UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANALISIS

Importancia de las Citocinas

M O N O G R A F I A

Que para obtener el Ttulo de:

LICENCIADO EN QUIMICA CLINICA

i

i .nrfCa

Presenta:

ROSA M ARIA P ER A LTA V A Z Q U E Z

Asesor:
Q.C. SAN D R A MURRIETA

X A LAPA, VER.

1999.

AGRADECIMIENTOS.

A DIOS Por su amor, su f y su compaa.

A MIS PADRES Abel y Mercedes con mucho cario, por haberme permitido concluir mis estudios y por contar con ellos en todo momento.

A MIS HERMANOS Abel y Claudia por crecer juntos y por estar conmigo cuando ms los necesito.

A RAFAEL Con mucho amor, te agradezco el ser mi estmulo y tu apoyo incondicional para la realizacin de esta tesis.

A SANDRA MURRIETA Por ser una gran compaera y la asesora de este trabajo.

AL HONORABLE JURADO: Q.C. HECTOR ESCOBAR HENRIQUEZ. Q.C. SANDRA LUZ GONZALEZ HERRERA. Q.C. MARIA TERESA CRODA TODD. DR. FRANCISCO MALPICA.

INDICE:
CAPITULO UNO. 1 - CITOCINAS. 1 .1 - Definicin de citocinas. 1.2 - Descubrimiento y caracterizacin. 1 .3 - Propiedades generales. 1.4 - Funciones generales. 1.5 - Nomenclatura y clasificacin. 1.6 - Bioqumica y fisiologa. Pag. i OliOT? > I r i \ * n
1 1 2

3 5
6

CAPITULO DOS. 2 - CITOCINAS QUE MEDIAN LA INMUNIDAD NATURAL. 2.1 - Interfern tipo 1. 2.2 - Factor de necrosis tumoral. 2.3 - Interleucina-1. 2.4 - Interleucina - 6 . 2.5 - Quimiocinas.

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CAPITULO TRES. 3 - CITOCINAS QUE REGULAN LA ACTIVACIN, PROLIFERACIN Y DIFERENCIACIN LINFOCITARIA. 3.1 - Interleucina-2. 3.2 - Interleucina -4. 3.3 - Factor transformador de crecimiento |3

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CAPITULO CUATRO. 4 - CITOCINAS QUE REGULAN LA INFLAMACIN DE ORIGEN INMUNITARIO. 4.1 - Interfern y 4.2 - Linfotoxina. 4.3 - Interleucina-10. 4.4 - Interleucina -5. 4.5 - Interleucina-12. 4.6 - Factor de inhibicin de la migracin. CAPITULO CINCO. 5 - CITOCINAS QUE ESTIMULAN LA HEMATOPOYESIS 5.1 - Ligando de c-KIT. 5.2 - Interleucina -3. 5.3 - Factor estimulador de colonias de granulocitos-macrfagos 5.4 - Factor estimulador de colonias de monocitos-macrfagos. 5.5 - Factor estimulador de colonias de granulocitos. 5.6 - Interleucina-7. 5.7 - Otras citocinas estimuladoras de colonias.

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CAPITULO SEIS. 6 - ALGUNOS TEMAS CLNICOS RELACIONADOS CON LAS CITOCINAS 6.1 - Mielopoyesis. 6.2 - Oncologa. 6.3 - Produccin de citocinas por los tumores. 6.4 - Citocinas en el tratamiento de cncer. 6.5 - Citocinas en el caso de sepsis. 6.6 - Otro rol: las vacunas.

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CAPITULO SIETE. 7 - ENSAYOS Y BIOENSAYOS. 7.1 - Ensayos. 7.2 - Bioensayos. 7.3 - Inmunoensayos. 7.4 - Ensayos de Citocinas (ELISA y LIA). 7.5 - La necesidad de una estandarizacin. 7.6 - Aplicaciones clnicas.

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CONCLUSIONES. BIBLIOGRAFIA.

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CAPITULO UNO.
1.1 - DEFINICION: Las atocinas son protenas de tamao pequeo a mediano glicoprotenas utilizadas por las clulas inmunes e inflamatorias para comunicarse entre s y para controlar el medio interior en el cual operan, con actividades potentes y biolgicas diversas. La evidencia reciente sugiere que stas son de inmensa importancia para controlar los sucesos locales y sistmicos de la respuesta inmune, la inflamacin, hemopoyesis, el desarrollo neonatal y seo, reparacin de heridas (respuesta sistmica a la lesin), y las interacciones entre las diferentes vas biolgicas. Las atocinas pueden ser producidas como molculas precursoras grandes que pueden ser procesadas mediante la protelisis mediada por las enzimas hacia las formas de peso molecular ms bajo. En ciertos ejemplos la forma precursora ms grande es inactiva, mientras que las otras formas precursoras pueden tener actividad biolgica. Las mitades de carbohidratos de las citocinas glicosiladas no parecen ser necesarias para la actividad biolgica, pero pueden afectar su farm acodinam ia.(3,5) Las citocinas son molculas secretadas caractersticamente en varias cantidades, las cuales son rpidamente sobrereguladas en respuesta a varios estmulos ambientales (incluyendo las concentraciones aumentadas de otras citocinas). Estas pueden tener efectos sobre sus clulas de origen (efectos autcrinos), sobre clulas adyacentes de otros tipos (efectos parcrinos) sistemticamente (efectos endocrinos). En general, las citocinas se sintetizan en respuesta a estmulos inflamatorios antignicos y actan en forma local, de manera autcrina parcrina como se mencion anteriormente, unindose a receptores de alta afinidad de las clulas diana. Ciertas protenas pueden producirse en una cantidad suficiente para circular y ejercer acciones endocrinas. El trmino citocina describe a un grupo de pptidos con efectos inmunorregulatorios, siendo estos pptidos distintos de los factores de crecimiento que modulan la proliferacin de clulas no inmunes. Numerosas enfermedades pueden ser explicadas basndose en una produccin no balanceada de citocinas. Su secrecin anormal puede prolongar los estragos patolgicos, mientras que ciertas enfermedades pueden ser exacerbadas causadas por la secrecin anormal de citocinas, como un fenmeno secundario despus de un suceso iniciador, tal como la infeccin viral bacterial. Las anormalidades en la produccin de las citocinas estn involucradas en las enfermedades mediadas por clulas inmunes, tales como las alergias, el asma extrnseco, artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistmico, sndrome de Sjogrin, la

pancitopenia autoinmune y la psoriasis. Estas estn involucradas en las malignidades tales como el mieloma mltiple, la leucemia aguda, la leucemia linfoctica crnica, la enfermedad de Hodking, el linfoma de Burkitt y la enfermedad de Castleman. La produccin anormal de citocinas ocurre en las enfermedades inflamatorias incluyendo la pancreatitis, el sndrome de fuga capilar, la mielodisplasia, el mixoma cardiaco, la osteoporosis, rechazo de injertos, la curacin de heridas, la falla renal y la malaria cerebral.(3,5)'

1.2 - DESCUBRIMIENTO Y CARACTERIZACIN. El descubrimiento de una citocina puede relacionarse con la investigacin de una enfermedad infecciosa de una respuesta inmunitaria inducida por un antgeno. Los primeros estudios sobre las citocinas se realizaron a partir de 1950 y las describan como numerosos factores proteicos producidos por diferentes clulas que mediaban funciones particulares en bioanlisis particulares . (12 20> En la segunda fase de investigacin, en la dcada de los 70s se llev a cabo la purificacin y caracterizacin parcial de muchas citocinas y se observ primero que diversos efectos mediados por citocinas, estaban a menudo producidos por las mismas molculas. Por ejemplo: El Interfern (IFN-y) fue descubierto por virlogos como una protena antiviral derivada de la clula T y de forma independiente por inmunlogos como activador de las funciones de los macrfagos derivados de las clulas T . ( )' Una importante hiptesis generada en ese momento fue que las citocinas eran sintetizadas principalmente por leucocitos que actuaban bsicamente sobre (otros) leucocitos y por ello las denominaron interleucinas (IL). Por ejemplo: A un coestimulador de la actividad de los timocitos derivados de los macrgafos se le llam IL-1, y a un factor de crecimiento derivado de la clula T se le llam IL-2. No obstante las preparaciones de citocinas de las que se disponan en ese tiempo solan ser impuras, y muchos de los anticuerpos anticitocina no eran absolutamente especficos de esta citocina, por lo que fue una de las limitantes metodolgicas que evitaron la identificacin firme de los factores activados como la misma molcula molculas distintas. La edad de oro de las investigaciones de las citocinas fue en la dcada de los 80s donde se realiz la clonacin y expresin molecular de citocinas individuales y la produccin de anticuerpos neutralizantes completamente especficos, a menudo

monoclonales. Esto permiti una identificacin propiedades de la molcula de citocina. (12'20)-

definitiva

de

la estructura

En esta etapa de investigacin, fue ms que una culminacin del trabajo previo, porque adems, se descubrieron muchas citocinas nuevas y se revelaron muchas propiedades inesperadas de citocinas conocidas. Los ltimos 50 aos han presenciado el reconocimiento y caracterizacin de muchas hormonas producidas por clulas especializadas. Desde los experimentos de Rich y Lewis en 1932, sin embargo, ha estado claro que las clulas con funciones especficas tales como la inmunidad y la fagocitosis son capaces de producir molculas de sealamiento solubles.(20)El desarrollo de la tecnologa de DNA en los ltimos 10 aos se ha convertido en una serie de factores y actividades que ha demostrado que est formado por un gran nmero de pptidos bien definidos que llevan los signos de actividad, crecimiento y diferenciacin de un amplio rango de clulas. Su importancia en el diagnstico y tratamiento de la enfermedad es probablemente enorm e.(9)'

1.3 - PROPIEDADES GENERALES. Aunque las citocinas son un grupo de diversas protenas, comparten varias propiedades... I) Las citocinas se producen durante las fases efectoras de la inm unidad natural y especfica, y sirven para m ediar y regular las respuestas inm unitarias e inflam atorias. En la inmunidad natural, los productos microbicidas, como el lipopolisacrido (LPS), estimulan directamente a los fagocitos mononucleares a secretar sus citocinas. Por el contrario las citocinas derivadas de las clulas T se producen en respuesta sobre todo al reconocimiento especfico de antgenos extraos. Sin embargo, estas distinciones no son absolutas porque las citocinas producidas por un tipo celular suelen regular la sntesis de citocinas por otras clulas. La secrecin de citocinas es breve, autolimitada. En general, las citocinas no se almacenan como molculas pre-formadas, y su sntesis se inicia por una nueva transcripcin gentica. Esta activacin suele ser transitoria, y los RNAm que modifican las citocinas suelen ser inestables. La combinacin de un periodo corto de transcripcin con un RNAm de vida corta, asegura que la sntesis de citocinas sea transitoria. Algunas citocinas pueden controlarse adems por ciertos mecanismos, como la liberacin proteoltica de un producto activo a partir de un precursor inactivo. Una vez sintetizadas, las citocinas suelen secretarse con rapidez, lo que d lugar a un pico de liberacin de citocinas cuando se necesita.

II)

III)

Muchas atocinas son producidas po r muchos tipos celulares. La fuente celular de estas molculas no suele ser una caracterstica que las distinga. Pero como ya se ha mencionado entre las clulas que intervienen en su formacin estn los fagocitos mononucleares, linfocitos T activados y linfocitos. Las citocinas actan sobre diferentes tipos celulares. Esta propiedad se llama pleiotrofismo. Al concepto de que las citocinas son bsicamente molculas producidas por los leucocitos que actan en particular sobre los leucocitos (interleucinas) se le considera demasiado restringido. Las citocinas tienen a menudo m ltiples efectos diferentes sobre la misma clula diana. Algunos efectos pueden ser simultneos, mientras que otros ocurren en franjas de tiempo diferentes(es decir, minutos, horas o d a s ).(3,5) Las acciones de las citocinas son a menudo redundantes. Muchas funciones atribuidas originalmente a un a citocina comparten propiedades de varias citocinas diferentes. Esta observacin se ha reforzado con el estudio de los ratones =Knock-out= que carecen de genes de una citocina particular que puede mostrar solo alteraciones sutiles en sus respuestas inmunitarias, Las citocinas a menudo influyen en la sntesis de otras citocinas. Produciendo cascadas en las que una segunda o tercera citocina pueden mediar los efectos biolgicos de la primera. La capacidad de una citocina de aumentar o suprimir la produccin de otras citocinas puede proporcionar importantes mecanismos reguladores positivos y negativos para las respuestas inmunitarias e inflamatorias. Las citocinas a menudo influyen en la accin de otras citocinas. Dos citocinas pueden interaccionar para antagonizar sus acciones, producir efectos aditivos , en algunos casos, producir efectos mayores de los previstos e incluso distintos, un tipo de accin que se llama sinrgica. Las citocinas, como otras hormonas polipeptdicas, inician su accin unindose a receptores especficos en la superficie de la clula diana. La clula diana relevante puede ser la misma clula que secreta la citocina (accin autcrina) una clula cercana (accin parcrina) o, como las verdaderas hormonas, una clula distante que se estimula a travs de las citocinas secretadas a la circulacin (accin endocrina). En consecuencia solo necesitan producirse cantidades muy pequeas de citocinas para desencadenar efectos biolgicos. La expresin de muchos receptores de citocinas est regulada p o r seales especficas. Esta seal puede ser otra citocina incluso la misma citocina que se une al receptor, permitiendo la amplificacin positiva la retroalimentacin ne gativa .(3,5)-

IV)

V)

VI)

VII)

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IX)

X)

XI)

