Universidade Federal do Rio de Janeiro Daniele Gabriel Costa

MELHORA DA DISFUNO VENTRICULAR INDUZIDA PELO INFARTO DO MIOCRDIO APS TRATAMENTO COM 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2TIENILHIDRAZONA (LASSBio-294)

Rio de Janeiro 2011

Daniele Gabriel Costa

MELHORA DA DISFUNO VENTRICULAR INDUZIDA PELO INFARTO DO MIOCRDIO APS TRATAMENTO COM 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2TIENILHIDRAZONA (LASSBio-294)

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ps-graduao em Farmacologia e Qumica Medicinal do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Doutor em Cincias Biolgicas (Farmacologia e Qumica Medicinal).

Orientadores: Prof.a Dra. Gisele Zapata Sudo Prof. Dr. Roberto Takashi Sudo

Rio de Janeiro 2011

FICHA CATALOGRFICA

Costa, Daniele Gabriel. Melhora da disfuno ventricular induzida pelo infarto do miocrdio aps tratamento com 3,4 metilenodioxibenzoil-2tienilhidrazona (LASSBio-294) /Daniele Gabriel Costa 2011. 111 fl.: il Tese (Doutorado em Farmacologia e Qumica Medicinal) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Cincias Biomdicas, Rio de Janeiro, 2011. Orientadores: Gisele Zapata Sudo e Roberto Takashi Sudo. 1. LASSBio-294 2. Infarto do miocrdio 3. Remodelamento cardaco 4. Fluxo de clcio intracelular I. Zapata-Sudo, Gisele (Orient.). II. Sudo, Roberto Takashi (Orient.). III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Cincias Biomdicas, Programa de Ps-graduao em Farmacologia e Qumica Medicinal. IV. Ttulo.

FOLHA DE APROVAO

Daniele Gabriel Costa

Melhora da disfuno ventricular induzida pelo infarto do miocrdio aps tratamento com 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294)

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ps-graduao em Farmacologia e Qumica Medicinal do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Doutor em Cincias Biolgicas (Farmacologia e Qumica Medicinal).

Aprovada em: 22 de fevereiro de 2011.

_______________________________________________________________ Profa. Dra. Gisele Zapata Sudo, ICB/UFRJ (Orientadora) _______________________________________________________________ Prof. Dr. Roberto Takashi Sudo, ICB/UFRJ (Orientador) _______________________________________________________________ Prof. Dr. Carlos Alberto Manssour Fraga, Faculdade de Farmcia/UFRJ _______________________________________________________________ Prof. Dr. Jos Hamilton Matheus Nascimento, IBCCF/UFRJ _______________________________________________________________ Prof. Dr. Roberto Coury Pedrosa, HUCFF/UFRJ _______________________________________________________________ Profa. Dra. Valria do Monti Nascimento Cunha, ICB/UFRJ (Revisora) _______________________________________________________________ Prof. Dr. Emiliano Medei, IBCCF/UFRJ (Suplente)

Este trabalho dedicado aos meus pais, Claudio Luiz Gabriel Costa e Tania Mara Gabriel Costa; Aos meus irmos, Diogo Gabriel Costa e Dbora Gabriel Costa; Daisy Ribas Carestiato; Ao Dr. Rogrio Pires de Mello Neto; Aos meus tios, primos e amigos que me acompanharam nesta caminhada.

AGRADECIMENTOS:

minha famlia, em especial meus pais, irmos e tios; Aos meus orientadores: Profa Dra Gisele Zapata-Sudo e Roberto Takashi Sudo; revisora: Profa Dra Valria do Monti Nascimento Cunha; Aos membros da banca: Prof. Dr. Carlos Alberto Manssour Fraga, Prof. Dr. Jos Hamilton Matheus Nascimento e Prof. Dr. Roberto Coury Pedrosa; Ao Prof. Dr. Celso Caruso-Neves; Aos amigos do laboratrio em especial MSc. Jaqueline Soares dos Santos; PhD. Luana Braga Pontes; Profa. Dra. Fernanda Antunes; Profa Dra. Paula Lima do Carmo; As tcnicas do laboratrio Marly e Silvania; Aos meus amigos Dr. Rogrio Pires de Mello Neto, Daisy Carestiato, Dra. Tania Brum, Prof. Dr. Fernando Monteiro Sabia Pompeu, Camile Costa Branco Pinheiro, Bruno Pinheiro, PhD. Luana Braga Pontes, Priscilla Martins Vidal, Profa. Dra. Andrea Deslandes, MSc. Thiago Lemos de Carvalho, Prof. Dr. Rodrigo Fortunato, MSc. Daniele Leo Igncio e Carlos Magno Ramos, Virgnia Lima, Tatiana Fasolari e Bruna Baffa.

LISTA DE ABREVIATURAS -actina subtipo alfa da actina ACh acetilcolina A(2) subtipo 2 do receptor de adenosina A(2A) subtipo 2A do receptor de adenosina A(2B) subtipo 2B do receptor de adenosina ACDA artria coronria descendente anterior ADP adenosina difosfato AHA American Heart Association AMPc adenosina monofosfato cclico ATP adenosina trifosfato Ca2+ - on clcio CaCl2 cloreto de clcio CAMKinase II - clcio calmodulina cinase do tipo II Cav1.2 canal de clcio tipo-L DMSO dimetilsulfxido dP/dt mx. relao da derivada da presso e derivada do tempo mxima diastlica dP/dtmin. relao da derivada da presso e derivada do tempo mxima diastlica ECA enzima conversora de angiotensina EDTA cido etilenodiaminotetraactico EGTA K2-etileno glicol-bis (2-amino-etil-ter)-N, N, N', N'- cido tetraactico FC frequncia cardaca FKBP-12.6 isoforma 12.6 da protena ligadora de imunossupressores FO falso-operado GAPDH gliceraldedo fosfato desidrogenase GDP guanosina difosfato GTP guanosina trifosfato HEPES cido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanolsulfnico IC insuficincia cardaca ip intraperitoneal IM infarto do miocrdio

ICa corrente de influxo de clcio IfNa+ corrente de sdio de curta durao IL6 interleucina 6 IL10 interleucina 10 KACh canais de potssio dependentes de acetilcolina KATP canais de potssio dependentes de adenosina trifosfato K+ - on potssio LASSBio-294 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tielnilhidrazona M2 subtipo 2 do receptor muscarnico MyBP-C protena ligadora de miosina do tipo C MLC2 subtipo 2 da cadeia leve da miosina MLP protenas LIM musculares NCX trocador sdio-clcio Na+ - on sdio Na+/K+ ATPase bomba de Na+/K+ NO xido ntrico
iNOS

enzima xido ntrico sintase induzvel

NYHA New York Heart Association O2 tomo de oxignio PAS presso arterial sistlica PAD presso arterial diastlica PAM presso arterial mdia pCa potencial de clcio PDE fosfodiesterase PDE1 isoforma do tipo 1 da fosfodiesterase PDE3 isoforma do tipo 3 da fosfodiesterase PDE7 isoforma do tipo 7 da fosfodiesterase pH potencial de hidrognio PK protena cinase PKA protena cinase do tipo A PKC protena cinase do tipo C Pi fosfato inorgnico PLB fosfolamban PNA peptdeos natriurticos atriais

PMCA- clcio ATPase da membrana plasmtica PMSF fluoreto de fenilmetilsufonila Protena G protena trimrica ligadora de guanosina trifosfato Protena Gi protena trimrica ligadora de guanosina trifosfato inibitria Protena Gs protena trimrica ligadora de guanosina trifosfato estimulatria PVSFE presso ventricular sistlica final esquerda PVDFE presso ventricular diastlica final esquerda R2 coeficiente de determinao RS retculo sarcoplasmtico Receptor 1A subtipo 1A do receptor alfa-adrenrgico Receptor 1B subtipo 1B do receptor alfa-adrenrgico Receptor 1D subtipo 1D do receptor alfa-adrenrgico Receptor 2A subtipo 2A do receptor alfa-adrenrgico Receptor 2B subtipo 2B do receptor alfa-adrenrgico Receptor 2C subtipo 2C do receptor alfa-adrenrgico Receptor 1 subtipo 1 do receptor beta-adrenrgico Receptor 2 subtipo 2 do receptor beta-adrenrgico Receptor 3 subtipo 3 do receptor beta-adrenrgico RyR receptor de rianodina RyR2 receptor de rianodina do tipo II RAA renina-angiotensina-aldosterona SERCA2a subtipo 2a da clcio ATPase do retculo sarcoplasmtico Soluo R soluo de relaxamento Soluo W soluo de lavagem TNF fator de necrose tumoral alfa TGF1 fator de crescimento transformador beta 1 Tris tris(hidroximetil)-aminometano VEGF fator de crescimento do endotlio vascular

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RESUMO COSTA, Daniele Gabriel. Melhora da disfuno ventricular induzida pelo infarto do miocrdio aps tratamento com 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294). Rio de Janeiro, 2011. Tese (Doutorado em Farmacologia e Qumica Medicinal) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.

O infarto do miocrdio (IM) normalmente associado hipertrofia cardaca, reduo da captao de Ca2+ pelo retculo sarcoplasmtico (RS) e ao comprometimento do relaxamento cardaco. Atualmente os tratamentos disponveis ainda so insatisfatrios para impedir a evoluo das complicaes decorrentes do IM. O objetivo desse trabalho foi investigar o processo de remodelamento cardaco e a funo ventricular de coraes submetidos ao IM aps tratamento com uma nova tienilhidrazona: 3,4-metilenodioxibenzoil-2tienilhidrazona (LASSBio-294). LASSBio-294 aumenta significativamente a captao de Ca2+ em fibras cardacas desnudas, reduz a dor inflamatria e promove vasodilatao na presena do endotlio ntegro em condies controles. LASSBio-294 (2 mg/kg) ou veculo (dimetilsulfxido / DMSO - 100%) foi administrado diariamente por via intraperitoneal (ip) durante quatro semanas em ratos submetidos ao IM experimental e falso-operados. O volume de DMSO administrado em todos os animais variou entre 50 e 80 l. O remodelamento cardaco e a disfuno ventricular foram investigados atravs da anlise histoqumica do tecido cardaco e da determinao da presso intraventricular esquerda. A regulao de Ca2+ intracelular (captao e liberao) e a sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ foram avaliadas atravs da determinao da resposta contrtil de fibras ventriculares desnudas

provenientes de coraes dos ratos infartados e falso-operados. A expresso

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protica da isoforma SERCA2a foi verificada aplicando a tcnica de western blot. A hipertrofia cardaca que se desenvolveu quatro semanas aps o IM, de 4,5 0,2 para 7,1 0,3 mg/g, foi parcialmente revertida pelo tratamento com LASSBio-294 para o valor de 5,7 0,3 mg/g. O tratamento com LASSBio-294 tambm reduziu a densidade nuclear de 7.369 1.086 para 3.061 255 ncleos/mm2 e a rea percentual de colgeno de 4,2 0,8 para 2,1 0,3% nos ratos submetidos ao IM . A elevao da presso diastlica final do ventrculo esquerdo induzida pelo IM de 8,9 1,6 para 16,4 2,5 mmHg foi revertida com administrao ip do LASSBio-294 para 9,0 2,2 mmHg. O IM reduziu a captao de Ca2+ pelo RS, mas no modificou a liberao de Ca2+ nem a sensibilidade das miofibrilas a esse on. No entanto, LASSBio-294 restaurou a atividade de captao de Ca2+ pelo RS e aumentou a sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+. As modificaes observadas na captao de Ca2+ parecem estar relacionadas com alteraes na expresso da protena SERCA2a, tanto em resposta ao IM quanto ao tratamento. LASSBio-294 parece ser um candidato promissor para a melhoria da regulao de Ca2+, a preveno da disfuno cardaca e o potencial desenvolvimento de insuficincia cardaca (IC) decorrente do IM.

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ABSTRACT COSTA, Daniele Gabriel. Melhora da disfuno ventricular induzida pelo infarto do miocrdio aps tratamento com 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294). Rio de Janeiro, 2011. Tese (Doutorado em Farmacologia e Qumica Medicinal) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.

Myocardial infarction (MI) is usually associated with cardiac hypertrophy, reduced Ca2+ uptake by the sarcoplasmic reticulum (SR) and impairment of cardiac relaxation. Currently, the available treatments are still unsatisfactory to prevent the development of the MI complications. The aim of this study was to investigate the process of cardiac remodeling and ventricular function of hearts subjected to MI after treatment with a new thienylhydrazone: (LASSBio-294). 3,4-

methylenedioxybenzoyl-2-

thienylhydrazone

LASSBio-294

significantly increases Ca2+ uptake in denuded cardiac fibers, reduces inflammatory pain and promotes vasodilation in the presence of intact endothelium in control conditions. LASSBio-294 (2 mg/kg) or vehicle (dimethylsulfoxide/DMSO - 100%) was administered intraperitoneally (ip) every day during four weeks in rats subjected to experimental MI and sham-operated. The volume of DMSO administered in all animals ranged between 50 and 80 l. The cardiac remodeling and ventricular dysfunction were investigated by histochemistry analysis of cardiac tissue and determination of the left intraventricular pressure. The intracellular Ca2+ regulation (uptake and release) and the sensitivity of contractile proteins to Ca2+ were evaluated by determining the contractile response of denuded ventricular fibers from hearts of infarcted and sham-operated rats. Protein expression of SERCA2a isoform was verified by western analysis. Cardiac hypertrophy which developed four weeks after MI from 4.5 0.2 to 7.1 0.3 mg/g was partially reversed by treatment with

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LASSBio-294 to 5.7 0.3 mg/g. The treatment with LASSBio-294 also reduced the nuclear density from 7,369 1.086 to 3.061 255 nuclei/mm2 and the percent collagen area from 4.2 0,8 to 2.1 0.3% in rats submitted to MI . The increase in end diastolic pressure of left ventricle induced by MI from de 8.9 1.6 to 16.4 2.5 mmHg was reversed with ip administration of LASSBio-294 to 9.0 2.2 mmHg. MI reduced the uptake of Ca2+ by the SR but did not modify the Ca2+ or the sensitivity by myofibrils to this ion. However, LASSBio-294 restored the activity of Ca2+ uptake by SR and increased the sensitivity of contractile proteins to this ion. The changes observed in Ca2+ uptake seem to be related to alterations in SERCA2a expression in response to MI and treatment. LASSBio-294 seems to be a promising candidate for improving the regulation of Ca2+, prevention of cardiac dysfunction and the potential development of heart failure (HF) due to MI.

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SUMRIO 1 INTRODUO 1.1 FISIOLOGIA CARDACA 1.1.1 Estrutura e anatomia das clulas cardacas e do corao 1.1.1.1 Protenas contrteis e estruturais 1.1.1.2 Organelas celulares 1.1.1.3 Organizao macroscpica do tecido cardaco 1.1.2 Acoplamento excitao-contrao do msculo cardaco 1.1.3 Relaxamento do msculo cardaco 1.1.4 Modulao da atividade contrtil cardaca 1.1.5 Insuficincia cardaca 1.1.5.1 Definio e classificao da insuficincia cardaca 16 18 18 18 23 25 31 36 37 41 41

1.1.5.2 Mecanismo envolvidos no desenvolvimento da insuficincia 44 cardaca decorrente do infarto do miocrdio 1.2 TRATAMENTO FARMACOLGICO DA INSUFICINCIA CARDACA 52 1.3 ATIVIDADES FARMACOLGICAS E MECANISMO DE AO DE 55 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2-TIENILHIDRAZONA (LASSBIO-294) 1.4 OBJETIVOS 1.4.1 Objetivo geral 1.4.2 Objetivos especficos 2 MATERIAIS E MTODOS 2.1 ANIMAIS 2.2 FRMACOS E REAGENTES 2.3 DESENHO EXPERIMENTAL 2.4 MODELO EXPERIMENTAL DE INFARTO DO MIOCRDIO 2.5 AVALIAO DA HIPERTROFIA CARDACA 2.6 AVALIAO HISTOQUMICA 2.6.1 Processamento e seco do material 2.6.2 Colorao do material 57 57 57 58 59 59 61 61 62 62 62 63

2.6.3 Mensurao da densidade nuclear e da rea percentual de 64 fibrose 2.7 AVALIAO DA REGULAO DE Ca2+ INTRACELULAR 2.7.1 Captao e liberao de Ca2+ pelo RS 65 66

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2.7.2 Sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ 2.8 AVALIAO DA EXPRESSO DE SERCA2a NO TECIDO CARDACO 2.8.1 Preparao dos homogeneizados 2.8.2 Anlise da expresso protica por western blot 2.9 AVALIAO DOS PARMETROS HEMODINMICOS 2.10 ANLISE ESTATSTICA 3 RESULTADOS 3.1 HIPERTROFIA CARDACA 3.2 DENSIDADE NUCLEAR E VOLUME DE COLGENO INTERSTICIAL 3.3 CONTRATILIDADE CARDACA E MOBILIZAO DE Ca2+ INTRACELULAR 3.3.1 Regulao da captao e liberao de Ca2+ do RS 3.3.2 Relao da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ 3.4 EXPRESSODE SERCA2a NO TECIDO CARDACO 3.5 PARMETROS HEMODINMICOS 4 DISCUSSO 5 CONCLUSO 6 REFERNCIAS

69 70

70 70 71 73 74 75 76

79

79 82 84 86 88 99 101

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1 Introduo

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As doenas cardiovasculares esto entre as principais causas de morte nos Estados Unidos da Amrica (EUA) e em todo mundo. A epidemia que se alastra a cada ano ocorre principalmente devido ao aumento da incidncia dos fatores de riscos envolvidos na gnese dessas doenas como: o tabagismo, a obesidade, o sedentarismo, o diabetes melitus e a sndrome metablica (http://www.americanheart.org/statistics). Somente nos EUA, um em cada trs americanos possui algum tipo de doena cardiovascular, totalizando 80 milhes de portadores (http://www.americanheart.org/statistics). Dentre as disfunes mais proeminentes esto a insuficincia cardaca (IC), acometendo 5,7 milhes de habitantes e o infarto do miocrdio (IM) acometendo 7,9 milhes de norteamericanos (http://www.americanheart.org/statistics). A mortalidade decorrente das doenas cardiovasculares bastante elevada. S no ano de 2005 nos EUA, aproximadamente 450 mil pessoas morreram devido ao infarto do miocrdio (ADAMS et al., 2008). Esta situao vem sendo melhorada devido a polticas preventivas implementadas pelo governo, principalmente no que diz respeito a alimentao infantil. No entanto, esses nmeros ainda encontram-se longe do valor ideal. Entre latinos e hispnicos, a incidncia de novos eventos cardacos foi de 610 mil no ano de 2009 e de infartos recorrentes de 325 mil (http://www.americanheart.org/statistics) com taxa de mortalidade em 2005 de 118 indivduos para cada 100 mil habitantes

(http://www.americanheart.org/statistics). Esses dados ratificam a preocupao da Organizao Mundial de Sade com o tratamento e principalmente com a preveno dessas doenas. O custo com internaes hospitalares, bem como, com o tratamento farmacolgico e intervenes cirrgicas cada vez maior. O gasto estimado pelo governo americano no ano de 2009 foi de cerca de 166 bilhes de dlares para o tratamento das doenas coronarianas. Esse gasto para pessoas com IC girou em torno 33 bilhes de dolres no mesmo perodo. Inmeros esforos tm sido empregados na tentativa de desenvolver novas terapias que simplifiquem o tratamento das pessoas acometidas por doenas cardiovasculares, bem como, na preveno das mesmas. Nesse sentido, equipes multidisciplinares trabalham para desenvolver e modificar os hbitos populacionais

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contemporneos, que se caracterizam pelo consumo de alimentos com altos ndices calricos, a ingesto excessiva de lcool, o sedentarismo e o tabagismo. O tratamento farmacolgico dos pacientes que sofreram IM e desenvolveram IC feito atravs de um esquema teraputico amplo, que envolve a administrao de vrios frmacos. Isso se deve ao fato do desenvolvimento da doena e o aparecimento dos seus sintomas serem promovidos por uma srie de disfunes de processos fisiolgicos importantes no organismo. Assim, dependendo da intensidade do evento, do grau de acometimento que o mesmo gera no sistema cardiovascular, e dos tipos de sintomas apresentados, diferentes estratgias teraputicas podem ser implementadas. Atualmente, as pesquisas farmacolgicas esto voltadas para o desenvolvimento de novas substncias que possam apresentar maior eficcia no tratamento simultneo de diferentes sintomas, reduzindo a necessidade do uso de inmeros frmacos. Essa condio permite uma maior adeso do paciente ao tratamento e reduz o seu custo, tornando-o portanto mais eficaz. Diferentes frmacos vm sendo apresentados como novas alternativas para o tratamento da IC. Atualmente, o levosimendam e a espirolactona so frmacos que apresentam maior destaque no mercado para o tratamento da queda da contrtilidade cardaca induzida pela IC, apresentada por alguns pacientes e para inibio do remodelamento cardaco, respectivamente (LI et al. 2009; BERGH et al., 2010). Seguindo essa proposta, esse trabalho testou o efeito de uma nova substncia com propriedades inotrpica e lusitrpica positivas como possvel alternativa futura para o tratamento dos efeitos deletrios induzidos pelo IM. Esse trabalho foi desenvolvido com intuito de se observar as consequncias relacionadas administrao diria prolongada dessa substncia em ratos submetidos ao IM experimental e observar a sua eficcia no tratamento dos sintomas apresentados.

1.1 FISIOLOGIA CARDACA 1.1.1 Estrutura e anatomia das clulas cardacas e do corao 1.1.1.1 Protenas contrteis e estruturais

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O tecido muscular cardaco formado por protenas contrteis, que organizadas do origem a unidade funcional contrtil da clula conhecida como sarcmero. O mesmo constitudo pelos filamentos grosso e fino, sendo o primeiro composto por molculas de miosina e o segundo por troponina, tropomiosina e actina (Figura 1).

Figura 1. Esquema ilustrativo dos filamentos grosso e fino que compem o sarcmero e suas protenas representadas. Compondo o filamento fino encontram-se a actina, troponina, tropomiosina e compondo o filamento grosso observa-se a miosina. Retirado de http://panatpat.unicamp.brmusnormal.html/ Acessado em 21 de janeiro, 2011.

O filamento fino se une a estruturas conhecidas como linha Z (filamentos de -actina) que delimitam os sarcmeros. Molculas de actina-G (globular) alinham-se para formar uma estrutura filamentar conhecida como actina-F. Duas dessas estruturas se entrelaam, assumindo um formato de -hlice. Essa estrutura bifilamentar envolta, ainda, pelas molculas de tropomiosina e troponina, que, por sua vez, composta por trs unidades: troponina C, troponina I e troponina T. A primeira possui alta afinidade com ons clcio (Ca2+), a segunda encontra-se ligada ao filamento de actina e a ltima ligada tropomiosina. Acredita-se que a tropomiosina no estado de repouso, onde a concentrao de Ca2+ intracelular baixa, encubra os stios ativos presentes nas molculas de actina, impedindo o processo de contrao e mantendo o msculo relaxado. A presena da tropomiosina em seu estado conformacional de repouso inibe a ligao entre a miosina e actina, evento essencial para ativao da contrao muscular.

