Universidad Nacional Abierta y a Distancia

Guas del Laboratorio de Microbiologa de Alimentos ltima actualizacin: Enero 2013 Autora: Claudia Patricia Zambrano Parra

Bogot, Febrero de 2014

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS CIENCIAS BSICAS UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

Introduccin La unidad de Ciencias Bsicas de la Universidad Abierta y a Distancia incluye dentro de su formacin bsica disciplinar la asignatura de Microbiologa, de tipo metodolgico (Terico-Prctico) y en el que se desarrollan prcticas de laboratorio cuyo objetivo principal es ofrecer al estudiante una visin general de temas que le permitan identificar, comprender y analizar algunas estructuras, mecanismos y procesos involucrados en el amplio, complejo y fascinante mundo de la Microbiologa. Dentro de los temas tratados en estas guas de laboratorio se encuentran: la identificacin de microorganismos, como bacterias y hongos, presentes en diferentes superficies; las condiciones ideales de crecimiento de estos microorganismos; el conocimiento sobre el metabolismo microbiano y la evaluacin microbiolgica en alimentos. Cada una de las prcticas incluye: una serie de preguntas que le permiten al estudiante preparar el tema de la prctica con anticipacin, una breve explicacin de los fundamentos tericos necesarios para el logro de los objetivos propuestos, el desarrollo de la prctica y un cuestionario que le brinda al estudiante la posibilidad de profundizar en el tema tratado. Estas guas fueron adaptadas al rea de alimentos basndose en las guas de Microbiologa general elaboradas por Anglica Yara. Recomendaciones Generales A continuacin encontraran una serie de materiales que son de carcter obligatorio para el ingreso al laboratorio: Bata blanca de manga larga Gorro Tapabocas Fsforos Hipoclorito de Sodio o clorox Papel absorbente Pauelos desechables triple hoja Papel de arroz Cinta de enmascarar

Marcador de vidrio Tijeras Frasco de boca ancha Lminas portaobjetos Lminas cubreobjetos Asas bacteriolgicas: curva y recta Toalla para manos Jabn desinfectante para manos Jabn detergente en polvo Hisopos, aplicadores de madera Alcohol antisptico Churrusco para tubos de ensayo Un alimento contaminado con hongos para la primera prctica

El gorro, la bata y el tapabocas son de uso individual e indispensable para el ingreso al laboratorio. El resto de materiales se utilizan por grupos de, mnimo, 3 personas. Cada grupo debe tener todo el material. Adems se recomienda que tenga en cuenta las siguientes indicaciones: Recuerde que en algunas prcticas de laboratorio se trabaja con cepas bacterianas de alta patogenicidad por lo que debe extremar sus cuidados. No debe salir con la bata fuera del laboratorio Debe tener especial cuidado con el mechero y el material de vidrio (evitar quemaduras y cortadas) Debe trabajar muy concentrado pues un pequeo error o descuido, puede daar todo su trabajo en el laboratorio y tener el riesgo de contaminarse con bacterias patgenas. Observe el material de vidrio y pida al Tutor y coordinador que le ensee su adecuada manipulacin (cajas de petri, pipetas diferentes volmenes, pipetas de pasteur). El material de vidrio en microbiologa siempre debe ser utilizado estril por lo que debe ser empacado con papel kraft antes de ser sometido a un proceso de esterilizacin. Tenga especial cuidado con la manipulacin del material ya que se puede contaminar con microorganismos provenientes de las manos. Identifique las asas bacteriolgicas y reciba las indicaciones de uso por parte del Tutor o coordinador de laboratorio Una vez hecha la lectura de los medios de cultivo, quite la cinta de enmascarar .y entregue el material al grupo encargado de la esterilizacin. Despus del proceso de esterilizacin, espere a que el material este fro para proceder con el lavado de la siguiente manera: 1. Retire los restos de agar y cinta de enmascarar y depostelos en una bolsa roja para basura. No deje residuos en los vertederos !!! 2. Enjabone las cajas y dems material utilizado.

3. Enjuague bien, deje escurrir y seque el material. 4. Entregue todo el material al coordinador del laboratorio. RECUERDE DEJAR EL LABORATORIO EN PERFECTO ESTADO DE LIMPIEZA.

Prctica No. 1 Aislamiento de microorganismos en diferentes superficies

1. PRE LABORATORIO a. Que es bioseguridad? b. Cules son las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa? c. Mencione las clases de esterilizacin, cuales son los agentes de esterilizacin con ms uso en el laboratorio, en que consiste cada uno de ellos y para qu materiales se utilizan.

Agente de esterilizacin Esterilizacin con calor seco Esterilizacin con calor hmedo Radiaciones Filtracin

Temperatura de Uso (si se aplica)

Equipo utilizado

Material que se puede esterilizar por este mtodo.

d. Establezca las diferencias entre esterilizacin y desinfeccin e. Qu es un medio de cultivo; de qu estn compuestos principalmente; cmo se clasifican segn su proporcin de agar y segn su suministro de nutrientes? f. Cul es la utilidad de los medios de cultivo y qu diferencia un caldo de un medio slido? g. Cul es el fundamento de la coloracin de Gram? h. Qu diferencias encuentra entre bacterias Gram positivas y Gram negativas? i. Cules son las principales caractersticas morfolgicas y metablicas de los hongos? j.