La m ayor parte de las respuestas celulares a las atocinas precisan RNAm nuevo y la sntesis proteica. El mecanismo por el que la unin de la citocina a un receptor de superficie celular estimula transcripcin se explicar ms detalladamente. Algunos estudios recientes han identificado secuencias de nucletidos en las regiones adyacentes a los genes, cuya transcripcin se activa por la accin de las citocinas. Se cree que las citocinas estimulan la produccin la unin de factores nucleares reguladores especficos a estas secuencias diana, y que tal unin produce la transcripcin. Para muchas clulas diana, las citocinas actan como reguladores de la divisin celular, es decir, como factores de proliferacin. Algunos inmunlogos prefieren que las citocinas se clasifiquen con los factores de proliferacin celular epitelial y mesenquimal en un grupo funcional mayor de molculas reguladoras polipeptdicas. Sin embargo ahora se prefiere separar a aquellas molculas cuyas acciones bsicas son la mediacin de la defensa del husped (es decir, las citocinas), de aquellas molculas cuya funcin bsica reside en la reparacin de tejidos (es decir, los factores de proliferacin celular polipeptdicos epitelial y mesenquimal). (3'5)'

XII)

1.4 - FUNCIONES GENERALES. A continuacin, se han organizado a las citocinas especficas en 4 clases de funciones amplias: A) M ediadores de la Inm unidad natural. Desencadenadas por agentes infecciosos a partir de los fagocitos mononucleares. En donde se encuentran: Interfern tipo 1. Factor de necrosis tumoral. lnterleucina- 1 . lnterleucina- 6 . Quimiocinas. B) Citocinas que regulan la activacin, proliferacin y diferenciacin linfocitaria. Que surgen en respuesta al reconocimiento de antgenos especficos por los linfocitos: lnterleucina- 2 . lnterleucina-4. Factor transformador del crecimiento (5 C) Reguladoras de la inflam acin de origen inmunitario. Que activan a clulas inflamatorias inespecficas en respuesta a antgenos especficos por los linfocitos T: Interfern y. Linfotoxina. lnterleucina- 10 . lnterleucina-5. lnterleucina- 12 .

D) a to c in a s que estim ulan la proliferacin y diferenciacin de los leucocitos inm aduros (hematopoyesis). Ligando de c-KIT: lnterleucina-3. Factor estimulador de colonias de granulocitos-macrfagos. Factor estimulador de colonias de monocitos- macrfagos. Factor estimulador de colonias de granulocitos. lnterleucina-7. Otras citocinas estimuladoras de colonias. Esta clasificacin se basa en las que perecen ser las principales de las diferentes acciones biolgicas de una citocina, aunque como se ver ms adelante, muchas citocinas pueden actuar en ms de una c la s e .< 5 )

1.5 - NOMENCLATURA Y CLASIFICACIN. Como ya se mencion l termino citocina ha sido utilizado para describir un grupo de pptidos con efectos inmunoregulatorios, siendo estos pptidos distintos de los factores de crecimiento que modulan la proliferacin de clulas no inmunes. Ahora se sabe que existe una considerable relacin funcional entre las citocinas y los factores de crecimiento. Por lo tanto, l termino factor regulador pptido es usado para describir las molculas de baja masa molecular (menor de 80 kD) que tiene un rango corto intermedio de accin, receptores especficos y la habilidad para controlar la diferenciacin y la proliferacin de las clulas, sin embargo, algunas hormonas clsicas particularmente entre el vientre y el cerebro tambin caen dentro de esta categora. Para el inters de los Qumicos Clnicos estn las Interleucinas (IL), los interferones (IFN), los factores de necrosis tum oral (TNFS), los factores de crecim iento hem opoyticos y los factores de crecim iento de colonias (CFS). No hay evidencia alguna que indique que las mediciones de los otros factores de crecimiento puedan ser aplicadas tilmente a los fluidos biolgicos; a pesar de los intentos para unificar la nomenclatura, la terminologa no est bien definida. El termino IL fue introducido para describir los productos de la conocida secuencia de aminocidos producida por linfocitos macrfagos, a pesar de esto, varios mediadores encajan en esta descripcin. Ejemplo: El factor de necrosis del tumor, los interferones y los factores de estimulacin colonial mantienen sus nombres originales.(3)

1.6 - BIOQUMICA y f is i o l o g a . A pesar del hecho de que la mayora de las citocinas han sido descritas e inicialmente nombradas en base a una simple funcin biolgica, muchas son molculas multifuncionales con diversas acciones biolgicas y clulas objetivo (diana). En general las funciones ms importantes parecen ser los efectos locales, modulando el comportamiento de las clulas adyacentes (parcrina) la clula que la secreta (autcrina), pero en algunos casos notablemente (IL-1, TNF e IL-6 ) hacen efectos significativos sobre rganos tejidos distantes (endocrina). En muchos casos hay duplicacin de funcin entre las citocinas, por ejemplo: IL-1 comparte actividades con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) sobre las clulas del msculo liso, con el factor de estimulacin colonial del macrfago (FEC-M) sobre las clulas hemopoyticas, con IL-6 sobre la induccin de protenas de fase aguda, y con el TNF e IL-6 en la induccin de fiebre. En general, las citocinas actan a travs de receptores de la superficie celular de alta afinidad, muchos de los cuales han sido duplicados y secuenciales. La mayora de las citocinas son glicosiladas (dando un aumento a la considerable heterogeneidad) y las mitades de azcares pueden ser importantes para el enlace receptor y la m odulacin.(3) Esto significa que los estudios funcionales de las citocinas recombinantes producidas en las bacterias (y por lo tanto no glicosiladas) pueden proveer solo una parte de la imagen. Algunos receptores de citocinas contienen un complejo de 7 dominios transmembranales que interactan con las protenas de enlace GTP. Las protenas de enlace GTP regulan las enzimas crticas en las diferentes vas de transduccin. Ejemplos son las enzimas fosfoionocitasa C, la cual lleva a la movilizacin del calcio y a la activacin de la proteina quinasa C, y la adenilatociclasa, la cual cataliza la conversin de ATP a AMPc. El receptor IL-1 est conectado a la adenilatociclasa y a la proteina quinasa-A por va de la proteina de enlace GTP en algunas clulas, la AMP es un segundo mensajero probable. Otros receptores de citocinas tienen un dominio intracelular con la actividad de la tirosinaquinasa. Muchas citocinas interactan entre s a nivel celular. Los efectos de la citocina sobre una clula pueden depender del medio de otras citocinas y hormonas. Esto lleva a la conclusin importante de que la regulacin celular por las citocinas depende de las circunstancias bajo las cuales la clula est viviendo en un momento particular. Los experimentos in vitro con citocinas simples hasta con combinaciones de citocinas pueden ser engaosos, y las mediciones de citocinas simples pueden revelar solo parte de la historia.< 3 )

CAPITULO DOS.
CITOCINAS QUE MEDIAN LA INMUNIDAD NATURAL. La inm unidad es la propiedad del organismo, en virtud de la cual este no desarrolla una enfermedad cuando entra en contacto una bacteria, virus toxina. La inmunidad puede ser natural adquirida (activa o pasiva). La inm unidad natural es la que el individuo posee desde el nacimiento y se basa en una serie de mecanismos que incluye la fagocitosis y las acciones de las citocinas. Las citocinas que median la inmunidad natural son aquellas que protegen contra la infeccin viral y aquellas que inician reacciones inflamatorias que protegen contra las bacterias. Las citocinas que veremos en este captulo se resumen en la siguiente tabla.
Citocina describir IFN tipo 1 a Num. de genes. 20 IFN-a 1 IFN-p de 1 Tamao del polipptido. 18 KD (monmero) 17 KD Homotrmero Fuentq celular. Fagocito mononuclear Fibroblasto Nuclear, clula T Clula diana. Todas. Efectos bsicos en cada clula diana Antiviral antiproliferativa.

Factores necrosis tumoral

17 KD Interlucina -1 2 (IL-tx.lL-P ) (monmero)

Fagocito mononuclear, otras

Clula.NK Neutrfilo C. endotelial hipotlamo hgado msculo timocito Timocito. C.encotelial Hipotlamo Hgado Msculo. Timocito Clula madura Hgado Leucocitos

Activacin Activacin (inflamacin)

Activacin, inflamacin coagulacin

lnterleucia-6

Quimiocinas

Fagocito mononuclear Clula endotelial clula T 20 genes 8-10 KD Fagocito en relacin (monmero) mononuclear Clula endolial Fibroblasto Clula T Plaquetas 1 26 KD homodmero

Fiebre Reactantes de fase aguda. Catabolismos (caquexia) Co-estimulador. Co-estimulador Activacin (inflamacin, coagulacin) Fiebre Reactantes de fase aguda. Catabolismo (caquexia) Co-estimulador B Proliferacin Reactantes de fase aguda Reactantes de fase aguda. Quimiotxis.y activacin de leucocitos

2.1 - INTERFERON TIPO 1. Los nterferones (IFN) son una familia de citocinas antivirales que pueden ser reguladores naturales negativos de crecimiento para varios tipos de clulas. Basndose en la secuencia de aminocido, son reconocidos 2 grupos del Interferon tipo 1 : 19) Interferon a para la cual hay 13 genes con cdigo para 15 protenas funcionales. Es producto celular mononuclear. 29) Interferon (3 Viene principalmente de los fibroblastos y clulas epiteliales. ) Interferon y: Inmunitario o gamma, producido por las clulas T. Se mencionar independientemente, tambin es conocido como Interferon II. Los nterferones a y p son inducidos por virus, bacterias y DNA de doble enlace, mientras que el Interferon y es inducido por mitgenos y antgenos. A pesar que solamente existen un 29% de homologa, el Interferon a y p usan el mismo receptor celular. Estos son antivirales, induciendo la sintetasa oligodenilatosa la cual causa una ruptura en RNAm. Adems son proliferativos para muchas lneas de clulas transformadoras y cnceres. Estas son estimuladoras potentes de clulas T naturalmente destructoras y citotxicas y sobreregulan los antgenos de clase 1 , MHC (complejo mayor de histocompatibilidad), mejorando el reconocimiento del antgeno. El IFN tipo 1 tiene 4 funciones biolgicas principales: Inhibe la replica viral: el IFN hacen que las clulas sinteticen varias enzimas, como la 2, 5 oligodenilato sintetasa, que interfieren con la replica del RNA y DNA viral. La Accin antiviral del IFN tipo l es bsicamente parcrina, ya que las clulas infectadas por virus secretan el IFN para proteger a las clulas vecinas todava no infectadas. De una clula que ha respondido al IFN y es resistente a la infeccin viral, se dice que est en su estado antiviral. Inhibe la proliferacin celular: Esto se debe a la inhibicin de las mismas enzimas que bloquean la replicacin viral, pero tambin pueden afectar a otras enzimas que evitan la sntesis de aminocidos, especialmente de aminocidos esenciales como el triptfano. Aunque los mecanismos pueden ser parcialmente diferentes, los efectos antivirales y antiproliferativos del IFN no pueden separarse. Se ha propuesto que el IFN-(3 es un inhibidor fisiolgico de la proliferacin celular normal. El IFN-a se utiliza como un agente proliferativo en ciertos tumores (por ejemplo, la leucemia de clulas peludas y los hemangiomas infantiles). Aum enta el potencial Utico de las clulas agresoras naturales (NK). Una de las funciones principales de las clulas NK es matar a las clulas infectadas por virus.

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Modula la expresin de molculas del MHC. En general, el IFN tipo 1 aumenta la expresin de molculas de clase 1 del MHC e inhibe profundamente la de molculas clase 2. Dado que la mayor parte de los linfocitos T citolticos (LTC) reconocen antgenos extraos unidos a molculas de clase 1 del MHC, el IFN tipo 1 estimula la fase efectora de las respuestas inmunitarias mediadas por clulas aumentando la eficacia de la lisis mediada por los LTC. Al mismo tiempo, el IFN tipo 1 puede inhibir la fase de reconocimiento de las respuestas inmunitarias evitando la activacin de los linfocitos T cooperadores restringidos por la clase 2 del MHC. (57'12)

De este modo, las principales actividades del IFN tipo 1 son, principalmente la induccin del estado antiviral, la activacin de las funciones lticas de las clulas NK, y el aumento de la expresin de las molculas de clase 1 del MHC en las clulas infectadas por virus, todas ellas coordinadas para erradicar las infecciones virales. Hay muchas razones para creer que los interferones son agentes importantes naturales antivirales y controladores negativos del crecimiento de clulas. Su importancia en la enfermedad humana se relaciona principalmente a sus efectos antiproliferativos. Una de las aplicaciones teraputicas ms dramticas de las citocinas han sido las remisiones completas obtenidas mediante el IFN-a en la leucemia de las clulas velludas, desafortunadamente el IFN-a ha probado ser menos exitosa en otras enfermedades mieloproliferativas, pero es efectiva en la leucemia mieloide crnica y tiene alguna actividad en el mieloma y en los linfomas. La respuesta de los tumores slidos es desilucionante.(5,7,12)