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O filamento grosso formado principalmente por molculas de miosina, a mesma, por sua vez, composta por duas cadeias pesadas e quatro cadeias leves. As cadeias pesadas assumem o formato de -hlice, dando origem cauda da molcula, e na parte terminal se dividem para formar a parte da estrutura da cabea da miosina (Figura 2A). As cadeias leves, divididas em duas cadeias reguladoras (MLC2) e duas essenciais, encontram-se na parte terminal das cadeias pesadas e juntamente com essas formam a cabea da miosina (Figura 2A). A cadeia pesada apresenta atividade ATPsica necessria para ativar o processo contrtil exatamente no bolso onde a estrutura helicoidal se desfaz para dar origem cabea, regio essa denominada de bolso de ATP (BRAUNWALD et al., 2001). Existem duas isoformas das cadeias pesadas de miosina: 1. , predominante no tecido cardaco humano; 2. , predominante no tecido cardaco de roedores (BRAUNWALD et al., 2001). . Doenas como a IC podem levar a mudana no padro de expresso dessas isoformas, aumentando consideravelmente a sntese da isoforma , que apresenta atividade ATPsica mais lenta em relao isoforma (BARRY et al., 2008), o que poderia em parte justificar a reduzida contratilidade observada em coraes de roedores. No entanto, outros mecanismos esto envolvidos nesse processo e a importncia dessa mudana para a reduo da fora contrtil ainda no est totalmente estabelecida. Parte do corpo e da cabea da molcula de miosina formam, as chamadas pontes cruzadas, que conectadas actina e ativadas com energia fornecida pela clivagem do ATP so capazes de se encurtarem atravs da movimentao de pontos conhecidos como dobradias (Figura 2B).

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Figura 2. Esquema ilustrativo da molcula de miosina. (A) Estrutura molecular das cadeias leves e pesadas que compem a molcula de miosina. Retirado de Guyton e Hall, 2006. (B) Pontos de flexo da molcula denominados dobradias, essenciais para movimentao da molcula e encurtamento do sarcmero. Adaptado de http://www.scienceinschool.org/2007/issue4/motors/portuguese, Acessado em 21 de Janeiro, 2011.

Outras protenas estruturais que no fazem parte do processo de contrao tambm compem o sarcmero como: a titina, a protena C ligadora de miosina (MyBP-C) e a prpria -actina. Essas protenas, apesar de no

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possurem participao direta na contrao muscular exercem um papel importante na manuteno da estrutura da clula e sua unidade contrtil, podendo tambm indiretamente influenciar na contratilidade do msculo atravs da modulao da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ e da sntese protica (WALKER et al., 2009). A titina uma protena que une o filamento grosso linha z e possui um papel fundamental na manuteno da estrutura do sarcmero e da tenso passiva gerada pela contrao (Figura 3A). Acredita-se que o estiramento excessivo dessa estrutura decorrente de uma desorganizao estrutural do tecido pode levar ativao e modificao no padro de expresso protica dos cardiomicitos atravs da estimulao das protenas LIM musculares (MLP: lin-11 e mec-3), ativadoras do crescimento dos micitos. A energia potencial gerada com o estiramento da titina tambm parece contribuir para o aumento da gerao de fora observado no mecanismo de Frank-Starling (BRAUNWALD et al., 2001). A MyBP-C responsvel principalmente pela manuteno do alinhamento vertical dos filamentos fino e grosso. A mesma envolve verticalmente os dois filamentos, formando a zona C regio onde ocorre a sobreposio dos trs filamentos (Figura 3B). A fosforilao da MyBP-C pode ainda modificar a taxa de expresso protica, gerando mudanas nos parmetros contrteis e elevando a cintica do desenvolvimento de fora das clulas cardacas, provavelmente atravs do aumento da atividade ATPsica (STELZER et al., 2007). Alm dessas estruturas, a clula cardaca ainda formada por protenas do citoesqueleto membranar que tambm atuam na manuteno de sua forma e na modulao da expresso protica.

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Figura 3. Esquema ilustrativo das protenas estruturais que compem o sarcmero. (A) Filamento de titina que liga a o filamento grosso linha Z. Retirado de Braunwald, 2001. (B) Protena C ligadora de miosina (MyBP-C) que envolve verticalmente os filamentos fino e grosso formando a zona c. Modificado de Oakley e outros, 2004.

1.1.1.2 Organelas celulares

A clula cardaca composta por diferentes organelas e protenas responsveis pelo controle dos processos de contrao e relaxamento da clula como, por exemplo, as mitocndrias e o retculo sarcoplasmtico (RS). A

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organela envolvida na sntese de energia no processo de contrao do msculo cardaco a mitocndria. Esta para gerar ATP requer a presena do oxignio (O2) como aceptor final de eltrons na formao de gua. O principal substrato responsvel pela gerao de energia no corao so os cidos graxos provenientes das fontes lipdicas (KATZ, 2001, p.71). Os glicdios e seus derivados, como o lactato, tambm servem como fontes de energia para contrao muscular, mas em menor grau (BROOKS; FAHEY; BALDWIN, 2005). As mitocndrias se distribuem paralelamente aos sarcmeros, permitindo a disponibilizao instantnea de ATP miosina. A produo de espcies reativas de O2 durante a sntese de ATP pela mitocndria gera a ativao de mecanismos que podem induzir o remodelamento das clulas cardacas e gerar problemas no funcionamento do corao. Essa disfuno pode ser observada em diversas doenas cardacas como na IC aps IM. O RS uma organela envolvida nos processos de contrao e relaxamento do msculo. Sua principal funo servir de reservatrio intracelular dos ons Ca2+ para ativao da contrao muscular. No msculo cardaco, a principal fonte de ativao da contrao proveniente do Ca2+ contido no RS, porm para que haja liberao a partir desse reservatrio (RS), necessrio que o Ca2+ do meio extracelular se difunda para citoplasma e ative diretamente o receptor de rianodina (RyR). Essa difuso s possvel devido ao gradiente eletroqumico mantido entre o meio extracelular e intracelular (BRAUNWALD et al., 2001). Portanto, qualquer dano no processo que envolve a captao e/ou liberao de Ca2+, modificando suas concentraes, tanto luminal (RS) quanto citoplasmtica, pode acarretar modificaes no processo contrtil muscular, prejudicando a ejeo sanguinea pelo corao. O RS forma uma rede de sarcotbulos que envolvem os sarcmeros rodeando as miofibrilas (protenas contrteis). As partes terminais do RS formam cisternas que se justapem com invaginaes da membrana plasmtica denominadas de tbulos-T. A estrutura dupla formada por um tbulo-T e uma cisterna do RS conhecida como dade e possui uma grande importncia no processo contrtil (Figura 4).

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Tbulo-T

RyR2

Ca 2+

Canal de Ca 2+ Tipo -L

RS

Figura 4. Esquema ilustrativo da dade cardaca e o microdomnio de membrana formado entre o tbulo-T e a cisterna terminal do RS. Os crculos em azul claro representam molculas de + CA(2) .

A organizao espacial dessa estrutura permite que o acoplamento excitao-contrao do msculo ocorra de maneira eficiente e econmica. Por serem bem estreitas e por isso permitirem a justaposio das protenas envolvidas no transporte de Ca2+, as fendas entre o tbulo-T e o RS possibilitam que pequenas quantidades de Ca2+ sejam suficientes para ativao do processo, e por sua vez, que menos energia seja gasta para sua desativao. Quando essas estruturas se desorganizam impedindo a justaposio entre as protenas envolvidas na liberao e captao do Ca2+ pelo RS, so observadas disfunes nos processos de contrao e/ou relaxamento cardaco.

1.1.1.3 Organizao macroscpica do tecido cardaco

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As clulas musculares cardacas diferentemente das esquelticas possuem intercomunicaes (canais juncionais) que permitem o fluxo de ons e pequenas molculas (at 1 KDa) as clulas vizinhas. A excitao de uma clula anterior induz a despolarizao da clula seguinte com a qual possui junes intercomunicantes e discos intercalares. A presena dessas estruturas confere ao tecido cardaco a caracterstica de um sinccio funcional (Figura 5). Essa caracterstica viabiliza a ativao rpida do tecido com um gasto energtico mais baixo.

Figura 5. Esquema ilustrativo do msculo cardaco, salientando a presena dos discos intercalares, estriaes formadas pelas miofibrilas e junes intercomunicantes. Retirado de Guyton e Hall, 2006.

O corao possui quatro cavidades, duas superiores denominadas de trios e duas inferiores chamadas de ventrculos. Os trios e ventrculos so separados por vlvulas que permitem a passagem do sangue na direo trioventricular e impedem o seu refluxo durante a contrao dos ventrculos. A vlvula que separa o trio direito do ventrculo direito conhecida como tricspide. No mesmo nvel, encontra-se a vlvula mitral, separando o trio e o ventrculo esquerdos. Dando suporte a essas estruturas fibrosas esto os msculos papilares, presentes tanto no ventrculo direito quanto no esquerdo,

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essenciais para manuteno da forma e da funo das vlvulas. A vlvula pulmonar separa o ventrculo direito da artria pulmonar e a vlvula artica separa o ventrculo esquerdo da artria aorta. Ambas possuem uma estrutura anatmica diferente das vlvulas trios-ventriculares, mas funes idnticas (Figura 6). Entre o lado esquerdo e direito dos ventrculos encontra-se o septo ventricular, uma parede muscular grossa no qual o impulso eltrico proveniente do trio direito conduzido at os ventrculos. Em condies normais o septo se comporta funcionalmente como parte integrante do ventrculo esquerdo, entretanto, em casos onde a presso ventricular esquerda encontra-se aumentada, este passa a atuar como parte do ventrculo direito, prejudicando o bombeamento de sangue para circulao sistmica (KATZ, 2001, p.5).

Figura 6. Esquema ilustrativo do corao, demonstrando as cavidades trios-ventriculares, as vlvulas cardacas e ainda os msculos papilares. Retirado de http://www.infoescola.com/biologia/sistema-circulatorio/. Acessado em 21 de janeiro, 2011.

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As fibras musculares cardacas possuem caractersticas diferentes dependendo da regio onde se encontram. Os cardiomicitos da regio do nodo sinoatrial se caracterizam por serem auto-despolarizantes devido ampla presena de canais com baixo limiar de ativao que permite a ativao de correntes de influxo de sdio (Na+) de curta durao IfNa+. Essas correntes permitem que pequenas trocas inicas produzam potenciais de ao peridicos que mantm a atividade marca-passo do corao em funcionamento (GUYTON; HALL, 2006, p. 98). Outro conjunto de clulas encontra-se no nodo trio-ventricular. A caracterstica principal desses cardiomicitos a presena reduzida dos discos intercalares e das junes intercomunicantes (KATZ, 2001, p. 17). A funo dessas clulas retardar em alguns milissegundos o impulso eltrico gerado no nodo sino-atrial antes que o mesmo atinja os ventrculos, permitindo que os trios se contraiam antes que os mesmos. As clulas do sistema de Purkinje, por sua vez, so mais calibrosas e se organizam formando feixes (Feixe de His), responsveis pela rpida conduo eltrica e contrao simultnea dos ventrculos aps a passagem do impulso pelo nodo trioventricular (KATZ, 2001, p.4). As fibras musculares cardacas e o corao so envolvidos por tecidos fibroso e seroso que auxiliam em sua manuteno estrutural. Essa organizao anatmica importante para a integrao dos mecanismos de acoplamento excitao-contrao, assim como, para a manuteno das propriedades elsticas e mecnicas do tecido. A parte interna da parede cardaca

denominada de endocrdio. O corao circundado por uma membrana fibrosa na parte mais externa e serosa na parte mais interna, conhecidas como pericrdio fibroso e seroso, respectivamente. O pericrdio seroso dividido em duas lminas, o visceral (ou epicrdio) e parietal (na parte externa). Entre essas lminas est a cavidade parietal que contm um lquido que permite fluidez entre essas duas estruturas (GUYTON; HALL, 2006, p. 115). O pericrdio fibroso se liga ao diafragma na parte inferior e continua nas paredes das artrias e veias que se ligam as cavidades cardacas (Figura 7).

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Figura 7. Ilustrao das estruturas fibrosas e musculares que se encontram dispostas em camadas no corao. Retirado de http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/corpo-humanosistema-cardiovascular/coracao-5.php. Acessado em 21 de janeiro, 2011.

A principal funo do corao bombear sangue rico em O2 e nutrientes para os tecidos perifricos e em seguida levar o sangue rico em gs carbnico e catablitos para serem eliminados pelos pulmes. Outras funes do sangue so: o transporte de substncias como hormnios e frmacos para todo organismo, participao na manuteno do equilbrio cido-base do corpo e ainda no processo de coagulao e cicatrizao de tecidos entre outros (GUYTON; HALL, 2006, p. 130). O sangue proveniente dos tecidos chega ao trio direito atravs das veias cavas superior e inferior, ao atingir o trio direito com uma presso diastlica final em torno de -5 a 0 mmHg o mesmo bombeado para o ventrculo direito e em seguida para artria pulmonar at chegar aos capilares alveolares onde ocorrem as trocas gasosas (GUYTON; HALL, 2006, p. 144). Em seguida, atinge o trio e o ventrculo esquerdos, produzindo neste uma presso ao final da distole em torno de 5 mmHg. Sob uma presso de 120 mmHg o sangue ejetado atravs da artria aorta para ento ser distribudo para todo o organismo. Durante a distole ventricular esquerda, o sangue flui atravs das artrias coronrias para irrigar o prprio

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tecido cardaco. Esta irrigao feita principalmente atravs de quatro artrias coronrias: artria circunflexa, coronria direita, coronria esquerda e coronria descente anterior (ACDA) (Figura 8). A maior parte do ventrculo esquerdo irrigada pela ACDA. A obstruo desses vasos pode gerar isquemia e morte das clulas cardacas, fenmeno esse conhecido como IM. O tecido subendocrdico apresenta maior suscetibilidade de enfrentar eventos

isqumicos por se tratar da parte mais interna do corao, tal fato se intensifica em condies onde a presso interna das cavidades aumenta, gerando maior estresse da parede e dificultando o fluxo sanguineo pelas artrias coronrias (KATZ, 2001, p. 402). Portanto, em casos onde ocorre o entupimento da artria ACDA geralmente grande parte do ventrculo esquerdo no recebe o aporte de O2 necessrio, causando um infarto transmural (toda espessura da parede do miocrdio) de grande extenso e comprometendo o bombeamento de sangue para o organismo. Essa condio ativa mecanismos compensatrios para restaurao do dbito cardaco e da presso arterial (FUKUTA; LITTLE, 2008). Esses mecanismos vo desde a ativao de sistemas neuro-humorais, reprogramao de genes inativos, alterao da expresso protica e ativao do sistema imunolgico, gerando em um primeiro momento adaptaes benficas que em seguida sobrecarregam o sistema cardiovascular e induzem o processo de IC (LEHNART; MAIER 2009).

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Figura 8. Ilustrao das principais artrias coronrias responsveis pela irrigao do tecido cardaco. Retirado de http://www.misodor.com/CORACAO.php. Acessado em 21 de janeiro, 2011.

1.1.2 Acoplamento excitao-contrao do msculo cardaco Os eventos que vo desde a despolarizao do sarcolema dos cardiomicitos at o encurtamento dos sarcmeros e a contrao muscular so designados como processo de acoplamento excitao-contrao do msculo cardaco. Como salientado na seo anterior, a despolarizao das clulas cardacas tem incio nas clulas do nodo sino-atrial que possuem atividade marca-passo, para em seguida induzirem a contrao dos trios e ventrculos. O processo de gerao de potencial de ao de uma clula cardaca se inicia atravs da abertura de canais de sdio voltagem-dependente presentes na membrana plasmtica (GUYTON; HALL, 2006, p. 98). Esses canais so responsveis pela passagem seletiva dos ons sdio (Na+), e por possurem uma cintica de ativao rpida, so responsveis pela fase rpida do potencial de ao cardaco (fase I). A despolarizao da membrana ativa outro

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grupo de canais voltagem-dependentes. Esses canais possuem uma cintica de ativao mais lenta em comparao aos canais de Na+ e so seletivos aos ons Ca2+ e, em menor grau, aos ons Na+ (GUYTON; HALL, 2006, p.98). Os mesmos so conhecidos como canais de Ca2+ tipo-L ou receptores de dihidropiridina (Cav1.2) por serem antagonizados por substncias dessa classe qumica. Estes canais so responsveis pela gerao de um plat no potencial de ao atravs da manuteno do potencial positivo no interior da clula (fase II). Os canais voltagem-dependentes permeveis ao K+ e, de cintica ainda mais lenta, tambm so ativados durante a despolarizao da clula muscular cardaca. No entanto, a comporta de ativao desse canal presente na parte intracelular da membrana, se abre tardiamente, quando ambos os canais de Na+ e Ca2+ j se encontram inativados. O efluxo dos ons K+ durante essa fase permite a repolarizao da membrana celular (fase III), e a manuteno desse estado aberto promove a hiperpolarizao da clula, quando o potencial vai a valores mais negativos que o potencial de repouso (fase IV). A abertura dos canais de Ca2+ tipo-L permite que alguma quantidade de Ca2+ seja transportada passivamente para o interior da clula cardaca, devido diferena no gradiente eletroqumico existente entre o meio intracelular e extracelular dos cardiomicitos. Esse pequeno influxo de Ca2+ no citosol (ICa) suficiente para alcanar as cisternas do RS justapostas ao tbulo-T, ativando os RyR (BERRIDGE et al., 2000). Segundo Lehnart e Maier (2009), a fenda entre a juno do RS e o tbulo-T, que possui aproximadamente 12 nm de largura, funciona como microdomnio que compartimentaliza trocas inicas e facilitam o processo de acoplamento excitao-contrao. Os RyR so protenas presentes na membrana do RS. No corao a isoforma do receptor de rianodina predominante a do tipo II (RyR2). Os RyR2 respondem a uma srie de moduladores qumicos, como a rianodina, a cafena, o Ca2+, protenas cinases (PK) e a imunofilina FKBP-12.6 (12.6 kDa). Essa imunofilina responsvel pela estabilizao do canal na conformao fechada. Segundo Priori e Napolitano (2005), RyR2 uma das maiores protenas do organismo, possuindo um total de 4967 aminocidos e um peso molecular de 565 kDa. Alm de estar sujeito a modulao na sua parte externa, na qual se encontra a maior parte dos aminocidos que fazem parte da estrutura do canal, o mesmo est sujeito modulao interna, principalmente pelo Ca2+ presente no lmem

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do RS. Outras protenas presentes no lmem do RS, como calsequestrina, calreticulina, triadina e junctina tambm influenciam a abertura do RyR2 (BLAYNEY; LAI, 2009). Portanto, modificaes na expresso dessas protenas provocadas por doenas podem gerar distrbios na cintica do canal, causando problemas no ciclo contrao-relaxamento celular (BLAYNEY; LAI, 2009). A elevada concentrao do Ca2+ na parte interna do RS aumenta a probabilidade de abertura do RyR2 (LUKYANENKO et al., 1996; SITSAPESAN; WILLIAMS, 1997; GYORKE,I; GYORKE,S, 1998). Na ausncia de

calsequestrina essa probabilidade aumenta, possibilitando o vazamento de Ca2+ durante a distole (BLAYNEY; LAI, 2009). A mudana conformacional do RyR2 em resposta ao aumento do Ca2+ na regio das dades abre um poro no centro do receptor permitindo o efluxo de Ca2+, que est contido em altas concentraes no RS, para o citoplasma da clula. O mecanismo no qual o Ca2+ extracelular ativa a liberao do Ca2+ contido no RS, foi descrito por Fabiato, A. e Fabiato, F. (1979) em ensaios com fibras desnudas, e conhecido como mecanismo de Ca2+ induz a liberao de Ca2+ (Figura 9). A modulao do canal atravs desse mecanismo s ocorre em concentraes intermedirias de Ca2+ (10-7 > [Ca2+]i < 10-5), ou seja, o RyR2 encontra-se inativado tanto em baixas (< 10-8) quanto em altas concentraes de Ca2+ (> 10-2) (MEISSNER, 2002).

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Figura 9. Ilustrao do processo do fluxo de Ca durante a contrao muscular. Modificado de 2+ + Blayney e Lai, 2009. SERCA (Ca ATPase do RS, PLB (fosfolamban), NCX (trocador Na / 2+ 2+ Ca ), LCC (canal de Ca tipo-L), RyR2 (receptor de rianodina tipo 2)

2+

A abertura de RyR2 aumenta consideravelmente a concentrao intracelular de Ca2+ e permite que o mesmo se ligue s molculas de troponina C presentes nos filamentos finos dos sarcmeros. Essa ligao promove uma mudana conformacional no complexo da troponina alterando as posies da troponina I e T. Essa ltima ligada a tropomiosina desloca e libera os stios ativos da actina antes encobertos pela tropomiosina no estado de repouso. Segundo Braunwald e outros (2001), em baixas concentraes de Ca2+, as pontes cruzadas encontram-se desligadas ou em estado de baixa ativao. Aps a liberao dos stios ativos da actina mediado pelo o aumento da concentrao citoslica de Ca2+, as cabeas da miosina entram em contato com os stios da actina e a clivagem do ATP na cabea da miosina ativada, gerando um estado de ligao mais forte das pontes cruzadas. Aps a induo

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do estado de ligao forte pela atividade ATPsica da cadeia pesada da miosina, a adenosina difosfato (ADP) e o fosfato inorgnico se desligam do stio cataltico e em seguida ocorre a movimentao da cabea da miosina, gerando fora e encurtamento dos sarcmeros. A introduo de uma nova molcula de ATP na fenda cataltica, por sua vez, induz o retorno do estado original de ligao fraca das pontes cruzadas, permitindo que um novo ciclo de encurtamento seja desenvolvido (Figura 10).

Figura 10. Esquema Ilustrativo dos mecanismos moleculares de um ciclo de contrao. Retirado de http://faculty.irsc.edu/FACULTY/TFischer/AP1/cross%20bridge%20cycle.jpg. ATP (adenosina trifosfato), Pi (fosfato inorgnico), ADP (adenosina difosfato). Acessado, 21, janeiro, 2011.

A gerao de fora muscular depende, portanto, do nmero de pontes cruzadas que so recrutadas durante a contrao e nada tem a ver com a velocidade de contrao que influenciada pela atividade ATPsica da miosina

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(BRAUNWALD et al., 2001). . Portanto, o conceito de contratilidade ou estado contrtil do corao, que engloba as valncias: fora e velocidade de contrao, influenciado tanto pelo nmero de interaes de pontes cruzadas quanto pela isoforma miosina ATPase presente no msculo. Assim, conclui-se que a contratilidade reduzida tanto pela perda de protenas contrteis quanto pela modificao da atividade enzimtica das cadeias pesadas de miosina do msculo cardaco, entre outros fatores.