2. OBJETIVOS - Establecer normas y principios bsicos de comportamiento en el laboratorio. - Aprender y utilizar los mtodos de esterilizacin disponibles en el laboratorio. - Conocer los materiales y equipos utilizados en el laboratorio de microbiologa. - Aprender la preparacin y manipulacin de los medios de cultivo. - Realizar el aislamiento de microorganismos de flora humana, ambiental y de superficies. - Conocer y estudiar la morfologa de bacterias, mohos y levaduras. - Conocer y aplicar diferentes mtodos de tincin para la identificacin de los microorganismos.

3. INTRODUCCIN El organismo humano es considerado como un hospedero que puede albergar numerosos microorganismos, que solamente desarrollarn un poder agresor si las condiciones normales de este hospedero se ven alteradas por situaciones adversas intrnsecas o extrnsecas, favoreciendo as, la aparicin de diferentes procesos infecciosos y de sntomas clnicos. Esta poblacin microbiana puede denominarse flora normal, microbiota o indgena, localizndose en numerosas reas del cuerpo humano y que pueden resumirse as: reas del cuerpo hospederas de flora normal
TRACTO RESPIRATORIO SUSPERIOR Cavidad Oral Nasofaringe Orofaringe Amgdalas

TRACTO GASTROINTESTINAL BAJO Ilen Intestino Grueso

TRACTO GENITOURINARIO Genitales Externos Uretra Anterior Vagina

OJOS Conjuntiva

PIEL Y MUCOSAS

CONDUCTO AUDITIVO EXTERNO

Snchez, 1984

Debe comprenderse muy bien el concepto de flora normal y hospedero normal: Hospedero normal es aquel individuo que alberga un elevado nmero de microorganismos sin detrimento de su salud. Flora normal est constituida por todos aquellos microorganismos que pueden albergarse en un individuo sano, sin cambiar su condicin normal, pero cuando ocurre alguna alteracin, ya sea por causas externas o internas, aquellos microorganismos varan su comportamiento pasivo tornndose agresores activos y desarrollando procesos infecciosos. Por otro lado, dentro de las normas de calidad, especialmente en el rea de alimentos y farmacologa, se enfatiza el control microbiolgico de las superficies de trabajo ya que debido a las condiciones de uso habituales o por una mala desinfeccin, estas superficies pueden actuar como reservorios de agentes contaminantes, entre los que se incluyen microorganismos y agentes qumicos. Por consiguiente, se hace necesaria la valoracin peridica de superficies y ambientes con el fin de mejorar las condiciones de produccin y obtener un producto inocuo y ptimo para su consumo. La higiene de superficies, equipos y utensilios es uno de los pilares donde se asientan las buenas prcticas de manufactura, considerado el primer escaln para alcanzar cualquier sistema de calidad que se quiera implantar en la empresa o industria.

4. MATERIALES - 4 cajas petri con agar nutritivo (para crecimiento de bacterias) - 2 cajas petri con agar Sabouraud (para crecimiento de mohos y levaduras) - 1 caja petri con agar Baird Parker - 1 caja petri con McKonkey /SS - Frasco de boca ancha con agua y decol - Tubos con agua destilada estril - Hisopos estriles con palo de madera - Gradilla - Cinta de enmascarar - Mechero de bunsen - Fsforos

- Incubadora - Microscopio - Cepas de microorganismos - Azul de lactofenol - Azul de metileno - Colorantes para Gram : Cristal violeta, Lugol, Alcohol acetona, Fucsina. - Soporte para tincin - Solucin salina fisiolgica estril - Lminas portaobjetos - Lminas cubreobjetos - Cinta pegante - Asas bacteriolgicas - Papel absorbente - Frasco de boca ancha - Cuentacolonias

5. PROCEDIMIENTO: I PARTE a. Determinacin de Flora Ambiental Marque una de las cajas de agar nutritivo y otra de agar Saboureaud con cinta de enmascarar (en la base de la caja), as: No. de grupo, fecha, medio de cultivo y FLORA AMBIENTAL. Escoja un sitio seguro en el laboratorio o en la Universidad. Recuerde: No salir con la bata del laboratorio!! Retire la tapa de las cajas de Petri marcadas y exponga al aire por 15 a 30 minutos. Solo debe dejar que los medios de cultivo se expongan al ambiente. Pasado el tiempo, cierre las cajas y djelas en su sitio de trabajo.

b. Determinacin de Flora de Superficie En este caso deber evaluar una superficie antes y despus de utilizar un desinfectante. Antes de limpiar Marque una de las cajas de agar nutritivo y otra de agar Saboureaud con cinta de enmascarar (en la base de la caja), as: No. de grupo, fecha, medio de cultivo y SUPERFICIE ANTES DE LIMPIAR. Escoja una superficie en el laboratorio (mesones, pisos, pared, etc.) Delimite el sitio a muestrear (4x4 cm. aproximadamente) Encienda el mechero de bunsen.