2.2 - FACTOR DE NECROSIS TUMORAL. (FNT). El factor de necrosis tumoral (TNF, del: ingls, tumor necrosis factor) es el principal mediador de las respuestas del husped frente a las bacterias gramnegativas, y puede actuar tambin en la respuesta frente a otros microorganismos infecciosos. Algunos investigadores se refieren al TNF como TNFa, y a la Linfotoxina (LT) como TNF-0; aqu utilizaremos los trminos como TNF y LT. Los componentes activos de las bacterias gramnegativas son las molculas de lipopolisacridos (LPS), tambin llamada endotoxina, derivadas de la pared celular bacteriana. El TNF se identific originalmente y as se le llam, como un mediador de la necrosis tumoral presente en el suero de animales tratados con LPS. A bajas concentraciones, El LPS estimula las funciones de los fagocitos mononucleares del husped que contribuyen a la eliminacin de las bacterias invasoras. Sin embargo, concentraciones altas de LPS producen lesin tisular, coagulacin intravascular diseminada (CID) y shock, a menudo provocando la muerte, por lo que se puede decir que el TNF es uno de los principales mediadores de estos efectos del LPS. (1-91 3 )

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La principal fuente celular del TNF es el fagocito mononuclear activado por el IP S , aunque las clulas T activadas por el antgeno, las clulas NK activadas y los mastocitos activados pueden secretar tambin esta protena. El IFN-y producido por las clulas T, aumenta la sntesis TNF por los fagocitos mononucleares estimulados por el LPS. De este modo, el TNF es un mediador de la inmunidad natural y adquirida, y un importante nexo entre las respuestas inmunitarias especficas y la inflamacin aguda. (1'9'22) La sntesis del TNF es inducida por productos bacteriales tales como la endotoxina, la protena 1 de choque txico y las protenas micobacteriales. En general, actuando solo el TNF produce un rango de efectos proliferativos de clulas, la activacin de las funciones celulares, y la expresin de enzimas y macromolculas. Los aspectos ms importantes del TNF son sus efectos citolticos y citoestticos; los cuales son fuertemente expresados cuando el TNF acta en sinergia con el IFN-y. Esta combinacin es citotxica para un amplio rango de clulas transformadas y para las clulas normales epiteliales y endoteliales. El TNF es uno de los mejores ejemplos cuyas funciones son moduladas, inducidas y hasta invertidas en la presencia de otras citocinas.(1,9) Los efectos fisiolgicos ms importantes del TNF son los siguientes: Produce la expresin en las clulas endoteliales vasculares de receptores de superficie nuevos (molculas de adhesin), que hacen a la superficie endotelial adherente a los leucocitos, inicialmente para los neutrfilos y despus para los monocitos y linfocitos. El TNF acta tambin sobres los neutrfilos para aumentar su adherencia a las clulas endoteliales. Estas acciones contribuyen a la acumulacin de leucocitos en los lugares de inflamacin, y probablemente son los efectos fisiolgicos ms importantes del TNF. Activa a los leucocitos inflamatorios para que maten a microorganismos. El TNF es especialmente potente en la activacin de los neutrfilos, pero tambin afecta a eosinfilos y fagocitos mononucleares. Estimula a los fagocitos mononucleares y a otros tipos de clulas a producir citocinas, como la IL-1, la IL-6 , el propio TNF y a las quimiocinas. Ejerce un efecto protector similar al del interfern contra los virus, y aumenta la expresin de molculas de clase I del MHC, potenciando la lisis de clulas infectadas por virus por los LTC.(1,9,22)

Estos efectos del TNF son crticos para las respuestas inflamatorias frente a los microorganismos. Si estn presentes cantidades inadecuadas de TNF, por ejemplo, en animales tratados con anticuerpos anti-TNF neutralizantes, puede que no se contengan las infecciones. Si el estmulo para la produccin de TNF es suficientemente fuerte, se producen mayores cantidades de citocinas. En esta

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situacin, el TNF entra en el torrente sanguneo, donde puede actuar como una hormona endocrina. Las acciones sistmicas principales del TNF en las respuestas fisiolgicas del husped a las infecciones son las siguientes: El TNF es un pirgeno endgeno que acta sobre clulas de regiones reguladoras del hipotlamo para inducir fiebre. Comparte esta propiedad con la IL-1, y ambas citocinas se encuentran en el suero de personas animales expuestas al LPS, que acta como un pirgeno exgeno. La produccin de fiebre en respuesta al TNF la IL-1 est provocada por una sntesis aumentada de prostaglandinas en las clulas hipotalmicas, estimuladas por las citocinas. Los inhibidores de la sntesis de prostaglandinas, como la aspirina, reducen la fiebre al bloquear esta accin del TNF y la IL-1. El TNF acta sobre los fagocitos mononucleares y quizs sobre las clulas endoteliales vasculares para estimular la secrecin de IL-1 e IL-6 a la circulacin. Este es un ejemplo de una cascada de citocinas que comparten muchas actividades biolgicas. El TNF acta sobre los hepatocitos para aumentar la sntesis de ciertas protenas sricas, como la protena A. Este espectro de protenas del hepatocito inducidas por el TNF es idntica al de la IL-1, aunque difiera del inducido por la IL -6 (que se describir ms adelante). La combinacin de protenas plasmticas derivadas del hepatocito inducidas por el TNF la IL-1, ms las inducidas por la IL-6 , constituye la respuesta de fase aguda a los estmulos inflamatorios. El TNF activa el sistema de coagulacin, bsicamente alterando el equilibrio entre actividades procoagulantes y anticoagulantes del endotelio vascular. El TNF suprime la divisin de la clula madre de la mdula sea. La administracin crnica del TNF puede producir linfopenia e inmunodeficiencia. La administracin continua de TNF a animales de experimentacin produce alteraciones metablicas o caquexia, un estado caracterizado por el desgaste de las clulas musculares y grasas. La caquexia se produce en gran parte por la supresin del apetito que induce el TNF. El TNF tambin suprime la sntesis de la lipoproteina lipasa, una enzima necesaria para liberar cidos grasos de las lipoprotenas circulantes, para su utilizacin por los tejidos. Aunque el FNT puede producir caquexia por s mismo en animales de experimentacin, otras citocinas como la IL-1, puede contribuir tambin a la caquexia aue acompaa a ciertas enfermedades crnicas como la tuberculosis y el cncer, h-9'12-22)-

La combinacin de fiebre, elevacin de la IL-6 , la elevacin de los reactantes de fase aguda, la supresin de la mdula sea y la activacin de la coagulacin, se han observado en pacientes tratados con TNF intravenoso en la quimioterapia antineoplsica. La administracin intravenosa continua de cantidades elevadas de TNF es por s sola mortal, provocando un sndrome similar al shock.

i3

Varias acciones especficas del TNF a concentraciones extremadamente altas contribuyen a los siguientes efectos mortales: Reduce el riego sanguneo tisular al deprimir la contractilidad miocrdica. El mecanismo de accin implica la induccin de una enzima en los miocitos cardiacos, la sintetasa de xido ntrico (NOs), que convierte la arginina en citrulina y en xido nitroso (NO). El NO que produce esta enzima inhibe la contractilidad miocrdica.

Reduce an ms la presin arterial y el riego sanguneo tisular por la relajacin del tono muscular liso vascular. El TNF puede actuar directamente sobre las clulas musculares lisas y tambin indirectamente estimulando la produccin de vasodilatadores, como la prostaciclina y el NO por las clulas endoteliales vasculares. Produce trombosis intravascular, lo que reduce el riego sanguneo tisular. Esto se debe a una combinacin de alteraciones endoteliales y de los fagocitos mononucleares, que promueven la coagulacin y a la activacin de neutrfilos que producen taponamiento vascular. El TNF produce varias alteraciones metablicas, como una cada de las concentraciones de glucosa sangunea a valores incompatibles con la vida. Esto se debe a la utilizacin excesiva de glucosa por el msculo y a la incapacidad del hgado de reem plazarla.(1,22)

2.3 - INTERLEUCINA -1 . La interleucina -1 (IL-1), es una citocina multifuncional, el aislamiento de los duplicados de DNA para IL-1 ha demostrado que 2 genes son expresados para esta citocina: IL-a e IL-p. Estas citocinas muestran sorprendentemente poca homologa (26%), aunque estas actan sobre el mismo receptor de alta afinidad. La mayora de las clulas nucleadas parecen capaces de producir IL-1 cuando son daadas; pero los macrfagos producen las cantidades ms grandes y son probablemente los productores clave en la inflam acin.(16)' La IL-1 acta para promover las respuestas inmunes especficas de antgenos, la inflamacin y el remodelamiento de la matriz extracelular. Las acciones comunes sobre los muchos tipos de clulas son para estimular el metabolismo, produciendo prostaglandinas y la produccin de proteasas neutrales. La IL-1 tiene actividad de factor de crecimiento en las clulas T tambin en las clulas B. su actividad proinflamatoria afecta casi a cualquier suceso inflamatorio, actuando en forma parcrina.

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Aunque, la IL-1 se descubri como coestimulador de las clulas T, ahora sabemos que su principal funcin, como la del TNF es como mediadora de la respuesta inflamatoria del husped en la inmunidad natural. La principal fuente celular de IL-1, al igual que el TNF, es el fagocito mononuclear activado.(8)' La produccin de IL-1 por los fagocitos mononucleares puede estimularse con productos bacterianos como el LPS, con citocinas derivadas de macrfagos como el TNF la propia IL-1 y mediante el contacto con clulas T CD4+. Como el TNF, la IL -1 puede encontrarse en la circulacin tras una sepsis por gram negativos, donde puede actuar como hormona endocrina. La sntesis de IL-1 difiere de la TNF en dos aspectos importantes. Primero, las clulas T son ms eficaces que el LPS en la estimulacin de la sntesis de IL-1 por los monocitos mononucleares. Segundo, la IL-1 produce en muchos tipos de clulas endoteliales y epiteliales, lo que proporciona fuentes locales potenciales de IL-1 sin infiltrados ricos en macrfagos. La purificacin bioqumica de la IL-1 secretada por fagocitos macrfagos mononucleares, revel que la actividad biolgica de esta citocina resida en dos especies de polipptidos principales, cada unos de 17 kD pero con puntos isoelctricos distintos de 5.0 a 7.0. Ahora se sabe que estas dos formas mencionadas anteriormente, llamadas IL-a e IL-p respectivamente, son producto de dos genes diferentes. Las dos formas de IL-1 muestran una homologa estructural menor del 30%, pero ambas se unen a los mismos receptores de superficie celular y sus actividades biolgicas son esencialmente idnticas. Cabe mencionar que las molculas de IL-1 se relacionan tambin estructuralmente con las diferentes formas del factor de crecimiento de los fibroblastos. Los dos polipptidos de la IL-1 se sintetizan como precursores de unos 33kD que se inciden mediante protelisis para generar las protenas de 17 kD maduras. Las formas de 17 kD se pliegan en una estructura similar a un barril, ricas en bandas de hojas plegadas en (3 . El precursor de la IL-1 de 33 kD es biolgicamente activo, pero el de la IL-1 j3 debe procesarse a la forma de 17 kD antes de poder ejercer sus funciones biolgicas. En los fagocitos mononucleares, se ha identificado una proteasa especfica de IL-1 que es responsable en su mayor parte de la conversin de la IL-1 (3 a su forma activa. Se han caracterizado dos receptores de la membrana diferentes para la IL-1, ambos miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. El receptor de tipo I se ha caracteriz inicialmente a partir de una lnea de clulas T donde mediaba la estimulacin de la IL-1; tiene una afinidad algo mayor por la IL-1 (3 que por la IL-1 a. El tipo II se caracteriz inicialmente a partir de la clula B; tiene mayor afinidad por la IL1a que por la IL-1 (3. (18)

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Los efectos biolgicos de la IL-1, similares a los del TNF, dependen de la cantidad de citocina liberada. A concentraciones bajas de IL-1, los principales efectos biolgicos son como mediador local de la inflamacin. De forma especfica, la IL-1 acta sobre los fagocitos mononucleares y el endotelio vascular para aumentar a un ms la sntesis de IL-1 e inducir la IL-6 . Tambin comparte muchas de las propiedades inflamatorias de TNF. Por ejemplo, la IL-1 acta sobre las clulas endoteliales promoviendo la coagulacin y aumentando la expresin de molculas de superficie que median la adhesin de los leucocitos. La IL-1 no activa directamente a los leucocitos inflamatorios, como los neutrfilos, pero hace que los fagocitos mononucleares y las clulas endoteliales sinteticen quimiocinas que activan a los leucocitos. Cuando se secreta en grandes cantidades la IL-1 entra en el torrente circulatorios y ejerce efectos endocrinos. La IL-1 sistmica comparte con el TNF la capacidad de producir fiebre, de inducir la sntesis de protenas plasmticas de fase aguda (como la proteina A del amiloide srico) por el hgado, y de iniciar el desgaste metablico (caquexia). Aunque las acciones de la IL-1 son muy similares a las del TNF, existen varias diferencias importantes entre ellas ... I) La 1 1 -1 no produce lesin tisular por si misma, aunque se secreta en respuesta al LPS y puede potenciar la lesin tisular producida por el TNF. Adems, incluso a concentraciones sistmicas muy elevadas la IL-1 no es mortal. Aunque la IL-1 imita muchas de las propiedades inflamatorias y procoagulantes de TNF, no produce necrosis hemorrgica en los tumores. La mayor parte de las lneas de clulas tumorales no son lisadas directamente por la IL-1 in vitro. La IL-1 no comparte con el TNF la capacidad de aumentar la expresin de molculas del M H C .(8,1618)

II) III) IV)

El inters de la IL-1 ha aumentado dramticamente durante la ltima dcada, pero ha sido grandemente restringida a los inmunlogos, los biolgos celulares y los que estudian la inflamacin y el cncer. Sin embargo, recientemente se ha reconocido que el cerebro controla y modula directamente muchos aspectos de la funcin inmune, mientras que las molculas asociadas clsicamente con el sistema inmune tales como la IL-1 son sintetizadas dentro del cerebro y actan directamente en el SNC para modificarlas funciones locales y sistmicas, por lo tanto este tema es relativamente nuevo para los neurobilogos. (18'

