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Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura CÁTEDRA: HEMATOLOGÍA CLÍNICA

Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura

CÁTEDRA:

HEMATOLOGÍA CLÍNICA

TRABAJOS PRÁCTICOS

ALUMNO:………………………………………… GRUPO:… AÑO: 2012

INTEGRANTES DE LA CÁTEDRA:

PROFESORA RESPONSABLE: BQCA. MARIA CRISTINA GUEVARA

JTP ORDINARIA: BQCA. RINA MARINA TEJADA DE MARTÍNEZ

AUXILIAR DOCENTE ORDINARIA: BQCA. ALENJANDRA SÁNCHEZ

JTPs ADSCRIPTOS: BQCO. GONZALO ADRIÁN OJEDA - BQCA. CLAUDIA PATRICIA SERRANO - BQCA. VICTORIA IVAN

AYUDANTES ALUMNOS: FLORES EZEQUIEL, TOÑANES CYNTHIA, DE FRACESCHI CRISTINA, HOCHMUTH INGRID, RADOVANCICH VIRGINIA, ARECHAVALA MILAGROS

NÓMINA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

TP1: HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINA, VSG, COLORACION MGG)

TP2: HEMOGRAMA 2 (FÓRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB)

TP3: FÓRMULA PATOLÓGICA-ALTERACIONES SERIE BLANCA (MICROSCOPIA)

TP4: ANEMIA ARREGENERATIVAS (MICROSCOPIA)

TP5: ANEMIAS REGENERATIVAS (MICROSCOPIA Y RETICULOCITOS)

TP6: INMUNOHEMATOLOGÍA (GRUPO Y FACTOR, COOMBS D e I)

TP7: ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA

TP8:

(MICROSCOPIA)

CITOQUÍMICA

(MPO-PERLS-KLEIHAUER

TP9: LMA (MICROSCOPIA)

TP10: LLA-SLPC (MICROSCOPIA)

BETKE)

TP11: LMC-SLPC (MICROSCOPIA)

MEDULOGRAMA

TP12: HEMOSTASIA PRIMARIA (RECUENTO DE Pq, TIEMPO DE SANGRÍA, TIEMPO DE COAGULACIÓN, RETRACCIÓN DE COÁGULO)

TP13:

AUTOMATIZADOS)

HEMOSTASIA

SECUNDARIA

(TP,

KPTT,

MÉTODOS

MANUALES

Y

MODELO DE INFORME (EL INFORME ES INDIVIDUAL)

TP

FECHA…………… NOMBRE Y APELLIDO……………………………………………………………

N°………

GRUPO

DE

LABORATORIO:……

1-ACTIVIDADES REALIZADAS (detallar en forma resumida las actividades realizadas)

2- RESULTADOS HALLADOS

Determinación Valor hallado Método Valores de referencia

3- ELEMETOS OBSERVADOS

Para los TPs de microscopia especificar cada uno de los elementos observados (coloración y aumento) así como también, en caso de disponer de ellos, datos referentes al cuadro en que fue encontrado (edad, datos de hemograma, patología, tratamiento, etc).

Ej. Se observó un frotis con anisocitosis moderada (MGG 40x), correspondiente a un cuadro de anemia ferropénica en recuperación (Niño 8 años, GB: 7300 cel/mm 3 – GR: 4,18 x 10 6 cel/mm 3 – Hb 11,2 g%, Hto: 37 %, VCM: 87,3 fL, HCM 26,7 pg, CHCM 30,2 g%, RDW 18 %, Pq 323x10 3 /mm 3 , Tratamiento: Hierro oral)

Ej. Se observaron numerosos esferocitos (MGG 100x) en un frotis perteneciente a un paciente con AHAI.

4- DISCUSION DE RESULTADOS (variaciones fisiológicas, patológicas, posibles causas de error, procedimientos para la validación del resultado)

TRABAJO PRÁCTICO N° 1

HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINA, VSG, COLORACION MGG)

Ojetivos Generales

- Puesta en práctica de normas de bioseguridad básicas.

- Práctica de los pasos para la obtención de muestras de sangre venosa para la realización de las determinaciones incluidas en el hemograma.

- Aplicación de los criterios necesarios para la elección de anticoagulantes en función de las determinaciones a realizar.

- Manejo del material necesario para las prácticas a desarrollar.

- Interpretación de resultados.

1 -Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa

1.

Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene.

2.

El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y, una vez manipulado, no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo.

3.

Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin.

4.

Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables, los cuales se mantendrán puestos durante todo el procedimiento.

5.

Antes de iniciar la toma de muestra, tener TODO el material preparado.

6.

Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizándola visualmente y por palpación. Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y cierre el puño para facilitar la extracción.

7.

Una vez identificada la vena, limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol. Dejar secar.

8.

En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja, se la colocará en la jeringa sin tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del émbolo.

9.

La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba).

10.

Después de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete y luego la aguja, presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco.

11.

LA AGUJA SE DESCARTARÁ EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN.

12.

La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma y homogeneizando inmediatamente por inversión suave.

13.

Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente.

14.

En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más sangrado.

15.

La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. NO REUTILIZARLOS.

16.

Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro de muestras.

2 - Descripción de los anticoagulantes usados en Hematología

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos, el tamaño eritrocitario, no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el

máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C).

Los anticoagulantes más utilizados son:

EDTA (C 10 H 16 N 2 O 8 ) o sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético, actua mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca ++ ), impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. ES EL ANTICOAGULANTE DE ELECCIÓN PARA HEMOGRAMA. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja, respecto a las de sodio, de ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido, sin embargo , las tres sales afectan el tamaño del eritrocito, especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos. El K 2 EDTA . 2H 2 O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4.8 ± 1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/mL. de sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. Los productos habitualmente comercializados consisten en una solución equilibrada de sales sódicas y potásicas de EDTA (0,342 mol/l) pH 7,2, con estas la proporción recoemendad es 1/100 Ej: 10 µL de anticoagulante para 1 mL de sangre (990 µL estrictamente hablando).

HEPARINA SÓDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.

CITRATO TRISÓDICO, C 6 H 5 O 7 Na 3, actúa impidiendo que el calcio se ionice, evitando así la coagulación. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1 (Por Ej.:2mL sangre con 250µL anticoagulante); así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1 (Por Ej.: 2 mL sangre con 500 µL anticoagulante).

ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro volúmenes de sangre. La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0.9 g, Citrato disódico 2 g, Dextrosa 2 g, H 2 O destilada 120 mL.

3 - Recuento de hematíes

RECUENTO MANUAL

Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. Es un método poco usado debido al elevado error que presenta.