Abra el tubo tapa rosca con el agua destilada estril, introduzca el hisopo para humedecer el algodn. Escurra el hisopo en las paredes internas del tubo. Coloque el tubo en la gradilla. Pase el hisopo humedecido sobre toda la superficie delimitada Cerca del mechero, abra la caja de agar nutritivo marcada y pase suavemente el hisopo sobre el agar, haciendo un zig-zag en la superficie. Cierre la caja. Cerca del mechero abra la caja de agar sabouraud marcada y realice el mismo procedimiento que con el agar nutritivo. Cierre la caja. Descarte el hisopo en el frasco de vidrio con agua y clorox que trajo. Deje las cajas ya sembradas en su sitio de trabajo.

Procedimiento de Limpieza Una vez hecho el procedimiento anterior, limpie la zona delimitada con agua y jabn. Enjuague, seque y luego desinfecte con alcohol, agua mezclada con clorox o algn desinfectante de su inters. Deje secar.

Despus de Limpiar Efecte el mismo procedimiento que realiz en Antes de limpiar pero recuerde marcar las cajas de petri (agar nutritivo y Saboureaud) con SUPERFICIE DESPUES DE LIMPIAR.

c. Evaluacin de Manipuladores Antes de lavado de manos Marque una de las cajas de agar nutritivo con cinta de enmascarar (en la base de la caja), as: No. de grupo, fecha, medio de cultivo y FLORA HUMANA ANTES DE LAVADO DE MANOS. Abra el tubo tapa rosca con el agua destilada estril, introduzca el hisopo para humedecer el algodn. Coloque el tubo en la gradilla. Pase suavemente el hisopo humedecido sobre cada uno de los dedos y uas del manipulador. (Escoja la mano dominante del manipulador) Cerca del mechero abra la caja de agar Baird-Parker y de McKonkey/SS marcada y pase suavemente el hisopo sobre el agar, haciendo un zig-zag en la superficie. Cierre la caja. Descarte el hisopo en el frasco de vidrio con agua y clorox que trajo. Deje las cajas ya sembradas en su sitio de trabajo.

Procedimiento de Limpieza El manipulador debe lavarse las manos como rutinariamente lo hace.

Despus de Lavado de manos Efecte el mismo procedimiento que realiz en Antes de Lavado de manos pero recuerde marcar las cajas de agar Baird-Parker y de McKonkey/SS con FLORA HUMANA DESPUES DE LAVADO DE MANOS. d. Identificacin microscpica de hongos en alimento Coloque cerca al mechero el alimento con hongos y con ayuda de cinta pegante, recoja muestra de la superficie. Marque la lmina portaobjetos con cinta de enmascarar: nmero del grupo y coloracin. Coloque en el centro de la lmina portaobjetos una pequea gota de azul de Lactofenol, y luego pegue la cinta a la lmina. Presione ligeramente para eliminar burbujas de aire. Observe en el microscopio en los objetivos de 10x y 40x.

II PARTE: FORMAS DE SIEMBRA A. Siembra de medio slido a medio lquido Marque correctamente los tubos con el nmero del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha. Encienda el mechero y trabaje siempre a lado de el. Caliente el asa recta al rojo y djela enfriar. Con el asa tome un poco de colonia del cultivo, destape el tubo de caldo nutritivo estril flameando la boca del tubo con el mechero y deposite la porcin de cultivo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Caliente el asa al rojo. Esterilcela siempre antes de usarla y despus de usarla. Incube los tubos a 37C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. B. Siembra de medio lquido a slido Proceda en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa curva Si la siembra es e tubo recuerde hacer puncin y estra. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como estra, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Pregunte al Tutor o Coordinador de laboratorio en que consisten estos sistemas de siembra. C. Siembra de medio slido a slido Proceda de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Si la siembra es e tubo recuerde hacer puncin y estra. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como estra, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Pregunte al Tutor o Coordinador de laboratorio en que consisten estos sistemas de siembra.

D. Siembra en profundidad Marque la caja de petri estril con el nmero de grupo, la fecha y Siembra en Profundidad. Abra ligeramente la caja cerca del mechero. Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plstica, transfiera 1 ml de ste cultivo a la base de la caja de petri estril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesn, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por ltimo en forma de 8. Esto garantiza una distribucin homognea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento.

Procedimiento Final Rena todas las cajas de agar nutritivo con la tapa hacia arriba y los tubos, envulvalos con cinta de enmascarar y mrquelos con el nmero del grupo. Incubar a 37 c por 24 a 48 horas. Rena todas las cajas de agar Saboureaud con la tapa hacia arriba, envulvalas con cinta de enmascarar y mrquelas con el nmero del grupo. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 das.