1.1.3 Relaxamento do msculo cardaco Os processos de ativao das pontes cruzadas e gerao de fora ocorrem durante a sstole cardaca. Nessa fase, o aumento da presso gerado pela contrao promove a ejeo de sangue presente nas cavidades do corao. Para que o bombeamento ocorra de maneira eficiente, necessrio que haja o relaxamento dos cardiomicitos, permitindo o preenchimento das cmaras antes da ejeo. Esse processo se inicia com a reduo da concentrao de Ca2+ do citosol que, por sua vez, desativa o complexo troponina, bloqueando o mecanismo contrtil descrito acima. A diminuio de Ca2+ do citoplasma cardaco obtida atravs do transporte ativo e com gasto energtico, necessrio para vencer os gradientes eletroqumicos existentes entre o interior da clula, RS e o meio extracelular. Diferentes protenas so responsveis por esse processo, cada qual com um percentual diferente de contribuio. A Ca2+-ATPase da membrana plasmtica (PMCA) uma bomba de Ca2+ de alta afinidade e baixa capacidade responsvel pela extruso de uma pequena parte do Ca2+ intracelular. Por ser uma bomba de alta afinidade mais sensvel a ativao pelo Ca2+ intracelular. A outra Ca2+-ATPase encontra-se presente na membrana do RS e denominada de Ca2+-ATPase do RS ou SERCA. A SERCA tambm um transportador de Ca2+ de alta afinidade e baixa capacidade, que capaz de bombear grande parte do Ca2+ citoplasmtico para o lmem do RS. Uma protena ligada a SERCA conhecida como fosfolamban (PLB) responsvel pela modulao da atividade enzimtica dessa bomba de Ca2+ (BERS, 2002). A fosforilao de PLB por PK promovem o aumento da atividade da Ca2+ATPase e elevam a velocidade de relaxamento do msculo, efeito conhecido

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como lusitrpico positivo. Algumas doenas como a IC, cardiomiopatias dilatadas e hipertrficas reduzem tanto a expresso, quanto a atividade de SERCA2a (isoforma cardaca). Tal fato prejudica o relaxamento muscular e aumenta a sobrecarga do sistema cardiovascular (LEHNART; MAIER, 2009; MACKIEWICZ et al., 2009). O trocador Na+/ Ca2+ (NCX) outra protena presente no sarcolema que tambm auxilia no processo de relaxamento da clula cardaca, funcionando atravs do mecanismo de contra-transporte. O sistema de trocas inicas do NCX se caracteriza por ser um contra-transporte de Na+ e Ca2+ modulado pela atividade da protena Na+/K+ ATPase (bomba de Na+/K+). O NCX transporta simultaneamente trs ons Na+ e um on Ca2+ para faces opostas. Ao final da sstole quando a concentrao de Ca2+ encontra-se elevada no interior da clula, o NCX carreia concomitantemente um on Ca2+ para o meio extracelular e trs ons Na+ para o citoplasma, gerando uma pequena despolarizao da membrana da clula cardaca. O restabelecimento da concentrao de Na+ no meio intracelular feito pela Na+/K+ ATPase presente na membrana plasmtica, que tambm contribui para o retorno do gradiente eletroqumico do Na+. A funo dessa bomba tambm manter estvel o ciclo contrao-relaxamento da clula, j que como mencionado acima, direciona a atividade do trocador durante o relaxamento. A utilizao de frmacos que inibem Na+/K+ ATPase como os glicosdeos digitlicos induzem o inotropismo positivo, pois promovem a ativao inversa do NCX (KATZ, 2001, p. 234). Distrbios eletrolticos causados por algumas doenas podem induzir o mesmo efeito (GILMAN et al., 2005). No entanto, em condies fisiolgicas normais a funo do NCX reduzir a concentrao de Ca2+ intracelular (Figura 9).

1.1.4 Modulao da atividade contrtil cardaca A atividade marca-passo das clulas cardacas responsvel pela gerao dos impulsos eltricos que mantm o corao em constante funcionamento. No entanto, algumas situaes exigem o ajuste tanto da freqncia quanto na fora de contrao para que a demanda de fluxo sanguneo do organismo seja suprida. O sistema nervoso autnomo responsvel por esse ajuste. As terminaes nervosas simpticas aumentam o

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inotropismo,

lusitropismo

cronotropismo

cardacos.

sistema

parassimptico, atravs das terminaes vagais, promovem efeitos inversos. Essas respostas so alcanadas atravs de receptores metabotrpicos presentes na membrana das clulas cardacas. O sistema simptico atua atravs da liberao principalmente de norepinefrina dos neurnios psganglionares e ativa os receptores acoplados a protena G. Esses receptores possuem vrias isoformas e esto relacionados com a amplificao da resposta advinda do exterior para o interior da clula cardaca atravs de molculas denominadas de segundos-mensageiros (ALBERTS et al., 2009). No caso do sistema simptico, os receptores denominados adrenrgicos que esto acoplados protena G promovem principalmente o aumento da fora contrtil quando ativados pela norepinefrina. Esses so divididos em duas classes: os receptores adrenrgicos e . Os receptores -adrenrgicos, que podem ainda ser subdivididos nos subtipos 1A, 1B, 1D 2A, 2B e 2C, no possuem grande importncia no processo contrtil do msculo cardaco, sendo mais relevantes na modulao da funo contrtil do msculo liso vascular. J os receptores -adrenrgicos, que tambm podem ser subdivididos em receptores 1, 2 e 3, so mais expressos no tecido cardaco quando comparados com os receptores -adrenrgicos. Enquanto, 1 e 2 esto relacionados com o aumento da atividade contrtil muscular, o ltimo 3 parece estar envolvido na reduo da contratilidade cardaca (ALBERTS et al., 2009). Em condies normais a expresso dos receptores 1 nos ventrculos bem maior que a dos receptores 2 (cerca de 4x), demonstrando que em indivduos sadios, o receptor 1 parece ser o principal responsvel pela resposta simptica contrtil do tecido. No entanto, em condies como na IC, o excesso da atividade neuro-humoral simptica pode causar um desequilbrio dessa proporo (BRODDE; MICHEL, 1999). Os receptores 1 sofrem "down regulation" e a expresso de 2 elevada para tentar compensar a perda da sensibilidade resposta neuro-humoral (BRODDE; MICHEL, 1999). Os receptores

adrenrgicos e so acoplados a protena G que possui 3 subunidades que se mantm unidas na ausncia do ligante do receptor: , , . A unidade possui um stio de ligao para o GDP que aps a ativao do receptor pelo ligante sofre uma mudana conformacional ligando-se a uma molcula de GTP no lugar da anterior. Isso promove a dissociao dessa subunidade das

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subunidades e , que atuam como subunidade regulatria do receptor (ALBERTS et al., 2009). A protena G dependendo do subtipo do receptor adrenrgico, ativa ou inativa enzimas que so responsveis pela sntese dos segundos-mensageiros. No caso dos receptores 1 e 2 a protena G na qual eles se acoplam a Gs (estimulatria). Essa ativa a enzima adenilato ciclase presente nos microdomnios da membrana cardaca, elevando a sntese de adenosina monofosfato cclico (AMPc). Essa molcula mensageira modula atividade de protena cinase A (PKA) e ativa a fosforilao de uma srie de protenas intracelulares que participam do processo acoplamento excitaocontrao do msculo cardaco. Os principais alvos da PKA so os canais de Ca2+ tipo-L cardacos, RyR2, PLB, PMCA e protenas contrteis como a troponina I. Todos esses processos resultam no aumento das atividades inotrpica, lusitrpica e cronotrpica positivas. A fosforilao dos canais de Ca2+ do tipo-L e RyR2 geram aumento da concentrao de Ca2+ intracelular e da fora contrtil. J a fosforilao de PLB, PMCA e troponina I induzem aumento do relaxamento da clula (BRAUNWALD et al., 2001). . Como j citado em sees anteriores, algumas protenas tambm sofrem fosforilao pela PKA, modificando alguns padres da atividade contrtil como: MCL2 e MyBP-C. No entanto, seus papis so mais estudados em condies patolgicas. A resposta ao aumento do ritmo de contrao, da fora muscular e do relaxamento cardaco contraposta pelo sistema parassimptico atravs da liberao de acetilcolina (ACh) pelas terminaes nervosas vagais. No corao, as terminaes do nervo vago encontram-se principalmente no nodo sino-atrial, mas os trios e ventrculos tambm recebem sua inervao. A ACh reduz a freqncia cardaca (FC) e a fora de contrao atravs da ativao de receptores muscarnicos. Esses receptores possuem cinco subtipos, sendo o muscarnico do tipo 2 (M2) mais expresso no tecido cardaco e responsvel pela resposta observada na ativao parassimptica. O receptor M2 tambm um receptor acoplado protena G, no entanto isoforma Gi ou inibitria. Ao ser ativado, o receptor dissocia a sua unidade e esta inibe a adenilato ciclase, reduzindo o efeito da estimulao adrenrgica. Alm disso, os canais de potssio dependentes de ACh (KACh) e de ATP (KATP) so estimulados por Gi e esse efeito gera uma reduo da voltagem intracelular, diminuindo a freqncia

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de despolarizaes e logo a FC. Segundo Braunwald e outros (2001), os receptores M2 ainda estimulam a produo de GMPc no tecido cardaco, possuindo certo grau de efeito cronotrpico negativo, e ainda estimulam a liberao de ACh e inibem a liberao de norepinefrina dos terminais parassimpticos e simpticos, respectivamente. Dessa forma, M2 possui um duplo mecanismo de ao em resposta a estimulao do nervo vago. Existem outras substncias endgenas produzidas tanto localmente quanto sistemicamente que possuem ao no tecido cardaco e podem de certa forma modular a contrao. A adenosina sintetizada a partir do metabolismo da molcula de ATP que promove principalmente uma resposta cardioinotrpica negativa (ASAKURA et al., 2007). Segundo Headrick e Laslie (2009), adenosina estimula da protena Gi acoplada ao seu receptor do subtipo I (A(1)), expresso no msculo cardaco e ainda o subtipo A(2), presente principalmente nos vasos sanguneos, gerando um efeito vasodilatador. Ambas as respostas permitem elevao do suprimento de O2 para o msculo cardaco, sendo, portanto, a estimulao da sntese de adenosina um mecanismo cardioprotetor importante durante eventos isqumicos (HEADRICK E LASLIE, 2009). A bradicinina e os opiides possuem efeito semelhante ao da adenosina podendo apresentar alguma funo cardioprotetora (KATZ, 2001, p. 292). O xido ntrico (NO) tambm possui papel modulador principalmente do cronotropismo cardaco. O NO produzido em diferentes tecidos do organismo responsvel pela reduo do ritmo de despolarizao das clulas cardacas atravs da ativao da guanilato ciclase tanto nas clulas do corao quanto nos nervos vagos. Nesse ltimo o NO aumenta a liberao de ACh intensificando o efeito do sistema parassimptico. No tecido cardaco, NO principalmente produzido em situaes de choque cardiognico e sptico atravs da isoenzima NO sintase induzvel (iNOS), tornando-se um grande aliado para proteo contra doenas coronarianas devido a seu papel na reduo da demanda e aumento do suprimento de O2 para as clulas do corao (Brauwald et al., 2001). Os efeitos moduladores do sistema nervoso autnomo, bem como o de hormnios e de fatores locais necessitam de regulao para que sejam cessados. No caso dos nucleotdeos cclicos, esse efeito obtido atravs da ao de fosfodiesterases (PDE) que so responsveis pela clivagem dos

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mesmos e inibio de suas respostas, como por exemplo, a reduo da resposta contrtil cardaca, quando essa PDE clivar o AMPc. Existem diferentes isoformas de PDE com afinidade por um nucleotdeo especfico. No tecido cardaco a isoforma predominante a PDE3 (BERS, 2002), mas a PDE1 e a PDE7 tambm so expressas (DAS et al., 2005). As PDE tambm so alvo de modulao farmacolgica, e assim como outras enzimas e receptores podem servir de alvos teraputicos para o tratamento de doenas cardiovasculares. A inibio de PDE3 aumenta a atividade contrtil das clulas cardacas, j que essa enzima seletiva ao AMPc, portanto um inibidor dessa enzima, como a milrinona, promove um efeito cardiotnico similar quele observado durante a estimulao simptica.

1.1.5 Insuficincia cardaca 1.1.5.1 Definio e classificao da insuficincia cardaca

A maioria das doenas do sistema cardiovascular evoluem para o desenvolvimento da IC. Trata-se de uma sndrome complexa de causas multifatoriais, que apresenta uma variedade de sintomas, reduzem a qualidade de vida de um indivduo e podem muitas vezes levar ao bito. Por se estabelecer no estgio final de vrias doenas cardiovasculares, e pela caracterstica de desenvolvimento lento e progressivo, a IC apresenta maior prevalncia e incidncia na populao de idade mais avanada. Segundo Fukuta e Little (2008), a IC pode ser designada como a condio onde o corao de um indivduo no consegue manter o dbito cardaco suficiente para suprir as demandas exigidas pelo organismo, ou fazlo s custas de grandes presses de enchimento. Assim, muitas vezes o ndivduo desenvolve a doena sem necessariamente apresentar reduo da frao de ejeo. Alguns tipos de condies, como por exemplo, a hipertenso arterial e a estenose da vvula artica levam ao desenvolvimento de um fentipo da doena onde o sistema cardiovascular encontra-se extremamente sobrecarregado, mas no apresenta queda no suprimento de sangue (FUKUTA; LITTLE, 2008). No entanto, mesmo sob essas condies se a doena no for tratada e controlada com eficincia pode evoluir at o estgio

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onde o corao no suporta a demanda exigida, levando queda do dbito cardaco. A New York Heart Association (NYHA) classifica a IC em quatro classes funcionais (Tabela 1): a primeira ou classe I aquela que engloba os indivduos que vivem sob influncia dos fatores de risco mesmo sem apresentar qualquer sintoma ou alterao da funo cardaca; a segunda ou classe II aquela em que os indviduos apresentam alteraes morfolgicas e/ou hemodinmicas e ainda dispnia durante a atividade fsica; a terceira ou classe III se caracteriza pelo desenvolvimento dos sintomas anteriores e ainda pela reduo da capacidade de realizar atividades fsicas rotineiras; e por fim, a ltima a fase ou classe IV aquela na qual as alteraes da funo cardaca encontram-se bastante avanadas e os indivduos apresentam os sintomas de dispnia, fadiga e palpitao durante o repouso.
Tabela 1. Classificao funcional da insuficincia cardaca (NYHA)

Classes Funcionais I II

Pacientes - Assintomticos em suas atividades fsicas habituais. Assintomticos em repouso. Sintomas so desencadeados pela atividade fsica habitual. Assintomticos em repouso. Atividade menor que a habitual causa sintomas. - Sintomticos (dispnia, palpitaes e fadiga), ocorrendo s menores atividades fsicas e mesmo em repouso.

III

IV

NYHA: New York Heart Association. Modificado de Braunwald e outros, 2001.

Entretanto, a IC recebe vrios outros tipos de designaes para diferir a gnese da doena, o funcionamento da atividade contrtil cardaca, a fase da doena e as modificaes estruturais presentes no tecido. Os termos mais comuns usados para diferir os estgios da IC so eles: agudo e crnico (MA et al., 2010). Utiliza-se a classificao de IC antergrada e retrgrada para diferir a evoluo dos sintomas, por exemplo, quando a IC decorrente de uma sobrecarga de volume, causando congesto pulmonar ou sobrecarga pressrica, levando reduo do dbito cardaco e ativao do SRAA. Atualmente essa classificao vlida apenas para distino dos sintomas e

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pode ser usada como guia de tratamento, pois na verdade a IC danifica todo sistema cardiovascular, promovendo em estgio avanado ambos os sintomas includos nas classificaes antergrada e retrgrada (corao, artrias e veias) (KATZ, 2001, p. 660). A IC antergrada se caracterizaria pelo aumento da ps-carga que induz a hipertrofia cardaca concntrica (deposio das protenas em paralelo) e ativao o sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAA), j a retrgrada se caracterizaria por aumento do estresse da parede, aumento da presso de enchimento e hipertrofia dilatada (deposio das protenas em srie). Outra forma de classificao usada IC de baixo ou alto dbito, que especifica se a doena gera queda do dbito cardaco ou manuteno/aumento do mesmo (MEHTA; DUBREY, 2009). Ainda so usados os termos IC direita e esquerda para designar o ventrculo acometido (KATZ, 2001, p. 663; HONG et al., 2010) e, por ltimo, para distinguir algumas modificaes da arquitetura tecidual e da funcionalidade cardaca aplicam-se os termos IC diastlica e sistlica. Suas caractersticas se encontram na Tabela 2 (FUKUTA; LITTLE, 2008).
Tabela 2. Classificao baseada nas mudanas estruturais da insuficincia cardaca

Classificao IC sistlica

Caractersticas (1) Dilatao ventricular; (2) Hipertrofia excntrica; (3) Funo diastlica e sistlica comprometidas (1) Manuteno ou reduo do dimetro ventricular; (2) Hipertrofia concntrica; (3) Funo diastlica comprometida e frao de ejeo normal

IC diastlica

IC: Insuficincia cardaca. Adaptado de Fukuta e Little, 2008.

Essas diferentes classificaes demonstram a complexidade da doena e a dificuldade de entendimento dos mecanismos envolvidos na sua gnese. Dentre as causas mais comuns da IC esto: o IM, a insuficincia valvar, a hipertenso arterial, a estenose artica, a cardiomiopatia hipertrfica, a hipertenso pulmonar e o diabetes mellitus. No caso do IM, ocorrem mudanas especficas tanto na estrutura tecidual, quanto nos parmetros hemodinmicos, levando a queda do dbito sistlico. No modelo experimental de ocluso da ACDA de roedores, as modificaes teciduais comeam a aparecer logo aps a leso e a necrose celular. O extravasamento do contedo intracelular recruta

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clulas do sistema imunolgico que induz a sntese de tecido cicatricial no local do infarto (WEBER, 2004). Em humanos, a expanso da rea de IM ocorre em mdia at duas semanas aps a ocluso da coronria e a alterao da parede ventricular se prolonga durante um maior tempo e se estabiliza apenas aps quatro semanas (SAKAI et al., 2000). A perda de massa muscular reduz de maneira absoluta a gerao de presso sistlica e impe uma elevada carga pressrica na parede ventricular, que aliada ativao de mediadores locais e centrais induz a hipertrofia das clulas cardacas no infartadas. A hipertrofia cardaca um mecanismo compensatrio, que tem como objetivo principal restabelecer a frao de ejeo que se encontra comprometida aps o IM. Esse processo pode ser evidenciado a partir da terceira ou quarta semana do mesmo (MACKIEWICZ et al., 2009). No entanto, a perda global de tecido cardaco aliada ao aumento da resistncia vascular perifrica induz a queda da funo sistlica e do dbito cardaco logo aps a primeira semana de IM (MACKIEWICZ et al., 2009). Segundo Mackiewicz e outros (2009), essa perda no consegue ser compensada pelo aumento da fora contrtil individual das clulas promovida pela ativao do sistema simptico ou pela hipertrofia quando o IM extenso.

1.1.5.2 Mecanismos envolvidos no desenvolvimento da insuficincia cardaca decorrente do infarto do miocrdio

O IM uma condio onde ocorre necrose das clulas cardacas devido reduo do seu aporte de O2 e nutrientes para gerar energia. O tecido cardaco altamente dependente do metabolismo oxidativo (principalmente da oxidao de lipdios) para a sntese de ATP e com isso sua funo bastante sensvel concentrao desse gs no sangue arteriolar (BROOKS; FAHEY. BALDWIN, 2005). Quando o aumento da demanda devido elevao do trabalho cardaco no suprida pelo aporte de O2 necessrio, os cardiomicitos acumulam metablitos e o pH intracelular aumenta. Se esta situao se estende por perodo prolongado, as clulas acabam morrendo por falta de O2. As causas mais freqentes envolvidas com os eventos isqumicos so algumas doenas vasculares como: a ateroesclorese que reduz a luz das artrias coronrias, causando o seu entupimento.

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A primeira conseqncia da morte celular a reduo do dbito cardaco devido perda da massa contrtil e s arritmias geradas em conseqncia do desequilbrio qumico e eltrico gerados aps a lise dos cardiomicitos. Esta condio pode levar a morte do indivduo, dependendo da extenso da leso que normalmente irreversvel, com consequente reduo da quantidade total de clulas cardacas. Inmeros estudos relacionam a extenso do IM com a funo sistlica e diastlica apresentada pelos pacientes e por animais submetidos ao IM em condies experimentais (PFEFFER et al., 1979, RAYA et al., 1988, MINICUCCI et al., 2010). Essa extenso tambm possui relao com o prognstico da doena e com a taxa de mortalidade (MIURA; MIKI, 2008). Quando o IM no leva ao bito, algumas reaes orgnicas compensatrias so ativadas para que ocorra a manuteno do funcionamento de rgos vitais como o crebro, o pulmo e tambm o prprio corao. Essas alteraes imediatas normalmente restabelecem a queda do dbito e a presso arterial induzidos por morte celular significativa e, portanto, so consideradas como benficas. Essas alteraes so mantidas ao longo prazo, mas ao contrrio da fase aguda, em sua fase crnica essas mudanas promovem adaptaes que geram maior sobrecarga no sistema cardiovascular. A intensificao da sobrecarga no sistema, por sua vez, mantm a ativao dos mecanismos compensatrios que levam queda progressiva da eficincia do bombeamento de sangue pelo corao (PFEFFER et al., 1979; MACKIEWICZ et al., 2009). Esse ciclo contnuo progride durante o desenvolvimento da doena at causar danos irreversveis funo cardaca. A primeira resposta reduo do dbito sistlico proveniente de uma caracterstica intrnseca do tecido cardaco conhecida como lei de FrankStarling (BRAUNWALD et al., 2001). . Essa lei descreve a relao entre o desenvolvimento de presso sistlica e a pr-carga ou volume diastlico final, e estabelece que at certo ponto de estiramento, as clulas cardacas so capazes de gerar maior fora contrtil, aps esse ponto essa habilidade reduz com o aumento progressivo do volume ventricular (Figura 11).

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Presso

Volume
Figura 11. Curva presso x volume do ventrculo esquerdo, demonstrando o aumento do desempenho cardaco promovido pela elevao volume intraventricular at certo ponto e queda do desempenho posteriormente (Mecanismo de Frank-Starling). Adaptado de Katz, 2001.