Líquido diluyente: solución fisiológica o citrato de sodio 3,8%., o Solución de Hayem (HgCl 2 0,25%, Na 2 SO 4 2,5%, NaCl 0,5%)

La dilución empleada es de 1/200, para lo cual se mide exactamente:

Solución fisiológica o citratada: 3,98 mL

Sangre:

0,02 mL

El recuento se realiza en la cámara de Neubauer (40X) cuyo esquema es el siguiente:

la cámara de Neubauer (40X) cuyo esquema es el siguiente: El recuento de hematíes se realiza

El recuento de hematíes se realiza en el cuadrado central, se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeños, como se muestra a continuación:

en 16 cuadrados pequeños, como se muestra a continuación: Las líneas reforzadas, o triples, sirven únicamente

Las líneas reforzadas, o triples, sirven únicamente como límites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeños. Se deben contar 5 de estos cuadrados. La superficie de este cuadrado es de 1 mm 2 y la cámara tiene una profundidad de 0,1 mm.

Con la dilución indicada, luego de agitar adecuadamente, se carga la cámara y se cuentan los glóbulos rojos de los 80 cuadrados pequeños (zona sombreada). La cámara puede ser cargada con un capilar, evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente.

Considerando entonces, que el retículo tiene 400 cuadrados pequeños en total, el cálculo que se debe hacer es el siguiente:

Donde:

N x D x FC x ST

TC

= nº de glóbulos rojos/mm 3

N: número de eritrocitos contados. D: Título de la dilución realizada (200). FC: Factor de corrección de la profundidad, para llevar a 1 mm 3 (10). ST: Total de cuadrados pequeños en la superficie de 1 mm 2 (400). TC: Total de cuadrados pequeños contados.

Causas de error en el recuento en cámara de Neubauer

El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a:

1. Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. Coagulación parcial. Hemólisis.

2. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre.

3. Utilización de material mal calibrado, sucio o húmedo.

4. Falta de suficiente agitación de la sangre diluida.

5. Cámara de Neubauer mal ajustada, sucia o mojada.

6. Llenado incompleto de la cámara Neubauer.

7. Empleo de cubreobjetos deformable, no rígido.

8. Células mal distribuidas en el fondo de la cámara.

9. Errores del operador al realizar el recuento.

10. Errores al efectuar los cálculos.

VALORES DE REFERENCIA

Edad

Sexo

Intervalo de referencia

Recién nacidos

ambos

4,7x10 12 /L - 6,3x10 12 /L

Niños (2-12 años)

ambos

4,0x10 12 /L - 5,3x10 12 /L

Adultos jóvenes (12-18 años)

mujeres

4,1x10 12 /L - 5,1x10 12 /L

varones

4,5x10 12 /L - 5,3x10 12 /L

Adultos jóvenes (19-60 años)

mujeres

4,1x10 12 /L - 5,2x10 12 /L

varones

4,6x10 12 /L - 5,9x10 12 /L

4 - Hematocrito

DEFINICION

El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre, expresado como porcentaje. Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina, por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia. Así, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el aumento lo es de poliglobulia.

El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo), es una técnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja complejidad.

En la actualidad, todos los autoanalizadores hematológicos suministran, dentro del contexto del hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas, por lo que es siempre algo inferior (1-3 %).

Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados, son un buen parámetro del estado de la serie eritroide.

El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. Por Ej., un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración, el Hto. puede ser normal o alto, aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión.

METODO MANUAL

Micrométodo (microhematocrito)

Es una técnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, muy sencilla y poderse realizar en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo.

Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm. de longitud por 1mm. de diámetro interno. Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechará la primera gota después de la punción.

Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 L). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000 rpm. Tan pronto se detiene la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito (ABACO), que nos darán el resultado directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres:

A------- 100

B------- x

x: hematocrito en tanto por ciento

A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular

La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01%.

Causas de error

Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor, al perderse mayor proporción de células que de plasma.

El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra

En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los líquidos tisulares que provoca hemodilución.

En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentración.

La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hematíes vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal.

VALORES DE REFERENCIA ( x 2 DE)

El valor de Hto varía con la edad y el sexo.

Edad y sexo

Hematocrito %

Fracción

Recién Nacidos

54

10

0,54 0,1

Niños (hasta 10 años)

38

5

0,38 0,05

Mujeres (18-50 años)

42

5

0,42 0,05

Embarazadas

39

5

0,39 0,05

Varones (18-50 años)

45

5

0,45 0,05

5 - Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina

FUNDAMENTO

Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa, se transforman en HiCN según el siguiente proceso:

Hemoglobina + [K 3 Fe(CN) 6 ] metahemoglobina

Metahemoglobina + [CNK] cianmetahemoglobina

MATERIAL

1. Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados periódicamente mediante la solución patrón de HiCN, preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH)

2. Tubos: 12 x 100 mm.

3. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-Na 2 (1,5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). Puede emplearse sangre capilar.

4. Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 mL.

5. Pipetas automáticas: de 20 L, debidamente calibradas.

6. Reactivo de Cianmetahemoglobina:

Composición (pH 7-7,4)

Ferricianuro potásico [K 3 Fe(CN) 6 ]

200

mg

Cianuro potásico [CNK]

50 mg

Fosfato monopotásico [KH 2 PO 4 ]

140

mg

Detergente no iónico*

1 mL

Agua destilada hasta

1000 mL

Detergentes no iónicos: Tritón X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218.

El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la transformación de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3 min. Este reactivo debe tener un color amarillo pálido, ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo).

7. Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina. Todo patrón de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN.

METODO

Se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuación:

1. Conectar el espectrofotómetro.

2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión del tubo 20 veces.

3. Pipetear (CON PROPIPETA) 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio.

4. Mediante la micropipeta añadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operación, es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta.

5. Agitar el tubo mediante inversión (4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.

6. Leer la A de la solución a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco.

7. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibración.

Curva de calibración de hemoglobina

Se toma un Kit. de calibración con estándar de CC. Normal, de una CC. Alta y otro de una CC .baja, y se miden las absorbancia de cada una de ellas o se toma un Standard de CC. conocida y se hacen diluciones mayores y menores que el normal y se miden las absorbancia y se determina un factor que es el promedio de las tres diluciones. Teniendo que A=ɛ . b. C y como b=1 cm => A/ ɛ = C para facilitar el calculo A . (1/ ɛ) = C donde (1/ ɛ)= F y es la inversa de la pendiente de la curva tendremos que C= F . A. Dicho en otras palabras la recta se ajusta a una ecuación del tipo y=ax+b. Grafico:

la curva tendremos que C= F . A. Dicho en otras palabras la recta se ajusta

De esta manera controlo:

La linealidad del equipo

El deterioro que sufre el reactivo

Puedo trabajar con un estándar diario, procesado por cada operador que realiza la determinación de hemoglobina, como si fuese una muestra más y determino el factor del estándar.

Procesando un estándar todos los días:

CONTROLO EL DETERIORO QUE PUEDE SUFRIR EL REACTIVO DESDE EL DIA QUE SE LO PREPARO Y SE REALIZÓ LA CURVA.

CONTROLO EL FACTOR HUMANO

CAMBIOS EN LA TENSIÓN DE LA RED O DESGASTE DE LA LÁMPARA DEL FOTOCOLORÍMETRO

Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina

La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (50 x 10 9 /l). No obstante, la mayoría de las veces los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen.

