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CROMATOGRAFIA

Teoria generale Significato di cromatogramma Efficienza, selettivit e risoluzione Fattori che influenzano la separazione Applicazioni qualitative e quantitative della cromatografia

Teoria generale La cromatografia un metodo analitico usato per la: SEPARAZIONE e PURIFICAZIONE IDENTIFICAZIONE DETERMINAZIONE di componenti chimici in miscele complesse. Nessun altro metodo di separazione cos potente e di cos generale applicabilit come la cromatografia. Sebbene sia difficile definire in modo rigoroso il termine cromatografia (data la grande variet di sistemi e tecniche cromatografiche) si pu indicare dei tratti generali indicativi della separazione cromatografica in genere. Infatti tutte le tecniche cromatografiche sono caratterizzate dalla presenza di: Una Fase Fissa O Stazionaria Una Fase Mobile che si muove lungo o attraverso la fase stazionaria trasportando con s lanalita. Nella cromatografia la separazione dei componenti di una miscela avviene in funzione delle velocit con cui questi sono trasportati attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile; questultima pu essere un gas, un liquido o un fluido supercritico. Tralasciando la trattazione dei singoli meccanismi che caratterizzano le varie tecniche (adsorbimento, ripartizione, scambio ionico, esclusione, affinit), ci che si sfrutta la diversa affinit delle molecole e degli ioni nei confronti delle due diverse fasi: la fase mobile viene fatta scorrere in modo continuo sulla fase stazionaria realizzando la dinamica dellestrazione in modo continuo. La distribuzione dei componenti della miscela tra le due fasi funzione delle interazioni che, secondo meccanismi diversi, si stabiliscono tra il singolo componente e ciascuna delle fasi. Il tipo e lentit delle interazioni dipendono dalle propriet chimico-fisiche (momento dipolare, costante dielettrica, legami idrogeno, forze di Van der Waals) delle due fasi e della sostanza in esame. Delle tecniche cromatografiche lunica che, idealmente, non risente di nessuna interazione attrattiva tra fase stazionaria e soluto la cromatografia di esclusione che opera una separazione tramite fattori dimensionali piuttosto che chimici fisici. Daltro canto i meccanismi che intercorrono dinamicamente nel processo di eluizione non sono mai ideali: non possibile escludere che durante la separazione intervengano anche altri meccanismi al di l della Size Esclusion Cromatografy. Questo vero, in generale, per tutte le tecniche cromatografiche.

Quello che bisogna sottolineare, dunque, che durante leluizione (ovvero il processo in cui i soluti sono dilavati o eluiti attraverso una fase stazionaria da una fase mobile in movimento) la sostanza coinvolta in un processo dinamico tra le due fasi: AMOBILE ASTAZIONARIA

Il soluto A che compone la miscela viene, cio, continuamente trasferito da una fase allaltra. La costante di equilibrio, detta coefficiente di ripartizione K, pari al rapporto tra le due concentrazioni dellanalita nelle due fasi: K= CS / CM dove per CS si intende la concentrazione molare analitica nella fase stazionaria E per CM la concentrazione molare analitica nella fase mobile. La velocit di migrazione delle specie lungo la fase stazionaria risulta essere inversamente proporzionale a K, dal momento che il tempo di permanenza in colonna : tanto minore quanto pi alta la concentrazione della specie nella fase mobile; detto altrimenti pi la specie affine alla fase mobile meno tempo rester in colonna, pi sar affine alla fase stazionaria pi tempo vi rester e sar eluita successivamente ad altre specie pi affini alla fase mobile.

Cromatogramma
Se alluscita della colonna si pone un rivelatore in grado di rispondere alla concentrazione del soluto e il segnale rilevato riportato in funzione del tempo di eluizione ( o del volume di eluizione di fase mobile addizionata)1, come succede ad esempio in HPLC o in GC, si ottiene un diagramma costituito da una serie di picchi la cui forma quella simmetrica di una curva gaussiana. Questo diagramma chiamato cromatogramma ed utile sia per lanalisi QUALITATIVA che per quella QUANTITATIVA: La posizione dei picchi sullasse dei tempi pu essere utile per lidentificazione dei componenti del campione; Le aree sottese ai picchi forniscono una misura quantitativa del contenuto di ogni specie.

Usare un rivelatore alla fine del sistema di separazione cromatografica consente di visualizzare in continuo le specie eluite; daltro canto ci non toglie che, se non si dispone di un rivelatore, non si possa raccogliere le singole frazioni di eluato e procedere successivamente allanalisi. Un tipico cromatogramma per una miscela a due componenti ha due situazioni diverse: il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, tM il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo tR > tM