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2.4 - INTERLEUCINA - 6 . La interleucina - 6 (IL-6 ), es una citocina de aproximadamente 26 kD que sintetizan los fagocitos mononucleares, las clulas endoteliales vasculares, los fibroblastos y otras clulas en respuesta a la IL-1 y en menor grado, al TNF. Tambin es sintetizada por algunas clulas T activadas. La IL-6 puede detectarse en la circulacin tras la infeccin de bacterias gram negativas la administracin intravenosa de TNF, y parece secretarse en respuesta al TNF la IL-1 en lugar de al propio LPS. La IL-6 no produce la trombosis vascular la lesin tisular que se ven en respuesta al LPS al TNF. La IL -6 es una citocina pleiotrpica que acta sobre la respuesta inmune especfica del antgeno; en la inflamacin este es un mediador clave en la respuesta de fase aguda. La primera funcin identificada de este molcula fue la induccin de la diferenciacin terminal de las clulas B y la produccin de inmunoglobulinas. La preactivacin mediante IL-4 es necesaria. La IL -6 tiene un rol auxiliar en la activacin de las clulas T y sinergetiza con la IL-3 con el granulocito-macrfago para mejorar el crecimiento de las clulas progenitoras hemopoyticas. Se duda que la IL-6 posea cualquier actividad antiviral. La IL-6 es probablemente la mayor inductora fisiolgica de la sntesis de protenas de la fase aguda en el hgado, con la IL-1 y el TNF tomando roles solamente subsidiarios.(7 ) Las 2 acciones mejor descritas de la IL-6 son sobre los hepatocitos y las clulas B ... I) II) La IL-6 hace que los hepatocitos sinteticen varias protenas plasmticas como el fibringeno, que contribuyen a la respuesta de fase aguda. La IL -6 sirve como factor de proliferacin para las clulas B activadas en fases avanzadas de su diferenciacin. La IL-6 acta de forma similar al factor de proliferacin de muchas clulas plasmticas neoplsicas (plasmocitomas mieolomas), y muchas clulas de plasmocitomas que proliferan de forma autnoma pueden secretar en realidad IL-6 como un factor de proliferacin autcrino. Adems la IL -6 puede promover el crecimiento de los hbridos de clulas somticas producidas por la fusin de clulas normales con clulas de plasmocitoma, es decir los hibridomas que producen lo anticuerpos monoclonales.

La IL -6 puede inducir fiebre y la sntesis de IL -6 mediante el estroma endometrial ha sido sugerido como mediadores de las fluctuaciones de temperatura en el ciclo menstrual. La IL -6 acta sobre clulas de tejido para mejorar o inhibir la proliferacin e induce la liberacin de prostaglandina en el fibroblasto. Al igual que la IL-1, esta puede por lo tanto tener efectos locales en la inflamacin y en la reparacin. < 3,7)'

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Entre las caractersticas que hacen a la IL-6 tan interesante e importante estn su induccin mediante otras citocinas y su sinergismo con la IL -1 y el TNF para inducir la sntesis de proteina de fase aguda y para estimular el crecimiento de los timocitos. Estas observaciones delinean la complejidad de la cadena de citocinas. Los roles posibles de la IL-6 en la enfermedad han sido dramticamente demostrados por un grupo de Kishimoto, quien cre ratones transgnicos, expresando constitutivamente altas cantidades de IL-6 . Los ratones desarrollaron plasmocitomas policlonales mortales con glomerulonefritis membranosa proliferativa e infiltracin masiva de la mdula mediante los megacariocitos maduros. La IL -6 ha sido fuertemente implicada como un factor de crecimiento autcrino para varios tumores. La mayora de los pacientes con sepsis que han sido estudiados, han mostrado aumentos en la IL-6 . Waage investig a pacientes con enfermedad meningofocal. La concentracin media de suero con IL-6 fue 1000 veces mas alta en los pacientes con choque sptico que en los pacientes con meningitis o leucemia solamente. Hank tuvo descubrimientos similares mostrando que las concentraciones de IL -6 en el plasma se correlacionaron con la severidad del choque y el resultado clnico. El tambin observ un rango muy amplio de los valores de IL-6 . Los pacientes con 40 U/ml o menos sobrevivieron mientras que el 89 % de aquellos con concentraciones excediendo las 7500 U/ml murieron. En otros estudios la IL-6 se correlacion con las concentraciones en suero de las protenas de fase aguda, como la protena C reactiva, haptoglobina y la a1-cidoglicoprotena y tambin se relacionaron con la fie b re .(3,7''

2.5 - QUIMIOCINAS. Un descubrimiento reciente en el campo de las citocinas es la existencia de una gran familia de citocinas con estructuras homologas, de aproximadamente 8 a 10 kD. Estas molculas comparten la capacidad de estimular el movimiento de los leucocitos (quimiocinesis) y el movimiento dirigido (quimiotaxis) y se han denominado quimiocinas. Todas estas molculas contienen 2 asas de disulfuro internas. Algunos investigadores separar estos factores en dos subfamilias, ya sea, que los dos residuos, cistena del extremo amino terminal estn juntos (cis-cis) o separados por un aminocido (cis-X-cis). Estas diferencias se correlacionan con la organizacin de las 2 subfamilias en grupos de genes separados.(12,21) Las quimiocinas de la subfamilia cis - x - cis son producidas en gran parte por los fagocitos mononucleares, as como por clulas tisulares (endotelio, fibroblastos) y megacariocitos (que originan plaquetas que contienen quimiocinas almacenadas). Estas molculas actan de forma predominante sobre los neutrfilos como

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mediadores de la inflamacin aguda. El miembro mejor caracterizado de esta subfamilia es la interleucina - 8 . (12, 1 ) La subfamilia cis-cis la produce en gran parte la clula T activada. Estas molculas actan de forma predominante en subgrupos de clulas inflamatorias mononucleares. Por ejemplo: una quimiocina llamada RANTES acta sobre las clulas T memoria CD4+ y los monocitos. Una excepcin a esta generalizacin es la protena quimiotctica del monocito -1 (MCP-1 del ingls monocyte chemotactic protein- 1 ), una quimiocina cis-cis que acta solo sobre los monocitos pero es sintetizada por fagocitos mononucleres activados y clulas tisulares, as como por las clulas T. Las quimiocinas de las 2 subfamilias se unen a los proteoglicanos heparan sulfato de la superficie de la clula endotelial, y pueden principalmente estimular la quimiocinesis de los leucocitos que se unen al endotelio activado por citocinas, a travs de la induccin de molculas de adhesin.

CAPITULO TRES

CITOCINAS QUE REGULAN DIFERENCIACIN LINFOCITARIA.

LA

ACTIVACIN.

PROLIFERACIN

Algunas citocinas actan principalmente para regular la proliferacin y diferenciacin de los linfocitos, y mediar la fase de activacin de las respuestas inmunitarias. La mayor parte de estas citocinas son producidas por las clulas T. especialmente linfocitos T CD4 + especficos para el antigeno. Estas clulas T cooperan en las respuestas inmunitarias mediadas por clulas en las humorales. Las citocinas que actan bsicamente para regular a los propios linfocitos son las interleucinas -2 , la interleucina - 4 y el factor transformador del crecimiento (TGF-3). Las propiedades de las citocinas a comentar en este captulo se resumen en el cuadro siguiente...

CTQC1NA

H m m

fU ShlTE

f e ADA ^ U J L A Clulas T Proliferacin, produccin de citocinas Activacin Sntesis de anticuerpos Activa la unin al isotipo IgE. Innibe la activacin Proliferacin Inhibe la activacin y la proliferacin Inhibe la activacin Regulacin de la proliferacin

lnterleucina-2

14-17kD (monmero)

Clulas T

Clulas NK Clulas B

Clulas B lnterleucina-4 i 20 kD (monmero) Clulas TCD4 Mastocitos Clulas T. fagocito mononuclear. Otras Fagocito mononuclear Clulas T Clulas T Fagocito mononuclear Otros tipos de clulas

Factor transformador del crecimiento

14 kD (homodlmero)

Abreviaturas NK, agresora natural; kD. kiloDalton; Ig, inmunoglobulina

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3.1 - INTERLEUCINA-2. La interleucina-2 (IL-2), originalmente llamada factor de proliferacin de la clula T (TCGF del ingls, T cell growth factor), es la principal citocina responsable de la progresin de los linfocitos T desde la fase G a la S del ciclo celular. La IL-2 es producida por las clulas T CD4+ y en menor cantidad por las clulas T CD8+. La IL-2 acta sobre la misma clula que la produce, es decir, funciona como un factor de proliferacin autcrino. La IL-2 tambin acta en los linfocitos T cercanos, incluidas las clulas CD4+ y CD8+, y por lo tanto es tambin un factor de proliferacin parcrino. Durante las respuestas inmunitarias fisiolgica, la IL-2 no circula en la sangre para actuar a distancia, por lo que no se le considera factor de proliferacin endocrino. La IL-2 secretada es una glucoprotena de 14 a 17 kD codificada por un solo gen del cromosoma 4 en los seres humanos. El tamao heterogneo de la protena madura se debe a la extensin variable de la glucosilacin de un polipptido de aproximadamente 130 aminocidos. La IL-2 nativa se pliega en una protena globular que contiene dos grupos de hlices paralelas en parejas, estando orientada cada hoja en una leve angulacin respecto a la otra. Normalmente se transcribe, sintetiza y secreta por las clulas T, solo tras la activacin de los antgenos. La sntesis de IL2 suele ser transitoria, con un pico precoz de secrecin que se produce aproximadamente cuatro horas despus de la activacin. Las acciones principales de la IL-2 son sobre los linfocitos: La IL-2 es el principal factor de proliferacin autcrino de los linfocitos T, y la cantidad de IL-2 sintetizadas por las clulas T CD es un determinante importante de la magnitud de las respuestas inmunitarias que depende de las clulas T. La IL-2 estimula tambin la sntesis de otras citocinas derivadas de las clulas T. A estas otras citocinas se les conoce con el nombre de IFN-yy la linfotoxina (LT). La incapacidad para secretar cantidades adecuadas de IL-2 se ha descrito como causa de anergia de clulas T especfica para el antgeno. La accin de IL-2 sobre las clulas T esta mediada por la unin a su receptor. Este sistema es quizs el mejor conocido de todos los receptores de citocinas. Existen dos protenas de superficie celular diferentes que se unen a la IL-2 que son: IL-2Ra e IL-2Rp.

La ll-2Ra fu la primera en identificarse, es un polipptido de 55 kD que aparece tras la activacin de la clula T y al que se llam en un principio antgeno Tac (por activacin T). La unin de la IL-2 a las clulas que expresan IL-2Ra no produce ninguna respuesta biolgica detectable.

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La segunda proteina que se une al IL-2 IL-2RP tiene aproximadamente 70 a 75 kD. La afinidad de la unin por este receptor es mayor que por el IL-2Ra. La IL-2R(3 se expresa junto con un polipptido de 64 kD llamado IL-2Ry formndose un complejo denominado IL-2R(3y". La IL-2 provoca la proliferacin de las clulas que expresan solo IL-2Rpy, produciendo la mitad de la estimulacin proliferativa mxima con la misma concentracin de IL-2 que produce la mitad de unin mxima. Las clulas que expresan IL-2Ra e IL-2 RPy pueden unirse a la IL-2 con mayor fuerza. La estimulacin de la proliferacin de estas clulas se produce a una concentracin de IL-2 igualmente baja. La unin a la IL-2 y la estimulacin de la proliferacin puede bloquearse con anticuerpos frente a IL-2Ra IL-2Rp, y ms eficazmente mediante una combinacin de anticuerpos frente a las subunidades del receptor. La IL-2Ra forma un complejo con la IL-2RPy, aumentando la afinidad de este ltimo por la IL-2, y permitiendo por tanto, producir una seal de proliferacin con concentraciones significativamente menores de IL-2. Se cree que la IL-2 se une primero a la IL-2Ra ya que esto facilita la asociacin de IL-2RPy Las clulas T en reposo expresan IL-2Rpy pero no IL-2Ra y pueden ser estimuladas por niveles elevados de IL-2. Tras la activacin de las clulas T por el antgeno, se expresa con rapidez la IL-2Ra, reduciendo as la concentracin de IL-2 necesaria para la estimulacin de la proliferacin. De hecho, la propia IL-2 puede aumentar la sntesis de IL-2Ra. La IL-2 estimula la proliferacin de las clulas NK y aumenta su funcin citoltica, produciendo las tambin conocidas como clulas agresoras activadas por linfocinas (LAK, del ingls lymphokine-activated killer). Las clulas NK, como las clulas T en reposo, expresan IL-2Rpy y pueden ser estimuladas por niveles elevados de IL-2. Las clulas NK, sin embargo no expresan IL-2Ra y, por lo tanto no reducen la cantidad de IL-2 necesaria para estimular su proliferacin. La IL-2 acta sinrgicamente con otras citocinas, especialmente con la IL-12, para inducir la secrecin de IFN-y por las clulas NK. La IL-2 acta sobre las clulas B humanas como factor de proliferacin y como un estmulo para la sntesis de anticuerpos.