Errores en la obtención del espécimen de sangre:

1. Errores de extracción

2. Empleo de anticoagulantes no recomendados

3. Coagulación parcial de la sangre

Errores de la dilución:

1. Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o húmedas

2. No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo

3. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo

Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN:

1. Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido

2. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la Hb en HiCN

Errores de la determinación:

1. Empleo de instrumentos no calibrados

2. Cubetas sucias o deterioradas

3. Soluciones turbias de HiCN

Errores en la conservación del reactivo:

1. Congelación del reactivo, lo que produce transformación de K 3 Fe(CN) 6 en K 4 Fe(CN) 6 y

una oxidación parcial de la Hb. Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formación exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de concentración de Hb obtenidos son inferiores a los reales.

6 - Velocidad de sedimentación globular (VSG) o Eritrosedimentación

FUNDAMENTO

El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo.

VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia, por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin, linfomas y mieloma múltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico. Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple.

MECANISMO

El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado, pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células.

Desde el punto de vista físico, este fenómeno depende de los siguientes factores:

a. Tamaño de los GR

b. Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma,

c. Viscosidad del plasma.

d. Temperatura.

Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad a una

velocidad

v: R = 6vr

La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se hace más lenta al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del

recipiente.

La etapa más importante es la primera o de aglutinación, ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. Así, cuanto más pequeño sean los agregados, más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa.

Dado que, como se mencionó más arriba, el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR, éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.

La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albúmina retarda la VSG. El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que

estas células se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones

de albúmina, globulinas y fibrinógeno. Así, mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial

zeta, las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto

el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina, lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas.

METODOLOGIA

Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el método de Wintrobe. Ambos métodos poseen limitaciones. El método de Westergren es menos sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y así puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening.

El método de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no específico de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre los agregados en sedimentación. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias, pero no resultaron confiables.

Tradicionalmente, la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren

que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standardization

in Hematology (ICSH).

Durante los últimos años, han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable. Estos sistemas, aunque reproducen exactamente el método de Westergren, se diferencian de éste por su carácter cerrado (recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisión del llenado de las pipetas.

MÉTODO DE WESTERGREN

Es el método de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un método poco reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar, como es la necesidad de prediluir la sangre.

A.

MATERIALES.

A.1

Anticoagulante

Si utiliza citrato trisódico dihidratado (Na 3 C 6 H 5 O 7 .2H 2 O) en solución acuosa 32,08 g/l.

A.2 Tubo de sedimentación

Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1.5 mm y de un diámetro de 2.55 + 0.15 mm. El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm) todo a lo largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200

mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países.

Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza. Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plásticos resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de taponamiento. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.

A.3 Gradillas

Las gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición vertical inmóvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1. La misma debe estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en ella.

B.

TÉCNICA

A)

La sangre se obtiene por punción venosa, evitando contaminación con materiales utilizados para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol

de solución de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml

de

sangre

en

0,5

ml

de

anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a

temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs. si es mantenida a 4C.

 

B)

Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversión repetidas veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero.

C)

El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25C), sin exposición a la luz del sol directa, libre de vibraciones y corrientes de aire, manteniéndolo exactamente 60 min.

D)

Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora).

C.

VALORES DE REFERENCIA

   

Valores

de

Límite superior de la normalidad

EDAD (años)

referencia (mm)

Niños

mayores

y

0-15

5

a 10

15

jóvenes

 

Varones adultos

 

17-50

4

± 3

10

 

51-60

6

± 3

12

 

61-70

6

± 4

14

Mujeres adultas

 

17-50

6

± 3

12

 

51-60

9

± 5

19

 

61-70

10 ± 5

 

20

Factores técnicos capaces de modificar la VSG

Causas de aumento

Desviación de verticalidad de la pipeta

Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta

Elevación de la temperatura ambiente

Dilución de la sangre

Causas de disminución:

Reducción del diámetro de la pipeta

Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido)

Cambio de anticoagulante

D.

INTERPRETACION DE RESULTADOS

Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia), el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos orales, etc.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos.

Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente, han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica, por lo que no se recomienda su empleo.

Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda, y también en el embarazo normal y el puerperio.

Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas.

La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, vera anormalidades de GR (hemoglobinopatías, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.), hipofibrinogenemia, defectos cardíacos congestivos, y ocasionalmente sin causa aparente.

Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgánica.

Para muestras pediátricas o cuando el volumen a obtener será escaso se puede utilizar las pipetas de Chattas, estas requieren un volumen de sangre mucho menor (40 µL), la técnica se realiza de la misma manera pero los resultados deben ser corregidos utilizando un nomograma o tabla para conversión.

NOMOGRAMA DE CHATTAS

Chattas

Westergren

Chattas

Westergren

Chattas

Westergren

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

1 a 10

1 a 10

21

31

32

95

11

12

22

34

33

106

12

13

23

38

34

120

13

14

24

42

35

>120

14

16

25

47

36

>120

15

18

26

53

37

>120

16

20

27

59

38

>120

17

22

28

65

39

>120

18

24

29

71

40

>120

19

26

30

77

   

20

28

31

84

   

7-OBTENCIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequeña de sangre (1-2 mm) recién obtenida, ya se trate de punción digital, o del talón (en pediatría) o de la última gota de sangre extraída con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes porque altera la morfología de las células.

Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ángulos (extensor), se realiza la extensión de la gota de sangre: conservando un ángulo menor de 45respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se avanza con firmeza y no muy rápidamente. Así se obtiene una fina película de sangre que representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.

integralmente a la gota de sangre que se extiende. Secar rápidamente el extendido al aire para

Secar rápidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las células.

Un extendido así obtenido poseerá tres áreas de diferente espesor y con distribución también distinta de leucocitos:

1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la región inmediata al punto de partida de la

extensión (cabeza). En ella hay siempre un aumento del número de linfocitos.

2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión (cola) y en ésta se observa un

exceso de granulocitos y monocitos.

3. Zona ideal: Región central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las células.

1 2 3
1
2
3

Para que un frotis sea valido:

1)

2) No debe ser demasiado delgado (será muy pobre en elementos lo que impediría una lectura conveniente). 3) No debe alcanzar los bordes ni las extremidades del porta (se perderían los elementos

No debe ser demasiado grueso (los elementos estarán retenidos y no serán identificados.

4)

mas voluminosos). La gota debe agotarse sobre el porta. No debe presentar agujeros (utilización de portas mal desengrasados) ni estrías o flecos (provocados por un extensor de bordes no esmerilados, irregulares). Conviene elegir el

extensor observando sus bordes en el microscopio para asegurarse de que sean bien lisos.

5)

Debe ser regular (si no, el reparto de elementos es heterogéneo y por tanto el recuento variara según los campos examinados).

6) Debe ser secado correctamente (un secado defectuoso produce artefactos: hematíes festoneados por ejemplo).

Existen algunas sutilezas que es necesario cuidar:

El tamaño de la gota debe ser el adecuado y esto lo enseñara la experiencia.

Si ha caído un exceso de gota limpiar el porta con gasa o algodón. Repetir el procedimiento las veces que sea necesario hasta que la cantidad de sangre sea la adecuada.

