MTODOS DE DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DAS INFECES

Eliane de Oliveira Ferreira

Definio dos agentes etiolgicos Testes diagnsticos apropiados Terapias especficas

TEMPO

O papel do laboratrio de Microbiologia:

- Determinar a presena de patgenos potenciais nos tecidos, nos lquidos corporais ou nas secrees de pacientes. - Se presentes indentific-los;

- Indispensvel ao mdico;
- Prever a evoluo da infeco;

- Orientar a escolha da terapia apropriada;

Como obter todas essas informaes??

 Exame microscpico de espcimes obtidos do paciente; Cultura e identificao de mios a partir de espcimes obtidos do paciente; Determinao de uma resposta imune patgeno-especfica no paciente; Deteco de macromolculas patgeno-especficas em amostras do paciente; -Magnetude laboratrio. e confiabilidade da informao de cada

- S. aureus - facilmente detectveis

- T. gondii complexas medidas de estabelecimento de sua presena

OBJETIVOS DOS TESTES MICROBIOLGICOS

DIAGNSTICO DA INFECO E IDENTIFICAO DE PATGENOS ESPECFICOS DETERMINAO DA TERAPIA ADEQUADA TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA AVALIAO DA TERAPIA INSTITUDA DETERMINAO DE RISCO DOENA

QUANDO UTILIZ-LOS ???

Pacientes com doenas refratrias e recidivantes; Pacientes com doenas agressivas; Pacientes com comprometimento imunolgico e doenas sistmicas; No planejamento de procedimentos restauradores extensos; Na avaliao dos diferentes estgios de tratamento; Em estudos epidemiolgicos.

AVALIAO DOS TESTES DE DIAGNSTICO

DOENA
+ Falso positivo Negativo verdadeiro

+
TESTE -

Positivo verdadeiro

Falso negativo

SENSIBILIDADE = Positivo verdadeiro / Total com a doena x 100%

ESPECIFICIDADE= Negativo verdadeiro / Total sem a doena x 100%

- Definio: desempenho e o valor dos testes diagnsticos

- Na prtica: no existem testes diagnsticos 100% de sensibilidade e especifidade; - Combinao de testes: quando disponveis;

- Teste do diagnstico: influncia pela frequncia da infeco na populao

COLETA DAS AMOSTRAS

Mtodo de coleta - material adequado; Representatividade da amostra (qualidade e quantidade); Pureza (evitar contaminao); Coleta prvia ao uso de antimicrobianos; Estgio da doena (fase aguda/crnica); Meios de transporte; Tempo.

MTODOS CONVENCIONAIS
MICROSCOPIA TICA Utiliza luz visvel para visualizao de microrganismos; baixa resoluo; visualizao de microrganismos requer o uso de tcnicas de colorao

Tcnicas de colorao: Simples: positiva ou negativa Diferencial Gram Ziehl-Neelsen azul de metileno - Giemsa impregnao pela prata imunoperoxidase endosporo

- Patgenos: aspectos morfolgicos, colorao ou mobilidade caractersticos;

Identificados com preciso sensvel e especfico;

- A presena de bactrias em fluidos orgnicos estreis: urina, lquido pleural ou cefalorraquidiano (LCR);

- Diplococos Gram no interior de leuccitos no pus uretral = gonococo; o mesmo em LCR= meningococo.
- Menos til: locais no estreis microbiota normal; - Escarro contaminado (orofaringe) - Ziehl-Neelsen

MICROSCOPIA
FLUORESCNCIA CAMPO ESCURO
CONTRASTE DE FASE CONFOCAL

ELETRNICA

MTODOS TRADICIONAIS DE IDENTIFICAO DE MICRORGANISMOS ORAIS - CULTURA MICROBIANA Disperso Diluio Identificao fenotpica morfologia das clulas e colnias estruturas celulares tolerncia atmosfrica motilidade metabolismo bioqumico perfil proteico (SDS PAGE) Incubao

Sangue

Staphylococcus aureus

Sistemas automatizados Bactec

Api test

CULTURA Vantagens Identificao das espcies predominantes da microbiota (amplo espectro) Identificao de novas espcies (possveis patgenos) Determinao da proporo de diferentes espcies na microbiota Avaliao da susceptibilidade a antimicrobianos

