08-12h
AVALIAAO DE FISIOLOGIA ENDOCRINA
Agata 14-17h
AVALIAAO SUBSTITUTIVA
Aaata 08-11h Planto tira-dvidas
Agata 13-17h
AVALIAAO FINAL
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Bibliografia recomendada: Tratado de Fisiologia Mdica, GuYton & Hall, 11 ed., Editora Elsevier
Fisiologia, Linda Costanzo, 4 ed, Editora Elsevier
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Avaliaes: 4 provas (9 pontos cada) + notas dos relatrios de aula prtica (1 ponto cada)