Si tuvieran que elegir entre un extendido largo, y uno corto, es preferible el segundo, pero lo ideal es que ocupe ¾ partes de la lamina.

Se prefieren en general los frotis delgados pero el excesivamente fino tiene muchos inconvenientes: los hematíes aparecen poligonales con su claridad central desaparecida, las plaquetas se destruyen y los leucocitos resultan rotos o distorsionados.

Nunca debe llevarse la gota de sangre por delante del extensor porque produciría erosión de las células.

Un buen frotis debe constar de una zona inicial gruesa (cabeza), una zona central mediana (espesor ideal para la lectura) y la cola delgada terminada suavemente en un borde convexo sin estrías prolongadas que hablan de un extensor defectuoso. Un buen extendido luce como una pincelada sobre el vidrio.

Aun cuando el frotis sea ideal y el reparto homogéneo no se puede evitar una cierta segregación de los elementos. Los linfocitos (mas pequeños) predominan en el centro de la extensión. Los polimorfonucleares y los monocitos son atraídos hacia los “bordes y cola”.

FROTIS ARRASTRADOS: todos los elementos están en la cola. Deben rechazarse para la formula.

Defectos observados en frotis con sangre anticoagulada:

1)

2) Los núcleos de los monocitos aparecen como con lóbulos, inclusive pueden estar

desintegrados o coloreados más homogeneamente, más compactos que con sangre fresca, el citoplasma puede aparecer vacuolado.

Impide agrupación de plaquetas.

Importante:

Lavar y secar bien el extensor entre una y otra extensión Los portas nuevos deben ser desengrasados con agua jabonosa, enjuagados minuciosamente.

8-COLORACIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

La coloración se realiza por el método de May Grünwald-Giemsa.

Fundamento

Prácticamente todos los métodos empleados para teñir las células de la sangre se basan en el empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno.

Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de modo que las que tienen carácter básico fijan en mayor medida la eosina (colorante ácido), mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante básico). Esto explica que ciertas estructuras basófilas presentes en el núcleo (nucléolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidófilos como la hemoglobina adquieren color rosado.

De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrófilos, en los que la granulación específica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultáneamente, resultando en un color pardo; eosinófilos, en los que la granulación específica contiene sustancias de intenso carácter básico que fijan fundamentalmente los colorantes ácidos, dando un color rojo-naranja; y los basófilos, cuya granulación específica posee sustancias de carácter ácido, que fijan colorantes básicos dando un color azul oscuro.

Reactivos

Solución May Grünwald : eosinato de azul de metileno en metanol.

Solución Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado en medio alcalino: el azur II, y eosina (tetrabromofluoresceína).

Método

Cubrir el frotis de sangre seco con solución May Grünwald. Dejar 3 minutos. A continuación, agregar buffer fosfato pH 6.8 o una mezcla de agua de canilla con agua destilada en partes iguales, en proporción igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivén. Dejar 3-5 minutos. Volcar, enjuagar bajo chorro de canilla suave y cubrir el preparado con una solución de Giemsa, obtenida a razón de dos gotas del colorante por ml de agua (1/10). Dejar 10- 12 minutos. Lavar con agua, limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodón y secar al aire.

TRABAJO PRÁCTICO N°2

HEMOGRAMA 2 (FÓRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB)

Objetivos generales -Familiarizarse con el uso de la cámara de Neubauer -Adquirir destreza en la preparación de diluciones y manejo de muestras de sangre entera -Adquirir destreza en el manejo del microscopio y la cámara de Neubauer para el recuento de glóbulos blancos -Delinear los criterios para la identificación de glóbulos blancos en preparados coloreados con MGG -Realizar fórmulas leucocitarias en muestras de pacientes sanos -Interpretación y validación de resultados

1- RECUENTO DE LEUCOCITOS

Método manual

1)

Agregar 20 l de sangre anticoagulada a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solución de Türk. Esta solución contiene acido acético al 1 % en agua destilada y el agregado de una punta de espátula de azul de metileno. DILUCION 1/20

2)

Homogeneizar la mezcla.

3)

Cargar la cámara de recuento

4)

Ubicar el reticulado de la cámara con bajo aumento (10X), constatar la ausencia de burbujas y que la distribución sea regular.

5)

Proceder al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de la cámara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre sí en más del 20%. En caso contrario debe cargarse nuevamente la cámara.

los cuatro cuadrados no deben diferir entre sí en más del 20%. En caso contrario debe

La lectura se realiza en los cuatro campos L. Además de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos adheridos en la línea horizontal superior y vertical exterior, o de lo contrario, todos los leucocitos adheridos a la línea horizontal inferior y vertical interior.

Si el valor obtenido (leucocitos/mm 3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el recuento empleando una dilución 1:10. Si por el contrario el número resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.

6) Cálculo:

m x 10 x d

n

= N° de leucocitos/ mm 3

Donde: m=número de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y d=dilución utilizada, n= número de cuadrantes contados.

Valores de referencia

Adultos

4.000

- 11.000 / mm 3

Recién nacidos

10.000

- 25.000 / mm 3

Niños de 1 año

6.000

- 18.000 / mm 3

Niños de 4 a 7 años

6.000

- 15.000 / mm 3

Niños de 8 a 12 años

4.500

- 13.000 / mm 3

2-

DETERMINACIÓN

DE

LA

FÓRMULA

LEUCOCITARIA:

RECUENTO

DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

En todo frotis coloreado con M.G.G. debe colocarse una delgada capa de aceite de inmersión, aun para el pequeño aumento a seco. Si no se cumple este requisito la refringencia de los elementos impide una buena observación. Para esto es suficiente depositar una gota en un extremo, aplicar de plano sobre ella otro portaobjetos que puede contener otro extendido en cuyo caso se harán coincidir ambas caras que los contengan y desplazarlos suavemente unos contra otros. La observación debe hacerse al principio de manera panorámica con objetivo de 10X para ver la dispersión de los elementos. Con este aumento se observaran la presencia de células grandes como los linfocitos hiperbasofilos de la mononucleosis. Por ello debe evitarse la tendencia a usar e comienzo la inmersión. Luego se pasa a 40 X aumento que resulta útil para evaluar alteraciones de tamaño de los glóbulos rojos y finalmente se pasa a 100X para el recuento diferencial de los glóbulos blancos y para la observación detallada de los elementos sanguíneos.

Un extendido correctamente realizado poseerá tres áreas de diferente espesor y con distribución también distinta de leucocitos:

1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la región inmediata al punto de partida de la extensión (cabeza). En ella hay siempre un aumento del número de linfocitos.

2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión (cola) y en ésta se observa un exceso de granulocitos y monocitos.