CULTURA Desvantagens Alto custo Grande consumo de tempo Requerimento de pessoal treinado Inabilidade de identificar espcies no cultivveis ou de crescimento difcil Avaliao de nmero limitado de amostras Viabilidade da amostra (tempo da coleta at incubao proximidade com laboratrio)

Cromatografia lquido-gasosa (GLC/HPLC)

Anlise de produtos finais do metabolismo - cidos orgnicos e inorgnicos Anlise de lipopolissacardeos, c. graxos, c. miclicos Equipamento sofisticado, alto custo

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel eletrophoresis)

Anlise de ptns de superfcie, periplasmticas e totais variao na expresso de ptns resultante de fatores ambientais e tcnicos (padronizao do mtodo) interferem na sensibilidade/especificidade Difcil interpretao - significncia de pequenas diferenas (Gaston et al. 1988)

SODIUM DODECYL SULFATE - POLYACRILAMIDE GEL ELECTROPHORESIS (SDS PAGE)

+ SDS detergente protenas aninico bacteriana

corrente eltrica

Coomassie Staining

Impregnao pela prata

MW 1 2 3 4 5 6

kDa

195 111 59

MW MW 100 200 300 400

29 24 12 6.4

Western-Blotting
300 400

100

200

Oxidado 1o oxidado 1r reduzido Reduzido

Western blotting

Protenas de interesse.

MTODOS MODERNOS Tcnicas imunolgicas

Imunofluorescncia ELISA

Testes enzimticos
BANA

Tcnicas de biologia molecular Sondas de DNA PCR Sequenciamento / Microarray

DETECO DE ANTGENOS BACTERIANOS ATRAVS DO USO DE ANTICORPOS ESPECFICOS

IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA

anticorpo secundrio conjugado fluorescena

anticorpo primrio

bactria

ELISA fixando o antgeno na placa

ELISA fixando o Ac na placa

Ac1 especfico adio da suspeno bacteriana

Ac3 anti-Ac2 conjugado enzima

Ac2

adio do substrato colorimtrico

TCNICAS MOLECULARES BASEADAS NO DNA

Amplificao de DNA PCR; Hibridizao DNA-DNA; DNARNA; Perfil de Restrio - RPFL Sondas de DNA: Southern, Checkerboard, Ribotipagem Eletroforese de campo pulsado (PFGE) Sequenciamento

Extrao do DNA

Eletroforese

POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR (Reao em cadeia da polimerase)

Eletroforese

PCR
Amplamente utilizada; Excelente especificidade; Sensibilidade e limite de deteco; Microrganismos no viveis; rapidez; Nmero limitado de espcies identificadas; qualitativo Desvantagem: contaminao cruzada (microcontaminao); Preparo de sondas para hibirdizar o DNA-alvo.

ELETROFORESE
Gel de agarose Aplicao Fonte

Visualizao

SONDAS DE DNA - Hibridizao

Marcadas: radioistopos, digoxigenina, biotina, fluorescena;
Deteco: colorimtrica, quimioluminescncia, radioatividade, fluorescncia; Hibridizao com DNA complementar (homologia);

Especificidade e sensibilidade: quantidade do DNA alvo, sequncia de nucleotdeos, tamanho do fragmento;

Usadas em mtodos de slot-blot, dot-blot, colony-lift, southern blot, ribotipagem.

CONSTRUO DE SONDAS DE DNA

DESNATURAO

NUCLEOTDEOS DIG-UTP POLIMERASE

HIBRIDIZAO COM SONDAS DE DNA

LISE DAS CLULAS DESNATURAO DEPOSIO E FIXAO DO DNA NA MEMBRANA

SUSPENSO BACTERIANA

DNA EM SUSPENSO

INCUBAO COM SUBSTRATO E PRODUO DE LUZ DETECTADA NO FILME

INCUBAO COM ANTICORPO ANTI-DIG CONJUGADO ENZIMA

HIBRIDIZAO COM SONDA DE DNA ESPECFICA

RFLP- Restriction fragment lenght polymorphism

Transmisso de cepas orais entre membros da mesma famlia e regies geogrficas distintas- fidelidade de transmisso e predominncia de um clonotipo (zmeri et al. 1999)
P.gingivalis e P. intermedia - Loos et al. 1990 S. mutans (mes-filhos) - Caulfield e Walker 1989 P.gingivalis - van Steenbergen et al.1993 Aa - Petit et al. 1993

Petit et al. 1993 - 14 cepas de Aa isoladas de 3 membros de uma famlia (digesto com BamHi e PstI)