6. RESULTADOS a. Flora Ambiental De acuerdo al medio de cultivo utilizado identifique el nmero y las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las colonias. Para las caractersticas microscpicas deber realizar la coloracin de Gram (ver anexo al final de las prcticas). Ambiente analizado _____________________________________________________

Agar Nutritivo/Agar Saboureaud Cepa Nmero de colonias Caractersticas Macroscpicas

Caractersticas Microscpicas

b. Flora de Superficie: De acuerdo al medio de cultivo utilizado identifique el nmero y las caractersticas macro y microscpicas de las colonias. Superficie analizada ____________________________________________________

Indique la tcnica y elementos utilizados en la limpieza de la superficie ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ________________________

Antes de Limpiar Agar Nutritivo/Agar Saboureaud Cepa Nmero de colonias Caractersticas Macroscpicas

Caractersticas Microscpicas

Despus de limpiar Agar Nutritivo/Agar Saboureaud Cepa Nmero de colonias Caractersticas Macroscpicas

Caractersticas Microscpicas

c. Evaluacin del Manipulador: Identifique el nmero y las caractersticas macro y microscpicas de las colonias. Indique la tcnica y elementos utilizados en el lavado de manos ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

Antes de Lavado de manos Cepa Nmero de colonias Caractersticas Macroscpicas

Caractersticas Microscpicas

Despus de Lavado de manos Cepa Nmero de colonias Caractersticas Macroscpicas

Caractersticas Microscpicas

d. Hongos en alimento Dibuje lo observado en el microscopio y seale las principales estructuras identificadas.

Caractersticas Microscpicas

7. CUESTIONARIO a. Indique la importancia del conocimiento del laboratorio de microbiologa, en el rea de alimentos b. Por que no se utiliza medio Saboureaud en la determinacin de flora humana? c. A que se debe la diferencia de incubacin entre bacterias y hongos? d. Indique 5 puntos que debe tener en cuenta el manipulador de alimentos al momento de manejar los alimentos e. Indique cual es la principal flora normal encontrada en humanos y como se relaciona con las ETAs

Prctica No. 2 Condiciones de crecimiento y Metabolismo Bacteriano

1. PRE LABORATORIO a. Qu factores intrnsecos y extrnsecos afectan el crecimiento de los microorganismos? b. Defina los diferentes sistemas de siembra: Puncin y estra, agotamiento, rejilla y profundidad. c. Qu se entiende por metabolismo Bacteriano

2. OBJETIVOS - Reconocer las principales pruebas metablicas utilizadas en la identificacin de microorganismos Gram negativos. - Identificar los factores ambientales que afectan el crecimiento en bacterias - Conocer las diferentes tcnicas de siembra y aislamiento de microorganismos a partir de cultivos puros. - Adquirir destreza en la manipulacin de medios de cultivo y cepas microbianas.

3. INTRODUCCIN Prcticamente todos los microorganismos, pero en particular las bacterias, pueden cultivarse sobre substratos nutritivos (medios de cultivo) para el estudio de sus propiedades y lograr identificarlas. El crecimiento de las bacterias es el resultado de la intervencin de diferentes sustancias alimenticias y principios activos, y donde intervienen factores fsicos como la temperatura, pH, tensin de oxgeno, potencial redox, etc. Para su crecimiento los microorganismos necesitan agua, adems de estar presentes en forma utilizable el carbono, el oxgeno, el hidrgeno, el nitrgeno, el azufre, el fsforo, el potasio, el calcio, el magnesio y el hierro. Para la seleccin y diferenciacin de los microorganismos se aaden sustancias al medio de cultivo, entre las que se encuentran: las sustancias selectivas que ofrecen buenas condiciones de crecimiento solamente a determinados organismos, mientras que otros no pueden proliferar, o solo lentamente. Los aditivos, del medio de cultivo, pueden reaccionar con los productos del metabolismo bacteriano que son formados slo por determinados organismos. Esto lleva a modificaciones en el medio (cambio de color, formacin de gas, etc) o influir en el aspecto de las colonias respectivas (ej. Por acumulacin de colorante). Igualmente, en el medio de cultivo se pueden encontrar colorantes, como indicadores, cuyo cambio de color es caracterstico para un determinado intervalo de pH y obviamente de microorganismos. Algunas sustancias selectivas se emplean como

colorantes: cristal violeta, verde brillante, que inhiben los organismos gram positivos por lo que solamente crecern los gram negativos. Por consiguiente, de acuerdo a la habilidad que tienen los microorganismos para crecer sobre medios de cultivo especficos, as como la formacin de colonias caractersticas y una morfologa especial, se pueden clasificar en 4 importantes grupos: a. Microorganismos Gram-positivos : Cocos (Staphylococcus y Streptococcus) y Bacilos (Corynebacterium y Listeria) b. Microorganismos Gram-Negativos (crecimiento exigente): Cocos (Neisserias patgenas), Bacilos y Cocobacilos (Haemophilus), Formas espirales (Campylobacter). c. Microorganismos Gram-Negativos (crecimiento no exigente): Bacilos (Enterobacterias y Pseudomonas). d. Anaerobios estrictos De otra parte, el paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo, ya sea lquido o slido, se denomina siembra o inoculacin. El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra. Estos procedimientos se pueden realizar de diferentes formas y depender de las caractersticas de la muestra, del medio en el que se van a sembrar o resembrar, del tipo de material que se utilice, etc. Entre los mtodos ms importantes de siembra estn: estras, agotamiento, rejilla y profundidad.