Il tempo di ritenzione tR il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector.
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Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocit: la loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano; il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocit media. I picchi cromatografici, in realt, hanno raramente la forma simmetrica della curva Gaussiana: e si possono osservare due tipi di deformazione, di deviazione dal valore medio: Tailing Fronting Nel tailing alla destra del cromatogramma compare una sorta di coda nel picco in quanto il tracciato sale bruscamente fino al punto di massimo per poi scendere lentamente verso la linea di base; nel fronting si ha landamento contrario. La formazione dei picchi asimmetrici, molto frequente nelle analisi cromatografiche, dipende da molti fattori, tra cui: Introduzione troppo lenta o comunque scorretta della miscela da separare Adsorbimento irreversibile della sostanza sulla fase stazionaria Reazioni chimiche in colonna Sovraccarico per saturazione dei siti attivi (si parla di capacit di carico come la quantit massima di campione che la fase stazionaria pu supportare senza compromettere la qualit della separazione) Variazioni di K in funzione della concentrazione (coefficiente di ripartizione non lineare)

Distorsioni di questo tipo sono indesiderate, perch portano a separazioni meno buone e a tempi di eluizioni meno riproducibili.

Nello studio di un sistema analitico bisogna valutarne efficienza, selettivit e risoluzione Descrizione quantitativa dellefficienza della colonna Per una valutazione quantitativa dellefficienza di una colonna cromatografica si analizzano due parametri tra loro correlati: Laltezza del piatto H Il numero dei piatti teorici N Lequazione che li correla colonna

N=L/H

dove L la lunghezza (di solito in cm) della

(N perci dipende dalle caratteristiche della colonna) In pratica idealmente si considera la colonna formata da N sezioni o piatti teorici: allinterno di ogni sezione pu avvenire unequilibrazione dinamica fra fase mobile e fase stazionaria prima che leluente trascini il soluto verso il piatto successivo. Maggiore sar N, migliore sar la separazione tra prodotti che mostrano differente K (coefficiente di ripartizione). Il numero dei piatti teorici dato dalla relazione

N = 16 ( )

dove tR il tempo di ritenzione ed W la larghezza del picco alla sua base (espresso in unit di tempo)

La separazione sar ottimale se per ogni soluto grande il rapporto tra tempo di ritenzione ed W; N dunque una misura dellefficienza della colonna. Lefficienza indica la capacit di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una data specie chimica con la stessa velocit, in modo da formare bande strette, che forniscano picchi molto stretti. Poich N dipende dalle caratteristiche intrinseche della colonna ( dalla lunghezza L) un modo per analizzare teoricamente lefficienza della separazione quello di considerare H (altezza equivalente del piatto teorico) piuttosto che N. un modello matematico operativo che cerca di spiegare lallargamento delle bande quello che usa lequazione di Van Deemter per esprimere landamento di H in funzione della velocit o del flusso della fase mobile, in modo da riprodurre al meglio di dati sperimentali. Nella sua forma pi semplice lequazione di Van Deemter :

Dove la velocit lineare media della fase mobile A il contributo dovuto alla diffusione vorticosa B/ longitudinale C al tempo necessario per ogni equilibrazione (dove C, nello specifico, associato alla resistenza al trasferimento di massa) Il flusso una variabile molto importante, anche perch pu essere facilmente regolato dallanalista durante la messa a punto del metodo di analisi. Poich il secondo e terzo termine dellequazione danno indicazioni opposte per quanto riguarda la regolazione del flusso, per intervenire su questo parametro necessario considerare il peso relativo dei due termini. Nella pratica di laboratorio la ricerca del flusso ottimale viene usualmente effettuata per via empirica by trial and error, misurando il valore di H per diversi valori di e si costruisce la curva per interpolazione dei dati sperimentali. Qualunque sia il valore scelto per , essenziale che esso si mantenga costante o, almeno, che la sua variazione possa essere programmata in modo riproducibile. Per trarre delle considerazioni pratiche generali quello che si pu dire che la velocit non deve essere troppo alta altrimenti il termine C prevale su B/ e questo porta ad un aumento di H e quindi ad una diminuzione di N. Non deve essere nemmeno troppo bassa altrimenti prevale B/ e ci conduce ad una perdita di efficienza. Esiste un valore ottimale per il quale si ha un valore minimo di H.

Nel caso della cromatografia LC il valore ottimale molto basso, perch la diffusione dei soluti nei liquidi lenta (B ha poco peso). Cos in LC si lavora, di solito, a superiori alla velocit di flusso ottimale (altrimenti ci sarebbero tempi di separazione troppo lunghi). Nel caso della GC il valore ottimale molto pi alto (i coefficienti di diffusione nei gas sono 105 volte superiori). dunque cruciale la scelta di per avere un H minimo. Altri parametri operativi su cui bisogna intervenire per migliorare lefficienza della separazione sono il diametro delle particelle della fase stazionaria (o del sopporto) e limpaccamento. Piccole dimensioni delle particelle di fase fissa migliorano lefficienza, perch riducono il termine a (che tra laltro indipendente ) e il termine C. La granulometria deve essere uniforme oltre che piccola. C da sottolineare, per, la granulometria non pu essere ridotta oltre un certo limite ( il valore teorico ottimale 1m), perch, riducendo la granulometria, aumenta la resistenza al flusso della fase mobile in quanto diminuisce la permeabilit. Lequazione di Van Deemter, nonostante possa risultare insoddisfacente in molti casi specifici, la pi usata in quanto rende conto dellallargamento delle bande sia in GC, in HPLC e SFC. Dire che le bande sono larghe vale a dire che i picchi delle specie eluite si sovrappongono, mentre nelle separazioni cromatografiche dotate di buona efficienza le bande sono strette e ben distinte.