Portanto, a reduo repentina da fora contrtil gerada pela necrose celular reduz imediatamente o volume sistlico final de uma contrao, aumentando com isso o volume diastlico final do ciclo cardaco seguinte. Esse aumento estira as clulas cardacas que permaneceram em perfeito estado e levam as mesmas a gerar mais fora durante a contrao. O aumento da fora em funo volume visto no mecanismo de Frank-Starling explicado pela elevao da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ provocada pelo estiramento das clulas cardacas (BRAUNWALD et al., 2001). . O mecanismo de Frank-Starling, porm, no suficiente para manuteno da perfuso sanguinea adequada dos rgos. Outros mecanismos so ativados para auxiliar nessa funo. O sistema nervoso simptico responde rapidamente queda de presso, promovendo o aumento da fora contrtil cardaca, permitindo que o ventrculo relaxe mais rapidamente e elevando o seu enchimento. Os nervos simpticos ps-ganglionares responsveis pela regulao do fluxo sanguineo da pele e das extremidades induzem vasoconstrico, direcionando o fluxo sanguineo para reas vitais (PINA et al., 2003). Sua ao ainda promove venoconstrico, gerando um maior retorno venoso e aumento da presso de enchimento (KATZ, 2001, p. 667; PINA et al., 2003). Todos esses fatores juntos induzem a melhora da capacidade de bombeamento sanguineo pelo corao e promove os ajustes dos distrbios

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hemodinmicos causados pelo IM. Esses efeitos so basicamente obtidos atravs da ativao dos mecanismos de transduo envolvendo segundos mensageiros, como o AMPc , Ca2+, as PK que promovem a fosforilao das protenas SERCA, RyR2, os canais de Ca2+ tipo-L, entre outras. Mecanismos humorais tambm so ativados na tentativa de compensar os distrbios hemodinmicos causados pelo IM. A liberao de renina pelo crtex adrenal e a ativao do sistema RAA permite a reteno hdrica e de Na+, elevando a volemia e presso arterial (CHIONG; CHEUNG, 2010). Alm disso, o efeito vasoconstrictor da angiotensina II auxilia o sistema nervoso simptico na elevao da presso de enchimento. A ativao do eixo RAA se d tanto pela reduo do fluxo renal decorrente da queda do dbito cardaco, quanto pela ativao simptica diretamente no crtex adrenal. J a liberao de epinefrina pela medula adrenal induz o inotropismo positivo (GUYTON; HALL, 2006, p.101). Todos esses efeitos agudos em conjunto reduzem os malefcios causados pela necrose das clulas e mantm a perfuso e o funcionamento de rgos vitais como o crebro, corao, pulmo. Como o efeito da perda das clulas cardacas aps o IM irreversvel e hiperplasia celular j no ocorre nesse estgio (KATZ, 2001, p. 313), os mecanismos compensatrios relatados acima permanecem sendo ativados na tentativa de manter os efeitos benficos causados na fase aguda. Entretanto, a manuteno da ativao desses processos leva a adaptaes que induzem cada vez mais queda da capacidade contrtil e sobrecarga progressiva do sistema cardiovascular. A ativao crnica dos receptores adrenrgicos atravs do sistema nervoso autnomo e da ao hormonal influencia no s a atividade das protenas celulares envolvidas no processo de contrao e relaxamento celular, mas tambm a sua expresso atravs da modulao das vias de sinalizao responsveis pela sua regulao. Alm da quantidade de protenas expressas, a qualidade tambm alterada, a modificao da isoforma das protenas permite a alterao do funcionamento das atividades enzimticas intracelulares (SWYNGHEDAUW, 1999). Essas mudanas podem entre outros fatores serem causadas pela ao da angiotensina II sintetizada localmente nos

cardiomicitos, ou a partir da ativao do sistema RAA (ZHANG et al., 2010). Outro fator indutor da sntese protica importante a ativao do sistema

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imunolgico. A necrose e a liberao do contedo citoplasmtico no meio extracelular levam a ativao do sistema imune. O recrutamento de clulas imunolgicas constituintes desse sistema vai promover liberao de fatores inflamatrios como citocinas, que modificaro a expresso protica das clulas e principalmente levaro a formao de colgeno e desenvolvimento de tecido fibroso (cicatricial) no local do IM (BOLGER et al., 2002; ANKER; VON HAEHLING, 2004). As citocinas e fatores de crescimento comumente mais envolvidos na transcrio gnica so: fator de necrose tumoral alfa (TNF-), fator de transformao de crescimento (TGF-1), fator de crescimento do endotlio vascular (VEFG), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10) (ONO et al., 1998). Outro mediador responsvel pelas mudanas no padro de expresso protica o Ca2+, que alm de estar em altas concentraes nas clulas adjacentes ao IM liberado em grande quantidade durante a lise celular. Alm de participar da regulao da expresso protica, a liberao de macia de Ca2+ pode gerar cardiotoxicidade, induzindo a ativao de apoptose celular e ainda causar arritmias cardacas fatais (MACGOWAN, 2009). Essas mudanas no padro da expresso de protenas tanto intracelulares quanto extracelulares induzem o processo de remodelamento cardaco, onde ocorrem a hipertrofia dos cardiomicitos remanescentes, o desenvolvimento de fibrose intersticial e a reorganizao estrutural do tecido cardaco (SWYNGHEDAUW, 1999). O remodelamento cardaco ocorre tambm pela ativao de protenas estruturais presentes no interior da clula que fazem parte do seu esqueleto e que mantm conexes com outras protenas extracelulares, permitindo a ativao de vias que regulam a expresso protica de toda uma regio tecidual. Dentre algumas dessas protenas esto as caderinas, integrinas, titinas, e as molculas de adeso que agem em conjunto com as primeiras, induzindo a transduo dos sinais (KATZ, 2001, p. 337). O remodelamento cardaco no IM promove a hipertrofia muscular em srie (os sarcmeros sendo depositados longitudinalmente), gerando um alongamento das fibras cardacas (FUKUTA; LITTLE, 2008). Esse alongamento produz um aumento exacerbado do dimetro do ventrculo esquerdo e afinamento de sua parede, o que produz um maior estresse sobre a sua superfcie (estresse da parede), segundo a lei de LaPlace. A lei de LaPlace que indica que o estresse da parede diretamente proporcional ao raio do

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ventrculo e inversamente proporcional a espessura do mesmo (KATZ, 2001, p. 401). Portanto, o aumento do estresse eleva a presso ventricular diastlica final, dificultando o enchimento do ventrculo e aumentando ainda mais os sinais induzidos pela deformao das clulas cardacas. Alm disso, aumenta o consumo energtico e o requerimento de O2, podendo gerar novos eventos isqumicos. Esse tipo de hipertrofia denominada dilatada, difere da hipertrofia fisiolgica gerada pelo exerccio, pelo desenvolvimento do estreitamento da parede e a presena de tecido fibroso que contribui para a reduo da elasticidade do corao, o relaxamento e o enchimento ventricular (KATZ, 2001, p.677). A hipertrofia fisiolgica no induz apoptose celular e muito menos sobrecarrega o sistema cardiovascular. O remodelamento pode tambm causar danos no processo de acoplamento excitao-contrao. A formao do tecido fibroso, bem como, a modificao das protenas do citoesqueleto e a ruptura tecidual decorrente do remodelamento promovem o desacoplamento do processo excitao-contrao atravs da modificao da estrutura dos microdomnios na regio onde se encontram as dades. Isso altera o posicionamento e alinhamento de estruturas proticas envolvidas no processo contrtil que, por sua vez, so essenciais para eficincia desse processo (SCHAPER et al., 1991; SONG et al., 2006). Alm do dano na arquitetura tecidual, ocorrem mudanas na expresso e no funcionamento dessas protenas. Uma das primeiras modificaes em curso temporal que podem ser observadas a reduo da expresso de SERCA (MACKIEWICZ et al., 2009). Yamaguchi e outros (1997) utilizaram fibras desnudas de ratos submetidos a oito semanas de IM e observaram reduo da tenso isomtrica gerada por uma concentrao fixa de Ca2+ em diferentes tempos de carregamento, sugerindo que este processo encontra-se ineficiente aps o IM. Mackiewicz e outros (2009), demonstraram que a partir de quatro semanas de IM os animais j apresentavam reduo da expresso de SERCA e da captao de Ca2+. Outros estudos realizados em fraes microssomais de RS demonstraram a mesma reposta (AFZAL; DHALLA, 1992; HOLT et al., 1998; NEARY et al., 2002; SHAO et al., 2005; MACKIEWICZ et al., 2009). A reduo da capacidade de captao de Ca2+ pelo RS retarda o tempo de relaxamento (lusitropismo negativo) e contribui ainda mais para reduo do enchimento ventricular e aumento da presso diastlica final. Esse um

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distrbio

hemodinmico

progressivo

que

agrava

os

sintomas

da

IC

(FERREIRA-MARTINS; LEITE-MOREIRA, 2010). A expresso da bomba de Ca2+ de membrana PMCA tambm reduzida aps o IM no modelo de ocluso da ACDA (MACKIEWICZ et al., 2009). A diminuio da captao de Ca2+ pelo RS e da extruso desse on pela PMCA, eleva a sua concentrao intracelular e intensifica o funcionamento do NCX (LEHNART; MAIER, 2009). O aumento da concentrao de Ca2+ intracelular ainda promove a ativao da enzima Ca2+- calmodulina cinase do tipo II (CAMkinase II). A CAMkinase II e a ativao -adrenrgica promovem a hiperfosforilao de protenas envolvidas no processo de contrao (CURRAN et al., 2007). Segundo Wu e outros (2004), os canais de CA2+tipo-L se encontram fosforilados nos tecidos cardacos de pacientes transplantados e essa hiperfosforilao aumenta a probabilidade de abertura do canal, tornando mais eficiente o mecanismo de Ca2+ induz a liberao de Ca2+. Outra protena de extrema importncia para o processo contrtil e que se encontra hiperfosforilada em vrios modelos de IC a RyR2 (BLAYNEY; LAI, 2009). A hiperfosforilao de RyR2 resulta em uma mudana do estado de ativao do receptor que permite o vazamento de Ca2+ durante a distole. Alm de contribuir para o a reduo do lusitropismo cardaco, o aumento de sua concentrao intracelular pode induzir taquiarritmias severas, causando muitas vezes morte sbita (BLAYNEY; LAI, 2009). Essas modificaes aliadas ao aumento da funo, bem como, da expresso do NCX reduz os estoques globais de Ca2+, contribuindo ainda mais para a reduo da fora contrtil. Segundo Pieske e outros (1995), a queda da funo contrtil est relacionada com a variao global da concentrao de Ca2+ (transiente de Ca2+), portanto, quanto menor for o transiente de Ca2+ da clula menor ser a reserva desse on para ativao da contrao muscular. O resultado final dessas alteraes so a perda da eficincia contrtil da clula e ainda sobrecarga do msculo cardaco, as quais resultam em um acometimento progressivo da doena. Alteraes nas protenas contrteis tambm so observadas em vrios modelos de IC (BODOR et al., 1997; LI et al., 1997; LAM et al., 2010). Walker e outros (2009) demonstraram que MLC2, MyBP-C e troponina I esto hipofosforiladas logo aps da induo do IM (dois dias) e que essa reduo parece ocorrer na tentativa de aumentar a sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ e, portanto, de restabelecer a frao de ejeo.

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Eles ainda observaram que aps dois meses de IM a troponina I encontra-se hiperfosforilada, sugerindo que a hipofosforilao observada na fase aguda pode decorrer de uma tentativa rpida para o ajuste da frao de ejeo. De fato, Jideama e outros (2006), demonstraram que a hipofosforilao de troponina I aumenta a sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+, podendo ento aumentar a gerao de fora da clula. Outros fatores decorrentes do IM so de grande importncia para o desenvolvimento da sndrome da IC. O desacoplamento energtico e distrbios na funo metablica das clulas cardacas observados aps o evento isqumico induz a sntese de espcies reativas de O2. Essas, por sua vez, promovem a nitrosilao de diversas protenas, causando distrbios em sua funo e levando a apoptose celular (FRANGOGIANNIS et al., 2002). Alm da expresso protica do tecido cardaco e da matriz celular, as citocinas liberadas sistemicamente por clulas imunolgicas, as sintetizadas pelas clulas recrutadas, e aquelas produzidas pelo prprio tecido cardaco (FRANGOGIANNIS et al., 2002) induzem, a ruptura das clulas cardacas atravs da estimulao de metaloproteinases que so responsveis pela degradao da matriz celular, desorganizando ainda mais a arquitetura celular cardaca (GALLAGHER et al., 2006). O remodelamento ainda envolve a reativao do programa de genes fetais que entre outros fatores causam a expresso da isoforma da cadeia pesada da miosina que apresenta a atividade ATPsica mais lenta. No tecido cardaco humano essa a isoforma predominante, portanto a modificao do padro da expresso protica no altera a funo contrtil das clulas. No entanto, no corao de roedores a isoforma predominante a , que possui atividade ATPsica rpida. Apesar da alterao das cadeias pesadas sugerir a ocorrncia de uma reduo da contratilidade do msculo cardaco de ratos, no se sabe ao certo o quanto a reprogramao dos genes fetais pode interferir na velocidade mxima da ATPase da miosina e, portanto, na atividade contrtil do corao desses animais. Por ltimo, outra alterao importante na expresso protica ocorrida aps o IM o aumento da sntese de peptdeos natriurticos atriais (PNA). Acredita-se que a liberao de PNA pelas clulas atriais pode ser atribuda a tentativa de proteger as clulas cardacas aps o IM, j que esses peptdeos

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promovem o relaxamento da clula cardaca e das artrias, evitando o aumento da extenso da rea de IM (KISHIMOTO et al., 2009). A concentrao srica dos PNA correlacionada com a extenso da leso causada por isquemia, e por isso, atualmente os nveis sricos desses peptdeos vm sendo usados como marcadores do IM (ASAKURA et al., 2004). No entanto, o exato propsito do aumento da sntese de PNA ps IM ainda precisa ser completamente elucidado.

1.2 TRATAMENTO FARMACOLGICO DA INSUFICINCIA CARDACA

Por se tratar de uma doena multifatorial que acomete diferentes rgos do corpo progressivamente, a abordagem teraputica da IC bem ampla, sendo tratamento feito simultaneamente com diferentes frmacos. As associaes utilizadas, bem como, a escolha do tipo de frmaco variam com o diagnstico, com o estgio no qual a doena se apresenta e o seu prognstico. As principais substncias usadas no tratamento da IC so: diurticos de ala e tiazdicos, nitrovasodilatadores, hidralazina, antagonistas dos receptores de aldosterona, betabloqueadores, inibidores da enzima conversora de

angiotensina (ECA), antagonistas dos receptores de angiotensina, agonistas adrenrgicos, glicosdeos cardacos, inibidores de fosfodiesterases entre outros (GILMAN et al., 2005). Dependendo do estgio no qual o paciente se encontra os objetivos principais do tratamento so diferentes. Assim, com os pacientes da classe I, os principais objetivos so prevenir ou reverter a progresso do remodelamento e dos sintomas. Com os pacientes da classe II alm desse objetivo, visa-se melhorar a capacidade funcional, contra as hospitalizaes, incapacidades e a mortalidade. Na classe III e na classe IV os objetivos so os mesmos com a principal preocupao da reduo da mortalidade dos pacientes (BRAUNWALD et al., 2001). Na classe I, a tentativa de reduzir o remodelamento se alcana atravs da reduo dos fatores precursores da IC, como por exemplo, o tratamento da angina pectoris, hipertenso arterial, diabetes mellitus, etc. Tais efeitos so obtidos com o uso dos inibidores de ECA e betabloqueadores principalmente

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(BRAUNWALD et al., 2001). . No entanto, alguns trabalhos vm investigando a utilizao dos bloqueadores do receptor de aldosterona, no qual seu representante principal a espirolactona, e tem encontrado bons resultados no que diz respeito reduo da fibrose e hipertrofia (BING, 2001). Os diurticos tambm so eficazes na reduo da hipertenso arterial, podendo reduzir o fator precipitante da IC. No estgio II, os inibidores da ECA e os betabloqueadores so os frmacos mais utilizados na tentativa de reduzir a mortalidade. Alguns antagonistas do receptor de angiotensina como valsartano promoveram o aumento da mortalidade quando aliado administrao dos inibidores da ECA e os betabloqueadores. Esse efeito no foi observado com o uso do candesartano (BRAUNWALD et al., 2001). Esses resultados salientam a peculiaridade de cada frmaco integrante das classes e demonstraram que esses podem apresentar respostas teraputicas diferentes, reafirmando a complexidade da sndrome da IC e do seu tratamento. Esses dados tambm chamam a ateno no cuidado que se deve ter ao associar frmacos no esquema teraputico. Alguns frmacos inotrpicos positivos como a digoxina so eficazes em aumentar a capacidade funcional do paciente e podem ser utilizadas durante esse estgio. Porm, ao mesmo tempo, aumentam o risco de ocorrncia de arritmias taquiventriculares, requerendo maiores cuidados na sua administrao (GILMAN et al., 2005). Os diurticos e a restrio da ingesto de sdio tambm so bastante eficazes nesses casos. No caso, os antagonistas do receptor de aldosterona agem, evitando a hipopotassemia que poderia agravar o quadro da IC, e ainda reduzem a formao de fibrose cardaca. Nos pacientes da classe III o ndice de internaes, bem como, a mortalidade se acentuam drasticamente, e o tratamento visa principalmente reduzir esses ndices. Nesse caso, os diferentes inibidores do sistema RAA se mostraram bem mais eficazes que os bloqueadores -adrenrgicos. A associao de um diurtico tiazdico com um poupador de potssio tambm muitas vezes utilizada para controle da reteno hdrica (KALRA et al., 2010). A utilizao da hidralazina (vasodilatador arterial), associada ao dinitrato de isossorbida (nitrovasodilatador no-seletivo) parece ser benfica, permitindo a reduo da mortalidade.

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Por ltimo, os pacientes do estgio IV possuem a funo contrtil bastante comprometida, assim a reduo do avano do remodelamento j mais difcil. Portanto, a utilizao dos bloqueadores -adrenrgicos j no quase mais necessria, porm, os inibidores do sistema RAA ainda apresentam alguma eficcia embora ainda que reduzida. Os tratamentos farmacolgicos nesse caso so apenas paliativos e visam resguardar a funo contrtil cardaca do paciente at que haja a possibilidade da realizao do transplante cardaco. Nesse sentido, os cardiotnicos administrados que vm demonstrando bons resultados so a dobutamina (agonista -adrenrgico), dopamina (agonista dopaminrgico), milrinona, enoximona (inibidores de PDE3), e o levosimendan que considerado tanto um sensibilizador de Ca2+ quanto um fraco inibidor de PDE3 (BRAUNWALD et al., 2001; GILMAN et al., 2005). Alguns frmacos auxiliares tambm podem ser utilizados na tentativa de reduzir sintomas importantes decorrentes da IC. As arritmias podem ser tratadas com alguns bloqueadores de canais de Ca2+, a amiodarona (bloqueador dos canais de K+ voltagem-dependentes) e o sotalol (antagonista -adrenrgico), (MANSON, 1993; DOVAL et al., 1994). Outro sintoma importante a ser tratado a tromboembolia, sendo nesse caso a varfarina, um anticoagulante oral, o frmaco de escolha porque reduz significativamente o risco de tromboembolias. Portanto, a varfarina um coadjuvante importante, principalmente na IC decorrente de cardiomiopatias no isqumicas. Alguns alvos farmacolgicos importantes para o desenvolvimento da IC vm sendo investigados em animais experimentais. Os antagonistas dos canais de Ca2+, so um exemplo. Sandmann e outros (2001), observaram que verapamil, amlodipina e mibefradil reduziram o desenvolvimento do

remodelamento cardaco no mesmo modelo de IM com ocluso ACDA. Outro exemplo pode ser observado com agonistas dos receptores A(2), usando o mesmo modelo de IM. Segundo Nekooeian e Trabrizchi (1998), a administrao aguda de CGS 21680 (agonista A(2A)) reduziu a progresso dos efeitos deletrios hemodinmicos em ratos desenvolvidos oito semanas aps o IM. Esses estudos confirmam a preocupao de pesquisadores com a busca de novos alvos teraputicos que possam servir como alternativa para o tratamento da IC.

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1.3 ATIVIDADES FARMACOLGICAS E MECANISMO DE AO DE 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2-TIENILHIDRAZONA (LASSBio-294)

A molcula 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona designada como LASSBio-294 (Figura 12) foi desenvolvida pelo Laboratrio de Sntese de Substncias Bioativas (LASSBio) da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, a partir de um esforo inicial para se obter novas substncias cardioativas que pudessem ser utilizadas no tratamento da insuficincia cardaca.

Benzodioxol (Safrol)
O O O N H N

Tiofenol

N-acilidrazona
Figura 12. Representao estrutural do LASSBio-294. Retirado de Barreiro, 2002.

Atravs de estratgias de simplificao molecular, obtiveram-se compostos com a subunidade N-acilidraznica em suas estruturas, dentre elas o LASSBio-294. A utilizao dessa subunidade (N-acilidrazona) na estrutura das molculas se deveu ao fato desta ser muito similar a estrutura dos frmacos inibidores de PDE3 (BARREIRO, 2002). LASSBio-294 tem como base a estrutura benzodioxola proveniente do safrol, componente qumico do leo de Sassafrs, e a presena do substituinte 2-tiofnico na insaturao imnica da funo N-acilidrazona, caractersticas que conferiram a substncia algumas propriedades bioativas especficas e importantes. Silva e outros (2002), descreveram ao vasodilatadora dependente do endotlio em anis de aorta. J Sudo e outros (2001), demonstraram que essa substncia

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apresenta atividade inotrpica positiva decorrente de um mecanismo diferente do apresentado pelos digitlicos. Utilizando o modelo de fibras quimicamente desnudas, eles observaram que LASSBio-294 aumentava a fora isomtrica das fibras cardacas atravs da elevao da captao de Ca2+ pelo RS, o que em tese seria uma grande vantagem para o tratamento da IC, pois promoveria o aumento do inotropismo positivo e melhoraria da funo diastlica cardaca. Tal mecanismo, at aquele momento, no havia sido descrito ainda para nenhuma substncia que apresentasse atividade inotrpica positiva. Essa caracterstica peculiar gerou o depsito de uma patente na USA Patent (SUDO et al. No 7,091,238) na data 15 de agosto de 2006. A investigao toxicolgica de LASSBio-294 ratificou a segurana da substncia, no demonstrando

alteraes significativas promovidas pela mesma em doses bem a cima da dose teraputica (SUDO et al., USA Patent, No 7,091,238, 2006). Tal fato conferiu mais uma vantagem ao LASSBio-294 perante os outros inotrpicos positivos no tratamento da IC, j que os que so usados na clnica, apresentam baixa eficcia, ou possuem uma janela teraputica muito estreita, como o caso dos digitlicos (GILMAN et al., 2005). Mais recentemente, um estudo encomendado ao CEREP pelo LASSBio promoveu a investigao dos possveis alvos farmacolgicos do LASSBio-294 (TANG, 2008). A substncia apresentou ligao em torno de 57% ao receptor A(2A) que acoplado a protena Gs e, portanto, ativa a sntese de AMPc. Em tese agonistas desses receptores poderiam modular todos os mecanismos regulados pela molcula de AMPc, que em um estgio avanado da IC tem sua sntese reduzida devido a downregulation dos receptores -adrenrgicos, e com isso trazerem benefcios teraputicos. Estudos da literatura demonstraram que a ativao dos receptores A(2A) induzia a reduo de diversos sintomas da IC em diferentes modelos da doena (HORI; KITAKAZE, 1991; KITAKAZE, et al., 1993). Segundo Asakura e outros (2007), a ativao desses receptores diminui o desenvolvimento da fibrose e ainda restaurou a resposta contrtil cardaca induzida por adrenrgicos. Assim, descoberta de que LASSBio-294 possua afinidade de carter agonista por A(2A), solidificou ainda mais hiptese de que a substncia poderia apresentar algum efeito benfico no tratamento da IC decorrente do IM. (ASAKURA et al., 2007).

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Levando em considerao todas essas informaes supracitadas, o presente estudo testou a influncia do tratamento com LASSBio-294 na reduo das complicaes induzidas aps quatro semanas de IM, levantando a hiptese de que a melhora da funo diastlica, promoveria efeito inotrpico positivo e reduziria o remodelamento cardaco, podendo ainda modificar as vias de sinalizao envolvidas com a sntese de protenas controladas por Ca2+ e AMPc. 1.4 OBJETIVOS 1.4.1 Objetivo geral

Avaliar os efeitos teraputicos decorrentes da administrao prolongada por via ip de LASSBio-294 no sistema cardiovascular de ratos submetidos ao IM experimental.

