2. Control de calidad en la preparacin de los medios de cultivo. Objetivo.

Realizar la preparacin de medios de cultivo con funciones y caractersticas adecuadas que permitan un adecuado crecimiento y en su caso identificacin de los microorganismos presentes en una muestra farmacutica. Alcance. Aplicable a la preparacin de los medios de cultivo. Adems de la calidad fisicoqumica, teraputica y biolgica de un producto farmacutico se encuentra la calidad microbiolgica del mismo, es por ello que los medios de cultivo representan una valiosa herramienta en el estudio microbiolgico de los productos farmacuticos. Por otra parte, la preparacin adecuada de los medios de cultivo nos permite favorecer la disposicin de los nutrientes y las condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos. Procedimiento. Material. 4 Matraces erlenmyer de 250 mL. 1 Matraz erlenmeyer de 500 mL. Papel glaseen. 1 Espatula. 15 Cajas de petri esteriles. 4 Tubos de ensayo 16 X 150 con tapa de rosca. 1 Balanza granataria. 1 Mechero Fisher. 1 Parrilla de calentamiento. 3 tubos de 38X200. 1 probeta de 250 mL. 1 pizeta con benzal y esponja. 1 jarra 1 desecador para condiciones anaerobias. Autoclave.

Reactivos 100 mL de HCl 1N. 100 mL de NaOH 1N. Agua destilada.

Medios de Cultivo. Agar T.S.A. Agar Mac Conkey. Agar ENDO.

Agar Salmonella Shigella. Medio caldo tioglicolato. Medio Caldo Selenito Cistina.

Instrumentos. Potencimetro. Termmetro.

Equipos. Incubadora EL-01.

Microorganismos. Salmonella typhimurium ATCC 14028 Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococus aureus ATCC 25923 Staphylococus aureus ATCC 6538 Proteus vulgaris ATCC 13315 Staphylococus aureus ATCC 6538 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Bioindicadores.

Medidas de seguridad. Emplear cubre bocas para evitar la inhalacin de polvos de los medios de cultivo, usar guantes de asbesto para evitar quemaduras al calentar los medios de cultivo. A. Procedimientos de preparacin de medios de cultivo. Para la preparacin de los medios de cultivo, es necesario considerar la calidad del agua a utilizarse:
1.1. Realizar anlisis fisicoqumicos del agua a utilizar (pH y conductividad) aceptables conforme a lo establecido en la FEUM vigente. 1. Utilizar agua destilada, de preferencia que sea agua del da. Preparacin de medios de cultivo.

1.2. Si el agua cumple con las especificaciones emplearla para la preparacion de los medios de cultivo de no ser asi, rechazar el lote del agua y realizar medidas preventivas.

2. Leer cuidadosamente la informacin de la etiqueta del medio de cultivo verificando el nmero del lote, la fecha de caducidad y el fabricante de dicho medio.

2.1. Abrir el contenedor y observar las caractersticas fsicas del medio de cultivo: apariencia y color, de ser posible comparar con los datos de referencia del proveedor. 3. Pesar la cantidad de medio deshidratado conforme a la relacin de la etiqueta y la cantidad a preparar. 2.1 Preparacin de agar T.S.A.

2.1. Preparacin de 200 mL de Agar TSA.

Revisar las caractersticas fsicas del polvo deshidratado. Si el polvo cumple con las caractersticas, continuar con el procedimiento

Pesar en papel glasinne 8g de agar TSA y disolver con 200 mL de agua destilada. Calentar agitando frecuentemente hasta observcar disolucion completa*.

Esterilizar en Autoclave a 121C por 15 min.

Dejar enfriar de 45-50 C y vertir en cajas petri aproximandamente 18-20 mL.

Realizar pruebas de control de calidad de los medios de cultivo

3. Preparacin de 200 mL de agar ENDO.

Revisar las caractersticas fsicas del polvo deshidratado, si el polvo cumple con las caractersticas continuar con el procedimiento. Pesar 8.3 g de agar ENDO y suspender con 200 mL de agua destilada. Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir por 1 minuto para disolver los ingredientes

Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.

Dejar enfriar un poco y con ayuda del potencimetro medir el pH y ajustarlo a 7.5 +/- 0.2 a 45C usando NaOH 1N y/o HCl 1N. Vertir en cajas de Petri estriles 18-20 mL del agar preparado. Realizar control de calidad de los medios de cultivo.

En condiciones aspticas tomar 10 mL de agar y medir el pH: Registar el pH final en caso de que requiera ajuste realizar los ajustes necesarios a 45 C.

Sembrar por estra simple las siguientes cepas: Salmonella typhimurium ATCC 14028 Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococus aureus ATCC 6538 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Medio sin estriar. 2. Incubar durante 18-72 h a 35-37C.

Si: Pasar a prueba de reactividad del medio de cultivo

El medio preparado no debe presentar 1. Agua de condensacin 2.Burbujas en el medio. 3. Humedad en la placa. 4. Volumen adecuado. 5. Color de la placa concorde a la especificacin del fabricante.