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APCPRESENTADO EL ANTIGENO
LINFOCITO T EN REPOSO (l_-2Rp7 bajo, IL-2Ra ausente)

CONCENTRACION DE IL-2 NECESARIA PARA LA RESPUESTA PROLIFERATIVA. 1 x 10_9M

NFOCITO T PARCIALMENTE ACTIVO <IL-2R0y alto, IL-2Ra bajo) Estimulacin I airtocrina/paracrina I por IL-2 I LINFOCITO T TOTALMENTE ACTIVO (IL-2RPY alto, IL-2Ra alto; sntesis aumentada de IL-2))

1 x 10U M

1 I io1 5 m

h, IL-2R P 7 *.- 1 x 10"

^

M IL-2

E D d

IL-2R a K .-J x TO'* M IL-2

COMPLEJO lL-2Rpy, IL-2Roc, HL-1 x 10 M IL-2 IL-2

El receptor de alta afinidad de la IL - 2 (IL - 2R) se compone de un complejo de dos pollpptldos separados (IL - 2R (3ye IL - 2R a) que Interaccionan para unirse a la IL - 2 con alta afinidad. Las clulas T en reposo expresan solo IL - 2R fty, que se une a la IL - 2 con baja afinidad. La activacin de la clula T por el antgeno y una clula presentadora (ADC) conduce a la sntesis y expresin de IL - 2R a, aumentando la afinidad de receptores IL - 2R Pyy permitiendo la estimulacin de la proliferacin a concetraciones de IL - 2 fisiolgica. La IL - 2 producida por la clula T activada, aumenta an mas la expresin de IL - 2 R a y estimulan la sntesis de IL - 2, proporcionando un sistema de amplificacin positivo.

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3.2 - INTERLEUCINA-4. La interleucina 4 (IL-4) se identific inicialmente como una citocina derivada de la clula T de aproximadamente 20 kD y su principal funcin fisiolgica es la regulacin de las reacciones alrgicas. La IL-4 es un miembro de la familia de las citocinas helicoidales, y su receptor es una protena de 130 kD. Las principales fuentes celulares de IL-4 son los linfocitos T CD4+. Los mastocitos y los basfilos activados, como algunos T CDa+, tambin son capaces de producir IL -4 .(5,20)' La IL-4 tiene importantes acciones sobre varios tipos de clulas: I) La IL-4 es necesaria para la produccin de Ig E, y es la principal citocina de switching cambio de clulas B a este isotipo de cadena pesada. La Ig E es el principal mediador de las reacciones de hipersensibilidad inmediata (alrgicas), y se cree que la produccin aumentada de IL-4 es central para el desarrollo de reacciones alrgicas. Los anticuerpos Ig E tambin actan en la defensa frente a las infecciones con helmintos, siendo esta una importante funcin. Los ratones con el gen de la IL-4 anulado no producen Ig E. La IL-4 tambin inhibe el switching a Ig G2a y a Ig G3 en los ratones, que estn potenciando en cambio por el IFN-a. Esta es una de las diversas acciones antagnicas recprocas de la IL-4 y el IFN-y. La IL-4 inhibe la activacin del macrfago y bloquea la mayor parte de los efectos activadores sobre el macrfago del IFN-y incluida la produccin aumentada de citocina como la IL-1, el xido ntrico y las prostaglandinas. La IL-4 es un factor de proliferacin y de diferenciacin de las clulas de un subgrupo llamado TH 2. La IL-4 promueve el desarrollo de las clulas TH 2 secretoras de IL-4 + IL-5, a partir de clulas T nativas estimuladas por el antgeno. De este modo, los estmulos que favorecen la produccin de IL-4 precozmente tras la exposicin al antgeno, favorecen la aparicin de las clulas TH 2. La IL-4 tambin acta como factor de proliferacin autcrino para las clulas T H 2, promoviendo ms la expansin de este subgrupo. Los ratones que carecen del gen de la IL-4 muestran un dficit en el desarrollo y mantenimiento de las clulas TH2, incluso tras estmulos (como las infecciones por helmintos que suelen ser potentes inductores de este grupo.) La IL-4 estimula la expresin de ciertas molculas de adhesin, sobre todo de las molculas de adhesin celular vascular 1(VCAM-1) sobre las clulas endoteliales, lo que produce una mayor unin de los linfocitos, monocitos y especialmente los eosinfilos.Las clulas endoteliales tratadas con IL-4 tambin secretan la protena quimiotctica de monocitos 1 (MCP-1, del ingls, monocyte chemotactic protein- 1 ), y una quimiocina todava no definida que acta especficamente sobre los eosinfilos. Como resultado de ello, concentraciones locales elevadas de IL-4 inducen reacciones inflamatorias ricas en monocitos y eosinfilos.

II)

III)

IV)

24

V)

La IL-4 es un factor de proliferacin para los mastocitos y acta sinrgicamente con la IL-3 en la estimulacin de la proliferacin de los m astocitos.(5,20)

De este modo, la IL-4 desempea una funcin crtica en las reacciones inflamatorias medidas por la Ig E y los eosinfilos. En la actualidad se estn probando antagonistas de la IL-4 en pacientes para controlar reacciones alrgicas graves.

3.3 - FACTOR TRANSFORMADOR DE CRECIMIENTO (5 La descripcin original del factor transform ador del crecim iento [3 se hizo en el campo de la Biologa Tumoral. Se observ que ciertos tumores producan llamados factores transformadores del crecimiento que permitiran a clulas normales proliferar en agar blando, una caracterstica de las clulas malignas (transformadas). Posteriormente se observ que la estimulacin de la proliferacin estaba causado por un polipptido llamado TG Fa (transforming growth factor a); este factor es un polipptidico de proliferacin para las clulas epiteliales y mesenquimales y no entra dentro del grupo de las citocinas.(3) Existe un segundo factor que se requera en la supervivencia en el agar blando al que se le llam TGF(3 el cual es una familia de molculas muy relacionadas, codificadas por genes diferentes, que se clasifican en TGF-(31, TGF-J52 y TGF-P3. Las clulas del sistema inmunitario (por ejemplo, las clulas T y los monocitos) sintetizan principalmente TGF-(31, aunque ciertas localizaciones anatmicas (por ejemplo, el SNC) puede contener cantidades elevadas de TGF-p3. El TG F-pi nativo es una protena homodmera de aproximadamente 28 kD y se sintetiza en una forma latente que debe activarse por medio de proteasas.

Sintetizan

Clulas T y monocitos

Principalmente

TGF-p1

Se activa Inhibe la proliferacin __________ ^ de clulas. Por proteasas

Tanto las clulas T activadas por el antgeno como los fagocitos mononucleares activados por el LPS secretan TG F-pi activo. Los receptores del TGF-p1 no estn bien definidos, aunque una de las protenas que se unen al TGF-p puede ser una serina /treonina cinasa.

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Las acciones del TGF-p son muy pleiotrpicas. Este inhibe la proliferacin de muchos tipos de clulas y estimula la proliferacin de otras. A menudo el TGF-p puede inhibir o estimular la proliferacin del mismo tipo de clula, dependiendo de condiciones del cultivo como el grado de confluencia. El TGF-p produce la sntesis de protenas de la matriz extracelular como las colgenas, y de receptores celulares para las protenas de la matriz. La capacidad del TGF-p de inducir la matriz extracelular probablemente est relacionada con su capacidad de promover la proliferacin celular del agar blando. In vivo, el TGF-p estimula la proliferacin de vasos sanguneos nuevos, un proceso llamado angiognesis. Como citocina, el TGF-p es potencialmente importante, porque... Antagoniza muchas respuestas de los linfocitos. Por ejemplo: el TGF-p inhibe la proliferacin de la clula T frente a mitgenos policlonales en cultivos mixtos de leucocitos e inhibe la maduracin de los LTC. Inhibe la activacin de los macrfagos. Acta sobre otras clulas, como los leucocitos polimorfonucleares y las clulas endoteliales, de nuevo antagonizando los efectos de las citocinas proinflamatorias.

Aunque el TGF- es un regulador en gran medida negativo de las respuestas inmunitarias, puede tener efectos positivos, ya que se encarga de generar respuestas inmunitarias en algunas mucosas.(3,5)-

VA*

26

CAPITULO CUATRO.

CITOCINAS QUE REGULAN LA INFLAMACIN DE ORIGEN INMUNITARIO. La inflamacin es un estado que se produce en el organismo, debido a la respuesta natural defensiva de los tejidos contra estmulos nocivos, sean fsicos, qumicos o bacterianos. Se caracterizan por ingestin, aumento local de temperatura, edema, dolor y alteracin temporal de la funcionalidad de la parte afectada. La inflamacin que acompaa a menudo al proceso de reconstruccin de los tejidos daados, sirve tambin para limitar la expancin de una infeccin, construyendo una barrera alrededor; aunque esta barrera puede convertirse en un obstculo durante el tratamiento.(21) La inflamacin incluye una serie de cambios celulares que facilitan finalmente la fagocitosisy ya sea la destruccin de microorganismos la digestin de desechos celulares. Esto es seguido por la proliferacin de las clulas del tejido conectivo y la reparacin de la matriz intracelular. Ambos sucesos requiren el control complejo de varios tipos de clulas a un nivel local. La evidencia aumentada indica que, aunque otras molculas puedan ser de efectos mediadores tales como la permeabilidad vascular y la quimiotaxis, las citocinas ejercen control de una forma muy sofisticada con la duplicacin remarcable de elementos clave y la interaccin compleja negativa y positiva entre s y con otras hormonas.(12,21) Los procesos locales de inflamacin son facilitados por los cambios metablicos sistmicos que movilizan la energa en forma de glucosa cidos grasos y bloques de construccin de aminocidos. La fiebre sobreregula varias reacciones enzimticas en las clulas inflamatorias y de tejidos que tal vez al ser potencialmente peligrosos, operan a un ndice suboptimal en la temperatura normal del cuerpo. Los efectos contraregulatorios tales como la liberacin de cortisol entra en efecto y detienen los efectos potencialmente destructivos en la inflamacin. Todos estos sucesos son en parte, controlados por las mismas citocinas pleiotrpicas que ejercen controles locales claves.(12,21) En este captulo se comentar a este grupo de citocinas que son derivadas principalmente de los linfocitos T CD4+ y CD8+ activados por el antgeno, que sirven bsicamente para activar las funciones de las clulas efectoras nespecficas. De este modo, estas citocinas actan en la fase efectora de las respuestas inmunitarias mediadas por clulas. Las molculas a describir en esta seccin se resumen en la siguiente tabla...

FEfsTE ...... Interfern-y POt-iPcPTlOO

.....

ru a , fUAllL
..............

.......

EFECTOS BASICOS EN .

, ...... '

21-24 kD (homodmero)

Linfotoxina

24 kD (homodmero) 20 kD (homodmero) 20 kD (homodmero) 35-40 kD (heterodmero) ?

lnterleucina-10 lnterleucina-5

1 1

lnterleucina-12

2 ?

Factor de inhibicin de la migracin.

Activacin Activacin Activacin Aumento de molculas de clase 1y II del MHC Clula T Neutrfilo Activacin Cl. endotelial Activacin Clula NK Activacin CluIaT F.M. Inhibicin Clula B Activacin Clula T Eosinfilo Activacin Clula B Proliferacin y activacin Macrfago Clulas NK Activacin Clulas T Activacin (proliferacin y diferenciacin) Clula T F M: Conversin de estado de movilidad al de inmovilidad

Clula T Clula NK

F.M. Cl. endotelial Clula NK Todas.

Abreviaturas NK. agresora natura!, KD. kiloDalton. MHC, complejo mayor de histocompatibilidad ;F M .fagocito mononuclear

4.1 - IN TE R FE R O N -y.

El interfern-y (IFN-y) tambin denominado interferon tipo II" es una glucoprotena homodmera que contiene subunidades de aproximadamente 21 a 24 kD El tamao variable de las subunidades se debe a los grados variables de glucosilacin, pero cada subunidad contiene un polipptido idntico de 18 kD codificado por el mismo gen.(24) El IFN -7 lo produce tanto clulas T cooperadoras CD4" nativas como T CD". La transcripcin se inicia directamente como consecuencia de la activacin del antgeno y est aumentada por las IL-2 e IL-12. El IFN-y tambin lo producen las clulas agresoras naturales (NK), que son la principal fuente de esta citocina en los ratones que carecen de clulas T; en esta situacin el IFN-y puede actuar como un mediador de la inmunidad natural. Como su nombre implica, el INF-y comparte muchas actividades con el IFN tipo I De forma especfica el IFN-y, induce a un estado antiviral y es antiproliferativo No obstante, el IFN-y se une a un receptor de superficie celular nico, diferente aunque estructuralmente relacionado con el que utiliza el IFN tipo I. Lo ms importante, es que el IFN-y tiene varias propiedades relacionadas con la inmunorregulacin que las separan funcionalmente del IFN tipo l .(3 24)