1.4.2 Objetivos especficos

1. Avaliar a hipertrofia cardaca (Avaliao da razo peso do corao/ peso corporal); 2. Quantificar o infiltrado celular e a rea de fibrose do tecido cardaco (Anlise histoqumica); 3. Avaliar os processos de captao e liberao pelo RS e sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ em fibras cardacas quimicamente desnudas (Tcnica de skinned fibers); 4. Quantificar a expresso da protena SERCA2a no tecido cardaco ventricular esquerdo; (Tcnica de western blot) 5. Investigar os parmetros hemodinmicos (Presses arteriais,

ventriculares e taxa de contrao e relaxamento) in vivo.

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2 Materiais e Mtodos

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2.1 ANIMAIS Ratos Wistar machos pesando inicialmente entre 150-200 gramas foram utilizados no presente estudo. Esses animais foram alocados em caixas de acrlico forradas com maravalha e colocadas em ambiente constantemente refrigerado temperatura de 20oC, seguindo um ciclo diurno-noturno de 12/12h. Rao e gua foram oferecidas vontade aos animais. Todos os experimentos seguiram as normas do comit de uso de animais de experimentao da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

2.2 FRMACOS E REAGENTES Para a execuo dos experimentos foram utilizados os seguintes reagentes e solues: A tabela 3 mostra a composio da soluo desprovida de Ca2+ usada para disseco de feixes ventriculares.
Tabela 3. Composio da soluo Ca experimentos com fibras desnudas.
2+

(livre de Ca

2+

nominal) usada durante os

Substncia NaCl CaCl2 KCl MgCl2 NaH2PO4 NaHCO3 Glicose

Concentrao (mM) 130,0 1,25 5,0 1,0 0,5 24,0 5,6

As concentraes esto expressas em mM.

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A composio das solues de lavagem (W) e a soluo de relaxamento (R) encontram-se na tabela 4 descrita abaixo.
Tabela 4. Composio da soluo W e R usadas durante os experimentos com fibras desnudas. Substncias Propionato de potssio Acetato de magnsio Potssio EGTA K2NA(2A)TP EGTA Concentrao de W (mM) 185,0 2,5 10,0 5,0 Concentrao de R (mM) 185,0 2,5 10,0 5,0 5,0

As concentraes esto expressas em mM. EGTA = K2-etileno glicol-bis (2-amino-etil-ter)-N, N, N', N'- cido tetraactico. pH = 7.0

As constantes de associao utilizadas para obteno da relao entre K2EGTA/CaK2EGTA e outros ligantes foram as mesmas utilizadas por Orentlicher e outros (1974) e Fabiato, A. e Fabiato, F. (1979). LASSBio-294 foi dissolvido em dimetilsulfxido (DMSO, 100%) com uma concentrao estoque de 50 mM. Saponina, Triton X-100, Tween-20, DMSO e blsamo de entelam foram obtidos da MERCK & Co, Inc. (Whitehouse Station, NJ, USA). Cafena, cido etilenodiaminotetraactico (EDTA), cido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-

etanolsulfnico (HEPES), tris(hidroximetil)-aminometano (Tris), fluoreto de fenilmetilsufonila (PMSF), K2-etileno glicol-bis (2-amino-etil-ter)-N, N, N', N'cido tetraactico (EGTA), sirius red, os anticorpos primrios monoclonais antiSERCA2a, e secundrio anti-mouse conjugado com peroxidase provieram da Sigma Co. (St. Louis, MO, USA). O anticorpo monoclonal anti-gliceraldedo fosfato desidrogenase (GAPDH) foi adquirido na Millipore Co. (Billerica, MA, USA) e o substrato ECL-plus (Enhanced Chemiluminescence) foi obtido da Amersham Biosciences (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ, USA). Os reagentes, cido propinico, cloreto de magnsio, imidazol, xileno, paraformaldedo, cido fosfomolbdico, cido pcrico e cido clordrico foram comprados da VETEC QUMICA FINA LTDA (Duque de Caxias, RJ, BR). O

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sevoflurano e pentobarbital sdico foram gentilmente doados pela Cristlia Produtos Qumicos Farmacuticos Ltda. (So Paulo, SP, BR).

2.3 DESENHO EXPERIMENTAL Os animais foram aleatoriamente divididos em quatro grupos

experimentais: 1. falso-operado tratado com o veculo (FO - DMSO), 2. falsooperado tratado com LASSBio-294 (FO - LASSBio-294), 3. infartado tratado com o veculo (IM - DMSO), 4. Infartado tratado com LASSBio-294 (IM LASSBio-294). LASSBio-294 (2 mg/kg) foi administrado diariamente por via intraperitoneal (ip) com incio no dia da realizao da cirurgia e at quatro semanas depois. Utilizou-se o volume correspondente do veculo para o tratamento dos grupos controles, e semanalmente as doses foram ajustadas de acordo com as mudanas ponderais dos animais. O volume de DMSO (100%) administrado com LASSBio-294 ou puro variou de 50 80 l em todos os animais includos nesse estudo.

2.4 MODELO EXPERIMENTAL DE INFARTO DO MIOCRDIO Os animais foram anestesiados com sevoflurano e a cirurgia experimental do IM realizada em condies asspticas e de forma indolor. Os ratos foram mantidos em decbito dorsal e uma inciso para-esternal esquerda foi feita seguida de disseco dos msculos peitoral maior e menor. Aps a disseco, exteriorizou-se o corao entre o quarto e quinto espaos intercostais atravs de compresso manual do hemitrax direito. A ocluso total da artria coronria descendente anterior foi obtida atravs da sua ligadura com fio de seda (Ethicon, 6.0). Imediatamente aps este procedimento, o corao foi rapidamente recolocado na cavidade torcica e em seguida suturaram-se a pele e os msculos com intuito de fechar a inciso e facilitar a respirao do animal. Aplicou-se ventilao artificial quando necessrio at a recuperao de conscincia completa dos ratos. Os ratos do grupo falso-operados (FO) foram submetidos aos mesmos procedimentos descritos anteriormente, porm no sofreram a ligadura da artria coronria. Aps vinte e quatro horas da cirurgia, confirmou-se o IM atravs da observao da onda Q (> 1mV) no

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eletrocardiograma (derivao I) e quando a mesma no ocorria os ratos eram descartados (YAMAGUCHI et al., 1997).

2.5 AVALIAO DA HIPERTROFIA CARDACA A hipertrofia cardaca foi determinada indiretamente atravs do clculo da relao entre peso do corao e peso corporal dos animais aps as quatro semanas (peso do corao/ peso do animal).

2.6 AVALIAO HISTOQUMICA Aps o sacrifcio dos animais, os coraes foram retirados e colocados sobre placas de ptri para separao dos ventrculos atravs de um corte longitudinal no corao direta do septo ventricular. Apenas o ventrculo esquerdo foi utilizado para o processamento histolgico. O mesmo foi estocado em recipientes contento fixador paraformaldedo a 10% em soluo-tampo fosfato, por um perodo mnimo de sete dias.

2.6.1 Processamento e seco do material Aps a fixao com formaldedo (10%), os tecidos foram desidratados da seguinte forma: exposio sequencial ao etanol , 50%, 70%, 85%, 95%, 100%, 100% durante uma hora cada e em seguida feita a clarificao com xilol I, II, III durante o mesmo tempo cada. Aps a remoo do xilol, os tecidos foram infiltrados trs vezes durante uma hora em parafina lquida aquecida na estufa (Biopar Eletro-eletrnicos Ltda, Porto Alegre, RS) a 56oC para serem, ento includos em blocos de parafina. Os blocos foram seccionados em fatias de quatro a sete micra utilizando micrtomo (Lupe Indstria e Comercio Ltda., Cambuci, SP). As fatias foram colocadas em banho 37oC e em seguida suspensa em lminas de vidro. A retirada da parafina das lminas foi realizada durante duas horas na estufa aquecida e banhadas em xilol para em seguida serem coradas.

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2.6.2 Colorao do material Como os corantes no se misturam com xilol os cortes foram hidratados com concentraes decrescentes de lcool, para s ento serem aplicados os corantes. Em seguida, mais uma desidratao foi realizada para completar o processo. A hematoxilina e eosina so corantes bsicos e cidos, respectivamente, que reagem com estruturas celulares, permitindo a observao de estruturas aninicas como: os ncleos (hematoxilina) e o citoplasma (eosina). Essa colorao demonstra os ncleos das clulas em azul e o citoplasma em rosa, e possibilita uma anlise geral das estruturas teciduais. Nesse estudo usou-se o seguinte protocolo para colorao do tecido cardaco (Tabela 5).
Tabela 5. Colorao do tecido cardaco com hematoxilina e eosina. Reagentes Xilol I, II, III Etanol (100%) + Etanol (100%) Etanol (95%, 85% e 70%) gua corrente Hematoxilina + gua corrente Eosina Etanol (85 %) Etanol (95%) 2 x Etanol (100%) Etanol (100%) Durao 10 minutos cada 2 minutos + 10 minutos 5 minutos cada 5 minutos 20 minutos cada 1 minuto 1 mergulho 3 minutos 10 minutos 15 minutos

Os diferentes reagentes Xilol I,II,II eram compostos iguais e foram assim designados apenas para ratificar a necessidade do uso de recipientes diferentes. O mesmo ocorre quando as mesmas concentraes de etanol so utilizadas seguidamente.

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A colorao picrosirius permitiu a observao do depsito de colgeno (formao de fibrose) em vermelho no tecido cardaco e as clulas musculares cardacas em amarelo. O protocolo utilizado para esta colorao encontra-se descrito na Tabela 6. Aps o processo de colorao, as lminas foram montadas com blsamo de entelam.
Tabela 6. Colorao do tecido cardaco com picrosirius. Reagentes Xilol I, II, III Etanol (100%) + Etanol (100%) Etanol (100%, 95% e 90%) 2x gua cido fosfomolbdico gua Pcrosirius cido clordrico Etanol (70%) Etanol (95%, 100%, 100%) Xilol I, II, III Durao 15 minutos cada 2 minutos + 10 minutos 3 minutos cada 5 e 10 minutos cada 1 minuto 5 minutos 90 minutos sem luz 2 minutos 45 segundos 5 minutos cada 10 minutos cada

Os diferentes reagentes Xilol I,II,II eram compostos iguais e foram assim designados apenas para ratificar a necessidade do uso de recipientes diferentes. O mesmo ocorre quando as mesmas concentraes de etanol so utilizadas seguidamente.

2.6.3 Mensurao da densidade nuclear e da rea percentual de fibrose O infiltrado celular no tecido cardaco foi avaliado atravs da medida da densidade nuclear (ncleos/mm2). Para o clculo, obteve-se a mdia da quantidade de ncleos celulares de seis campos distintos de uma lmina usando uma objetiva de 40x, e em seguida calculou-se a mdia de dez lminas diferentes (10 animais diferentes) em cada grupo experimental (MONDEN et

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al., 2007, KUBOTA et al., 2000). Como a distino entre os ncleos de clulas inflamatrias, de clulas musculares e fibroblastos complexa, com o do corante hematoxilina e eosina, todos os ncleos foram includos na contagem para anlise e quantificao do infiltrado celular. Em seguida, a presena de fibrose foi feita com a marcao de colgeno com o corante picrosirius (MONDEN et al., 2007, KUBOTA et al., 2000). A rea percentual de colgeno foi obtida atravs da medida da rea de fibrose marcada em vermelho em funo da rea total do tecido (objetiva de 20x). Assim como anteriormente, seis campos distintos de uma lmina foram avaliados para obteno de uma mdia, que foi usada para calcular uma mdia final de um total de dez lminas (10 animais diferentes) para cada grupo experimental. 2.7 AVALIAO DA REGULAO DE Ca2+ INTRACELULAR A avaliao da regulao do Ca2+ intracelular foi feita atravs da tcnica de fibras desnudas, primeiramente proposta por Fabiato, A. e Fabiato, F. (1979). Esta tcnica, atravs da anlise da resposta contrtil de fibras cardacas capaz de inferir a variao da concentrao Ca2+ citoplasmtico na fibra cardaca desnuda, sem que seja necessrio desmembramento do maquinrio contrtil, como acontece, por exemplo, no isolamento de fraes do RS. Isso possibilita a manuteno das estruturas intracelulares, reduzindo possveis distores na interpretao dos mecanismos moduladores que podem ocorrer quando as estruturas so isoladas. A tcnica de fibras desnudas ainda oferece a vantagem de possibilitar a avaliao direta da fora de contrao exercida pelo tecido, correlacionando-a com a mobilizao de Ca2+ e viabilizando anlise do estado contrtil da clula. Feixes de fibras ventriculares quimicamente desnudas foram utilizados para investigar a regulao da mobilizao de Ca2+ intracelular aps o IM e a influncia do tratamento com LASSBio-294 sobre essa resposta. Os coraes de ratos infartados e FO foram submetidos anlise dos processos de captao e liberao de Ca2+ pelo RS e da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ atravs de trs protocolos experimentais. Os animais de cada grupo experimental foram sacrificados sob anestesia com ter e em

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seguida seus coraes retirados e mergulhados em soluo nominalmente livre de Ca2+. Feixes de aproximadamente 10 mm de comprimento e 250350 m de dimetro foram ento removidos do sub-endocrdio do ventrculo esquerdo a temperatura ambiente e posicionados em uma cuba experimental de 1 ml de volume interno, preenchida com soluo de relaxamento (soluo R contendo EGTA). As extremidades dos feixes foram presas a duas garras localizadas horizontalmente, onde uma delas encontrava-se conectada a um

micromanipulador (Narishige mod. 3) e a outra a um transdutor de tenso isomtrica (Grass, modelo FT03). Em seguida, as fibras foram estiradas para 120% do seu comprimento inicial atravs da visualizao em

estereomicroscpio binocular (Zeiss) provido de uma escala na ocular. Em todos os experimentos, a temperatura da cuba foi continuamente monitorada e mantida a 22,0 0,5 oC. O registro da tenso isomtrica foi feito em polgrafo (Grass mod. 7400). Para permeabilizao da membrana celular e

consequentemente livre acesso das substncias do meio extra para o intracelular, os feixes foram submetidos ao tratamento com saponina diluda em soluo R (0,5% v/v) durante cinco minutos. O sucesso do desnudamento foi confirmado comparando-se a amplitude da contratura em reposta exposio do feixe ao CaCl2 antes e aps uso da saponina. A tenso mxima desenvolvida pelas clulas cardacas desnudas foi determinada atravs da exposio soluo contendo CaCl2 (15,85 M ou pCa 4.8). As Figuras 13A e 13B demonstram o esquema ilustrativo de uma cuba experimental e os processos reguladores do fluxo de Ca2+ intracelulares a serem avaliados.

2.7.1 Captao e liberao de Ca2+ pelo RS Antes do incio de cada protocolo, a permeabilidade e a integridade das protenas contrteis foram avaliadas atravs do registro da resposta contrtil mxima (P0) induzida por uma soluo de pCa 4.8 (15,85 M Ca2+). Em seguida, a viabilidade do RS foi analisada como demonstra a Figura 14. Aps a lavagem das fibras com a soluo W, esvaziou-se o RS com cafena (20 mM) diluda em soluo R durante um minuto, em seguida o carregamento do RS foi obtido atravs da exposio das fibras a uma soluo de pCa 7.4 (0,04 M Ca2+) durante trs minutos. Aps o carregamento induziu-se uma contratura

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com uma soluo de cafena (20 mM) diluda em soluo W e a integridade do RS foi aceita caso a tenso isomtrica gerada fosse 60% do P0. O relaxamento da fibra tanto aps a contratura induzida por Ca2+ quanto pela cafena foi induzido com a aplicao da soluo R na cuba experimental.

Transdutor de Tenso Cuba Experimental

B

Haste Fixa

Figura 13. Avaliao da mobilizao de Ca intracelular atravs da tcnica de fibras desnudas. (A) Esquema ilustrativo da cuba experimental. (B) Ilustrao dos mecanismos intracelulares 2+ envolvidos na regulao de Ca e contrao cardaca. Modificado de Bers, 2002. NCX = + 2+ trocador Na /Ca ; ATP = adenosina trifosfato; RyR = receptor de rianodina; PLB = fosfolamban; Sarcolemma = sarcolema; T-tubule = tbulo-T; Myofilaments = miofilamentos.

2+

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R R

Saponina pCa 4.8 Cafena W W pCa 7.4 W W Cafena 0,5% (20 mM) (20 mM) 3 min. 5 min. + R 1 min.

Figura 14. Representao grfica do ciclo de contrao aplicado para avaliao da permeabilizao do feixe de fibras cardacas, da integridade das protenas contrteis e do RS. 2+ Aps as contraturas induzidas por Ca e cafena a soluo R foi adicionada cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras.

A captao de CA2+foi investigada atravs da avaliao da curva de tenso isomtrica em funo dos tempos de carregamento do RS com Ca2+. Diversos ciclos de contrao-relaxamento foram obtidos em cada feixe de fibras musculares, usando-se tempos crescentes de carregamento (0,5, 1, 2, 3, 5 e 8 minutos) com o valor fixo de Ca2+ (pCa 7.4 Figura 15). Ao final do protocolo experimental, uma nova contratura com soluo de pCa 4.8 foi gerada para garantia da integridade das clulas. Caso a resposta contrtil fosse menor que 70% do P0 inicial, o experimento era descartado.
R R

Cafena W W (20 mM) + R 1 min.

pCa 7.4 0,5 - 8 min.

Cafena W W (20 mM)

pCa 4.8

Figura 15. Representao grfica do protocolo para avaliao da captao de Ca pelo RS. Diferentes tempos de carregamento foram utilizados e a resposta isomtrica analisada. Aps 2+ as contraturas induzidas por Ca e cafena a soluo R foi adicionada cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras.

2+

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A liberao de Ca2+ do RS foi avaliada de maneira similar a captao, no entanto, obteve-se uma curva da resposta contrtil em funo de diferentes concentraes de cafena (0,2; 0,5; 2,0; 5,0; 10 e 20 mM). Nesse protocolo, tanto o valor da concentrao de Ca2+ (pCa 7.4) quanto o tempo de carregamento do mesmo para o RS foram fixos (3 minutos). Da mesma maneira que anteriormente, as fibras que apresentaram ao final do experimento, resposta ao pCa 4.8 menor que 70% do P0 inicial, estas foram excludas (Figura 16).
R

Cafena W W (20 mM) + R 1 min.

pCa 7.4 3 min.

Cafena W W pCa 4.8 (0,2 - 20 mM)

Figura 16. Representao grfica do protocolo para avaliao da liberao de Ca pelo RS. Diferentes concentraes de cafena foram aplicadas com um tempo fixo de carregamento e a 2+ resposta isomtrica analisada. Aps as contraturas induzidas por Ca e cafena a soluo R foi adicionada cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras.

2+

2.7.2 Sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ A avaliao da interao das protenas contrteis com o Ca2+ foi realizada em fibras cardacas desnudas sem o RS funcional. A exposio prvia de Triton X-100 (2%) durante quinze minutos, aps o primeiro teste de contrao, destri o RS sem alterar o funcionamento das protenas contrteis. Dessa maneira, avaliou-se a resposta das fibras na presena de cafena aps o uso do Triton X-100 e a ausncia de resposta garantia a ruptura completa da membrana do RS. Em seguida, as fibras foram submetidas ao protocolo de avaliao da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+. Como pode ser observado na Figura 17, este protocolo consistiu na gerao de uma curva de tenso isomtrica em funo de concentraes crescentes de Ca2+ (pCa 7.4; 6.6; 6.4; 6.2; 5.6; 5.4; 5.2; 5.0; 4.8). Da mesma forma, ao final do experimento,

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as fibras que apresentaram reduo da resposta ao pCa 4.8 abaixo de 70% do P0 inicial foram descartadas.

Triton W W Cafena W W pCa 7.4 Cafena W W 2% (20 mM) 3 min. (20 mM) 15 min. + R 1 min.

pCa 7.4

W W pCa 7.4 5.0

W W pCa 4.8

Figura 17. Representao grfica do protocolo para avaliao da sensibilidade das protenas 2+ contrteis ao Ca . O RS foi destrudo com Triton x-100 e diferentes concentraes de 2+ Ca foram aplicadas para anlise da resposta isomtrica. Aps as contraturas induzidas por 2+ Ca a soluo R foi adicionada cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras.

2.8 AVALIAO DA EXPRESSO DE SERCA2a NO TECIDO CARDACO 2.8.1 Preparao dos homogeneizados Aps o sacrifcio dos animais, os coraes foram retirados e colocados em soluo resfriada contendo sacarose 250 mM, HEPESTris (pH 7.6) 10 mM, EDTA 2 mM e 1 mM do inibidor de protease PMSF. O tecido ventricular muscular esquerdo foi separado do tecido fibroso atravs de disseco macroscpica, sendo este ltimo em seguida descartado. Os coraes foram homogeneizados em tubos envoltos por gelo utilizando-se um ultraturrax. Aps esse processo, os homogeneizados foram centrifugados em 9.686 x g a 40C durante vinte minutos. Utilizou-se apenas o sobrenadante para determinao da quantidade protica. A concentrao de protenas presente nas amostras foi dosada atravs do mtodo de Lowry, aplicando-se o reagente folinfenol e albumina bovina srica como padro. A medida foi obtida por

espectrofotometria com absorbncia de 450 m.

2.8.2 Anlise da expresso protica por Western blot Aps a dosagem protica, o material foi igualmente diludo para conter uma concentrao de 30 g de protena, usando sacarose como veculo de

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diluio. Posteriormente, os mesmos foram preparados para a eletroforese com um tampo de amostra contendo SDS-PAGE (9%). Cada poo foi carregado com a mesma quantidade de protena e a corrida feita em gel de poliacrilamida (10%). Terminada essa fase, as protenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose e bloqueadas durante uma hora em leite desnatado diludo (5% p/v) em Tris-tampo salina contendo 0,05% de tween 20 (TBS-T) em temperatura ambiente. As membranas ento foram incubadas a 4oC durante vinte e quatro horas com anticorpo monoclonal anti-SERCA2a (1:1000) e em seguida com anticorpo secundrio conjugado com a enzima peroxidase (1:10000). Como controle interno usou-se anticorpo monoclonal anti-GAPDH (1:4000). A expresso das protenas foi detectada atravs do ensaio de quimioluminescncia, Chemiluminescence, usando como substrato o e ECL-plus atravs da (Enhanced exposio

Amersham

Biosciences)

radiogrfica. A densitometria foi calculada da razo entre SERCA2a/GAPDH para ento serem obtidas as mdias dos diferentes grupos experimentais.

2.9 AVALIAO DOS PARMETROS HEMODINMICOS Os parmetros cardiovasculares in vivo foram obtidos com o intuito de averiguar se as mudanas observadas in vitro, seja na plasticidade tecidual ou na funcionalidade celular, resultavam em distrbios nos parmetros

hemodinmicos dos animais. Para obteno dessas medidas, ao final das quatro semanas os ratos foram anestesiados com pentobarbital sdico (50 mg/kg) e aps a perda dos reflexos sensitivos uma tricotomia na regio cervical seguida de separao dos tecidos musculares foi realizada para se ter acesso artria cartida direita (Figura 18).