3. Zona ideal: Región central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las células.

Formas de recorrer el preparado Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de

Formas de recorrer el preparado

Formas de recorrer el preparado Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada
Formas de recorrer el preparado Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada
Formas de recorrer el preparado Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada
Formas de recorrer el preparado Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada
Formas de recorrer el preparado Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada
Formas de recorrer el preparado Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada
Formas de recorrer el preparado Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada
Formas de recorrer el preparado Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada

Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada uno de ellos para establecer los porcentajes. Refiriendo al valor de recuento de glóbulos blancos se puede expresar cada tipo de leucocitos en valores absolutos por mm3 de sangre. Siempre que sea posible se deben contar 100 elementos, recordar que se está haciendo una estimación porcentual de las poblaciones, el recuento de 100 elementos resulta relativamente sencillo en pacientes con valores absolutos de GB dentro de los valores de referencia. Distinto es el caso de pacientes leucopénicos con recuento bajos por ej: 1500 GB / mm 3 en estos casos resultará muy tedioso llegar a encontrar 100 elementos para poder expresar en % , por ello es aconsejable expresar literalmente lo que se vió al observar el preparado por ej: se realiza la fórmula leucocitaria en un paciente leucopénico y solo se logró contar 80 elementos ( pueden ser 70, 90 dependiendo del tiempo utilizado y del grado de leucopenia del paciente) entonces lo aconsejable es expresar los resultados de la siguiente manera: DE 80 ELEMENTOS CONTADOS “x” son Neutrófilos, “y” son eosinófilos, “z” son linfocitos, etc, etc, es decir se expresa cuantos elementos de cada serie se observó en el total de GB contados Y NO EN PORCENTAJE!

FORMULA LEUCOCITARIA EN ADULTOS SANOS

LEUCOCITOS

(%)

ABSOLUTO (cel / mm 3 )

CAYADOS

0

– 1%

100

- 250

NEUTROFILOS SEGMENTADOS

55

– 70 %

3000

- 5000

EOSINOFILOS

1

– 4 %

20

- 350

BASOFILOS

0

– 1 %

10

- 60

LINFOCITOS

20

– 40 %

1500

- 4000

MONOCITOS

4

– 8 %

100

- 500

No hay variación de la fórmula según el sexo, pero sí según la edad.

Nacimiento: 70% de neutrófilos.

Primera semana: 50% de neutrófilos y 50% de linfocitos.

Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrófilos3-4 años: 50% de linfocitos y 50% de neutrófilos.

10-12 años: valores de referencia del adulto.

Descripción de cada uno de los elementos que componen una fórmula normal

1. Neutrófilos: Núcleo lobulado (2-5 lóbulos). Los lóbulos están unidos entre sí por filamentos cromatínicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una célula terminal. Mide aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una granulación fina específica de color pardo rojiza.

2. Eosinófilos: Mide aproximadamente 13 m. El núcleo es segmentado, con predominio del bisegmentado en forma de anteojo aunque pueden aparecer con más lóbulos. El citoplasma es abundante y está cubierto de granulaciones esféricas de mayor tamaño que las del neutrófilo y que se colorean de anaranjado.

3. Basófilos: Mide aproximadamente 10 m. El núcleo está irregularmente lobulado. La cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relación al citoplasma. Las granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamaño pudiendo quedar superpuestas al núcleo, cubriéndolo parcialmente.

4. Linfocitos: Es una célula generalmente pequeña (7 m), pero puede llegar hasta 12 m. La forma más pequeña posee sólo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un 10% de los linfocitos circulantes son células más grandes y con citoplasma más abundante. El núcleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es densa.

Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamaño (18-24 m). El núcleo presenta forma irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporción núcleo-citoplasma es aproximadamente semejante. El citoplasma se tiñe de celeste plomizo y no presenta granulaciones.

TRABAJO PRÁCTICO N° 3:

ELEMETOS SANGUÍNEOS NORMALES Y PATOLÓGICOS – ALTERACIONES DE LA SERIE BLANCA

Objetivos Generales -Identificar los diferentes elementos sanguíneos normales y patológicos -Desarrollar criterios para la clasificación de elementos patológicos -Correlacionar los elementos encontrados con diferentes patologías y datos de contador hematológico.

GLOBULOS ROJOS:

PROERITROBLASTO (1):

Célula voluminosa (20-30 um. de diámetro) Núcleo: ocupa la mayor parte de la célula. Cromatina con aspecto de esponja uno o dos nucleolos teñidos de rosa por el giemsa. Citoplasma: intensamente basófilo por el gran contenido de ARN. Presenta sobre uno de los costados del núcleo una formación redondeada que se destaca por su coloración rosada: el arcoplasma que corresponde al APARATO DE GOLGI y CENTRO CELULAR. Hay numerosos ribosomas. Escasos organoides membranosos, excepto mitocondrias.

Escasos organoides membranosos, excepto mitocondrias. ERITROBLASTO BASOFILO (1) : Tamaño : menor (15-18 um.)
Escasos organoides membranosos, excepto mitocondrias. ERITROBLASTO BASOFILO (1) : Tamaño : menor (15-18 um.)

ERITROBLASTO BASOFILO (1):

Tamaño: menor (15-18 um.) Núcleo: menor tamaño nuclear. Desaparición de los nucleolos. Cromatina condensada en grumos. Citoplasma: intensamente basófilo. El halo perinuclear es menos notorio. Contiene mitocondrias. Ferritina en mayor cantidad formando acumulos.

ERITROBLASTO POLICROMATÓFILO (2):

Tamaño: se sigue reduciendo 11-13 um. Núcleo: menor tamaño, se va condensando la cromatina. Citoplasma: comienza a cargarse de un tinte lilaceo, debido a la superposición de la basofilia ribosómica con la acidofilia de la hemoglobina. A medida que los estadios progresan predominan los tintes rojizos sobre los azulados. Presentan mitocondrias donde se metaboliza el HEM. Ferritina en acumulos groseros (siderosomas).

ERITROBLASTO ORTOCROMÁTICO (2):

Perdió la capacidad de división. Tamaño: alrededor de 10 um. Núcleo: picnotico, retraído. Citoplasma: acidofilo (rosado).Menos mitocondrias y ribosomas. Gran cantidad de siderosomas.

mitocondrias y ribosomas. Gran cantidad de siderosomas. RETICULOCITO: Es la célula anterior que ha perdido el

RETICULOCITO:

Es la célula anterior que ha perdido el núcleo por expulsión o lisis (aunque se acepta más lo primero). Contiene todavía algunos ribosomas y mitocondrias. En un extendido coloreado con Giemsa aparece de tamaño algo mayor que el glóbulo rojo maduro y con una ligera policromatofilia. Pero con una coloración supravital (colorea los elementos vivos, fuera del organismo) el colorante precipita los ribosomas, formando una sustancia retículo-filamentosa, que toma distintos aspectos según la cantidad de ARN que contienen, siendo los mas maduros aquellos que contienen menos ARN.

siendo los mas maduros aquellos que contienen menos ARN. GLOBULO ROJO MADURO, ERITROCITO O HEMATIE: Es

GLOBULO ROJO MADURO, ERITROCITO O HEMATIE:

menos ARN. GLOBULO ROJO MADURO, ERITROCITO O HEMATIE: Es un residuo celular desprovisto de núcleo en

Es un residuo celular desprovisto de núcleo en todos los mamíferos. Forma: disco bicóncavo. Diámetro: 7,5 um. Esta recubierto por una membrana cuya estructura responde al modelo de mosaico fluido, al igual que todas las unidades de membrana biológicas. Tiene forma de disco bicóncavo

GRANULOPOYESIS:

Durante la maduración de la serie granulocítica se suceden una serie de cambios morfológicos que consisten en la desaparición de los nucléolos, la reducción de la relación núcleo/citoplasma, la condensación de la cromatina, la desaparición de la basofilia citoplasmática, la aparición de las granulaciones primarias o azurófilas en el estadio de promielocito y de las secundarias o específicas a partir del estadio de mielocito. Por último en esta serie de cambios morfológicos se va a comenzar a producir la segmentación nuclear que se puede apreciar en el metamielocito, para dar origen al polimorfonuclear en banda o cayado y por último a la célula más madura de esta serie, el polimorfonuclear segmentado.

