INTRODUCCION

La mayora de las bacterias pueden multiplicarse formando colonias visibles en medios de cultivo artificiales, los cuales, una vez preparados y listos para ser inoculados con bacterias, pueden tener varias presentaciones en cuanto a su consistencia, la cual est determinada por la concentracin de agar presente en el medio o la ausencia del mismo. El instrumento ms utilizado para la inoculacin (sembrado) de bacterias es el asa bacteriolgica, la cual puede ser de alambre de platino, nicromo u otro material parecido el cual se inserta en un mango. Existen en el mercado asas microbiolgicas calibradas para tomar un volumen constante de inculo, las ms utilizadas con este fin son las de 0.01 y 0.001 ml, las cuales son utilizadas para el anlisis bacteriolgico cuantitativo de agua y orina sin diluir. El sembrado de cada uno de los medios de cultivo, se realiza de manera diferente de acuerdo al fin que se persigue, el aislamiento de las bacterias de las muestras remitidas al laboratorio, se realiza casi siempre por sembrado en la superficie de una placa de agar en lneas paralelas por medio de un asa este procedimiento asegura la suficiente dilucin, permitiendo el desarrollo de colonias aisladas que pueden emplearse para la obtencin de cultivos puros, en los que se puede realizar la identificacin. (M.C. MARIA DEL ROCIO VILLA GONZALEZ)

OBJETIVO

CONOCER Y PONER EN PRACTICA LOS CONOCIMIENTOS ACERCA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y METODOS DE SIEMBRA BACTERIOLOGICA; PARA AISLAMIENTO Y SIEMBRA EN MEDIOS PARA CONTAR COLONIAS,TAMBIEN PARA EVALUAR EL METABOLISMO BACTERIANO.

MATERIALES Y METODO

MATERIAL

Medios de cultivo slido. Asa. Mechero. Cepas bacterianas. Jeringa 5ml. Alcohol. Algodn.

METODO
SIEMBRA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicacin. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

Que se efecten aspticamente Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados Que se realicen solo los manipuleos indispensables Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. Utilizando un mechero.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar.

Medios slidos:

Siembra por inmersin: Se coloca el inculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este mtodo se utiliza para microorganismos aerobios.

Siembra en superficie: Se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inculo. Con ayuda de una esptula de Drigalsky se extiende el inculo hasta su absorcin total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

Siembra en estra: Se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar.

A.- PASOS SUCESIVOS DEL AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA

OTROS SISTEMAS DIFERENTES DE AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA

SIEMBRA PARA RECUENTO:

2.1.--Tcnica de Barry

En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

De inoculo a dilucin conocida y con asa de Dygraski (Barry modificada):

Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota 0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que est completamente seco. Incubar la placa, en posicin invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de microorganismo.

La posicin invertida evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas. Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente la dilucin.

PREPARACIN DE AGAR SANGRE El agar sangre es una combinacin de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 % de sangre ovina, tambin puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa tambin para ver la capacidad hemoltica de los microorganismos patgenos (que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemlisis que posee: alfa: halos verdosos (reduccin de la hemoglobina de los glbulos rojos a metahemoglobina en el medio) beta: halos incoloros (hemolisis total) gamma: inexistencia de halos (sin hemolisis)

Procedimiento: Calentar el agar base sangre Dejar enfriar Tomar 5ml de sangre humana u ovina Mesclar y verter en placas.

PREPARACIN DE AGAR CHOCOLATE

El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. Con un medio anlogo a ste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primeros asilamientos selectivos de gonococos, despus de aadir antibiticos. El Agar chocolate lleva hemoglobina que aporta al medio un importante elemento par el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. Otros factores, en particular el factor V (difosfopiridina nucletido) termosensible, que no se encuentran en el Agar chocolate, pueden aportarse en una mezcla qumicamente definida: el PolyViteX. Enriquecido de esta manera, el Agar chocolate presenta una gran regularidad de composicin.

UTlLIZACIN

El Agar chocolate permite el cultivo de la mayor parte de los grmenes encontrados en patologa humana o veterinaria. La siembra de lquidos cefalorraqudeos, pus, resiembra de hemocultivos, etc., es favorable en este medio, pero est particularmente indicado para aislamiento de las Neisserias patgenas y de los Haemophilus.

PREPARACION: La preparacin de este medio se da con el calentamiento paulatino del agar chocolate, hasta lograr la hemolisis de los glbulos rojos.