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El IFN-y es un potente activador de los fagocitos mononucleares. Induce directamente la sntesis de enzimas que median el respiratory burs't (en espaol, estallido respiratorio, aludiendo al metabolismo oxidativo que generan radicales txicos), que permite a los macrfagos matar a los microorganismos fagocitados. Junto a segundas seales, como el LPS y quizs el TNF, permite a los macrfagos matar clulas tumorales. A las citocinas que producen cambios en los fagocitos mononucleares se les llama factores activadores de macrfagos (MAF, del ingls macrophage, activating factors). El IFN-y es el principal MAF y es el medio por el que las clulas activan a los macrfagos. Es importante sealar aqu, que la activacin del macrfago implica en realidad varias respuestas diferentes, y se dicen que los macrfagos estn activados cuando realizan una funcin particular que se mide. Por ejemplo, el IFN-y activa completamente a los macrfagos para que maten microorganismos fagocitados pero solo parcialmente para que maten clulas tumorales. El IFN-y aumenta la produccin de molculas de clase I del MHC y al contrario que el IFN-y tipo I, tambin provoca la expresin de molculas de clase II de MHC con diversas clulas. De este modo, el IFN-y amplifica la fase de reconocimiento de la respuesta inmunitaria promoviendo la activacin de las clulas T cooperadoras CD4+ restringidas por la clase II. In vivo, el IFN-y puede aumentar las respuestas inmunitarias humorales y celulares a travs de acciones en la fase de reconocimiento El IFN-y acta directamente sobre los linfocitos T y B para promover su diferenciacin. IFN-y promueve la diferenciacin de la clulas T CD4+ nativas e inhibe la proliferacin de otras clulas. Tambin es una de las citocinas necesarias para la maduracin de los LTC CDa+. Tambin acta sobre las clulas B para promover el =switching= a las subclases lgG2a e lgG3 en ratones, e inhibir el =switching= a lgG1 e IgE. El IFN-y activa a los neutrfilos, activando su =respiratory burs't=. Es un activador de neutrlitos, menos potente que TNF la linfotoxina. El IFN-y estimula la actividad citoltica de la clulas NK, ms que el IFN tipo I. El IFN-y es un activador de las clulas endoteliales vasculares, promoviendo la adhesin de la linfocitos T CD4+ y los cambios morfolgicos necesarios para facilitar su extravasacin. Como se mencion antes, el IFN-y tambin potencia muchas de las acciones del TNF sobre las clulas endoteliales.*3'2124>

El efecto neto de estas actividades del IFN-y es promover las reacciones inflamatorias ricas en macrfagos, a la vez que suprimen las reacciones ricas en eosinfilos. Los ratones en los que se han anulado los genes del IFN-y o de sus receptores muestran varios defectos inmunitarios, incluida la mayor susceptibilidad a las infecciones de microorganismos intracelulares (que no pueden eliminarse por el fallo en la activacin de los macrfagos), la produccin reducida de cido ntrico en

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los macrfagos procedentes de ratones infectados por micobacterias, la concentracin srica reducida de anticuerpos lgG2a e lgG3, la expresin reducida de molculas de clase II del MHC en los macrfagos de ratones infectados por micobacterias, y fallos en la funcin de la clula NK. ^ 1 ,2 4 >

4.2 - LINFOTOXINA La linfotoxina es una glupoprotena de 21-24 kD que presenta una homologa de aproximadamente un 30% con el TNF, y compite con l por la unin a los mismos receptores celulares (como ya se mencion, la LT se denomina a veces TNF-(3). En los seres humanos, los genes de la LT y del TNF se localizan dentro del MHC del cromosoma 6 . La LT la producen exclusivamente los linfocitos T activados, y a menudo se produce junto al IFN-y en tales clulas. La LT, humana, al contrario que la TNF, contiene 1 2 oligosacridos unidos por enlaces N (responsables de la variedad del tamao molecular). Adems, la LT se sintetiza como una verdadera protena secretora sin regin transmembranosa. Recientemente se ha descrito un tercer miembro de la familia TNF/LT. El producto gentico llamado provisionalmente LT-(3 es una protena de superficie celular que se une a la LT para formar un complejo de superficie que media los efectos de la LT sobre otras clulas. La mayor parte de los estudios han encontrado pocas diferencias entre los efectos biolgicos del TNF y de la LT, compatible con su unin al mismo receptor. La ms importante distincin entre estas citocinas parece ser que la LT la sintetizan solo las clulas T, deriva predominantemente de los fagocitos mononucleares. En general, las cantidades de LT, sintetizadas por las clulas T son mucho menores que la de TNF sintetizadas por los fagocitos mononucleares estimulados por el LPS. Por lo tanto, la LT habitualmente acta como un factor parcrino y no como mediador de lesin sistmica. Aunque ni el TNF ni la LT son txicos para las clulas normales (no neoplsicas), ambos pueden participar en la lisis de clulas diana mediada por los LTC.< 5 '9) Como el TNF, la LT es una activadora potente de neutrfilos y de este modo proporciona a los linfocitos un medio de regular las reacciones inflamatorias agudas. Es un activador de neutrfilos ms potente que el IFN-y, y este ltimo potencia las acciones de la LT. La LT es tambin un activador de las clulas endoteliales vasculares aumentando la adhesin leucocitaria, la produccin de citocinas y los cambios morfolgicos que facilitan la extravasacin de los leucocitos. Estos afectos como los del TNF, son tambin potenciados por el IFN-y.(5,9)

30

4.3 - INTERLEUCINA - 10. La nterlucina 10 (1L- 10) es una citodna de 18 kD producida por el subgrupo Th2 de las clulas cooperadoras CD4+. Tambin es producida por algunas clulas B activadas, por algunas clulas Th 1 (en seres humanos), por macrfogos activados y por algunas clulas no linfocticas (por ejemplo, los queratinocitos). La IL-10 es un miembro de la familia de las citocinas a-helicoidales, y probablemente acta en forma de homodmero. Las 2 actividades principales de la IL-10 son inhibir la produccin de citocinas (es decir, TNF, IL-1, quimiocina e IL-2) por los macrfagos, e inhibir las funciones accesorias de los macrfagos en la activacin de la clula T. Este ltimo efecto se debe a la expresin reducida de molculas de clase II del MHC, y a la expresin reducida de ciertos coestimuladores. El efecto neto de estas acciones es inhibir la inflamacin mediada por la clula T. Adems de sus efectos inhibidores sobre los macrfagos B, la IL-10 tiene acciones estimuladoras sobre las clulas B. Puede ser un factor de =switching= para la produccin de lgG4 en seres humanos (homlogo a la IgG 1 en ratones). Estudios en ratones con el gen de la IL-10 anulado por una cierta tecnologa, revelan pocas alteraciones inmunitarias. Estos ratones presentan lesiones inflamatorias intestinales, de origen desconocido. Es interesante resaltar que el genoma del virus de Epstein-Barr contiene un gen homlogo al de la IL-10, y que la IL-10 viral comparte actividades in vitro con la citocina derivada de la clula T. Esto plantea la posibilidad intrigante de que el virus haya adquirido el gen humano como un medio de inhibir la inmunidad an tiviral.(3,5)

4.4 - INTERLEUCINA- 5 . La nterlucina-5 (IL-5) es una citocina homodimrica de aproximadamente 40 kD producida por el subgrupo TH2 de las clulas T CD4+ y por los mastocitos activados. Pertenece a la familia de citocinas de 4 hlices, aunque cada haz de 4 hlices consta de 3 tramos de un monmero y uno del otro. La principal accin de la IL-5 es estimular la proliferacin y diferenciacin de los eosinfilos y activar a los eosinfilos maduros para que puedan matar helmintos. En los ratones, los anticuerpos neutralizantes frente a la IL-5 inhiben la eosinofilia que se v en respuesta a la infeccin por helmintos. La actividad de la IL-5 se complementa con las de la IL-4 (por ejemplo el =swtching= a IgE y el reclutamiento de eosinfilos) y las de la IL-10 (por ejemplo el =swtching= a lgG4), contribuyendo a las reacciones alrgicas mediadas por el T h2. La IL-5 tambin acta como un coestimulador para la proliferacin de las clulas B de ratn activadas por el antgeno y previamente se le denomin factor del crecim iento de la clula B factor reem plazador de la clula T. La IL-5 puede actuar

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sinrgicamente con otras citocinas, como la IL-2 y la IL -4 para estimular la proliferacin y diferenciacin de las clulas B. Tambin la IL-5 acta sobre las clulas B maduras para aumentar la sntesis de inmunoglobulinas, especialmente de Ig A .(3,5)

4.5 - INTERLUCINA - 12. La interleucina -1 2 es un heterodmero de 70 kD que consta de 2 cadenas polippticas unidas de forma covalente, una de 35 kD (p35) y otra de 40 kD (p40). La subunidad p35 la producen muchos tipos de clulas, incluidos los linfocitos T y B, las clulas NK y los monocitos. La cadena p40 es producida principalmente por monocitos activados y clulas B, por lo que estos son las fuentes principales de la citocina completa (en esta categora funcional de citocinas, la IL-12 es la nica que no producen las clulas T, y por su accin por las clulas NK, puede ser considerada un mediador de la inmunidad natural). La protena p35 tiene una estructura de 4 hlices a, similar a la de otras citocinas. Es interesante sealar que el componente p40 de la IL-12 es homlogo al del receptor de la IL-6 . De este modo el heterodmero intacto parece estar compuesto de una protena similar a una citocina y de una protena similar a un receptor de citocinas. Estudios de la unin indican que el verdadero receptor de la IL12 se expresa en las clulas T y NK activadas, pero todava no se ha caracterizado completamente. La IL-12 es un importante regulador de las respuestas inmunitarias mediadas por clulas y por sus efectos sobre clulas NK y linfocitos T. 1) La IL-12 es el ms potente activador conocido de la clula NK. Induce la transcripcin de IFN-y por las clulas NK, y muestra fuerte sinergia con la IL-2. Adems de estimular la produccin de IFN-y, la IL-1 2 aumenta la actividad citoltica de las clulas NK y es un factor de crecimiento para estas clulas. 2) La IL-12 estimula la diferenciacin de las clulas T CD4+ nativas al subgrupo T H1 frente a una TH 2, puede controlarse por la produccin relativa de IL-12 e IFN-y, que favorece la diferenciacin a TH1. y de IL-4 e IL- 1 0 , que promueve la diferenciacin a T h2. 3) La IL-12 estimula la diferenciacin de las clulas T CD8+ a LTC activos y maduros. Debido a este efecto, la IL-12 puede ser un tratamiento potencial del cncer diseminado. De este modo, la IL-12 es un importante regulador de la fase efectora de las reacciones inmunitarias mediadas por clulas. Sirve a esta funcin activando directamente a algunas clulas efectoras, y regulando el desarrollo de otras.(4,6)

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Por otro lado, desde su descubrimiento al final de los 80 s, la potente citocina IL-12 ha disfrutado las trampas de una molcula caliente. Su rol crucial para darle forma a los momentos ms tempranos de la respuesta inmune ha llevado a una explosin de artculos en los peridicos inmunolgicos. Como droga, esta ya ha entrado en los juicios clnicos humanos en contra del cncer y el sida. Los investigadores recientemente otorgaron el sobrenombre de bala mgica a la IL-12 a causa de su poder para inhibir a los vasos sanguneos que alimentan a los tumores en los experimentos naturales, poderes anotados en el Wall Street Journal. Recientemente fu el tumo de los expertos en enfermedades infecciosas en los Institutos Nacionales de Salud, quienes patrocinaron los encuentros para exaltar a la IL-12 como un agente teraputico potencial y una vacuna adyuvante. Los representantes de las compaas farmacuticas dejaron claro en el encuentro que aunque la IL-12 ha mostrado una promesa en contra de las enfermedades infecciosas prevalentes en los pases en desarrollo, las presiones econmicas sugieren que esta probablemente ser desarrollada primero para mercados lucrativos cercanos. Debemos remarcar que desde 1989, cuando apareci el primer reporte en la literatura, la IL-12 ha demostrado ser producida por los monocitos, macrfagos, neutrfilos y las clulas dendrticas (las primeras clulas en encontrar un antigen extrao durante una infeccin) tanto como las clulas B que producen anticuerpos. La IL-12 a su vez activa a las clulas destructoras naturales y las clulas T y parece particularmente potente en su habilidad para inducir la produccin del IFN-y La combinacin del IFN-y y la IL -12 enva un poderoso signo hacia las clulas precursoras sencillas del lineaje auxiliar T, cambiando una respuesta inmune no duplicable hacia la inmunidad mediada por las clulas, una de las dos grandes extremidades de la inmunidad adquirida (la otra siendo una forma humoral asociada con el anticuerpo). (4615)

4.6 - FACTOR DE INHIBICION DE LA MIGRACION El factor de inhibicin de la migracin (MIF, del ingls, migration inhibition factor) es otra de las citocinas que regulan a las clulas efectoras. Una de las primeras investigaciones de las reacciones inmunitarias mediadas por clulas propuso que la acumulacin del fagocito mononuclear en los tejidos dependa de la retencin de tales clulas en respuesta a citocinas producidas a nivel local, que inhiban la motilidad. Ahora parece ms probable que la retencin de los leucocitos en los tejidos est controlada bsicamente por la expresin de receptores especficos para las molculas de la matriz extracelular. Sin embargo, una de las principales actividades de citocina que se identific, fu una que inhiba la motilidad de macrfagos in vitro llamada Factor de Inhibicin de la M igracin .(3,5)

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CAPITULO CINCO.

CITOCINAS QUE ESTIMULAN LA HEMATOPOYESIS.

Algunas de las citocinas generadas durante la inmunidad natural y las respuestas inmunitarias inducidas por antgenos especficos, tienen potentes efectos estimuladores para la proliferacin y diferenciacin de las clulas progenitoras de la mdula sea. De este modo, las reacciones inmunitarias e inflamatorias, que consumen leucocitos, tambin estimulan la produccin de leucocitos nuevos que reemplacen a las clulas inflamatorias. Todas las poblaciones de leucocitos maduros surgen a consecuencia de una expansin progresiva, y de una diferenciacin irreversible de la progenie de clulas madre pluripotenciales autorrenovables. La maduracin de las clulas implica el compromiso de una lnea particular, y ocurre junto a la prdida de la capacidad de evolucionar hacia otros tipos de clulas maduras. Este proceso se ha representado como un rbol.(2,3) Las citocinas que estimulan la expansin y diferenciacin de las clulas progenitoras de la mdula sea, se denomina Factores Estim uladores de Colonias (CSF del ingls, colony- stimulating factor), porque se suelen analizar en funcin de su capacidad para estimular la formacin de colonias celulares de los cultivos de mdula sea. Estas colonias de clulas maduran durante el anlisis in vitro, adquiriendo caractersticas de lneas de clulas especficas (por ejemplo, granulocitos, fagocitos mononucleares). Diferentes CSF actan sobre clulas de la mdula sea en diferentes estados de maduracin y promueven de forma preferencial el desarrollo de colonias de diferentes lneas. Todo esto se lleva a cabo como se presenta en la siguiente figura....