MIELOBLASTO:

Elemento iniciador de la progenie. Tamaño: aproxim. 20 um. Núcleo: de gran tamaño, ocupa casi toda la célula, con una fina membrana nuclear lisa y delgada y una cromatina muy fina, muy delicada que no hace condensación cerca de la membrana nuclear. Suele tomar el aspecto de una red o tamiz. Contiene uno o dos NUCLEOLOS. Citoplasma: se colorea de celeste claro, es apenas un halo alrededor del núcleo tan voluminoso. Con el microscopio común no se observan granulaciones. Sin embargo el microscopio electrónico detecta la presencia de lisosomas que en otras etapas van a constituir las granulaciones inespecíficas.

etapas van a constituir las granulaciones inespecíficas. PROMIELOCITO: Tamaño: mayor que el anterior (25-30 um.)
etapas van a constituir las granulaciones inespecíficas. PROMIELOCITO: Tamaño: mayor que el anterior (25-30 um.)
etapas van a constituir las granulaciones inespecíficas. PROMIELOCITO: Tamaño: mayor que el anterior (25-30 um.)
etapas van a constituir las granulaciones inespecíficas. PROMIELOCITO: Tamaño: mayor que el anterior (25-30 um.)

PROMIELOCITO:

Tamaño: mayor que el anterior (25-30 um.) Núcleo: grande, pero la relación núcleo citoplasma es menor. Puede ser redondo u ovalada, generalmente es excéntrico. La cromatina todavía es laxa, aunque algo menos que en el anterior. Presenta NUCLEOLOS. Citoplasma: presenta una zona clara perinuclear llamada arcoplasma (corresponde a la zona del complejo de golgi y centro celular). Sigue siendo basófilo y ya son visibles con el microscopio óptico numerosas granulaciones inespecíficas (se llaman así porque no permite identificar a la célula como precursora de neutrofilo-eosinofilo-basófilo). Tambien son llamadas primarias. Contienen enzimas y la más características es a mieloperoxidasa. Los gránulos primarios son lisosomas rodeados por lo tanto de unidades de membrana.

MIELOCITO (1): Tamaño: 20-25 um. Núcleo: ya no muestra NUCLEOLOS . La cromatina comienza a

MIELOCITO (1):

Tamaño: 20-25 um. Núcleo: ya no muestra NUCLEOLOS. La cromatina comienza a mostrar condensaciones. Citoplasma: es todavía basófilo, pero además de las granulaciones primarias presenta en la zona del arcoplasma, granulaciones específicas que permiten hablar de mielocito neutrofilo-eosinofilo- basófilo según el contenido de sus gránulos específicos o secundarios. El mielocito es el último elemento en el cual se presenta división.

es el último elemento en el cual se presenta división. METAMIELOCITO: Tamaño: algo menor que el

METAMIELOCITO:

Tamaño: algo menor que el mielocito. Núcleo: de forma arriñonada con cromatina en forma parcelada, mostrando zonas condensadas. No presenta nucleolos. Citoplasma: policromatofilo (intermedio entre azul y rosado). Predominan las granulaciones específicas. Las granulaciones primarias son escasas y van poco a poco perdiendo su coloracion.

GRANULOCITO EN BANDA O CAYADO:

Tamaño: menor que el metamielocito. Núcleo: en forma de “C” (bastón o cayado) “S” o en una banda. Con cromatina condensada, disposición parcelada. Citoplasma: acidofilo (rosado) con granulaciones específicas o secundarias. Las granulaciones primarias ya no son visibles al microscopio común. De acuerdo a los gránulos que presenta será neutrofilo, eosinofilo o basófilo.

que presenta será neutrofilo, eosinofilo o basófilo. GRANULOCITO MADURO: granulocito con núcleo segmentado. 26

GRANULOCITO MADURO: granulocito con núcleo segmentado.

GRANULOCITO NEUTRÓFILO:

Es el elemento más abundante del frotis normal de un adulto Núcleo: lobulado o segmentado. Presenta de 2 a 5 lóbulos que se van formando a partir de estrangulaciones en el núcleo del granulocito en cayado, que se van profundizando de manera que van quedando los segmentos o lóbulos unidos por filamentos de cromatina. La cromatina tiene una disposición en mosaico, con zonas de cromatina muy condensada y otras de cromatina extendida. La mayor cantidad de lóbulos indica mayor madurez de la célula. Tamaño: de 12 a 14 um. Citoplasma: rosado con granulaciones específicas muy finas, que toman tanto los colorantes ácidos como los básicos (de allí el nombre de neutrófilos) y aparecen de color violeta. Contienen enzimas como la fosfatasa alcalina y sustancias de acción bactericida.

la fosfatasa alcalina y sustancias de acción bactericida. GRANULOCITOS EOSINÓFILOS: Tamaño: 12-15 um. Núcleo :

GRANULOCITOS EOSINÓFILOS:

Tamaño: 12-15 um. Núcleo: predomina el núcleo bilobulado, semejante a un anteojo. Disposición de la cromatina en mosaico. Citoplasma: cubierto de granulaciones esféricas de mayor tamaño que las neutrófilos, coloreadas de color naranja (o pardo rojizo) por la eosina. Prácticamente cubren todo el citoplasma y se consideran lisosomas.

cubren todo el citoplasma y se consideran lisosomas. GRANULOCITO BASÓFILO: Tamaño: 10-12 um. Núcleo:

GRANULOCITO BASÓFILO:

Tamaño: 10-12 um. Núcleo: irregularmente lobulado. Cromatina muy densa, masa nuclear voluminosa en relación al citoplasma. Citoplasma: rosado. Contiene granulaciones grandes, irregulares en forma y tamaño, de color azul oscuro, casi negro, que a veces, por el aspecto esférico de la célula viva, cuando se transforma en disco por la desecación (al realizar el frotis) quedan superpuestas al núcleo cubriéndolo parcialmente. Son solubles en agua, por eso muchas se disuelven durante

quedan superpuestas al núcleo cubriéndolo parcialmente. Son solubles en agua, por eso muchas se disuelven durante

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la coloración. Contiene heparina e histamina.