METABOLISMO BATERIANO

Agar Almidn El almidn es producido principalmente por plantas superiores, est compuesto de amilosa y amilopectina. Diversas enzimas amilolticas hidrolizan almidn y sus productos

El lugol con el almidn forman un complejo color caf-prpura que desaparece cuando el almidn ha sido degradado.

Caldo base de Fermentacin: La fermentacin (degradacin) de un compuesto orgnico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la formacin de gas capturado en la campana de fermentacin. Este medio contiene como indicador el rojo de fenol, el cual vira: Rojo: medio alcalino Amarillo: medio acido.

ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa con produccin de cido por la va cido mixta o con produccin de un producto final neutro (acetona) por la va butanodilica.

Prueba de Voges Proskauer La aparicin de un color rosado constituye una reaccin positiva indicadora de la presencia de acetona, producto de la fermentacin de la glucosa

Prueba de Rojo de Metilo Una coloracin roja, indicadora de la presencia de cidos provenientes de la fermentacin de la glucosa, constituye un resultado positivo, una coloracin amarilla constituye una reaccin negativa.

Caldo Peptonado (con tira con acetato de plomo):

La mayor parte de las protenas tienen aminocidos sulfurados. Algunos microorganismos tienen enzimas que desprenden el tomo de azufre de estos aminocidos, el cual es luego reducido con hidrgeno (de los substratos), para formar cido sulfhdrico, en este proceso los microorganismos cumplen con la actividad que puede catalogarse como fermentacin proteica, que es la produccin de cido sulfhdrico.

Prueba de Indol El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminacin reductiva del triptfano y esta reaccin es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Aadimos unas gotas de reactivo de Kovacs. Si se ha producido Indol aparecer un anillo rosa fucsia en la superficie del caldo de cultivo.

Indol positivo

RESULTADOS AGAR ALMIDON: S. AUREUS: AMILASA (-) BACILLUS: AMILASA (+) CALDO BASE DE FERMENTACION: PSEUDOMONA: NO FERMENTADOR. SHIGELLA: PRODUCE ACIDOS, PERO NO PRODUCE GAS. E. COLI: PRODUCE ACIDOS, PRODUCE GAS. CALDO VP/RM: E.COLI: VP (-)/ RM (+) ENTEROBACTER: VP (+)/ RM (-) CALDO PEPTONADO: CITROBACTER: ACIDO SULFIDRICO (+)/INDOL (-) E.COLI: ACIDO SULFIDRICO (-)/ INDOL (+)

DISCUSIN
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS MENCIONAN QUE EL ENTEROBACTER, NO ES PRODUCTOR DE ACIDOS, PERO EN PRACTICA SI SE OBSERVO LA PRODUCCION DE ESTOS ACIDOS (MEDIANTE EL ROJO DE METILO), LA EXPLICACION

PARA ELLO ESO: LA CEPA BACTERIANA CON LA CUAL SE TRABAJO ERA DE 42 HORAS DE SEMBRADA EN EL MEDIO Y LA BIBLIOGRAFIA EVALUA LA PRODUCCION DE ESTOS ACIDOS, DENTRO DE LAS 24 HORAS.

ENUNCIADO RESUMEN
EN AGAR ALMIDON: LA CEPA DE GENERO BACILLUS: PRODUCE AMILASA. EN CALDO BASE DE FERMENTACION: LA E. COLI, ES PRODUCTORA DE ACIDOS MIXTOS Y PRODUCTOR DE GAS COMO DESECHO DE SU METABOLISMO. EN CALDO VP: EL ENTEROBACTER ES UNA BACTERIA QUE USA LA VIA ALTERNA (BUTILEN-GLICOL) PRODUCINEDO ACETOINA. EN CALDO PEPTONADO: EL CITROBACTER ES UNA BACTERIA PRODUCTORA DE ACIDO SULFIDRICO, METABOLISA LOS AMINOACIDOS AZUFRADOS. LA E.COLI ES PRODUCTORA DE TRIPTOFANO, LO CUAL SE EVIDENCIA CON PRODUCCION DE INDOL.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Medidas de crecimiento (en espaol). Consultado el 08 de septiembre de 2011.

PELCZAR. M. J, Introduccin a la microbiologa.

http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html

 http://www.uniovi.es/biologia/docs/asignaturas/segundo/microbiologi a.htm

http://www.britanialab.com.ar/espanol/k02_62.html
http://www.monografias.com/trabajos14/bacterias/bacterias.shtml#ixzz2xZ7hcLiM

FAO agar manual