34

MADURACION DE LAS CLULAS SANGUINEAS.

CELULA MAORE f
a u t o -r e n o v a b l e

1Ligando da c-kit 1

PROGENITORA MIELOIDE

CELULAMADRE PROGENITORA UNFOIDE Pl.URIPOTENCIAL | L _ -i IL-7, otras TIMO; IL-2. 1 ------ ^ ------1 IL-4. IL ^ . o u a s j

P 'lL-3 . GM-CSF: IL-1 .IL-8 ~l

V
| e r it r o p o y e t in ] UNFOCITOSB

UNFOCITOST

CFU eritroide

Megacariocito

CFU de basfilos

CFU de eosinfilos

CFU de granuloctos-monocilos / llt -3 GM-CSF. G-CSf I

I ertropoyiina}

{IL-3 GM-CSF,

'

T
*
BASOFILOS EOSINOFILOS NEUTROFILOS

r
ERITROCITOS

MONOCITOS

PLAQUETAS

EL ARBOL HEMATOPOYETICO

La m a d u r a ^ c t l a s de colonias de granuloatos -

o n .a s T I n t e r l e u a n a ; ' e s t e l a n t e

cr fago s.(2,312>.

Los nombres asignados al CFS reflejan los tipos de colonias que surgen en estos anlisis. Es interesante sealar que muchos de los CFS se localizan en un grupo de genes en el cromosoma 5 humano, incluyendo a la IL-3 y el G M -CbK La IL-4 y la IL-5 se han localizado en este mismo complejo. Algunas de las acciones de los CSF estn influidas por otras atocinas Por ejemplo, el TNF, la LT, el IFN-y y el TGF-p inhiben la proliferacin de las clulas progenitores de la mdula sea. Por el contrario, la IL-1 y la IL-6 aumentan la respuesta a los CSF En general, se cree que las citocinas son necesarias para la normal funcin de la mdula sea y para proporcionar un medio de ajuste fino en respuesta a la estimulacin. Algunos de los CSF especficos se enumeran a continuacin

;s C E L U L A f? Clula estromal mdula sea T de C E L U L A O lA N A

A A ^ 'r it

Activacin Ligando de c- KIT 1 24 Kd (monmero) Clula madre pluripotencial Proliferacin y diferenciacin de todas las lineas celulares.

lntertucina-3

22 Kd (dimero)

Clula T. fagocito mononuclear Clula endoteliai, fibroblasto

Progenitora inmadura

CSF granulocitosmacrfagos

de 1

22 KD (dimero)

Clula T, fagocito mononuclear Clula endotelial. fibroblasto

Progenitora inmadura

diferenciacin de 1 todas las lineas celulares.

CSF de macrfagos

40kD (dimero)

Fagocito. mononuclear, endotelial

clula

Progenitora inmadura

diferenciacin de todas las lineas celulares Proliferacin i diferenciacin todas las celulares Proliferacin diferenciacin linfocito. y! de lineas

CSF de granulocitos

19 kD (dimero)

Fagocito, mononuclear, endotelial

clula

Progenitora inmadura

lnterteucina-7

25 kD (monmero)

Fibroblasto, clulas estromales de la mdula sea

Progenitora inmadura

y a

Abreviaturas. CSF. ftjet or estimular te de colonias. kD kilodalton -------------------------------

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5.1 - LIGANDO DE c-KIT La clula madre pluripotencial expresa un receptor de tirosn cinasa en la membrana que se ha identificado como el producto proteico del oncogn celular cKIT. La porcin extracelular de este receptor contiene 5 dominios de Ig. A la citocina que interacta con este receptor se le ha llamado Ligando de c-K IT y tambin se le denomina factor de la clula madre. El ligando de c-KIT se sintetiza en las clulas estromales de la mdula sea (incluidos los adipocitos. Los fibroblastos y las clulas endoteliales) en dos formas: Protena transmembranosa de aproximadamente 27 kD Protena secretada de aproximadamente 24 kD.

Estos productos diferentes son el resultado de la religacin alternativa del mismo gen. La forma soluble de este ligando no existe en una cepa de ratones mutantes llamada Factor A cero}3,5) El ratn con el factor acero tiene huecos selectivos en la poblaciones celulares derivadas de su mdula sea (por ejemplo, una produccin inadecuada de mastocitos y eosinfilos), que se llevado a la conclusin de que la forma superficial celular del ligando de c-KIT es ms importante que la forma soluble, para la estimulacin de la maduracin de las clulas madre a varias lneas hematopoyticas. Todava no es posible purificar un nmero elevado de clulas madre para su anlisis directo. Muchas de las conclusiones sobre el ligando de c-KIT y otros CSF de accin precoz, derivan de experimentos en los que se exponen poblaciones enriquecidas con clulas madre a citocinas en cultivo, y se analizan las tipos de colonias que surgen. A partir de este tipo de experimentos, se cree que el ligando de c-KIT es necesario para que la clula madre sea sensible a otros CSF, pero este no produce la formacin de colonias por s solo. Los cultivos de clulas de mdula sea que contienen clulas estromales no necesitan un aporte exgeno del ligando de c-KIT ya que estas clulas no lo expresan.(3)-

37

5.2 - INTERLEUCINA - 3 La interleucina 3 (IL-3) tambin conocido como factor estim ulante de colonias de m ltiples lneas (multi-CSF) es un producto de 20 a 26 kD de las clulas T CD4+ que acta sobre la mayor parte de los progenitores de la mdula sea inmaduros, y que promueve la expansin de clulas que se diferencian en todos los tipos de clulas maduras conocidos. La IL-3 es un miembro de la familia de citocinas de 4 hlices. En el ratn la subunidad transductora de seales es nica. La mayor parte de los anlisis funcionales de la IL-3 se han hecho en ratones. Se ha encontrado que la IL-3 tambin promueve la proliferacin y el desarrollo de los mastocitos a partir de progenitores de mdula sea, una accin aumentada por la IL-4. La IL-3 es producida por las clulas T cooperadoras CD4+ de los subgrupos TH1 yTH2. La IL-3 humana se ha identificado mediante la clonacin de DNA complementario (DNAc) de una molcula homologa a la IL-3 de ratn. Aunque la citocina 3 es sintetizada por algunos clones de clulas T humanas, ha sido ms arduo establecer la funcin de esta citocina en sistemas experimentales de hematopoyesis en seres humanos. De hecho, muchas acciones atribuidas a la IL3 mrida parece que las realiza el CSF de granulocitos macrfago humano. No se sabe si estos resultados experimentales reflejan diferencias entre especies en la condiciones experimentales. Si se trata de una diferencia entre especies, puede relacionarse con la diferente estructura del receptor de la IL-3.(3,11)

5.3 - FACTOR ESTIMULADOR DE COLONIAS DE GRANULOCITOSMACROFAGOS. El factor estimulador de colonias de granulocitos macrfagos (GM-CSF) es una glucoprotena de 22 kD sintetizada por las clulas T activadas y por los fagocitos mononucleares activados, las clulas endoteliales y los fibroblastos. El GM-CSF es un miembro de la familia de citocinas de 4 hlices. Su receptor consta de una subunidad nica y una subunidad transductora de la seal 150 KD. Como se dijo antes, esta ltima subunidad la comparte el receptor de la IL-5, y en los seres humanos pero no en los ratones, el receptor de la IL-3. El GM-CSF del ratn acta bsicamente en los progenitores de la mdula sea ya comprometidos en el desarrollo a leucocitos, y por ello acta sobre poblaciones ms diferenciadas que la IL-3. En los sistemas humanos, sin embargo, el GM-CSF tambin promueve la proliferacin de clulas que todava no se han comprometido en evolucionar a leucocitos (por ejemplo, plaquetas y progenitores de hemates) reemplazando a la IL-3. El GM-CSF tambin activa a leucocitos maduros. Por ejemplo, imita a algunas de las acciones del IFN-y como activador de macrfagos, aunque es menos potente.

38

El GM-CSF no se detecta en la pertrcos el GM-CSF en los lugares en que se produc_ pueden intervenir principalmente en la nroducido por la clulas T y macrofagos pteoen respuestas inmunitanas activacin Se los leucocitos maduros e n ^ " / . f c o s pueden estar mediados por inflamatorias, T |as clulas endoteliales los fibroblastos de la el GM-CSF producido por la clulas i , mdula sea. Se ha utilizado a He para e s S a /l^ r e T u p e r a c i n de la - e de 13 mdu'a ~

5 .4 . f a c t o r e s t im u l a d o r d e c o l o n ia s d e m o n o c t o s - m a c r o f a g o s El factor estimulador de co|0a* Stulas endoteliales y los llamado CSF-1. es sintetizado.por'a ^ " ^ a d a m e n t e 40 kD i * * fibroblastos. El polipetido secretado re(aciona estructuramente con el c-KIT.

celular normal del oncogen viral v-fms. Fl M-CSF acta bsicamente sobre aquellos en el desarrollo a monocitos, y la cdulas sobre

& e \M C SF no circula, y el principal efecto ,oca' den,r de *

medular.(5)

55

FACTOR ESTIMULADOR DE COLONIAS DE GRANULOCITOS.

E1 fa c o r estimulador de colones

' las

Un^ Q . CSF

mismas

clulas g ue

C le m e n te forma un dmero. El G-C^ f ^

de'a fe m to de citocinas de 4 hlices a. Al contrano que otros C normalmente circula. Acta bsicamente sobre i r ^ a r r o llo a granulocitos, de nuevo ^

comprometidos en

pob|acln ms madura que la que P Duecie actuar a distancia, la

mdula .15,71

. . .

15.7)

5 6 - INTERLEUCINA IN i tn L c u w n - 7
La interleucina - 7

B T fm a y o re p a rte d rio semodelos de " S ^ c o m

desarrollo n que la IL-3 o el GM-CSF. nivel de
s

n m

u y precozmente

r o

, a m

e n

t e

s o

r e

c l u

, a

3 1

, s m

o ia Estudios recientes sugieren ^

IL-7 puede tambin estimula y q q 4+ y c 8+ inmaduras en el timo.

:
rio la IL-7 en el timo. n ra rc a ^ linfoides perifricos.

2 : -

e8 1ori9e" ce,u,ar

on pxceso la IL-7 muestran un en ,a mdula sea y en los i d o s

s 7 . OTRAS CITOCINAS ESTIMULADORAS DE COLONIAS. La IL-9 es una protena de 3 a 4C> kD que ^ Sin embargo, no, b e si ~ ,n6aS 3 " d e ^o s mastocitos^ 8U Pre UrSOreS

'e M a ^ g u lic i n de las ^ ^

normales (diferentes e a h matop0yesis n vitro. respuestas inmunttanas o en ,a hem P , La IL-11 es un citocina de la n z a r s e e x p e l

-ras su activacin (que puede

m e n te mediante agentes farmacologtcos).

ua IL-11 estimula la r P e g a c a n o p o y e t * t y d e X X T ' f

m a cr fa g o ^y quizs d e s o ir s H n e a s ^ ^ u la re s a p a rtirle precursores medulares.

40

CAPITULO SEIS
ALGUNOS TEMAS CLINICOS RELACIONADOS CON LAS CITOCINAS 6.1 - MIELOPOYESIS. c n r 9r s F n MCSF v ^ N ^ ^ e c l a ^ a proIrteraclR1 y 'diferenciacin de las GMCSF, GCSF, MCSF y . sorDrendente nmero de factores de clulas mieloides. En los humanos a P una regin sobre el brazo largo del crecimiento mielopoyetico han :sido ^ eventos de translocalizacion o cromosoma 5 frecuentemen codificacin de genes para GMCSF, MCSF, desalojamiento vistas en ai euc . sdo localizados en la regin IL-3, IL-4, IL-5, y el receptor celular pa a el m l ^ , |n v |v 0 sugere que estas 5P23-35. La evidencia de ambos * s, breregu|acin de la m ie lo p o y e s is j^e n el aumento d e M ic e de liberacin de clulas sanguneas hacia la circulacin. .

6 2 . ONCOLOGIA (CITOCINAS COMO FACTOR DE CRECIMIENTO AUTOCRINO)

Los sistemas experimentales indicari que 'a jr a n s .o m ja c ^ ocurrir mediante un circuito ae,oqr' ' Muchas lineas celulares malignas, y ejemplo, el factor de < = ^ ' ^ 0slX t a y responden a la citocinas y factores de tumores extrados de Pacientef ; . ^ ? ' as noS han nevado a la hiptesis de que las crecimiento. Estas y otras cara factores de citocina/crecimiento, y de sus ^ e " e e x p r e s ^ R e c e p to re s , pueden yacer bajas formas de malignidad.