ORIGEN DE LOS MONOCITOS:

Se acepta como único lugar productor de monocitos en el organismo, la médula ósea.

productor de monocitos en el organismo, la médula ósea. MONOBLASTO: Tamaño: aproximadamente 20 um. Es muy

MONOBLASTO:

Tamaño: aproximadamente 20 um. Es muy parecido al mieloblasto, se diferencia de el en que el núcleo presenta una ligera indentacion (que hace recordar al monocito maduro) presenta tambien varios nucleolos. La otra

diferencia es que el citoplasma es ligeramente grisáceo y a veces marca pliegues.

PROMONOCITO:

Tamaño: algo mayor que el monoblasto. Cromatina nuclear: con aspecto de fina red. Queda restos de nucleolos. Núcleo de contorno irregular con indentaciones. Citoplasma: de un color grisáceo mas basófilo que su predecesor.

MONOCITO:

color grisáceo mas basófilo que su predecesor. MONOCITO: Célula de mayor tamaño en el extendido (18-24
color grisáceo mas basófilo que su predecesor. MONOCITO: Célula de mayor tamaño en el extendido (18-24

Célula de mayor tamaño en el extendido (18-24 um) Forma: irregular. Núcleo: con lobulaciones incompletas como si se replegara sobre si mismo, de modo que recuerda las circunvoluciones del cerebro. A veces forma arriñonada. Con forma abigarrada en herradura, indentado o doblado. Cromatina laxa, delicada, condensada en grumos, dando un aspecto como de pinceladas desparejas. No presenta nucleolos. Citoplasma: grisáceo. No presenta gránulos pero si un polvillo muy fino, en el limite de visibilidad del microscopio y pequeñas vacuolas. Ese polvillo esta constituido por acumulos de lisosomas.

LINFOPOYESIS: Se originan en médula ósea y luego sufren procesos de maduración y diferenciación en órganos linfáticos secundarios.

LINFOBLASTO:

LINFOBLASTO: Tamaño: aproxim. 20 um. Núcleo: grande, con membrana nuclear gruesa debido a que la cromatina

Tamaño: aproxim. 20 um. Núcleo: grande, con membrana nuclear gruesa debido a que la cromatina se condensa cerca de la membrana. Esto permite diferenciarlo de un mieloblasto y monoblasto. Citoplasma: basófilo. Sin gránulos. Es escaso porque el núcleo ocupa gran parte de la célula.

PROLINFOCITO:

Tamaño: 15-18 um. Núcleo: algo más pequeño, cromatina más condensada. Generalmente es excéntrico. Todavía se identifican nucleolos. Citoplasma: mas abundante que en el linfoblasto. Sin gránulos.

LINFOCITO MADURO:

que en el linfoblasto. Sin gránulos. LINFOCITO MADURO: Podemos encontrarlo como linfocito pequeño o linfocito
que en el linfoblasto. Sin gránulos. LINFOCITO MADURO: Podemos encontrarlo como linfocito pequeño o linfocito

Podemos encontrarlo como linfocito pequeño o linfocito mediano y grande. LINFOCITO PEQUEÑO:

Tamaño: aprox. 9 a 14 um. Núcleo: color púrpura, cromatina muy condensada. A veces puede atisbarse algún nucleolo. Ocupa casi toda la célula. Generalmente es redondo. A veces presenta una escotadura. Citoplasma: azul celeste muy escaso.

LINFOCITO GRANDE:

Tamaño: mayor 12-15 um. (A veces tamaño de un monocito). Núcleo: cromatina densa. Se ubica oralmente en forma excéntrica. Citoplasma: más abundante que en el pequeño y mediano. Color celeste. Suele contener algunas granulaciones muy pequeñas de color púrpura.

algunas granulaciones muy pequeñas de color púrpura. CELULA PLASMATICA: Representa el 1-4% de las células
algunas granulaciones muy pequeñas de color púrpura. CELULA PLASMATICA: Representa el 1-4% de las células

CELULA PLASMATICA:

Representa el 1-4% de las células nucleadas de MO en un sujeto normal y es el estadio final de la maduración y transformación del linfocito B maduro. Es una célula redonda u ovalada que mide entre 11 y 15 um. de diámetro. Se caracteriza por el núcleo redondo, denso y excéntrico con la heterocromatina dispuesta en masas groseras de disposición radial (“en rueda de carro”). Por lo general no presentan nucléolo. El citoplasma puede tener frecuentemente bordes de apariencia irregular y se tiñe de azul violáceo muy intenso, indicio de su riqueza en RNA con una zona clara cercana al núcleo denominada "arcoplasma". Normalmente no contienen granulaciones, pero pueden mostrar vacuolas o cuerpos de inclusión pálida o rosa, que corresponden a acumulos de inmunoglobulinas (cuerpos de Russell).

Cuando estas inclusiones son muy numerosas, el aspecto de la célula es el de una mórula (célula de Mott). En algunos procesos reactivos que cursan con estimulación antigénica crónica (por ej. artritis reumatoidea activa) pueden aparecer en SP en un pequeño número. Se pueden observar también plasmocitos con inclusiones que representan acumulos de inmunoglobulinas en la cisterna perinuclear con la subsecuente invaginación dentro del núcleo, que da la apariencia de ser intranucleares. Estas estructuras se conocen como cuerpos de Dutcher. En algunos pacientes con mielomas IgA se pueden observar células plasmáticas “flameadas” caracterizadas por una coloración eosinofilica en la periferia o a veces en el citoplasma completo. En raras ocasiones se pueden observar plasmocitos multinucleados o células plasmáticas inmaduras (plasmoblastos) en aspirados de MO normal.

SERIE MEGACARIOCITICA-PLAQUETARIA

En la serie megacariocítica las divisiones nucleares no son seguidas de divisiones citoplasmáticas, lo que da lugar a la existencia de células poliploides de gran tamaño. Se

distinguen cuatro estadios evolutivos: el megacarioblasto, el promegacariocito, el megacariocito granular y el megacariocito formador de plaquetas o maduro.

granular y el megacariocito formador de plaquetas o maduro. MEGACARIOBLASTO: Es la célula descendiente de la

MEGACARIOBLASTO:

Es la célula descendiente de la SC, con orientación plaquetogénica. Su tamaño oscila entre 10 - 25 micras. El núcleo generalmente tetraploide u octaploide es único, grande, ovalado o bilobulado con cromatina laxa y numerosos nucléolos. El citoplasma, es intensamente basófilo, agranular y puede presentar algunas prolongaciones a modo de seudópodos muy característicos.

PROMEGACARIOCITO:

Mide 30 a 50 micras y se identifica fácilmente en MO por su gran tamaño y por el aspecto característico de su citoplasma que posee bordes mal limitados y emite numerosas prolongaciones. El núcleo es multilobulado, su cromatina es densa y no posee nucléolos. En el citoplasma persiste su tonalidad basófila, con numerosas granulaciones azurófilas que cubren distintas zonas.

granulaciones azurófilas que cubren distintas zonas. MEGACARIOCITO GRANULAR : Es característico su gran tamaño

MEGACARIOCITO GRANULAR:

que cubren distintas zonas. MEGACARIOCITO GRANULAR : Es característico su gran tamaño (80 micras o más)

Es característico su gran tamaño (80 micras o más) y su elevada ploidía. Su citoplasma amplio no posee basofilia y está totalmente cubierto por granulación azurófila rojo rosada. El núcleo es multilobulado o segmentado con cromatina condensada sin nucléolo.