Enzimas de restrio

RFLP tcnica
Southern-blotting

Ribotipagem Revelao
Ribotipagem
Interao com a sonda

RIBOTIPAGEM Tcnica de REA e southern blotting dos genes que codificam o RNA r (16S e 23S) e ptns ribossomais; Genes do RNAr so conservativos e universalmente presentes em todas as espcies - uma nica sonda de RNAr pode ser aplicada na tipagem de vrios microrganismos; nmero menor de bandas - melhor interpretao; escolha da endonuclease;

Reproduzvel, discriminao moderada; Desvantagens: - Tempo na execuo, custo e laborioso;

Pulsed Field Gel Eletrophoresis (Schwartz e Cantor 1984) Separao fragmentos de DNA de grandes dimenses: endonucleases com baixa frequncia de sitios de restrio e direo alternada do campo eltrico permite a separao desses fragmentos;

Nmero pequeno de fragmentos - fcil interpretao; Mtodo altamente discriminatrio e reproduzvel; DNA ntegro - cls. bacterianas so colocadas em plugs de agarose; lise enzimtica e desnaturao protica; digesto do DNA no gel; Grande tempo de execuo; Alto custo; Mtodo de escolha para tipagem de MRSA, enterococos, C. difficile M. avium e entricos (Tenover et al. 1994)

Ribotipagem comparativa:

CLONAGEM TCNICA RECOMBINANTE

 Sequenciamento de DNA: mtodo padro para deteco de similaridades entre espcies baseado na sequncia de nucleotdeos do DNA cromossomal ou genes especficos amplificados - banco de dados GenBank (EUA) e EMBL (Cambridge, Inglaterra)
utilizado em combinao com o PCR - rapidez; dados estocados em bancos de dados genticos; a sequncia de DNA deve estar presente em todas as espcies e ter certo grau de variabilidade para comparao Ex.: micobactrias associadas doena disseminada em pacientes HIV/aidticos (Bttger et al. 1992)
Maxmam-Gilbert Sanger

Microarray ou gene array

- Coleo de DNAs microscpicos (cDNA) que representam certos genes;

- Quantitativo ou qualitativo: DNA-DNA ou DNA-RNA;

- Alta estringncia; - 10 a 390.000 sondas podem ser sintetizadas;

- Fragmentos de DNA genmico, cDNAs ou oligonucleotdeos fixados a uma superfcie slida (carga positiva);
- Aplicao nos spots feita por robs: 10.000 pontos/cm2 - Pesquisa: genmica funcional

MICROARRAY

CHECKERBOARD DNA-DNA HYBRIDIZATION

AVALIAO MICROBIOLGICA DE UM GRANDE NMERO DE AMOSTRAS DE PLACA BACTERIANA45 SONDAS DE DNA DE DIFERENTES ESPCIES, SIMULTANEAMENTE RPIDO E DE RELATIVO BAIXO CUSTO

SENSVEL (LIMITE DE DETECO DE 102 CLULAS BACTERIANAS)

103

NO REQUER A PRESENA DE MICRORGANISMOS VIVEIS

CHECKERBOARD DNA-DNA HYBRIDIZATION

Socransky et al. BioTechniques 1994

PREPARAO DAS AMOSTRAS

MiniSlot

Colocar amostra em 150l buffer TE pH 7.6

Adicionar 100l NaOH 0.5M Ferver durante 10 minutos

Canaleta aberta Membrana de nylon filtro

Adicionar 800l Acetato de Amnia 5M Depositar amostras nas canaletas do MiniSlot fixar DNA na membrana a 120 por 20 min

HIBRIDIZAO
MiniBlotter
Sondas de DNA genmicas marcadas com digoxigenina Prehibridizao a 42C 1 hr. Girar membrana 90 Hibridizao em buffer de formamida a 42C 16 hrs. Lavado de alta adstringncia em buffer SSC 0.4M a 68C 40min. Anticorpo contra digoxigenina conjugado fosfatase alcalina (1:15.000) Deteco por quimioluminescncia com CDPStar em filme RX

Canaletas de hibridizao

Membrana de nylon

RELAO SONDAS - AMOSTRAS

Sondas de DNA

Amostras de Placa

Identificao positiva (Sinal)