4. MATERIALES - Tubos con caldo nutritivo estril - Tubo con Tioglicolato - Un tubo con caldo nutritivo pH 3.0 - Un tubo con caldo nutritivo pH 7.0 - Un tubo con caldo nutritivo pH 11.0 - Tubo con Cepa bacteriana - Tubos con los siguientes medios de cultivo inclinados estriles Lisina Hierro Agar (LIA) Triple azcar hierro (TSI) Citrato (CIT) Sulfuro Indol Motilidad (SIM) Tubos con los siguientes medios lquidos estriles Caldo lactosado BRILLA con campana de Durham Caldo nutritivo (CN) Cajas de petri con los siguientes medios estriles Agar nutritivo (AN) Eosina azul de metileno agar (EMB) S.S. agar (SS) Mc Conkey (McCk)

- Hisopos estriles - Sensidiscos - Pinzas estriles - Hipoclorito de sodio al 5% - Aceite mineral estril - Asas bacteriolgicas - Pipeta estril - Gradilla - Incubadora - Nevera

5. PROCEDIMIENTO 5.1. FACTORES EXTRNSECOS E INTRNSECOS a. Influencia de la temperatura

Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos: Tubo 1: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 4C Tubo 2: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 37C Tubo 3: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 55C Esterilice el asa recta o curva y djela enfriar Recoja con el asa estril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados. Esterilice el asa.

b. Influencia del pH

Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos: Tubo 1 pH 3.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 3.0 Tubo 2 pH 7.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 7.0 Tubo 3 pH 11.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 11.0 Esterilice el asa recta o curva y djela enfriar Recoja con el asa estril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados. Esterilice el asa.

c. Influencia de la Tensin de oxgeno Marque los tubos de la siguiente manera Tubo de tioglicolato: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y TIOGLICOLATO. Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y AEROBIO. Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y ANAEROBIO. Esterilice el asa recta o curva y djela enfriar Recoja con el asa estril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados. Esterilice el asa. Adicione 2 ml de aceite mineral estril a los tubos de tioglicolato y al tubo para anaerobios. Una vez realizados los tres procedimientos anteriores (a, b, y c) separe el tubo marcado con 4 C y 55 C, y entrguelos al coordinador del laboratorio para que los lleve a incubar a las temperaturas correspondientes.

Los otros tubos envulvalos en cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero del grupo y entrguelos al coordinador para incubarlos a 37C.

5.2. METABOLISMO MICROBIANO Para iniciar el proceso de identificacin de cultivo que le correspondi, realice una tincin de gram. Marque muy bien todos los medios con el No. de la cepa, No. del grupo y nombre del medio de cultivo. Esterilice el asa, djela enfriar para luego tomar una cepa de bacterias. Inocule los medios diferenciales de la siguiente manera:

- Tubos con agar inclinado (TSI, LIA, CIT): Realice una puncin en el fondo del tubo y una estra en la superficie. - Tubo con medio semislido (SIM): Realice una sola puncin hasta el fondo del tubo. - Tubos con medio lquido (BRILLA, CN): Suspenda la cepa bacteriana en el medio lquido y gire varias veces el asa. - Cajas de agar (AN, EMB, SS, McCk): Utilice el sistema de siembra de rejilla para obtener unidades formadoras y colonias individuales. Finalmente envuelva los tubos y cajas con cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero del grupo y llvelas a incubar a 37 C durante 24 a 48 horas.

5.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD EN ALIMENTOS - Para esta prueba el estudiante debe traer un alimento envasado en cualquier tipo de presentacin (bolsas, enlatados o tetra-pack), hermticamente cerrados.

- Inicialmente debe hacerse una inspeccin previa de los envases donde se visualicen las marcas de identificacin y manchas o corrosin que se observen en los envases o cualquier anomala que indique defectos del producto. - En el caso de los enlatados se deben detectar abolladuras, depresiones del borde, picos, pliegues, pestaas salientes y defectos de solapados.

Procedimiento - Se toman dos envases y se envuelven en papel absorbente. Luego uno de los envases se lleva a 37 C y el otro a 55 C durante 8 das. - Se deben examinar los envases por lo menos 2 veces en la semana para determinar si el papel absorbente est manchado de producto, lo que indicara fugas. Tambin se debe observar si aparece abombamiento que indicara la presencia de gas. - En cualquiera de los dos casos se debe inmediatamente abrir el producto y examinar el contenido de los envases. - Una vez terminado el perodo de incubacin se desinfecta externamente el producto con alcohol al 70% y se toma la muestra as: * Si es un producto lquido se abre el envase y se toma 1 mL de muestra, con pipeta estril, que se siembra en caldo BHI (1 tubo en aerobiosis y 1 tubo en anaerobiosis), para un total de 2 mL de muestra. * Si es un producto slido se abre el envase y se toma aproximadamente de 1 a 2 gr de producto con pinzas estriles, que se siembra en caldo BHI (1 tubo en aerobiosis y 1 tubo en anaerobiosis), para un total de 2 g de muestra. - Este procedimiento se realiza para los dos envases que se encuentran a 37 C y a 55 C. - Luego se incuban los tubos sembrados a las respectivas temperaturas (37 C y 55 C) -Debe realizarse la tincin de Gram directamente del producto despus de la incubacin.