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Figura 18. Fotos ilustrativas da preparao de um animal para a medida dos parmetros hemodinmicos. (A) Animal anestesiado com eletrodos fixados para o registro do eletrocardiograma (B) Artria cartida direita dissecada.

Aps a disseco da artria, um cateter de polietileno (PE50) foi introduzido para registro da presso arterial. O cateter conectado a um transdutor de presso (ADInstruments model MLT884, Bella Vista NSW, AU) registrou as presses: arterial sistlica (PAS) e diastlica (PAD) e arterial mdia (PAM). Em seguida, o mesmo foi introduzido at o ventrculo esquerdo para as medidas das presses ventriculares esquerdas: sistlica final (PVSFE) e diastlica final (PVDFE). O registro do eletrocardiograma foi feito em uma derivao (I). O sinal obtido pelo transdutor de presso e pelos eletrodos foi amplificado e digitalizado (Powerlab, ADInstruments) para posterior anlise, utilizando-se o software LabChart (ADInstruments, verso 7.0, Bella Vista NSW, AU). Atravs dele foi possvel obter os valores das derivadas mxima e mnima da presso em funo da derivada do tempo ou os valores da dP/dt mx. e dP/dtmin., respectivamente (Figura 19).

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Figura 19. Fotos ilustrativas (A) da aparelhagem utilizada o para o registro dos parmetros hemodinmicos e (B) dos registros de presso arterial, eletrocardiograma, freqncia cardaca e dP/dt mx. e min de obtidos de um animal.

2.10 ANLISE ESTATSTICA Todos os dados foram expressos atravs da mdia EPM. As curvas da tenso isomtrica em funo das crescentes concentraes de cafena e CA2+foram ajustadas atravs da equao: Y= Ymx + (Ymx Ymn) / {1+10
[(LogEC50 - X) n]

}, considerando-se y o percentual da tenso isomtrica, X a

concentrao das substncias ou o tempo de carregamento, n o coeficiente de Hill, e LogEC50 o logaritmo das concentraes de Ca2+ ou do tempo de carregamento necessrios para atingir 50% do efeito mximo. Anlise de regresso linear e o coeficiente de determinao foram obtidos entre a resposta isomtrica observada no tempo de carregamento de trinta segundos e a expresso de SERCA2a para os diferentes grupos. Os valores foram

comparados atravs da anlise de varincia de um fator (ANOVA One-way) e Post Test de Tukey, quando necessrio. A diferena entre as mdias foram consideradas significativas quando P < 0,05.

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3 Resultados

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Durante todo tratamento os ratos tratados com LASSBio-294, tanto falso-operados quanto infartados, no apresentaram mudana comportamental aparente que pudesse inviabilizar o tratamento e os experimentos.

3.1 AVALIAO DA HIPERTROFIA CARDACA Os valores do peso corporal e da relao peso do corao/ peso corporal podem ser observados na Figura 20. A
FO - DMSO FO - LASSBio-294 IM - DMSO IM - LASSBio-294 400

B
FO - DMSO FO - LASSBio-294 IM - DMSO IM - LASSBio-294 8 6 4 2 0

Peso corao/ Peso corporal (mg/g)

Peso corporal (g)

* *

300 200 100 0

Figura 20. Anlise da hipertrofia cardaca quatro semanas aps o IM. (A) Peso corporal dos animais e (B) Relao peso do corao/peso corporal. * P < 0,05 comparado ao grupo FO DMSO, P < 0,05 comparado ao grupo IM - DMSO. Os valores representam mdia EPM de 15 - 20 animais. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.

Nota-se que nenhuma mudana significativa no peso dos animais ocorreu entre os quatro grupos experimentais em todo o perodo de observao. O peso corporal foi de 286,3 11,6 g; 280,3 5,4 g; 278,5 7,9 g e 269,0 8,0 g para os grupos FO DMSO; FO LASSBio-294; IM DMSO e IM

LASSBIO-294, respectivamente. A relao entre peso do corao e peso corporal aumentou de 4,5 0,2 g (FO DMSO) para 6,9 0,8 g aps quatro semanas de IM (IM DMSO). O tratamento com LASSBio-294 no alterou a

76

relao peso do corao/ peso corporal nos animais falso-operados, ficando o valor 4,6 0,2 g semelhante ao grupo FO DMSO. No entanto, os animais infartados submetidos ao tratamento com LASSBio-294 durante quatro semanas apresentaram o valor da relao de 5,7 0,2 g, que foi significativamente menor que os animais no tratados (IM DMSO).

3.2 DENSIDADE NUCLEAR E VOLUME DE COLGENO INTERSTICIAL

A densidade nuclear representada como o nmero total de ncleos em funo da rea de tecido cardaco foi usada com o objetivo de avaliar e quantificar a presena de infiltrado celular no tecido cardaco dos diferentes grupos experimentais. Por causa da dificuldade na diferenciao entre os ncleos de clulas inflamatrias, fibroblastos e clulas musculares, todos os ncleos presentes foram includos na contagem. Na Figura 21, encontram-se seces de tecido cardaco coradas com hematoxilina e eosina.

Qualitativamente, observa-se que a presena de ncleos (corados em roxo) encontra-se mais elevada no corao do animal submetido ao IM e tratado apenas com DMSO em comparao ao animal FO tratado com o mesmo. O tecido do animal FO tratado com LASSBio-294 no apresenta alteraes representativas do nmero de ncleos em comparao ao animal do grupo FO DMSO. Em contra partida, o animal infartado submetido ao tratamento com LASSBio-294 possui uma distribuio de ncleos bem semelhante a do FO tratado com o veculo. Na avaliao quantitativa (Figura 22), constatou-se que o grupo FO DMSO apresentou uma mdia de 3325 201 ncleos por mm2, enquanto que o grupo FO tratado com LASSBio-294 no alterou a densidade nuclear, apresentando valor semelhante de 3235 377 ncleos/mm2. No entanto, o valor de 7369 1086 ncleos/mm2 apresentado pelos ratos infartados e tratados com DMSO aumentou significativamente em relao ao grupo dos animais FO e tratados com DMSO aps 4 semanas. Posteriormente ao IM e tratamento com LASSBio-294, a mdia de 3061 255 ncleos/mm2 obtida como valor da densidade nuclear, permaneceu semelhante ao grupo FO DMSO.

77

Figura 21. Cortes histolgicos dos coraes de ratos dos quatro grupos experimentais corados com hematoxilina e eosina. As setas brancas indicam os ncleos celulares.

10000

FO - DMSO FO - LASSBio-294 IM - DMSO IM - LASSBio-294

Densidade Nuclear (ncleos/mm 2)

*
7500 5000

2500 0

Figura 22. Quantificao da densidade nuclear (ncleos/mm ). * P < 0,05 comparado ao grupo FO DMSO, P < 0,05 comparado ao grupo IM - DMSO. Os valores representam mdia EPM de 8 - 10 animais. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.
2

Numa etapa seguinte, avaliou-se a presena de colgeno no tecido cardaco, j que as clulas inflamatrias esto envolvidas no processo de desenvolvimento de fibrose tecidual atravs da induo da liberao de citocinas e quimiocinas responsveis pela sntese de colgeno. Para isso, analisou-se a rea de colgeno presente no corao dos diferentes grupos

78

experimentais. Caso essa resposta seguisse o mesmo padro das respostas observadas na avaliao da densidade nuclear, seria possvel que a substncia pudesse estar atuando na diminuio da formao de fibrose no tecido cardaco. Na Figura 23, observam-se as imagens ilustrativas de coraes dos quatro grupos experimentais corados com a colorao picrosirius, onde a rea de colgeno pode ser evidenciada em vermelho.

Figura 23. Cortes histolgicos dos coraes de ratos dos quatro grupos experimentais corados com picrosirius. As setas pretas indicam presena de colgeno.

Nota-se que aps o IM, o msculo cardaco do rato tratado com DMSO apresentou intensa marcao para a presena de colgeno. J o tecido do animal do grupo IM LASSBio-294 apresentou marcao semelhante a dos ratos dos grupos FO DMSO e FO LASSBio-294, que apresentaram marcao compatvel com a presena de matrix intercelular. A quantificao do volume de colgeno nos diferentes grupos pode ser observada na Figura 24. De acordo com o esperado, o grupo IM DMSO apresentou um valor de volume de colgeno de 4,2 0,8% bem superior ao grupo FO DMSO que foi de 1,2 0,3 %. O tratamento com LASSBio-294 aps o IM reduziu significativamente esse volume para 2,1 0,3%, que por sua vez tambm foi semelhante ao valor apresentado pelo grupo FO DMSO. Os resultados tambm indicam que LASSBio-294 no alterou a estrutura tecidual dos

79

coraes de ratos falso-operados (FO LASSBio-294), agindo apenas quando houve necrose das clulas cardacas.

FO - DMSO FO - LASSBio-294 IM - DMSO IM - LASSBio-294

rea de Colgeno (%)

*
4 2

Figura 24. Quantificao da rea de colgeno (%). * P < 0,05 comparado ao grupo FO DMSO, P < 0,05 comparado ao grupo IM - DMSO. Os valores representam mdia EPM de 8 - 10 animais. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.

3.3

CONTRATILIDADE

CARDACA

MOBILIZAO

DE

Ca2+

INTRACELULAR Neste trabalho utilizou-se a tcnica de fibras cardacas desnudas com o intuito de avaliar se o tratamento prolongado com LASSBio-294 provocaria mudanas nos mecanismos celulares moduladores do fluxo de Ca2+ intracelular, que por sua vez, determina os processos de contrao e relaxamento do msculo cardaco. Os protocolos experimentais aplicados buscaram avaliar a captao e liberao de Ca2+ do RS e ainda, a sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+. 3.3.1 Regulao da captao e liberao de Ca2+ do RS As respostas entre a relao da contratura induzida por cafena e o tempo de carregamento podem ser observadas na Figura 25. Nota-se que a tenso

80

isomtrica gerada por uma concentrao fixa de cafena aumentou em funo do tempo de carregamento. Isto se deve ao fato de que um maior tempo de exposio da fibra a uma concentrao baixa de Ca2+ (insuficiente para ativar a contrao) permite que mais ons sejam transportados para o RS e liberados aps ativao dos canais de RyR2 com cafena. A tenso isomtrica mxima gerada pelo grupo FO DMSO foi alcanada aos oito minutos de carregamento sendo esta de 52,2 5,0 % da resposta contrtil mxima. Em trinta segundos, o menor tempo de carregamento avaliado, a resposta isomtrica foi de 22,2 7,4%. O IM reduziu a captao de Ca2+, fato evidenciado atravs da diminuio do desenvolvimento da tenso isomtrica pelo grupo FO- DMSO de 41,4 5,9%; 48,0 6,2%; 52,2 5,0%, em comparao ao grupo IM DMSO que apresentou os valores de 18,4 6,4%; 22,8 8,5%; 29,2 8,0%, nos tempos de carregamento de trs, cinco e oito minutos, respectivamente. O tratamento com LASSBio-294 aps o IM elevou a resposta da tenso para 61,3 6,5% e 61,6 5,8% aps 5 e 8 minutos de carregamento. J nos tempos de carregamento de trinta segundos, um, dois e trs minutos, os valores da tenso obtidos pelo mesmo grupo (IM LASSBio294) foram respectivamente de 47,9 7,1%, 50,7 7,7%, 55,9 6,1%; 57,2 6,2%, que por sua vez, foram significativamente maiores que os valores observados no grupo IM DMSO de 13,1 5,7%; 15,6 5,9%; 17,1 5,9%; 18,4 6,4% nos mesmos tempos de carregamento. A resposta obtida com o tratamento de LASSBio-294 aps o IM foi tambm maior que aquela observada no FO DMSO de 22,2 7,4%; 26,6 7,8%; 32,9 5,1%; 41,4 5,9%, no tempos de trinta segundos, um, dois e trs minutos, respectivamente. Segundo Sudo e outros (2001), o valor do tempo de carregamento necessrio para se alcanar 50% da tenso isomtrica mxima pode ser usado como parmetro comparativo da funo de captao de Ca2+ pelo RS entre os grupos experimentais (Tabela 7).

81

Tenso Isomtrica (% resposta mxima)

120 100 80

FO - DMSO IM - DMSO IM - LASSBio-294

60 40 20 0

* * *

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tempo de Carregamento (min)

2+

Figura 25. Captao de Ca para o RS de ratos falso-operados e infartados tratados com LASSBio-294 ou DMSO. * P < 0,05 comparado ao grupo FO DMSO, P < 0,05 comparado ao grupo IM - DMSO. Os valores representam mdia EPM de 6 - 8 animais. ANOVA OneWay seguido do teste de Tukey.

Tabela 7. Tempo de carregamento necessrio para atingir 50% da tenso isomtrica mxima obtida. Grupos FO DMSO IM DMSO IM LASSBio-294 Tempo (minutos) 1,3 0,4 6,9, 2,0 * 2,1 0,9 *

FO DMSO = falso-operado tratado com DMSO, IM DMSO = infartado tratado com DMSO, IM LASSBio-294: infartado tratado com LASSBio-294. * P < 0,05 comparado ao grupo FO DMSO, P < 0,05 comparado ao grupo IM - DMSO. Os valores representam mdia EPM de 6 - 8 animais. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.

A liberao de Ca2+ pelo RS foi avaliada atravs da relao da resposta isomtrica e as concentraes crescentes de cafena no tempo de carregamento de trs minutos (Figura 26).

82

Tenso Isomtrica (% resposta mxima)

120 100 80 60 40 20 0 0

FO - DMSO IM - DMSO IM - LASSBio-294

12

16

20

[Cafena] mM
Figura 26. Liberao de Ca do RS de ratos falso-operados e infartados tratados com LASSBio-294 ou DMSO. Os valores representam mdia EPM de 6 - 8 animais. ANOVA OneWay seguido do teste de Tukey.
2+

Neste grfico, nota-se que a resposta da liberao de Ca2+ no foi alterada aps o IM e nem com o tratamento com LASSBio-294.

3.3.2 Relao da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+

Avaliou-se tambm a interao das protenas contrteis com o Ca2+. Para isso as fibras foram expostas a concentraes crescentes de Ca2+ aps a destruio do RS com detergente Triton X-100. Observa-se na Figura 27 a resposta contrtil induzida pelo Ca2+ nos diferentes grupos experimentais. Os resultados demonstram que o IM no alterou a sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+. Entretanto, a administrao de LASSBio-294 nos animais que sofreram IM elevou significativamente a interao das protenas contrteis ao Ca2+ em comparao ao grupo no tratado, visto o deslocamento significativo da curva do grupo tratado para esquerda. Essa alterao ocorreu nas concentraes mais baixas onde no grupo IM LASSBio-294 as respostas

83

obtidas foram: 1,4 0,9%; 4,6 2,4%; 19,0 9,5% nos pCa 7.4, 6.8 e 6.4, respectivamente. Enquanto no grupo IM DMSO as respostas obtidas nas mesmas concentraes foram: 33,7 5,9%; 25,7 3,5%; 50,7 5,1%. Essa resposta tambm pde ser confirmada atravs da comparao dos valores de pCa50 (Tabela 8)

FO - DMSO IM - DMSO IM - LASSBio-294

Tenso Isomtrica (% resposta mxima)

120 100 80 60 40 20 0 7.5 6.5 5.5 4.5

pCa
Figura 27. Sensibilidade das protenas contrteis ao Ca de ratos falso-operados e infartados tratados com LASSBio-294 ou DMSO. P < 0,05 comparado ao grupo IM - DMSO. Os valores representam mdia EPM de 6 - 8 animais. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.
2+

Tabela 8. Potencial de Ca ou logaritmo negativo na base dez da concentrao molar dos ons CA2+necessria para atingir 50% da tenso isomtrica mxima obtida (pCa50). Grupos FO DMSO IM DMSO IM LASSBio-294 pCa50 6,66 0,20 5,97 0,13 6,86 0,26

2+

FO DMSO = falso-operado tratado com DMSO, IM DMSO = infartado tratado com DMSO, IM LASSBio-294: infartado tratado com LASSBio-294. n = 6 - 8 animais por grupo. P < 0,05 comparado ao grupo IM - DMSO. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.

84

3.4 EXPRESSODE SERCA2a NO TECIDO CARDACO O ensaio funcional com fibras desnudas permitiu a observao de que a captao de Ca2+ foi comprometida pelo o IM e ainda que o tratamento com LASSBio-294 foi capaz de induzir uma resposta inotrpica positiva do tecido cardaco tanto atravs do aumento da captao quanto da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+. Para investigar se a mudana na captao de Ca2+ relacionava-se com alteraes na expresso da Ca2+-ATPase do RS, quantificou-se a expresso de SERCA2a atravs dos ensaios de

immunoblotting. Na figura 28A, encontra-se a microfilmagem da expresso de SERCA2a feita em homogeneizados do tecido cardaco nos grupos FO DMSO, IM DMSO e IM LASSBio-294. Nota-se que o IM reduziu a expresso de SERCA2a, mas que o tratamento com a substncia em ratos submetidos ao IM impediu esse efeito. A avaliao semi-quantitativa da expresso de SERCA2a confirma esta hiptese (Figura 28B). Observa-se neste grfico que a expresso de SERCA2a reduziu aps quatro semanas de IM e que LASSBio-294 elevou essa expresso no somente em relao ao grupo IM DMSO mas tambm em relao a grupo controle FO - DMSO. A anlise de regresso entre os valores da expresso de SERCA2a e os valores da tenso isomtrica, observados no tempo de carregamento de trinta segundos, permitiu a avaliao da correlao entre os dois fenmenos. O coeficiente de determinao (R2) se prope a definir em termos percentuais, o quanto a expresso de SERCA2a varia juntamente com a resposta isomtrica. Apesar de no se poder estabelecer uma relao direta de causa e efeito com essa anlise, os valores obtidos permitem sugerir que a expresso SERCA2a seria proporcional resposta isomtrica obtida em trinta segundos de carregamento. Como esperado, os R2 observado nos grupos FO DMSO, IM DMSO e IM LASSBio-294 demonstram boa associao entre a resposta contrtil das clulas e a expresso da protena responsvel pela captao de Ca2+ para o RS.

85

A
FO - DMSO IM - DMSO IM LASSBio-294

PM

B
FO - DMSO IM - DMSO IM - LASSBio-294

Expresso de SERCA2a (Unidade Arbitrria)

1.0 0.8 0.6 0.4

*
0.2 0.0

Figura 28. Expresso de SERCA2a no tecido cardaco de ratos. (A) Microfilmagem da expresso de SERCA2a no tecido cardaco de ratos dos trs grupos experimentais e (B) avaliao semi-quantitativa da expresso. * P < 0,05 comparado ao grupo FO DMSO, P < 0,05 comparado ao grupo IM - DMSO. Os valores representam mdia EPM de 6 - 8 animais. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.

86

A FO - DMSO
50 Tenso Isomtrica (% resposta mxima) 40 30 20 10 0 0.4 0.5 0.6 Expresso de SERCA2a (Unidade Arbitrria)
Y = 394,0 . (X) - 143,7 R 2 = 0,87

B
40 Tenso Isomtrica (% resposta mxima)

IM - DMSO

30

20

10

Y = 162,5 . (X) - 21,2 R2 = 0,68

0 0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Expresso de SERCA2a (Unidade Arbitrria)

80

IM LASSBio-294

C
Tenso Isomtrica (% resposta mxima) 60

40
Y = 59,6 . (X) - 9,9 R 2 = 0,77

20 0.0 0.5

1.0

1.5

2.0

Expresso de SERCA2a (Unidade Arbitrria)

Figura 29. Anlise de regresso linear entre tenso isomtrica no tempo de carregamento de trinta segundos (0,5 minutos) x expresso de SERCA2a no tecido cardaco de ratos. (A) Grupo FO DMSO; (B) Grupo IM DMSO; (C) IM LASSBio-294.

3.5 PARMETROS HEMODINMICOS

A funo cardaca in vivo foi investigada com o objetivo de avaliar se as modificaes na contratilidade observadas in vitro anteriormente poderiam promover alteraes hemodinmicas nos animais. Para isso, um catter acoplado a um transdutor de presso foi inserido na artria cartida direita e

87

em seguida no ventrculo esquerdo dos animais para a anlise da FC, PAS, PAD, PAM, PVSFE, PVDFE, dP/dtmx e dP/dtmin. Os resultados da Tabela 9 demonstram que o IM promove aumento da PVDFE e reduo da dP/dtmin. Distrbios na captao levam a queda do lusitropismo induzindo o aumento do estresse e da presso interna da parede ventricular. A funo sistlica do VE foi comprometida aps quatro semanas de IM observada pela queda da dP/dtmx. No grupo IM - LASSBio-294 nota-se uma diminuio significativa da PVDFE, bem como, aumento da dP/dtmin e da dP/dtmx. O tratamento de LASSBio-294 no grupo FO tambm aumentou significativamente a contratilidade cardaca em relao ao grupo FO - DMSO. No houve alteraes significativas na FC e nas presses arteriais dos animais dos diferentes grupos.
Tabela 9. Caractersticas corporais e parmetros hemodinmicos dos grupos falso-operados e infartados.

FO DMSO Frequnciacardaca(bpm ) Presso arterial sistlica (mm Hg) Presso arterial diastlica(mm Hg) Presso arterial mdia(mm Hg) PVSFE (mm Hg) dP/dtmax (mm Hg/s) PVDFE (mm Hg) dP/dtmin (mm Hg/s)
335 15 113.1 7.1 85.0 6.2 94. 3 6.2 110 7.7 5349.6 299.8 4.5 3.6 -3765.7 678.6

FO - LASSBio-294
309 20 101.1 5.2 78.3 5.1 86.9 5.1 104.4 10.2 7310.6 965.9 8.9 1.6 - 4641.8 456.3

IM DMSO
315 21 1 00.0 5.2 82.4 5.1 88.2 5.1 95.2 5.2 2218.9 165.9 * 16.4 2.5* -1018.1 373.1 *

IM - LASSBio-294
346 12 107.3 9.9 79.2 10.1 89.6 12.1 99.9 5.8 6812.1 11804.5 9.0 2.2 -4464.8 355.1

PVSFE, presso sistlica final no ventrculo esquerdo; PVDFE, presso diastlica final no ventrculo esquerdo; dP/dtMax., derivada da presso sistlica/derivada do tempo; dP/dtmin., derivada da presso diastlica final/derivada do tempo. FO DMSO = falso-operado tratado com DMSO, FO LASSBio-294 = falso-operado tratado com LASSBio-294, IM DMSO = infartado tratado com DMSO, IM LASSBio-294: infartado tratado com LASSBio-294. n = 15 animais por grupo * P < 0.05 comparado ao grupo FO DMSO, P < 0.05 comparado ao grupo IM - DMSO. ANOVA One-Way. seguido do teste de Tukey.