Sondas de DNA

Amostras de placa bacteriana

CHECKERBOARD DNA-DNA HYBRIDIZATION

PODE SER UTILIZADO EM COMBINAO COM OUTRAS TCNICAS ( EX.: CULTURA, PCR, 16S rRNA ) DE FCIL PROCESSAMENTO AMOSTRAS PODEM SER ARMAZENADAS POR LONGOS PERODOS DE TEMPO ANTES DA SONDAGEM PERMITE A REMOO DAS SONDAS DE DNA E A HIBRIDIZAO COM UMA NOVA BATERIA DE SONDAS STRIPPING

CHECKERBOARD DNA-DNA HYBRIDIZATION

CONSTITUI UMA TCNICA DE GRANDE APLICABILIDADE NO DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE INFECES PERIODONTAIS, ASSIM COMO OUTRAS DOENAS INFECCIOSAS POSSIBILITA A EXECUO DE EPIDEMIOLGICOS E LONGITUDINAIS ESTUDOS

PERMITE A APLICAO DE TERAPIAS MAIS ADEQUADAS E A AVALIAO LONGITUDINAL DESSAS TERAPIAS

LIMITAES DA TCNICA DO CHECKERBOARD

IDENTIFICA SOMENTE MICRORGANISMOS PARA OS QUAIS SONDAS DE DNA FORAM CONFECCIONADAS REAO CRUZADA COM ESPCIES FILOGENETICAMENTE MUITO PRXIMAS NO PERMITE AVALIAO DE SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA

CHECKERBOARD + CULTURA

MICRORGANISMOS NO IDENTIFICADOS SEQUENCIAMENTO TESTES FENOTPICOS DO 16S rRNA

CHECKERBOARD + PCR
AMOSTRA DE PLACA SUBGENGIVAL

AMPLIFICAO DE SEQUNCIAS DE DNA DE DIFERENTES ESPCIES UTILIZANDO-SE PRIMERS ESPECFICOS

HIBRIDIZAO COM SONDAS DE OLIGONUCLEOTDEOS ESPECFICAS PARA AS DIFERENTES SEQUNCIAS AMPLIFICADAS UTILIZANDO-SE O CHECKERBOARD

Microbial profiles in clinical samples

Health NUP Periodontitis

Streptococcus spp.

Granulicatella adacens

Tannerella forsythensis Porphyromonas gingivalis Porphyromonas clone BB134 Capnocytophaga sputigena

CARACTERSTICAS DAS DIFERENTES TCNICAS DE DIAGNSTICO

MTODOS VANTAGENS DESVANTAGENS Alto custo Consome tempo Requer pessoal treinado Requer bactria vivel No detecta espcies no cultivveis ou de difcil cultivo

CULTURA

Detecta o maior espectro de diferentes espcies Determina susceptibilidade antimicrobiana Identifica espcies Limite de deteco 103 - 105 cls.

TESTES IMUNOLGICOS E SONDAS DE DNA

Determinam um nmero Relativo baixo custo e rpidos limitado de espcies Identifica espcies No determinam susceptibilidade No requerem a presena de antimicrobiana microrganismos viveis Reao cruzada entre espcies do 2 4 Limite de deteco de 10 - 10 cls. mesmo gnero Alta sensibilidade e especificidade Identifica espcies No requere a presena de microrganismos viveis Limite de deteco de 10 cls. Relativo alto custo Requer pessoal treinado e equipamentos adequados No determina susceptibilidade antimicrobiana Determinam um nmero limitado de espcies

PCR

TESTES MICROBIOLGICOS PARA INFECES ENDODNTICAS

casos refratrios - determinao da etiologia e antibiograma pacientes de risco - imunodeprimidos, problemas cardacos avaliao da cadeia assptica limitaes dos testes de uso rotineiro: mtodos de cultura em anaerobiose so custosos; dificuldades da coleta de material (presena de bactrias em canais laterais, nmero de clulas bacterianas insuficiente); turvao no identifica espcies utilizao de mtodos modernos: PCR e sondas de DNA

CONCLUSES
- Vrias tcnicas diferentes; - Todos os mtodos so sujeitos a falta de preciso;

- Alguns testes so sensveis ou mais especficos: determinao do mtodo a ser utilizado;

- Nem sempre a presena de um microrganismo ou anticorpos na amostra indica infeco ativa ou causa da doena; - Interpretao de um teste microbiolgico;

- Anlise final: interpretao dos resultados pelo mdico x contexto da doena.