5. RESULTADOS 6.1. FACTORES EXTRNSECOS E INTRNSECOS De acuerdo a la lectura de los medios de cultivo incubados complete las siguientes tablas:

1.1.

Influencia de la temperatura

Temperatura (To) 4 C 37 C 55 C

Crecimiento(Positivo/Negativo)

Tipo de microorganismo segn la temperatura de crecimiento_____________________

1.2. Influencia del pH pH 3.0 7.0 11 Crecimiento(Positivo/Negativo)

Tipo de microorganismo segn el pH de crecimiento____________________________

1.3.

Influencia de la tensin de oxgeno Tensin de O2 Aerobio Anaerobio Microaerfilo Crecimiento (Positivo/Negativo)

Tipo de microorganismo segn las necesidades de oxgeno de crecimiento _____________________________________________________________

6.2. METABOLISMO MICROBIANO Realice la lectura de la reaccin metablica de cada uno de los tubos y cajas inoculadas con anterioridad. Interprete y analice las reacciones obtenidas con los fundamentos de los medios de cultivo que investig y complete la siguiente tabla:

MEDIO Agar MacConkey Agar EMB Agar XLD TSI LIA Simmons Citrato Agar SIM BRILLA Klinger Agar

Reaccin que se evala en Color de las colonias o medio el medio de cultivo segn reaccin de cultivo

6.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD EN ALIMENTOS Lectura - Hacer frotis de cada tubo sembrado y colorearlo por el mtodo de gram para determinar el tipo de grmenes presentes.

7. CUESTIONARIO a. De acuerdo a los resultados obtenidos indique las caractersticas metablicas del microorganismo que le correspondi y seale la importancia de conocer estas caractersticas. b. Cul es la importancia de la prueba de esterilidad en alimentos. c. Describa en su alimento analizado (esterilidad de alimentos): mtodo de envasado y condiciones de almacenamiento e indique como estos dos factores pueden afectar el tipo de microorganismo que crece en el alimento. d. Indique en el proceso de la elaboracin del pan que factores fsicos, qumicos o biolgicos pueden afectar este producto. e. De acuerdo a los resultados de los factores extrnsecos indique en que tipo de alimento se puede encontrar este microorganismo.

Practica No. 3 Anlisis microbiolgico de alimentos

1. PRE-LABORATORIO a. Qu son microorganismos indicadores y que revela su presencia en un anlisis microbiolgico? b. Cmo se expresan los resultados de un recuento? c. En que consiste el mtodo del nmero ms probable?

2. OBJETIVOS a. Conocer los mtodos de anlisis microbiolgico de alimentos y materias primas en general. b. Conocer como se presentan y evalan los resultados microbiolgicos. c. Reconocer la importancia de la identificacin de microorganismos indicadores en un alimento o materia prima.

3. INTRODUCCIN En la elaboracin de los alimentos intervienen muchas variables, como por ejemplo: materias primas, superficies de trabajo, equipos e instrumentos, envases, manipuladores, etc. lo que lleva a que el producto final tenga una carga microbiana normal y que debe estar acorde con los rangos legales permitidos. Por consiguiente, los niveles microbianos de un alimento son indicadores del proceso o elaboracin del alimento, sealando si hay buenas o malas prcticas de manufactura. Es importante destacar que la implantacin de buenas prcticas de manufactura en la industria alimenticia, permite elaborar productos idneos e inocuos para el consumidor.

4. MATERIALES - Alimento o materia prima a analizar 11 g o ml - Cubiertos plsticos estriles - Balanza - Mechero de Bunsen - Agar Standard Plate Count fundido (SPC) - Agar Sabouraud (SAB) - Agar TSN fundido - 1 caja con agar Baird Parker - 9 tubos con caldo lactosado verde brillante (BRIILA) con campana de Dirham - Frasco con agua peptonada 0.1 % estril (90 mL) - 3 tubos con agua peptonada 0.1 % estril

- 1 pipeta estril de 10 ml - 3 cajas de petri estriles desocupadas - Tubos tapa rosca estriles - Gradilla - Incubadora 5. PROCEDIMIENTO Ubique la balanza digital en el laboratorio Coloque el frasco de agua peptonada (90 mL) sobre la balanza y tare a cero. Corte pequeas porciones de la muestra dentro del frasco hasta que lleve a 11 g. de muestra. Cierre el frasco y agite suavemente durante 15 minutos, con el fin de homogenizar adecuadamente la muestra. Proceda a marcar el resto del material as:

Frasco de agua peptonada: 10, Tubos de agua peptonada 0.1 %: 10, 10 Tubos de caldo lactosado bilis verde brillante: 3 10 3 10 3 10 3 cajas de petri estriles con los siguientes datos en la base: Mesfilos, SPC. Grupo, Fecha, 10 Mesfilos, SPC. Grupo, Fecha, 10 Mesfilos, SPC. Grupo, Fecha, 10 3 cajas de petri estriles con los siguientes datos en la base: Hongos y levaduras, SAB. Grupo, Fecha, 10 Hongos y levaduras, SAB. Grupo, Fecha, 10 Hongos y levaduras, SAB. Grupo, Fecha, 10 1 caja con Agar Baird Parker con los siguientes datos en la base: Estatafilococo. BP. Grupo, Fecha, 10 3 Tubos tapa rosca estriles con los siguientes datos: TSN. Esporas Clostridium. Grupo, Fecha, 10 TSN. Esporas Clostridium. Grupo, Fecha, 10 TSN. Esporas Clostridium. Grupo, Fecha, 10