No Se acepta el lote

Resultados
Salmonella typhimurium ATCC 14028: Colonias incoloras o rosa tenue. Escherichia coli ATCC 25922: Colonias rosa oscuro a rojizo Staphylococus aureus ATCC 6538: Inhibido Enterococcus faecalis ATCC 29212: Inhibido Medio sin estriar. 2. Incubar durante 18-72 h a 35-37C. Medio sin estriar. Color rojo violeta. 2. Incubar durante 18-72 h a 35-37C.

Si cumple con la prueba de reactividad

Se rechaza el lote
No cumple con la prueba de reactividad

4. Preparacin de 200 mL de agar Mac Conkey.

Polvo homogneo, libre de floculos y de color beige rosado.

Pesar en papel glasinne 10g de agar Mac Conkey y vaciar a un matraz erlenmeyer de 250 mL. Calentar hasta disolucin completa del polvo y ebullir por 1 min. Dejar enfriar un poco y con ayuda del potencimetro medir el pH y ajustarlo a 7.1 +/- 0.2, a 45 C usando NaOH 1N y/o HCl 1N. En condiciones aspticas tomar 10 mL de agar y medir el pH: Registar el pH final en caso de que requiera ajuste realizar los ajustes necesarios a 45 C.

Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.

Vertir en cajas de Petri estriles 18-20 mL del agar preparado.

Realizar control de calidad de los medios de cultivo.

Sembrar por estra simple las siguientes cepas: Salmonella typhimurium ATCC 14028 Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococus aureus ATCC 6538 Proteus vulgaris ATCC 13315 Medio sin estriar. 2. Incubar durante 18-72 h a 35-37C.

Si: Pasar a prueba de reactividad del medio de cultivo

El medio preparado no debe presentar 1. Agua de condensacin 2.Burbujas en el medio. 3. Humedad en la placa. 4. Volumen adecuado. 5. Color de la placa concorde a la especificacin del fabricante.

No Se acepta el lote

Resultados
Salmonella enteritidis ATCC 13076: crecimiento favorable y colonias incoloras. Escherichia coli ATCC 25922 Colonias rojo-rosadas con precipitado biliar Staphylococus aureus ATCC 6538: Crecimiento inhibido. Proteus vulgaris ATCC 13315 Crecimiento favorable, colonias incoloras. Medio sin estriar. Color rojo violeta. 2. Incubar durante 18-72 h a 35-37C.

Si cumple con la prueba de reactividad

Se rechaza el lote
No cumple con la prueba de reactividad

5. Preparacin de agar Salmonella-Shigella

Revisar las caractersticas fsicas del polvo deshidratado, si el polvo cumple con las caractersticas continuar con el procedimiento. Pesar 12 g de agar Salmonella Shigella y suspender con 200 mL de agua destilada. Calentar agitando frecuentemente y llevar a ebullicin de 2 a 3 minutos.

Vertir en cajas de Petri estriles 18-20 mL del agar preparado.

No esterilizar, dejar que se enfrie a 45-50C

Realizar control de calidad de los medios de cultivo.

Sembrar por estra simple las siguientes cepas: Salmonella typhimurium ATCC 14028 Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococus aureus ATCC 25923 Res ulta dos Enterococcus faecalis ATCC 29212 Medio sin estriar. 2. Incubar en condiciones anaerobias durante 24-48 h a 35-37C.

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Colonias transparentes color negro. Escherichia coli ATCC 25922: Colonias rosadas a rojas. Staphylococus aureus ATCC 25923 Crecimiento inhibido.
Enterococcus faecalis ATCC 29212. Incoloras de escaso crecimiento

El medio preparado no debe presentar 1. Agua de condensacin 2.Burbujas en el medio. 3. Humedad en la placa. 4. Volumen adecuado. 5. Color de la placa concorde a la especificacin del fabricante.

ple um c o

Medio sin estriar: Color rojo naranja.

No

Se rechaza el lote
Si: Pasar a prueba de reactividad del medio de cultivo

Si cumple con la prueba de reactividad Se acepta el lote

6. Preparacin de caldo selenito.

Polvo homogneo, libre de floculos y de color beige claro

Suspender 2.3 g de polvo en 100 mL de agua destiladay calentar ligeramente hasta su disolucin completa.

Evitar el calentamiento excesivo; no esterilizar El crecimiento microbiano se observa por turbidez. 1. Sembrar por picadura y en condiciones aspticas las siguientes cepas. Salmonella typhimurium ATCC 14028 Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococus aureus ATCC 25923 Sin inocular. 2. Incubar en condiciones anaerobias 35-37 C durante 16-24 h los tubos inoculados y sin inocular.

Control de Calidad Resultados. Salmonella typhimurium ATCC 14028 (Crecimiento satisfactorio) Escherichia coli ATCC 25922 (Inhibicin parcial) Staphylococus aureus ATCC 25923 (Crecimiento inhibido) Sin inocular. Medio color mbar, claro, traslcido.