Selettivit La selettivit indica la capacit di un sistema cromatografico di eluire specie chimiche diverse a velocit il pi possibile diverse, in modo tale che siano bene distinte luna dallaltra alluscita della colonna. Essa data dal fattore di separazione o ritenzione relativa dove i pedici 1 e 2 si riferiscono a due diverse sostanze Per effettuare una buona separazione fra due sostanze deve essere maggiore di 1 (>1). Tuttavia questo non sufficiente ad avere un buon risultato nella separazione, poich i due picchi, pur essendo ben distanziati, possono essere cos larghi da sovrapporsi. Risoluzione

Indica il grado di separazione dei picchi ottenuti al rivelatore di un sistema cromatografico: bande ben separate lungo la colonna generano picchi ben distinti e sufficientemente stretti da non sovrapporsi. In tal caso si dice che i picchi sono ben risolti. In pratica si ottiene una buona risoluzione quando RS>1 anche se valori >1,5 sono inutili, perch la separazione dei picchi aumenta eccessivamente, con un aumento eccessivo dei tempi di ritenzione e, quindi, dei costi. La separazione si ritiene soddisfacente quando si ottiene una buona risoluzione in tempi brevi; questo anche perch il tempo di ritenzione dipende da molti fattori, quali: Risoluzione (Rs) Selettivit fattore di ritenzione () Fattore di ritenzione (K) Altezza del piatto teorico (H) Velocit lineare media della fase mobile ().

Perci per ridurre i tempi di lavoro occorre tener conto di molti fattori, di molte variabili.

FATTORI CHE INFLUENZANO LA SEPARAZIONE


Scelta della fase stazionaria : Quanto pi polare il gruppo funzionale, tanto pi forte sar il legame con ladsorbente. Nel caso dellallumina i composri non polari escono pi velocemente dalla colonna perch hanno una minore affinit verso la fase stazionaria; i composti non polari si legano allallumina solo mediante deboli interazioni di Van der Waals, mentre nel caso di composti polari entrano in gioco interazioni dipolo-dopolo e legami ad idrogeno. Velocit di eluizione : un flusso troppo veloce potrebbe influire negativamente sulla separazione, mentre un flusso troppo lento farebbe si che le sostanze in soluzione avanzino pi velocemente per diffusione che per trascinamento. In questo caso si verifica un allargamento delle bande e la separazione peggiora. Polarit del solvente : spesso necessario utilizzare una miscela di solventi per ottenere una separazione completa. Di norma si inizia ad eluire con un solvente non polare, in modo da separare i composti a bassa polarit, poi si procede aumentando la polarit del solvente. Dimensioni della colonna : generalmente la quantit di assorbente necessaria circa 25-30 volte (minimo) la quantit del materiale da separare. Colonne lunghe e strette sono preferibili nel caso di piccole quantit di composto.

Applicazioni
ANALISI QUALITATIVA La cromatografia largamente usata per riconoscere la presenza o lassenza di componenti in miscele che contengano un numero limitato di specie la cui identit sia nota. Daltra parte poich il cromatogramma fornisce solo uninformazione parziale (il tempo di ritenzione) per ogni singola specie in una miscela, lapplicazione della tecnica allanalisi qualitativa di campioni complessi di composizione incognita limitata. Questa limitazione stata largamente superata collegando direttamente le colonne cromatografiche con spettrometri UV, IR e di MASSA. I risultanti sitemi ifenati sono potenti sistemi per lidentificazione di componenti di miscele complesse. importante notare che, mentre un cromatogramma pu non portare a sicura identificazione positiva della specie in un campione, spesso fornisce una sicura evidenza dellassenza della specie. Cos, il fatto

che non si ottenga un picco allo stesso tempo di ritenzione di uno standard ottenuto nelle stesse condizioni rappresenta unevidenza che il composto in questione assente ( o presente a concentrazione inferiore al limite di rivelabilit del metodo). ANALISI QUANTITATIVA Sfrutta la misurazione dellaltezza o dellarea sottesa ai picchi. Se le condizioni sono opportunamente controllate, entrambi questi parametri variano linearmente con la concentrazione. La misura dellarea pi affidabile in quanto non risente delleventuale allargamento dei picchi in seguito a variazione delle condizioni di lavoro. I metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima una curva di calibrazione per ciascun analita e poi si ricava la concentrazione dellanalita nella miscela in esame mediante interpolazione. Il metodo dello standard interno il pi affidabile: una quantit nota di standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nel campione in esame; il parametro analitico quindi costituito dal rapporto tra le aree dello standard e dellanalita (il metodo funziona solo se il picco dello standard vicino, ma separato da quello dellanalita).