Pipetas estriles 10 10 10 Con la pipeta marcada 10 tome 1 ml del frasco inicial (90 ml de agua peptonada) y adicinelo a todo el material marcado 10: 1 caja de mesfilos, 1 hongos y levaduras, 1 tubo de TSN, 3 tubos de BRILLA y un mililitro al tubo de agua peptonada 10. Con la pipeta marcada 10 tome 1 ml del tubo de agua peptonada 10 y adicinelo a todo el material marcado 10: 1 caja de mesfilos, 1 hongos y levaduras, 1 tubo de TSN, 3 tubos de BRILLA y un mililitro al tubo de agua peptonada 10. Con la pipeta marcada 10 tome 1 ml del tubo de agua peptonada 10 y adicinelo a todo el material marcado 10: 1 caja de mesfilos, 1 hongos y levaduras, 1 tubo de TSN, 3 tubos de BRILLA. Descarte las pipetas en el frasco de boca ancha con decol. Lleve los tubos de TSN a ebullicin durante 15 minutos. Tome las 3 cajas de petri desocupadas, vierta el medio de cultivo SPC y mezcle el medio sobre la superficie del mesn (siembra en profundidad). Deje solidificar el agar Agregue una segunda capa de agar a los tubos de TSN, deje solidificar. Separe las cajas segn el agar que contienen.

Lleve a incubar todo el material marcado, recuerde que las cajas de hongos y levaduras son a temperatura ambiente. Lave y entregue el material de la primera prctica, recuerde las recomendaciones de lavado y descarte de material contaminado.

6. RESULTADOS Solicite las cajas correspondientes a la siembra de su grupo. Realice los recuentos respectivos utilizando el cuenta colonias. Realice los clculos e informe los resultados.

Mesfilos (SPC) Dilucin Lectura 10-1 10-2 10-3

Hongos y Levaduras (SABOUREAUD) Dilucin Lectura 10-1 10-2 10-3

Estafilococo (BAIRD-PARKER) Dilucin Lectura 10-1 10-2 10-3

Clostridium Sulfito Reductor (TSN) Dilucin Lectura 10-1 10-2 10-3

Coliformes Totales (BRILLA) Dilucin Lectura 10-1 10-2 10-3

7. CUESTIONARIO a. De acuerdo al informe de los resultados de los anlisis microbiolgicos de la muestra analizada. Qu recomendaciones hara usted para mejorar la calidad del producto o mantenerla dentro de los lmites microbiolgicos establecidos? b. Explique en un diagrama de flujo la elaboracin del producto analizado y sus posibles puntos de contaminacin. c. Indique por que se han utilizado 5 medios de cultivo diferentes en esta prctica. d. Explique en un diagrama de flujo la elaboracin del producto que analiz en la prctica y describa mtodo de envasado y condiciones de almacenamiento e indique como estos dos factores pueden afectar el tipo de microorganismo que crece en el alimento. e. Explique dos formas de control microbiolgico para el rea de alimentos.

ANEXOS

A. FROTIS BACTERIANO Para realizar la coloracin de Gram se debe hacer el frotis bacteriano de la siguiente manera: Encienda el mechero y esterilice el asa, (curva para el cultivo lquido y recta para el cultivo slido) como indic el tutor. Djela enfriar cerca del mechero. Recoja con el asa estril una muestra de colonia bacteriana, al lado del mechero. En una lmina portaobjetos limpia, desengrasada y marcada, coloque una pequea gota de solucin salina estril y realice una suspensin homognea del cultivo (si el cultivo es slido). Si el cultivo bacteriano es lquido coloque una pequea gota de ste en la lmina portaobjetos y extindala. Dej que el frotis se seque a temperatura ambiente. Luego pase la lmina portaobjetos por el mechero 3 veces (con el frotis en la parte de arriba) con el fin de fijar el extendido. Coloque la lmina en el soporte de coloracin para realizar la coloracin de Gram.

Para hongos y levaduras Coloque cerca al mechero el alimento con hongos y con ayuda de cinta pegante, recoja muestra de la superficie. Marque la lmina con cinta de enmascarar: nmero del grupo y coloracin. Coloque en el centro de la lmina portaobjetos una pequea gota de azul de Lactofenol, y luego pegue la cinta a la lmina. Presione ligeramente para eliminar burbujas de aire. Observe en el microscopio en los objetivos de 10x y 40x. Realice una posible identificacin del hongo con los diagramas que encuentra en el laboratorio. Dibuje sus observaciones.