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_____________________________________________________________

4 Discusso

___________________________________________________________

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_______________________________________________________________

Este trabalho teve como objetivo principal a avaliao dos efeitos promovidos pelo tratamento com LASSBio-294, uma tienilhidrazona derivada do leo de sassafrs (BARREIRO, 2002), sobre as adaptaes no sistema cardiovascular decorrentes do IM. Tais adaptaes apresentam uma progresso temporal que evolui para IC, quando no tratadas adequadamente. Atualmente, os principais frmacos utilizados no tratamento dos distrbios promovidos pelo IM so: os bloqueadores -adrenrgicos, diurticos, inibidores da ECA, antagonistas dos receptores de angiotensina, antagonistas dos receptores de aldosterona (GILMAN et al., 2005). Em casos mais avanados so usados frmacos inotrpicos positivos e cardiotnicos como: glicosdeos cardacos, agonistas -adrenrgicos, sensibilizadores de Ca2+, inibidores de PDE, entre outros (LEHTONEN; PODER, 2007; GILMAN et al., 2005). Normalmente a administrao de vrios frmacos em um tratamento exige a aplicao de um esquema teraputico mais elaborado, podendo aumentar a incidncia de interaes medicamentosas, de reaes adversas, e ainda elevar o custo do tratamento. Tais fatores podem, por sua vez, comprometer a adeso do paciente terapia e com isso contribuir para o aumento do nmero de internaes hospitalares, intervenes cirrgicas, e tambm o nmero de bitos. Neste cenrio, a busca de novas substncias que permitam tornar o tratamento da IC mais abrangente torna-se de grande importncia para o aprimoramento da sua eficcia e a obteno de um melhor prognstico para os pacientes. A IC uma doena multifatorial que resulta da alterao e ativao de diferentes mecanismos em resposta a queda da frao de ejeo e do dbito sistlico (SUN; WEBER, 2000; BING, 2001; STRUTHERS, 2005; FUKUTA; LITTLE, 2008; TROIDL et al., 2009). O desenvolvimento desse trabalho foi baseado em resultados anteriores que demonstraram que LASSBio-294 possua um perfil promissor para a melhora destas alteraes como: o de aumentar a captao de Ca2+ pelo RS (SUDO et al., 2001, 2006), induzir a vasodilatao (SILVA et al., 2002) e possuir uma ligao significativa ao receptor A(2A), podendo se comportar como uma substncia agonista desse receptor (TANG, 2008). Esses resultados geraram a hiptese de que o

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tratamento crnico com a substncia seria capaz de impedir o desenvolvimento dos distrbios adaptativos promovidos pelo IM. O envolvimento dos receptores A(2) na proteo cardaca contra a isquemia no fenmeno de pr-condicionamento j vem sendo estudado h algum tempo. At o momento uma parte desse mecanismo j foi estabelecida, e parece envolver a ativao da PKC (protena cinase C) com concomitante reduo da sntese de espcies reativas de O2 no modelo de isquemia e reperfuso (BRAUNWALD et al., 2001). No entanto, pouco se conhece sobre os efeitos da ativao crnica dos receptores A(2) na IC que em roedores comea a se estabelece a partir da quarta semana aps o IM

(SWYNGHEDAUW, 1999; MACKIEWICZ et al., 2009). Alguns resultados demonstraram que agonistas do receptor A(2) reduzem a fibrose cardaca, atravs da inibio da proliferao de fibroblastos (DUBEY et al. 1997, 1998; VILLARREAL et al., 2003; EPPERSON et al., 2009). Outra substncia da mesma classe tambm melhorou parmetros hemodinmicos alterados pelo IM (a resistncia vascular perifrica, dbito cardaco e a capacitncia venosa) quando administrada uma nica vez atravs de infuso intravenosa (NEKOOIAN; TABRIZCH, 1998). Porm, nenhum estudo at o presente momento havia analisado a resposta cardiovascular ao tratamento prolongado com uma substncia agonista A(2) no IM crnico, onde comeam a aparecer os primeiros sintomas da IC (quatro semanas) como: modificaes estruturais no tecido cardaco, desenvolvimento de hipertrofia cardaca e alteraes hemodinmicas. Para observar tais respostas, nesse trabalho foi utilizado o modelo experimental de IM onde feita a ocluso da ACDA. Esse modelo gera alteraes semelhantes ao IM causado por placas de ateroma, ativando os mesmos mecanismos fisiolgicos do IM natural (KLOCKE et al., 2007). Como o modelo experimental exige uma inciso torcica que gera um processo inflamatrio, foram usados como controles animais falso-operados com objetivo de evitar falsas interpretaes dos resultados. Essa estratgia permite que as alteraes moleculares e funcionais observadas nos ratos sejam apenas aquelas provocadas pelo IM e/ou pelo tratamento, excluindo a influncia das complicaes cirrgicas. Assim, esses animais foram tratados diariamente durante quatro semanas com 2 mg/kg de LASSBio-294 ou com o volume

91

correspondente do veculo, DMSO, por via ip A escolha do tempo de tratamento foi baseada em estudos j citados anteriormente, que

demonstraram que o IM foi capaz de induzir o remodelamento cardaco e gerar a IC quatro semanas aps a isquemia induzida experimentalmente (PFEFFER et al., 1979; SWYNGHEDAUW, 1999; MACKIEWICZ et al., 2009). Um estudo piloto feito para essa tese realmente demonstrou que aps duas semanas de IM no se observou o desenvolvimento significativo de hipertrofia cardaca e de sntese de colgeno (dados no publicados), corroborando com os resultados dos outros investigadores. No mesmo estudo piloto, foram testadas doses menores da substncia e escolheu-se a dose mais baixa capaz de promover mudanas significativas na hipertrofia cardaca e na captao de Ca2+ para dar prosseguimento ao trabalho. Os resultados demonstraram que aps quatro semanas, a hipertrofia cardaca, avaliada atravs da relao do peso cardaco e peso corporal, encontrava-se elevada no grupo dos ratos que sofreram IM e foram tratados apenas como veculo. Esses dados esto de acordo com os achados de Leosco e outros (2008), e Mackiewicz e outros (2009) que encontraram valores muito similares. Observou-se tambm que o tratamento com LASSBio-294 no grupo FO no causou alterao significativa da hipertrofia cardaca, mostrando que a substncia no alterou a morfologia do corao no infartado. Esse dado de grande importncia, j que no seria interessante obter uma substncia que interferisse no processo de crescimento das clulas normais, gerando a hipertrofia cardaca e a IC por si s. O resultado no grupo IM demonstrou que o tratamento com a substncia (grupo IM LASSBio-294) foi capaz de reduzir significativamente a hipertrofia cardaca em relao ao grupo IM DMSO. No entanto, esta ainda apresentou-se mais elevada que o grupo controle (FO DMSO), o que poderia ser justificado pela dose utilizada no estudo. Por enquanto, no possvel afirmar que doses mais elevadas de LASSBio-294, tambm aumentariam a eficcia do tratamento. Porm, tal hiptese no pode ser descartada, principalmente ao observar os resultados do estudo-piloto (no publicados) que demonstram que uma dose inferior da substncia (1 mg/kg) no promoveu benefcio algum ao animais submetidos ao IM. Portanto, baseado no princpio da relao dose-efeito dos frmacos possvel que doses

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mais elevadas promovam resultados de maior intensidade que as observadas com a dose atual. O efeito na reduo da hipertrofia cardaca levou investigao dos possveis mecanismos nos quais a substncia poderia interagir para promover tal efeito. O crescimento das clulas cardacas aps o IM ocorre devido a diversos fatores. A ativao crnica do sistema nervoso simptico leva a ativao das vias de proliferao relacionadas protena G, que tem como alvo a PKA que fosforila fatores de transcrio (KATZ, 2001, p.287;

SWYNGHEDAUW et al., 2010). Da mesma forma o aumento da sntese de angiotensina II est envolvido no processo hipertrfico, assim como a aldosterona (KATZ, 2001, p. 348; BING 2001; STRUTHERS, 2005). O aumento da presso de enchimento, bem como da ps-carga eleva o estresse da parede, ativando vias de sinalizao envolvidas na hipertrofia celular atravs da modulao das MAPkinases (AGABITI-ROSEI et al., 2007). A sobrecarga de Ca2+ tambm gera ativao do crescimento, e o processo inflamatrio modula o turn-over de colgeno, aumentando a fibrose e gerando ruptura cardaca (WEBER, 2004). Esses e outros mecanismos esto relacionados com o desenvolvimento do remodelamento cardaco na IC e podem servir como alvo do LASSBio-294. De fato, Epperson e outros (2009) demonstraram que os receptores A(2A) e A(2B) esto expressos nos fibroblastos cardacos durante a IC e respondem presena de adenosina. Essa reposta segundo Chen e outros (2004), a reduo da proliferao de fibroblastos na IC. LASSBio-294 um ligante seletivo do receptor A(2A) (TANG, 2008), podendo ser um agonista do mesmo. Caso essa hiptese seja verdadeira LASSBio-294 poderia reduzir o processo cicatricial e a formao da fibrose cardaca. Para investigar se a substncia promoveria reduzir a sntese de colgeno e o desenvolvimento de fibrose foram avaliados cortes histolgicos do ventrculo esquerdo corados com hematoxilina e eosina, usados para a contagem do nmero de ncleos por rea, e com picrosirius usado para marcao de colgeno. Os resultados demonstram que o tratamento dos ratos submetidos ao IM com LASSBio-294 reduziu a presena de infiltrado celular e da fibrose tecidual. Os valores sugerem que a presena de colgeno nesse tecido foi muito semelhante quela apresentada pelos ratos pertencentes ao grupo FO DMSO, e

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condizente com a presena de matriz extracelular. Da mesma forma, os ratos FO, tratados com a substncia, no apresentaram alteraes significativas nos valores de volume de colgeno do tecido. Esses resultados sugerem que LASSBio-294 reduz a fibrose tecidual, contribuindo com a reduo do remodelamento cardaco. Confrontando esses dados, com os resultados da hipertrofia cardaca observa-se, porm, que a magnitude da sua reduo menor que aquela observada nos valores de volume de colgeno. Entretanto, no se pode desconsiderar que outros mecanismos, que no s a desestruturao tecidual, geram a ativao de mecanismos hipertrficos, como por exemplo, a ativao do sistema nervoso simptico gerando o aumento da presso de enchimento, atuao do sistema RAA, modificaes da expresso de protenas intracelulares, entre outros. Esses mecanismos podem, portanto no serem modulados pela substncia e se contraporem sua ao protetora, impedindo que a reverso da hipertrofia seja completa. (BRAUNWALD et al., 2001). Isso explicaria porque os valores de fibrose retornam prximos ao controle e ainda assim, continua-se observando hipertrofia nos coraes aps o tratamento. A partir dessas respostas, foi possvel formular a hiptese da atuao do LASSBio-294 na reduo da proliferao da matriz extracelular, provavelmente pela ativao dos receptores de adenosina presentes nas clulas do tecido conjuntivo, mantendo a elasticidade e a estrutura cardaca normais. Isto impediria o aumento do estresse em torno da parede do corao (FUKUTA; LITTLE, 2007) e o desacoplamento do processo excitaocontrao (LEHNART; MAIER, 2009), podendo ento desacelerar o processo de desenvolvimento da IC e reduzir o aparecimento de distrbios

hemodinmicos caractersticos do processo de remodelamento ps IM. No entanto, mais experimentos so necessrios para confirmar a atuao dos receptores de adenosina nesse processo. Visto que LASSBio-294 apresentou efeito na modulao de

CA2+intracelular in vitro (SUDO ET AL., 2001), fomos avaliar se o mesmo resultado seria reproduzido in vivo com o tratamento prolongado dos animais. Sudo e outros (2001), observaram em ensaios de fibras desnudas, que 100 M da substncia aumentou a gerao da fora isomtrica das fibras cardacas de ratos normais, sugerindo que LASSBio-294 aprimorou a captao de Ca2+ pelo RS. O efeito inotrpico foi observado tambm em clulas intactas dos msculos

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papilares, comprovando a acessibilidade da substncia ao meio intracelular com a membrana plasmtica ntegra. O mecanismo da ao inotrpica proposto para LASSBio-294 por Sudo e outros (2001), diferente daqueles apresentados por frmacos inotrpicos positivos e cardiotnicos, usados na clnica at o momento. Normalmente esses frmacos ou no possuem grande eficcia ou tem uma margem de segurana pequena, porque elevam a concentrao citoplasmtica de Ca2+ e tendem a gerar arritmias cardacas mais facilmente (digitlicos). Os resultados deste trabalho com as fibras desnudas revelaram que a captao de Ca2+ estava reduzida aps o IM. Dados semelhantes foram observados por diferentes pesquisadores (AFZAL;

DHALLA, 1992; NEARY et al., 2002; MACKIEWICS et al., 2009). Segundo Inesi e outros (2008), a hiperatividade do sistema nervoso simptico interfere na expresso de SERCA2a, atravs da ativao da protena Gs, e a angiotensina II atravs da ativao de PKC (TAKEISHI et al., 1999). Esses fatores podem ter contribudo para a reduo da captao de Ca2+ pelo RS observada no presente estudo. Os resultados com as fibras desnudas ainda revelaram que o tratamento no s restaurou essa captao de Ca2+ comprometida pelo IM, como tambm a elevou alm dos valores normais nos menores tempos de carregamento do RS. Esses resultados comprovam a hiptese anterior de que o tratamento modula a mobilizao de Ca2+ da mesma forma que in vitro. Os resultados demonstraram que a reduo da captao de Ca2+ pelo RS decorrente do IM, ocorreu nos tempos de trs, cinco e oito minutos de carregamento do RS. Esses dados sugerem que em condies fisiolgicas a reduo da captao de Ca2+ pelo RS aps o IM no deve ocorrer, pois a cintica enzimtica da SERCA2a in vivo mais rpida e o tempo de relaxamento ventricular dos coraes de roedores so bem menores do que os valores encontrados no ensaio de fibras desnudas (ex-vivo). No entanto, um estudo que mensurou o transiente de Ca2+ em clulas intactas e estimuladas eletricamente, demonstrou que aps quatro semanas, o IM reduziu significativamente a captao de Ca2+ induzida pela SERCA2a (MACKIEWCZ et al., 2009). A tcnica usada por Mackiewcz e outros (2009) possui maior sensibilidade que a desse trabalho, por se tratar de uma medida direta da mudana de concentrao de Ca2+. Portanto, provvel que o aumento da captao de Ca2+ pelo RS induzido pela administrao de LASSBio-294 em

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ratos submetidos ao IM aqui demonstrada, possa tambm ser observada em condies fisiolgicas. No foram obtidas mudanas significativas nos resultados que avaliaram a liberao de Ca2+ pelo RS nos grupos IM (IM DMSO e IM LASSBio-294). Yamaguchi e outros (1997), observaram queda da liberao de Ca2+ em ratos aps 8 semanas de IM. Esses resultados sugerem uma relao temporal para a disfuno do processo de liberao de Ca2+, no ocorrendo modificaes significativas at quatro semanas aps IM. Pirkko e outros (2007), no notaram mudana na expresso de RyR2 at quatro semanas aps o IM, reforando os resultados aqui encontrados. Blayney e Lai (2009) demonstraram numa extensa reviso, que RyR2 encontram-se hiperfosforilados na IC, e que a fosforilao de outras protenas juntamente com a de RyR2 pode resultar no aumento da sensibilidade de ativao do receptor (RyR2), do estado de subcondutncia do mesmo, da sincronizao, da amplitude dos Ca2+ sparks e em alguns casos no aumento da probabilidade de abertura de RyR2. Segundo esses autores, essas mudanas ocorrem como uma tentativa de tornar o acoplamento excitaocontrao mais eficiente e de facilitar a gerao de fora, que se encontra comprometida na IC (BLAYNEY; LAI, 2009). No presente trabalho as mesmas respostas podem estar ocorrendo, haja visto, que aps a IC induzida pelo IM as protenas envolvidas na mobilizao de Ca2+ tambm esto hiperfosforiladas (LEHNAR; MAIER, 2009). Dessa forma essa mudanas poderiam ser encaradas como mecanismos compensatrios que mantm a resposta de RyR2 em funo da presena de cafena, mesmo com a queda na captao aps o IM, assim como observado nesse estudo. No entanto, em fases avanadas da IC a liberao de Ca2+ do RS encontra-se reduzida, apesar dos RyR2 permanecerem hiperfosforilados. Segundo Lehnart e Maier (2009), uma possvel explicao para este fenmeno seria a reduo dos estoques globais intracelulares de Ca2+. Essa reduo seria decorrente do concomitante aumento da liberao de Ca2+ do RS, da reduo da captao de Ca2+ pelo RS e ainda aumento da expresso do NCX, o que juntos aumentariam a extruso celular de Ca2+, reduziriam seus estoques no RS e, por conseguinte, promoveriam a queda da liberao de Ca2+. A sensibilidade das protenas contrteis foi avaliada e observou-se que o LASSBio-294 aumenta a sensibilidade das protenas plasmticas das fibras dos ratos infartados. Isso

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poderia contribuir ainda mais com efeito inotrpico da substncia sem elevar as concentraes de Ca2+ intracelular. No entanto a sua atividade sensibilizadora de Ca2+ s ocorre em concentraes abaixo daquelas observadas fisiologicamente que varia de >10-7 a 10-5<, o que em tese excluiria o efeito da substncia. No entanto, no se pode descartar a sua utilidade nos estgios mais avanados da doena onde os estoques absolutos de Ca2+ encontram-se reduzidos. Pode ser que durante essa fase o efeito do LASSBio-294 sobre a sensibilizao das protenas contrteis ao Ca2+ se torne fisiologicamente importante para o aumento da fora de contrao das clulas cardacas. Esses resultados demonstram que LASSBio-294 age como modulador da fora contrtil por um mecanismo completamente diferente dos j vistos na clnica atualmente, promovendo um efeito inotrpico positivo semelhante aos digitlicos nas fibras intactas remanescentes do corao infartado. O LASSBio294 surge como um agente promissor para o tratamento da IC, pois parece elevar a fora contrtil da fibra por um mecanismo duplo, sem o aumento na concentrao de Ca2+ intracelular, ou seja, pela sensibilizao das protenas contrteis e aumento da captao de Ca2+. Alm disso, atravs desse ltimo mecanismo a substncia eleva o lusitropismo na fibra muscular. A vantagem desse mecanismo que na IC, no s a funo sistlica cardaca encontra-se acometida, mas tambm o seu relaxamento, portanto a administrao de LASSBio-294 pode facilitar o enchimento do ventrculo, contribuindo para reduo da presso de enchimento (FUKUTA; LITTLE, 2007, 2008). A queda na concentrao citoslica do Ca2+ provavelmente propiciada pela ao da substncia na fase diastlica tambm uma caracterstica muito importante. Sabe-se que a sobrecarga de Ca2+ no citosol altamente txica para a clula, podendo gerar espcies reativas de O2, provocar arritmias cardacas e ainda induzir a apoptose das clulas (TISSIER et al., 2008). Atualmente, os glicosdeos digitlicos so os frmacos que apresentam a maior eficcia nos pacientes da fase IV, no entanto, o seu uso implica um grande risco. A faixa teraputica dos digitlicos muito pequena quando comparada a de outros frmacos, no sendo incomum a ocorrncia de arritmias cardacas decorrente de sua administrao. Outro inotrpico positivo utilizado na clnica a dobutamina, responsvel por ativar os receptores , com certo efeito na vasodilatao e resistncia vascular perifrica. No entanto, sua eficcia nem

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sempre satisfatria, principalmente pelo fato dos receptores no estarem to responsivos por causa do efeito crnico da ativao adrenrgica

(LEINEWEBER; HEUSCH, 2009). E ainda seu uso ser mais restrito ao tratamento ambulatorial na IC descompensada. A dopamina tambm pode ser usada como inotrpico positivo, porm seus efeitos no sistema nervoso central limitam o uso contnuo sendo usado apenas em fases descompensadas (GILMAN et al., 2005). Alguns inibidores das fosfodiesterases, como a milrinona, so utilizados tambm em casos graves de IC, mas o seu uso no demonstrou resultados satisfatrios. O levosimendan vem demonstrando resultados muito positivos como cardiotnico nos pacientes com IC avanada. O levosimendan o sensibilizador de Ca2+ mais importante descoberto at o momento, sua ao via inibio de PDE3 tambm um fator importante para o tratamento do decrscimo da fora contrtil decorrente da IC (ENDOH, 2008). Endoh (2008) ainda indica uma possvel desvantagem deste frmaco por provocar distrbios na funo diastlica. Alm disso, seus efeitos no remodelamento ainda so pouco conhecidos. Esses fatores parecem garantir certa vantagem do LASSBio-294 sobre o mesmo, j que experimentalmente comprovou-se que o LASSBio-294 propicia o ajuste da funo sistlica e diastlica, e ainda do remodelamento cardaco. Os dados obtidos na patente (SUDO et al., 2006) ainda revelam que a substncia no apresentou efeito txico em uma dose correspondente dez vezes mais alta que a concentrao eficaz observada no estudo in vitro (100 M) por Sudo e outros (2001). Fato que eleva a sua vantagem sobre os digitlicos. Como muitos artigos demonstram que a queda da captao de Ca2+ pelo RS devido a reduo da atividade e/ou da expresso de SERCA (YAMAGUCHI et al., 1997; LEHNART; MAIER, 2009; YANG et al., 2009), quantificou-se a expresso da SERCA2a em homogeneizados de tecido ventricular esquerdo para observar os efeito de LASSBio-294 na sntese dessa protena. Os dados obtidos revelam que LASSBio-294 elevou a expresso de SERCA alm do valor controle, como observado nos resultados dos experimentos funcionais de captao com fibras desnudas. No entanto, os valores dos coeficientes de determinao (R2) obtidos entre a expresso de SERCA2a em funo da tenso isomtrica no tempo de carregamento de trinta segundos, juntamente com os dados in vitro observados anteriormente (SUDO

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et al., 2001) no descartam a hiptese de que a atividade enzimtica da protena (SERCA) tambm pode ser aumentada pela administrao de LASSBio-294. Essa funo poderia ser via modulao direta de PKA e CAMKinase II, ou via ativao dos receptores A(2A) e ainda atravs da modulao direta atravs de uma ligao estrutura da SERCA. Os distrbios moleculares que ocorrem durante a evoluo e instalao da IC acarretam problemas hemodinmicos, que por sua vez, induzem adaptaes deletrias, que geram mais sobrecarga no sistema cardiovascular at a falncia completa da bomba cardaca. Quando o IM transmural e extenso (> 50%), normalmente ocorre a queda intensa do dbito cardaco devido perda de massa muscular, sendo estabilizada logo em seguida (PFEFFER et al., 1979; MACKIEWICZ et al., 2009). Aliado a isso, as presses arteriais reduzem (PAS, PAD e PAM) e a PVDFE se eleva, dificultando o enchimento ventricular e elevando a ps-carga (NEKOOEIAN; TRABIZCHI, 1998). Nesse estudo observou-se que as presses arteriais mantiveram-se constantes, assim como a PVSFE de todos os grupos experimentais. No, entanto a PVDFE aumentou significativamente no grupo IM DMSO em relao ao grupo FO DMSO. Em contrapartida o grupo IM LASSBio-294 apresentou valores mais baixos, similares ao controle, demonstrando o efeito benfico da substncia em reparar o distrbio hemodinmico apresentado. Observa-se que, alm disso, os dados da contratilidade e relaxamento sistmicos do presente trabalho esto de acordo com os achados anteriores, ou seja, queda da dP/dtmx e elevao da dP/dtmin aps o IM. Esses resultados ratificam a credibilidade dos dados que sugerem que a substncia elevou tanto o inotropismo e lusitropismo positivos, melhorando o funcionamento do sistema cardiovascular. O fato de no ter sido observada uma reduo da PAS pode ter relao tanto com a rea de IM obtida nos ratos (PFEFFER et al.1979), quanto com outros ajustes hemodinmicos como, por exemplo, na resistncia perifrica total. Apesar de no podermos afirmar tal hiptese sem a medida da resistncia arterial, dados na literatura indicam que tanto a resistncia venosa e a arterial elevam aps o IM (XU et al., 2009). De um modo geral observou-se que o tratamento com LASSBio-294 (2 mg/kg) parece ter reduzido os efeitos deletrios induzidos pelo IM aps quatro semanas, como proposto na hiptese do trabalho.