Alguna evidencia indica que este m e c a m s m abtP c rjt0 y e| sarcoma d e ^a p o sL ^o m le " tfa cto r decrecim iento de fibroblastos puede tomar este rol. Matsuda ha demostrado q u e la ^ puede producir y responder a !a como el origen de la IL-6 , pero co pacientes con mieloma, las. f ulas P f e U'a ha, ^ >h ^ madamente el 50% de los responden a la IL -6 y que la anti IL-6 de ,a tim ,dina terciada, sugiriendo que la C i m i e n t o a u to c h n o -

41

6.3 - PRODUCCIN DE CITOCINAS POR LOS TUMORES. Ambos nodulos linfticos, el de mixoma cardiaco y el hiperplsico de la enfermedad de Kastleman puede producir altas cantidades de 11-6. Esto es interesante porque ambas condiciones estn asociadas con la activacin de clulas B policlonales, la hipergamaglobulinemia, la fiebre y la produccin de protenas de fase aguda. En la enfermedad de Kastleman puede existir tambin el mieloma mltiple. La removisin de los nodulos linfticos involucrados resultan de la recuperacin completa.(25)

6.4 - LAS CITOCINAS EN EL TRATAMIENTO DEL CANCER. Los interferones y el TGF-(3 tiene propiedades inhibidoras de crecimiento para un amplio rango de tipo de clulas. La utilidad clnica de los IFN ha sido resumida como = buena en la leucemia de clulas velludas, regular en otros cnceres hematlogicos y mala en los tumores slidos =. La IL-2 ha sido infundida en pacientes con cncer metastsico con algo de mejoramiento en la carga de clulas de tumor. Cuando se combina con las clulas destructivas activadas con la linfoquinas (las clulas destructivas naturales expuestas a la IL-2), las respuestas son un tanto mejoradas pero, an as, son desilucionantes.(25)

6.5 - CITOCINAS EN LOS CASOS DE SEPSIS. Las concentraciones aumentadas del TNF en el suero han sido observadas en humanos y en animales despus de inyeccin de endotoxinas, con un punto mximo de 2 horas y un retomo a la lnea de base a las 6 horas. Varios estudios han medido el TNF y otras citocinas en la sepsis. En las sepsis muy severa negativa de Gram, las concentraciones de TNF estn aumentadas en la mayora de los pacientes, a veces hasta muy altos valores, mientras que la IL-1 y el TNF estn aumentados en 20% de los casos. En un grupo de pacientes admitidos a una unidad de cuidados intensivos con choque sptico, el TNF est aumentado en solamente el 25% de los casos. Sin embargo, todas las concentraciones antes mencionadas indicaron una correlacin reciente de las concentraciones de TNF y la mortandad en el choque sptico. Es difcil definir un valor por encima del cual la procnosis disminuye marcadamente, particularmente porque la concentraciones vistas en la mayora de las pacientes con choque sptico severo son menores que aquellas en los voluntarios humanos despus de una inyeccin de endotoxina sin consecuencias dainas. La sepsis, la concentraciones de TNF, fueron mantenidas durante 2-6

horas sugiriendo que ia vibracin sostenida de l a e n d o n a duradn y .a resultado. Ademas, el TNF circula ^ ^ A p lica d o como el nico yJ que ,a relaclon con otras

dt^'inas'y^a'en doto xina circulatoria misma debe ser importante.

Actualmente la esta clase de informacin en el techa*

'

^ S e, ndicador de proteccin, dada la *

Cabe mencionar que no solamenJ ^ ^ b ^ m n ' ^ r c T

_4. (1.22.25)

quemaduras y en los recha.os

de injerto.'

6.7 OTROKUL. ROL:i_no LAS vVACUNAS 6 7 - -OTRO /-ww Adems de la co n sid e ra ci n j*i la I M 2 > con o , un

b = a e t ^

r dedo e s r fu " e SxIm fnadosV on el mismo ratones mostraron una respuesta " ^ ^ ^

* de forma TH2 de

s r j ^ s ;
te d o re s .

*
En ,a

Varios otros modelos de c u n a s ^ leishmaniasis el investigador

da dP derep e n s i E a ha demostrado do con

IL-6 , en los primeros no humanos en * estn estn siendo siendo investigados investigaos todava.

enfermedades

ca u s a -

"

a l

:
, e i i d 0

43

asociado con la esquistosomiasis (una infeccin helmntica propia del agua). Este dao es causado principalmente por la reaccin del sistema inmune a los huevecillos del parsito, los cuales son depositados en el hgado e inducen una vigorosa respuesta TH 2 asociada con la formacin de masas de tejido inflamado, granulomas, y el engrasamiento del tejido conectivo conocido como fib ro s is .(3)

44

CAPITULO SIETE

ENSAYOS Y BIOENSAYOS. 7.1 - ENSAYOS DE CITOCINAS Virtualmente todas las citocinas pueden ser mediadas con un apropiado bioensayo, esto no es sorprendente ya que la mayora de las citocinas fueron originalmente descritas como factores biolgicamente activas y fueron subsecuentemente purificadas y biolgicamente caracterizadas. Sin embargo, los bioensayos no son ideales y los sistemas apropiados de inmunoensayo sern requeridos antes de que la medicin de las citocinas pueda volverse un adjunto til para la Qumica Clnica.

7.2 BIOENSAYOS. El problema ms importante con los bioensayos es que estos no son especficos. Como ejemplo se encuentran los intentos para desarrollar un bioensayo especfico para la IL-1,, aunque el ensayo general de proliferacin de timocitos fu descrita como un ensayo especfico de IL-1, muchas citocinas han demostrado que influyen en este. La IL -6 y el TNF pueden reemplazar a la IL-1, y la IL-2 e IL-4 pueden sinergizar con la IL-1. En un intento para evitar estos problemas, se han desarrollado varias modificaciones en la metodologa. Utilizando anticuerpos neutralizadores especficos, uno puede demostrar que la actividad reside en la IL-1 IL-6 . Saturando el ensayo con IL-2 IL -4 se puede desechar la influencia de estas citocinas en el examen de muestra. Cabe mencionar, que la actividad biolgica medida en algunos bioensayos es menos que el aparentemente medido por el inmunoensayo -ta l vez a causa de los factores inhibidores- en las molculas de enlace de las citocinas las citocinas biolgicamente activas pero inmunoreactivas. Las molculas de enlace de las citocinas en el suero y en la orina han sido descritas para la IL-1, la IL-6 y el TNF. La mayora de los bioensayos de citocinas son un trabajo intenso, caro y sujeto a considerable influencia del operador. Aunque obviamente no es ajustable para los exmenes de laboratorio y de rutina de Qumica Clnica, estos tienen algunas ventajas que los hacen invaluables, al menos que el roll de los ensayos de citocinas est siendo determinado. Generalmente estos son muy sensitivos, detectando citocinas en forma de monogramas por milmetro Adems, los materiales requeridos para el bioensayo son a menudo ms fcilmente aprendidos que los del inmunoensayo; es particularmente difcil obtener buenos anticuerpos especficos para algunas citocinas. Por lo tanto la aplicacin de bioensayos puede identificar cuales reas garantizan la inversin en el desarrollo de un inmunoensayo.(5,23)

45

7.3 - INMUNOENSAYOS DE CITOCINAS. Aunque los inmunoensayos tienen varias ventajas distintas sobre los bioensayos (mtodos simples para usar y controlar), la introduccin de los inmunoensayos de citocinas hacia los exmenes de laboratorio de Qumica Clnica no es directa. Los inmunoensayos de varias citocinas estn ahora disponibles de fuentes comerciales, pero son de alto costo y en general han sido validados como herramientas de investigacin, a menudo solamente para los cultivos celulares. En muchos casos, estos inmunoensayos carecen de sensibilidad para su uso con plasma, y algunos estn sujetos a la interferencia del factor reumatoide los anticuerpos hetereoflicos. Estos son imprecisos y a menudo no demuestran perfiles de recuperacin aceptable de plasma, fluido cerebroespinal lquido sinovial. Por lo tanto, cuando sea posible, los laboratorios que se interesan en la medicin de citocinas en nmero sustancial de tomas necesitaran establecer sus propios ensayos. En esta forma ellos pueden asegurar la validez de sus resultados y motivar a la produccin de reactivos tales como los anticuerpos especficos de citocinas.(3,5)

7.4 - ENSAYOS DE CITOCINAS La formacin de colonias eritroides en los ensayos de colonia de la mdula sea, la estimulacin de la eritropoyesis en los ratones policitmicos post-hipxicos y la estimulacin de la sntesis heme en las clulas de la mdula sea ratas- humanos pueden ser analizadas mediante un examen de ELISA por un radioinmunoensayo (RIA). La GM-CSF estimula la proliferacin de los granulocitos y el macrfago tanto como la diferenciacin y activacin de la histamina. Este tiene un potente efecto sobre varias lneas de clulas, es difcil de detectar en la sangre perifrica aun en la infeccin bacterial la endotoxema, pero puede ser detectada en el fluido cerebro espinal durante la meningitis bacterial. Este tambin puede ser examinado por el examen ELISA Y RIA. Los bioensayos para el G-CSF son realizados al examinar la formacin de la colonia de granulocitos en los ensayos de colonia de la mdula sea, el mejoramiento de la produccin de superxidos en los neutrfilos, la proliferacin de una lnea de clulas murinas. El G-CSF ha demostrado ser til para movilizar las clulas tallo de la mdula sea humana hacia la sangre perifrica, ponindola disponible para su recoleccin, para uso posterior en la trasplantacin de clulas tallo. La G-CSF tambin ha sido utilizada para medir la toxicidad de la quimio y radioterapia en mdula sea y puede inducir el reclutamiento de clulas malignas. Otra de las funciones es la proliferacin de lneas especficas de la clulas leucmicas. El factor de clulas de tallo es un cofactor de la hemopoyesis temprana, producida por las clulas estromales. Este tiene una actividad relativamente pobre

sido desarrolladas. Por otro lado, la IL-2

s
- - La
i l -3

" res; ; ' estimula los " u e d e T e ' " ^

basfilos ^ por la

ensayos de formac ofreciendo examenes EL

^ )L 3 P r Aiuias j y NK y

La 1L 4 activa las clulas B, induce ' ^ P ^ f u n e T s d'e o fu ts especficas

s =

S S S

i H 2

s s f

5W ssE
^ ^ proliferacin de * *

de clulas. Los ELISA en est

LA |L -6 estimula la secrecin de an' ICU^ alzada al medir la proliferacin de IOS mocitos y la hemop,cyesis J r t a p u r * el mitgeno la lnea p t e y * lneas de clulas, la cl j f s deec,ada% o r su mejoramiento de la

tboratrios^estn W ^a n d ^ d^ada^tarla^aj^examen ^

r S S m
q

aaaaya

T '3

un factor de pronsticos en os pacientes^oort me,orna mltiple. ^

El factor de necrosis d ^ d ^ r a c t i v a c i n T s t o c l s i c a , la estim ularon activacin de PT T 0< o Z o ^ de factor decrecimiento

S r H S s s s s s w leucocito humano ^ LA?.eM(3,f,23)

las molculas de adhesin.

s s - 4- .

47

7 5 C TO cS um Tn^S 3 rASETEsfDADE p O R B SNTE0 STANSARIZACIN.

I mprliciones de laboratorio de las citocinas

condusiones errn eas.A

r sr

pr

xr i

analizar ciertas cltoc,n

rpsDonder a diferentes atocinas y a su v

,zzszsrZ-rj,
' " Z Z v s s s
0f

~
^
a

x
/ " g

t
t t TGF-

9 lo s estndares de la citocinas humanas y r| f 0 ^ disponibles en el Instituto Naciona de Estndar g

m .csf

S ~

s ,* r S : s s s v s - . r ;" " rr .
dadoso del espcimen.

internacionales. La nat

m uso

aumentado d e ja s e preparado para apoyar en el

. ,

* * s z ssen s r s r s (jc 0 con sus ensayos apropiados,

g

r s
mi c u la s < 2 3 )

Las tcnicas exactas son el requisito obvio para anaHaar es

7 .6

. APLICACIONES CLINICAS DE LA MEDICIONES DE CITOCINAS. A un nivel de investigacin, ma^ r | ^ s'V n muclros diferentes procesos

exitosamente

i S

&

m e n in g o fo c a l

y las c cerebroespinal en la mfeccio

sistem a Nervioso Central. ^ examinan la

Para entrar en el repertorio ^ Laboratorio de citocina deben ya sea p ^ e e j e v a jn .o tos .

d a g n s tc 0 6 el manejo

es

e n te m n e d a d jn ^

sensM dada e $ e < ^ c t e d ^ v e l^ '^ a d ^ d'apd S pdup i n de c itrin a a a ^ a m s ,

Al contrano. es el W estn comenzand^

de los ^

mayona de los la c a d o r

,Aiido -Tales como protenas d

. . . . d _ ase aguda,

^
... v (23)

de enzimas

CONCLUSIONES.
familia de mediadores

mismas atocina , y , as acciones de las diferentes atocinas w An m sntesis de otras citocinas. En g en la accin y inflamatorios y antigemcos, y

redundantes e influyen $e sintetizan en ,a capacidad para actuar a . alta afmidad en las u n a cantidad suficiente ^ ^ ^

ejercer acciones endcrinas.

son crticas para la D y unen a la inmunida

jfica con ta natural. P naturaleza de las respuestas

al antaeno. >ara eliminar al antigen .

, sss s s s s s s a s a . . -

. pxcesivas de las citocinas

^leggr

y asociarse con enfermedad.

en ,a deteccin y

rnedicinSdeaia^r^ o |c in a s '^ i^ ^ o a ^ para^ambos e ^ s t u d i ^ ^ J ^ ^ ^

enfatiza.

- huos oara su medicin estn

Cabe mencionar ^ ^ n s a y o s .^ n m u rw e n s a y o s , medicin de RNAm, ''desarrollados, y p S m e n t o s inmunoqumicos. siendo ensayos de enlace de recepto y P g su gfan

apoyar en el d,ag . CITOCINAS. este complejo mundo de las w

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