B. COLORACION DE GRAM Coloque sobre el frotis una pequea cantidad de Cristal Violeta durante 1 minuto (Debe cubrir el frotis) Vierta suavemente, sobre la lmina portaobjetos, agua de la llave, con el frasco de boca ancha y escurra el exceso de agua. Aplique la solucin de Lugol por 1 minuto (Debe cubrir el frotis). Lave con el frasco de boca ancha y escurra el exceso de agua. Decolore aplicando Alcohol acetona durante 30 segundos (Debe cubrir el frotis). Lave con el frasco de boca ancha y escurra el exceso de agua. Aplique el colorante de contraste Fucsina durante 1 minuto (Debe cubrir el frotis).

Por ltimo lave con agua y deje escurrir sobre papel absorbente a temperatura ambiente. Observe al microscopio con objetivo de 10x, luego de 40x y finalmente con el Objetivo 100 x (de inmersin) colocando una gota de aceite de inmersin sobre el frotis. Dibuje sus observaciones.

Una vez terminada sta actividad, coloque las lminas portaobjetos usadas dentro del frasco de boca ancha con agua y clorox. Deseche en la basura los alimentos analizados. Desconecte el microscopio, limpie sus lentes con Xilol y pauelos desechables triple hoja (nicamente), las dems superficies del microscopio puede limpiarlas con los paos absorbentes y alcohol antisptico. Por ltimo realice la entrega del microscopio al coordinador del laboratorio.

C. CARACTERSTICAS MACROSCOPICAS DE LAS COLONIAS BACTERIANAS A cada tipo de colonia que se observa, se le debe hacer el estudio macroscpico teniendo en cuenta las siguientes caractersticas: Tamao: puntiforme, pequea, mediana, grande, extendida Forma: Redonda, ovalada, irregular, filamentosa, rizoide Elevacin: Plana, elevada, convexa, monticular, umbeliforme, umbilicada Borde: Entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado. Superficie: Brillante o mate. Consistencia: dura, blanda Aspecto: hmedo, seco, cremoso, mucoso, granuloso, algodonoso. Color: blanco, crema, gris, transparente. Crecimiento: Abundante, moderado, escaso Caractersticas especiales: pigmentos, hemlisis.
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA KONEMAN, Elmer W. Diagnstico Microbiolgico. Ed. Panamericana. PUMAROLA, A. Microbiologa y Parasitologa. Ed. Salvat. MARTINEZ, Mara Mercedes. UNAD. Microbiologa. Facultad de Ciencias Bsicas e Ingeniera. MERCK. MANUAL DE MEDIOS DE CULTIVO.

DIAGRAMA DE FLUJO PRCTICA No. 1 FLORA AMBIENTAL

Agar nutritivo

Agar saboureaud

Abrir en ambiente escogido por 15 min. y cerrar.

Marcar y llevar a incubar segn corresponda

FLORA DE SUPERFICIE ANTES DE LIMPIAR

Escoger superficie a evaluar y delimitar

Abra tubo tapa rosca e introduzca el hisopo para humedecerlo

Pase el hisopo humedecido sobre la superficie a evaluar

Sembrar en e Agar nutritivo

100 80 60 40 20 0 1er trim. 2do trim. 3er trim. 4to trim. Este Oeste Norte

Agar saboureaud

n Marcar y llevar a incubar segn corresponda

DESPES DE LIMPIAR
Una vez limpia la zona escogida

Abra tubo tapa rosca e introduzca el hisopo para humedecerlo

Pase el hisopo humedecido sobre la superficie a evaluar

Sembrar en Agar nutritivo Agar saboureaud

Marcar y llevar a incubar segn corresponda

PRCTICA No. 2 FACTORES EXTRNSECOS E INTRNSECOS A. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA

Cepa asignada

Sembrar en 3 tubos de ensayo

4C

37C

55C

Marcar y llevar a incubar segn corresponda

B. INFLUENCIA DEL pH

Cepa asignada

Sembrar en 3 tubos de ensayo

pH :3.0

pH :7.0

pH :11

Marcar y llevar a incubar segn corresponda

B. INFLUENCIA DE LA TENSIN DE OXGENO

Cepa asignada

Sembrar en 3 tubos de ensayo

Tioglicolato

Aerobio

Anaerobio

Marcar y llevar a incubar segn corresponda

METABOLISMO MICROBIANO MEDIOS LQUIDOS

Cepa asignada

Sembrar en

TSI

LIA

CIT

SIM

BRILLA

KLINGER

Marcar y llevar a incubar segn corresponda

MEDIOS SLIDOS

Cepa asignada

Sembrar en

Agar MacConkey

Agar EMB

Agar XLD

Marcar y llevar a incubar segn corresponda

PRUEBA DE ESTERILIDAD

Alimento envasado en envase o bolsa o enlatado, hermticamente cerrado

Revisar el envase para detectar alguna anomala

Incubar a 37 C /8 das

Incubar a 55 C/8 das

Para cada envase sembrar en Caldo BHI

Aerobiosis

Anaerobiosis

PRCTICA No. 3 ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS

Alimento homogenizado: 11g en 90 mL agua peptonada

Dilucin 1:10 Diluciones

1 mL

1 mL

Dilucin 1:100

Dilucin 1:1000

Sembrar 1 mL de cada dilucin en

SPC: Mesfilos

SAB: Hongos y Levaduras

BP: Estafilococo

BRILLA: Coliformes

TSN: Esporas Clostridium