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5 Concluso

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1. As funes do LASSBio-294 observadas nesse estudo sugerem a atividade condizente a de uma substncia agonista do receptor A(2), como por exemplo, a reduo da formao da fibrose cicatricial, do remodelamento tecidual e da sobrecarga hemodinmica observada aps o IM. 2. LASSBio-294 contratilidade parece ter outra funo a importante captao e de direta Ca2+ na e

cardaca,

aumentando

possivelmente impedindo a sobrecarga citoslica do mesmo. O aumento da captao de Ca2+ para o RS tambm poderia impedir a reduo do estoque celular do mesmo modo que ocorre numa fase avanada do IM. Consequentemente, a fora contrtil tambm se eleva devido a liberao de Ca2+ pelo RS decorrente de uma maior estocagem do mesmo. 3. O aumento da contratilidade promovido pelo tratamento com LASSBio294 aps o IM pode em parte ser justificado pela maior expresso da SERCA, que por sua vez explicaria o aumento da captao de Ca2+ pelo RS observado no ensaio de fibras desnudas. O aumento da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ tambm contribui para a melhora da contratilidade reduzida pelo IM. Baseado nos efeitos apresentados, acredita-se que o LASSBio-294 um excelente candidato para integrar futuras pesquisas no desenvolvimento de um novo frmaco para o tratamento da IC. - Esses dados foram publicados na revista American Journal of Hypertension em Nov de 2010:- Costa DG, da Silva JS, Kmmerle AE, Sudo RT, Landgraf SS, Caruso-Neves C, Fraga CA, de Lacerda Barreiro EJ, Zapata-Sudo G. LASSBio-294, A compound with inotropic and lusitropic activity, decreases cardiac remodeling and improves Ca(+) influx into sarcoplasmic reticulum after myocardial infarction. Am J Hypertens., 23 (11):1220-1227, 2010 __________________________________________________________

101

______________________________________________________________

6 Referncias

_______________________________________________________________

102

______________________________________________________________ ADAMS, P.F.; HEYMAN, K.M.; VICKERIE, J.L. Summary health statistics for the U.S. population: National Health Interview Survey, 2008. Vital Health Stat., vol. 243, no. 2, p.1-104, 2009.

AFZAL, N.; DHALLA, N.S. Differential changes in left and right ventricular SR calcium transport in congestive heart failure. Am. J. Physiol., vol. 262, no. 3, p. 868874, 1992.

AGABITI-ROSEI, E.; MUIESAN, M.L.; SALVETTI, M. New approaches to the assessment of left ventricular hypertrophy. Ther. Adv. Cardiovasc. Dis., vol. 1, no. 2, p. 119 128, 2007.

ALBERTS, B. et al. Mecanismos da comunicao celular. In: Biologia molecular da clula. 4. ed. Rio de Janeiro: Artmed, 2009.

ANKER, S.D.; VON HAEHLING, S. Inflammatory mediators in chronic heart failure: an overview. Heart, vol. 90, no.4, p. 464-470, 2004.

Heart disease and stroke statistics. Disponvel em <WWW.AMERICANHEART.ORG/STATISTIC> Acessado em Nov de 2010.

ASAKURA, M. et al. Rationale and design of a large-scale trial using atrial natriuretic peptide (ANP) as an adjunct to percutaneous coronary intervention for ST-segment elevation acute myocardial infarction: Japan-Working groups of acute myocardial infarction for the reduction of Necrotic Damage by ANP (JWIND-ANP). Circ. J., vol. 68, no. 2, p. 95-100, 2004.

ASAKURA, M. et al. Impact of adenosine receptor signaling and metabolism on pathophysiology in patients with chronic heart failure. Hypertens. Res., vol. 30, no. 9, p. 781-787, 2007.

BARREIRO, E.J. Strategy of molecular simplification in rational drug design: the discovery of a new cardioactive agent. Qum. Nova, vol. 25, no. 6B, p. 11721180, 2002.

BARRY, S.P.; DAVIDSON, S.M.; TOWNSEND, P.A. Molecular regulation of cardiac hypertrophy. Int. J. Biochem. Cell. Biol., vol. 40, no. 10, p. 2023-2039, 2008.

103

BERGH, C.H. et al. Intravenous levosimendan vs. dobutamine in acute decompensated heart failure patients on beta-blockers. Eur. J. Heart Fail., vol. 12, no. 4, p. 404-410, 2010.

BERRIDGE, M.J.; LIPP, P.; BOOTMAN, M.D. The versatility and universality of calcium signaling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., v. 1, no. 1, p. 11-21, 2000.

BERS, D.M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature, v. 415, no. 6868, p. 198-205, 2002.

BING, RJ. myocardial ischemia and infarction: growth of ideas. Cardiovasc. Res. , vol. 51, no. 1, p. 13-20, 2001.

BLAYNEY, L.M.; LAI, F.A. Ryanodine receptor-mediated arrhythmias and sudden cardiac Death. Pharmacol. Ther., v. 123, no. 2, p. 155-171, 2009.

BODOR, G.S., et al. Troponin I phosphorylation in the normal and failing adult human heart. Circulation, vol. 96, no. 5, p. 1495-1500, 1997.

BOLGER, A.P. et al. Effect of interleukin-10 on the production of tumor necrosis factor-alpha by peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic heart failure. Am. J. Cardiol., vol. 90, no. 4, p. 384-389, 2002.

BRAUNWALD, E. et al. Parte III Funes cardacas normais e anormais. In: Tratado de doenas cardiovasculares. 6. ed. Philadelphia: W.B Saunders, Company, 2001.

BRODDE, O.T.; MICHEL, M.C. Adrenergic and muscarinic receptors in the human heart. Pharmacol. Rev., v. 51, no. 4, p. 651-689, 1999.

BROOKS, G.A.; FAHEY, T.D.; BALDWIN, K.M. Cellular oxidation of pyruvate and lactate. In: Exercise physiology: Human bioenergetics and its applications. 4. ed. New York: Mcgraw-Hill, 2005.

CURRAN J., et al. Beta-adrenergic enhancement of sarcoplasmic reticulum calcium leak in cardiac myocytes is mediated by calcium/calmodulin-dependent protein kinase. Circ. Res., vol. 100, p. 391-398, 2007.

104

CHEN, Y. et al. Functional effects of enhancing or silencing adenosine A(2B) receptors in cardiac fibroblasts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., vol. 287, no. 6, p. H2478-H2486, 2002.

CHIONG, J.R.; CHEUNG, R.J. Loop diuretic therapy in heart failure: the need for solid evidence on a fluid issue. Clin. Cardiol., vol. 33, no. 6, p. 345-352, 2010.

DAS, A.; XI, L.; KUKREJA, R.C. Phosphodiesterase-5 inhibitor sildenafil preconditions adult cardiac myocytes against necrosis and apoptosis: essential role of nitric oxide signaling. J. Biol. Chem., v. 280, p. 1294412955, 2005.

DOVAL, H.C. et al. Randomized trial of low-dose amiodarone in severe congestive heart failure. (GESICA). Lancet, vol. 344, no. 8921, p. 489-490, 1994.

DUBEY, R.K. et al. Exogenous and endogenous adenosine inhibits fetal calf serum-induced growth of rat cardiac fibroblasts: role of A(2B) receptors. Circulation, vol. 96, no. 8, p. 2656-2666, 1997.

DUBEY, R.K.; GILLESPIE, D.G.; JACKSON, E.K. Adenosine inhibits collagen and protein synthesis in cardiac fibroblasts: role of A(2B) receptors. Hypertension, vol. 31, no. 4, p. 943-948, 1998.

ENDOH, M. Cardiac CA2+signaling and CA2+sensitizers. Circ. J., vol.72, no. 1, p. 1915-1925, 2008.

EPPERSON, S.A. et al. Adenosine receptors and second messenger signaling pathways in rat cardiac fibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol., vol. 296, no. 5, p. C1171-C1177, 2009.

FABIATO, A.; FABIATO, F. Calcium and cardiac excitationcontraction coupling. Annu. Rev. Physiol., v. 41, no. 1, p. 473484, 1979.

FERREIRA-MARTINS, J.; LEITE-MOREIRA, A.F. Physiologic basis and pathophysiologic implications of the diastolic properties of the cardiac muscle. J. Biomed. Biotechnol., 2010, No Prelo.

105

FRANGOGIANNIS, N.G.; SMITH, C.W.; ENTMAN, M.L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc. Res., v. 53, no. 1, p. 31-47, 2002.

FUKUTA H.; LITTLE, W.C. Contribution of systolic and diastolic abnormalities to heart failure with a normal and a reduced ejection fraction. Prog. Cardiovasc. Dis., v. 49, no. 9, p. 229240, 2007.

FUKUTA, H.; LITTLE, W.C. The cardiac cycle and the physiologic basis of left ventricular contraction, ejection, relaxation and filling. Heart. Fail. Clin., v. 4, no. 1, p. 111, 2008.

GALLAGHER, G. et al. Regional cardiac dysfunction is associated with specific alterations in inflammatory cytokines and matrix metalloproteinases after acute myocardial infarction in sheep. Bas. Res. Cardiol., v. 102, no. 1, p. 6372, 2006.

GILMAN A.G.;HARDMAN, J.G.;LIMBIRD L.E. Tratamento farmacolgico da insuficincia cardaca. In: As bases farmacolgicas da teraputica. 10. ed. Rio de Janeiro: Mcgraw-Hill Interamericana, 2005.

GUYTON, A.C; HALL, J.E. Tratado de fisiologia mdica. 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Coogan, 2006.

GYORKE, I.; GYORKE, S. Regulation of the cardiac ryanodine receptor channel by luminal Ca2+ involves luminal Ca2+ sensing sites. Biophys. J., v. 75, no. 6, p. 28012810, 1998.

HEADRICK, J.P.; LASLEY, R.D. Adenosine receptors and reperfusion injury of the heart. Handb. Exp. Pharmacol., v.193, no.1, p. 189-214, 2009.

HOLT, E. et al. Mechanisms of cardiomyocyte dysfunction in heart failure following myocardial infarction in rats. J. Mol. Cell. Cardiol. , v. 30, no. 8, p. 15811593, 1998.

HONG, J.Y. et al. The correlation between left ventricular failure and right ventricular systolic dysfunction occurring in thyrotoxicosis. Korean Circ. J., v. 40, no. 6, p. 266271, 2010.

106

HORI, M.; KITAKAZE, M. Adenosine, the heart, and coronary circulation. Hypertension, v. 18, no. 5, p. 565574, 1991. INESI, G.; PRASAD, A.M.; PILANKATTA, R. The Ca2+-ATPase of cardiac sarcoplasmic reticulum: Physiological role and relevance to diseases. Biochem. Biophys. Res. Commun. , v. 369, no. 1, p. 182187, 2008.

JIDEAMA, N.M. et al. Phosphorylation specificities of protein kinase C isoenzymes for bovine cardiac troponin I and troponin T and sites within these proteins and regulation of myofilament properties. J. Biol. Chem., v. 271, no. 38, p. 23277-23283, 1996.

KATZ, A.M. Physiology of the heart. 3. ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. KALRA, S.; KALRA, B.; AGRAWAL, N. Combination therapy in hypertension: An update. Diabetol. Metab. Syndr., v. 2, no. 1, p. 44, 2010.

KISHIMOTO, I. et al. Signaling via Guanylyl Cyclase (GC)-A: An Endogenous Protective Mechanism of the Heart. Curr. Cardiol. Rev., v. 5, no. 1, p. 45-5, 2009.

KITAKAZE, M. et al. Ischemic preconditioning increases adenosine release and 5-nucleotidase activity during myocardial ischemia and reperfusion in dogs. Implications for myocardial salvage. Circulation, v. 87, no. 1, p. 208-215, 1993.

KLOCKE, R. et al. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovasc. Res., v. 74, no. 1, p. 29-38, 2007.

KUBOTA, T. et al. Soluble tumor necrosis factor receptor abrogates myocardial inflammation but not hypertrophy in cytokine-induced cardiomyopathy. Circulation, v. 101, no. 1, p. 2518-2525, 2000.

LAM, L. et al. Differential protein expression profiling of myocardial tissue in a mouse model of hypertrophic cardiomyopathy. J. Mol. Cell. Cardiol., v. 48, no. 5, p. 1014-1022, 2010.

107

LEHNART, S.E.; MAIER, L.S. Abnormalities of calcium metabolism and myocardial contractility depression in the failing heart. Heart Fail. Rev., v. 14, no. 4, p. 213-224, 2009.

LEHTONEN, L.; PODER, P. The utility of levosimendan in the treatment of heart failure. Ann. Med., v. 39, no. 1, p. 2-17, 2007. LEINEWEBER, K.; HEUSCH, G. Beta 1- and beta 2-adrenoceptor polymorphisms and cardiovascular diseases. Br. J. Pharmacol., v. 58, no. 1, p. 61-69, 2009.

LEOSCO, D. et al. Exercise promotes angiogenesis and improves betaadrenergic receptor signaling in the post-ischemic failing rat heart. Cardiovasc. Res., v. 78, no. 2, p. 385-394, 2008.

LI, M.J. et al. Treatment with spironolactone for 24 weeks decreases the level of matrix metalloproteinases and improves cardiac function in patients with chronic heart failure of ischemic etiology. Can. J. Cardiol. , v. 25, no. 9, p. 523-526, 2009.

LI, P. et al. Myocardial infarction alters myofilament calcium sensitivity and mechanical behavior of myocytes. Am. J. Physiol., v. 272, no. 1, p. H360-370, 1997.

LUKYANENKO, V.; GYORKE, I.; GYORKE, S. Regulation of calcium release by calcium inside the sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes. Pflugers Arch., v. 432, no. 6, p. 10471054, 1996.

MA, T.K. et al. Renin-angiotensin-aldosterone system blockade for cardiovascular diseases: current status. Br. J. Pharmacol., v. 160, no. 6, p. 12731092, 2010.

MACGOWAN, G.A. Good news for mice with heart attacks: preventing acute myocardial injury by inhibiting apoptosis. Cardiovasc. Res., v. 81, no. 1, p. 12, 2009.

MACKIEWICZ, U. et al. Sarcolemmal Ca2+-ATPase ability to transport Ca2+ gradually diminishes after myocardial infarction in the rat. Cardiovasc. Res., v. 81, no. 3, p. 546 554, 2009.

108

MASON, J.W. A comparison of seven antiarrythmic drugs in patients with tachyarrhythmia. Electrophysiologic Study versus Electrocardiographic Monitoring Investigators. N. Engl. J. Med., v. 329, no. 7, p. 452458, 1993.

MEISSNER, G. Regulation of mammalian ryanodine receptors. Front. Biosci., v. 1, no. 7, p. d2072d2080, 2002.

MEHTA, P.A.; DUBREY, S.W. High output heart failure. QJM., v. 102, no. 4, p. 235241, 2009.

MINICUCCI, M.F. et al. Association between sphericity, ventricular function and size of the infarction in rats. Arq. Bras. Cardiol., v. 94, no. 5, p. 645650, 2010.

MIURA, T.; MIKI, T. Limitation of myocardial infarct size in the clinical setting: current status and challenges in translating animal experiments into clinical therapy. Basic. Res. Cardiol., v. 103, no. 6, p. 501513, 2008.

MONDEN, Y. et al. Soluble TNF receptors prevent apoptosis in infiltrating cells and promote ventricular rupture and remodeling after myocardial infarction. Cardiovasc. Res., v. 73, no. 4, p. 794805, 2007. NEARY, P. et al. Assessment of sarcoplasmic reticulum Ca2+ flux pathways in cardiomyocytes from rabbits with infarct-induced left-ventricular dysfunction. Pflugers Arch., v. 444, no. 3, p. 360371, 2002.

NEKOOEIAN, A.A.; TABRIZCHI, R.T. Hemodynamic effects of a selective adenosine A(2A) receptor agonist, CGS 21680, in chronic heart failure in anaesthetized rats. Br. J. Pharmacol., v. 125, no. 4, p. 651658, 1998.

OAKLEY, C.E. et al. Myosin binding protein C: structural abnormalities in familial hypertrophic cardiomyopathy. Cell Res., vol. 14, no. 2, p. 95-110, 2004.

ORENTLICHER, M. et al. Calcium binding and tension development in detergent-treated muscle fibers. J. Gen. Physiol., v. 63, no. 2, p. 168186, 1974.

PFEFFER, M.A. et al. Myocardial infarct size and ventricular function in rats. Circ. Res., v. 44, no. 4, p. 503512, 1979.

109

PIESKE, B. et al. Alterations in intracellular calcium handling associated with the inverse force-frequency relation in human dilated cardiomyopathy. Circulation, v. 92, no. 5, p. 11691178, 1995.

PINA, I.L. et al. Exercise and Heart Failure: A Statement From the American Heart Association Committee on Exercise, Rehabilitation, and Prevention. Circulation, v. 107, no. 8, p. 12101225, 2003. PIRKKO, S. et al. Time course of changes in the expression of DHPR, RyR2, and SERCA2 after myocardial infarction in the rat left ventricle. Mol. Cell. Biochem., vol. 303, no.1, p. 97-103, 2007.

PRIORI, S.G.; NAPOLITANO, C. Cardiac and skeletal muscle disorders caused by mutations in the intracellular Ca2+ release channels. J Clin Invest. v. 115, no. 8, p. 20332038, 2005. RAYA, T. et al. Serial changes in left ventricular relation and chamber stiffness after larger myocardial infarction in rats. Circulation, v. 77, no. 1, p. 1424-1431, 1988.

SAKAI, I. et al. Time course of left ventricular remodeling after myocardial infarction. A two-dimensional echocardiography study. Jpn. Circ. J., v. 64, no. 6, p. 421-429, 2000.

SANDMANN, S. et al. Calcium channel blockage limits cardiac remodeling and improves cardiac function in myocardial infarction-induced heart failure in rats. J Cardiovasc. Pharmacol., vol. 37, no. 1, p. 64-77, 2001.

SCHAPER, J. et al. Impairment of the myocardial ultrastructure and changes of the cytoskeleton in dilated cardiomyopathy. Circulation, v. 83, no. 2, p. 504514, 1991. SHAO, Q. et al. Sarcoplasmic reticulum expression Ca2+ transport and gene expression in congestive heart failure are modified by imipradil treatment. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., v. 288, no. 4, p. H1674-H1682, 2005.

SILVA, C.L.; NOEL, F.; BARREIRO, E.J. Cyclic GMP-dependent vasodilatory properties of LASSBio-294 in rat aorta. Br. J. Pharmacol., v. 135, no. 1, p. 293298, 2002.

SITSAPESAN, R.; WILLIAMS, A. Regulation of current flow through ryanodine receptors by luminal Ca2+. J. Membr. Biol., v. 159, no. 3, p. 179185, 1997.

110

SONG, L.S. et al. Orphaned ryanodine receptors in the failing heart. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 103, no. 11, p. 4305-4310, 2006.

SUDO, R.T.; ZAPATA-SUDO, G.; BARREIRO, E.J. The new compound, LASSBio-294, increases the contractility of intact and saponin-skinned cardiac muscle from Wistar rats. Br. J. Pharmacol., v. 134, no. 3, p. 603-613, 2001. SUDO, R.T. et al. US Patent n. 7,091,238B1, 21 jun. 2000, 15 agosto 2006. United States Patent. University of Maryland, Baltimore, MD,US. Thienylhydrazon with digitalis-like properties (Positive inotropic effect).

SUN, Y.; WEBER, K.T. Infarct scar: a dynamic tissue. Cardiovasc. Res., v. 46, no. 2, p. 250-256, 2000. 2000; 46:250256.

STELZER, J.E. et al. Differential roles of cardiac myosin-bidding protein C and cardiac troponin I in the myofibrillar force responses to protein kinase A phosphorylation. Circ. Res., v. 101, no. 5, p. 503-511, 2007.

STRUTHERS, A.D. Pathophysiology of heart failure following myocardial infarction. Heart, v. 91, no. supl. 2, p. ii14-ii16, 2005.

SWYNGHEDAUW, B. Molecular mechanisms of myocardial remodeling. Physiol. Rev., v. 79, no. 1, p. 215-262, 1999.

SWYNGHEDAUW, B. et al. Molecular mechanisms in evolutionary cardiology failure. Ann. N. Y. Acad Sci., v. 1188, no. 2, p. 58-67, 2010. TANG, J. In vitro pharmacology & ADME-Tox- Study of compound LASSBio294. CEREP., Study number 15180, p. 1-61, 2008.

TAKEISHI, Y. et al. Effect of angiotensin-converting enzyme inhibition on protein kinase C and SR proteins in heart failure. Am. J. Physiol., v. 276, no. 1, p. H53-H62, 1999.

TISSIER, R. et al. Making the heart resistant to infarction: how can we further decrease infarct size? Front Biosci. v.13, no. 1, p. 284-301, 2008.

TROIDL, C. et al. Classically and alternatively activated macrophages contribute to tissue remodeling after myocardial infarction. J. Cell. Mol. Med., v. 13, no. 9B, p. 3485-3496, 2009.

111

VILLARREAL, F. et al. Modulation of cardiac remodeling by adenosine: in vitro and in vivo effects. Mol. Cell Biochem., v. 251, no. 1-2, p. 17-26, 2003.

WALKER, L.A. et al. Stage-specific changes in myofilament protein phosphorylation following myocardial infarction in mice. J. Moll. Cell. Cardiol., v. 48, no. 6, p.1-7, 2009.

WEBER, K.T. From inflammation to fibrosis: A stiff stretch of highway. Hypertension. , v. 43, no. 4, p. 716-719, 2004.

WU, Y. et al. Calmodulin kinase is functionally targeted to the action potential plateau for regulation of L-type Ca2+ current in rabbit cardiomyocytes. J. Physiol., v. 554, no. Pt1, p. 145-155, 2004.

YAMAGUCHI, F.; SANBE, A.; TAKEO, S. Cardiac sarcoplasmic reticular function in rats with chronic heart failure following myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol., v. 29, no. 2, p. 753-763, 1997.

YANG, Y. et al. Beneficial effect of rouvastatin on cardiac dysfunction is associated with alterations in calcium-regulatory proteins. Eur. J. Heart. Fail., v. 11, no. 1, p. 6-13, 2009.

XU, Y. et al. Enhanced myogenic constriction of mesenteric artery in heart failure relates to decreased smooth muscle cell caveolae numbers and altered AT1- and epidermal growth factor-receptor function. Eur. J. Heart Fail., v. 11, no. 3, p. 246-255, 2009.

ZHANG G.X. et al. Effects of angiotensin type I receptor blockade on the cardiac Raf/MEK/ERK cascade activated via adrenergic receptors. J. Pharmacol. Sci., v. 113, no. 3, p. 224-233, 2010.