MEGACARIOCITO MADURO ACTIVO:

En este estadio el núcleo sigue siendo lobulado pero más compacto. Finalizada la síntesis de ADN se inicia en el citoplasma la granulogénesis que dará origen a las plaquetas. Los gránulos azurófilos se distribuyen especialmente en la periferia, en pequeños agregados rodeados por una zona hialina citoplasmática correspondiente a las membranas de demarcación que irán delimitando las futuras plaquetas. Las plaquetas son finalmente liberadas como fragmentos citoplasmáticos por fusión de las membranas de demarcación.

por fusión de las membranas de demarcación. FORMULA LEUCOCITARIA NORMAL Valores de referencia para

FORMULA LEUCOCITARIA NORMAL

Valores de referencia para adultos sanos

 

Valor relativo (%)

Valor absoluto (x10 9 /L)

Cayados

0

– 2

0

– 0,2

Neutrófilos Segmentados

 

50

– 70

2,3 – 6,5

Eosinófilos

1

– 5

0,05 – 0,5

Basófilos

0

– 1

0

– 0,1

Linfocitos

 

25

– 40

1,5 – 4,0

Monocitos

3

– 8

0,1 – 0,8

ALTERACIONES CUANTITATIVAS Se refiere a una variación en la cantidad de los diferentes tipos leucocitos o bien a variaciones en el recuento total. Se evalúan mediante un conteo total de leucocitos y conteo diferencial de cada uno de ellos. Pueden ser trastornos malignos o benignos. Los trastornos malignos pueden ser ocasionados por transformación neoplásica de células progenitoras Los trastornos benignos pueden ser adquiridos o hereditarios.

1-ALTERACIONES FISIOLÓGICAS

Son todas aquellas alteraciones desencadenadas por causas diferentes a la enfermedad subyacente del paciente, son transitorias y no necesitan tratamiento ya que NO constituyen un parámetro de enfermedad. Edad Embarazo Stress emocional Ejercicio Raza (algunas personas de raza negra tienen tendencia a leucopenia)

2-ALTERACIONES PATOLÓGICAS

2.1-LEUCOCITOSIS: >11.0 x 10 9 /L (Neutrofilia, eosinofilia, basofilia, linfocitosis, monocitosis) 2.2-LEUCOPENIA: < 4.0 x 10 9 /L (Neutropenia, eosinopenia, monocitopenia, linfopenia) 2.3-REACCIONES LEUCEMOIDES entre 20.0 – 50.0 x 10 9 /L

2.1 – LEUCOCITOSIS

Neutrofilia: > 6.5 x 10 9 /L Aumento absoluto de los neutrófilos La causa más común es la infección bacteriana. Mecanismo: La invasión bacteriana estimula los precursores en la M.O, esto intensifica la proliferación, el pool marginal se desplaza hacia el pool circulante; reflejándose en la sangre como leucocitosis y neutrofilia. También es causada por quemaduras, medicamentos, lesiones, y leucemia mieloide crónica. (LMC). Los corticoides, actividad física intensa, situaciones de stress pueden manifestarse con neutrofilias sin desviación a la izquierda.

Eosinofilia: > 0.5 x 10 9 /L Puede verse en infecciones con parásitos metazoarios, trastornos alérgicos, cáncer y estados inflamatorios crónicos. Se observa también en el síndrome de Loeffler, el cual parece ser producido por una reacción alérgica. Una causa común es la migración del parásito Ascaris lumbricoides a través del tracto respiratorio. Otros parásitos de la familia Ascaris también pueden producir el síndrome. Entre las posibles causas adicionales se puede incluir la alergia a medicamentos, por ejemplo antibióticos sulfonamida. También se puede presentar en coexistencia con tumores sólidos.

Basofilia: > 0.1 x 10 9 /L Aumento absoluto de los basófilos. Está vinculada con reacciones de hipersensibilidad inmediata y afecciones mieloproliferativas crónicas (LMC). Se observa también en enfermedades inflamatorias del intestino, el mixedema y después de la exposición a la radiación

Linfocitosis: > 4 x 10 9 / L Incremento absoluto en el número de linfocitos. Generalmente responde a una infección viral. Un marcado incremento en el número de linfocitos puede estar asociado a una leucemia linfática crónica.

Monocitosis: > 0.8 x 10 9 / L Incremento absoluto del número de monocitos. Este estado se encuentra asociado a períodos largos y crónicos de infección bacteriana (brucelosis, tuberculosis, fiebre tifoidea) Se presenta en la etapa de recuperación de las infecciones agudas. Otras causas son leucemia monocítica y enfermedades del colágeno

2.2 – LEUCOPENIAS

Neutropenias: < 2.3 x 10 9 /L Disminución en la producción medular: aplasia medular, agentes citotóxicos que deprimen la división celular (sulfamidas, cloranfenicol), hematopoyesis ineficaz. Exceso de destrucción por Ac antineutrófilos, por medicamentos como la fenotiazina. Se observa en enfermedades virales, bacterianas y protozoarias (paludismo, tifo, etc) Fase inicial de la infección: la salida de los PNN a los tejidos es mayor que la salida medular (gran demanda tisular).

Eosinopenia: < 0.05 x 10 9 /L

Disminución en la cantidad de eosinófilos. Difícil de establecer debido a su bajo recuento. La ACTH aumenta los PMN circulantes pero disminuye los eosinófilos circulantes. Se presenta en situaciones estresantes agudas, reacciones inflamatorias y con la administración de glucocorticoides. La infección bacteriana puede causar disminución debido a una marginación creciente y a la migración de estas células a los tejidos, pero la recuperación se puede acompañar de eosinofilia leve

Monocitopenias: < 0.1 x 10 9 /L Se encuentra en trastornos de las células progenitoras como en la anemia aplásica, en las leucemias, y después de la terapia con glucocorticoides. En la fase inicial de procesos infecciosos.

Linfopenias: < 1.5 x 10 9 /L Disminución en el número de linfocitos Puede originarse por: falla en la producción, exceso en su destrucción, o pérdidas celulares a través de los conductos linfáticos del intestino. Las linfopenias por defectos en la producción son característica de algunas IDP, tales como:

inmunodeficiencia severa combinada, síndrome de DiGeorge completo, hipoplasia cartílago- pelo, inmunodeficiencia común variable, SIDA

2.3 - REACCION LEUCEMOIDE

Reacción benigna de leucocitos caracterizada por leucocitosis con muchos precursores inmaduros de leucocitos circulantes. Esta respuesta puede ser linfocítica, eosinofílica, así como neutrofílica. Puede producir un cuadro sanguíneo indistinguible de la leucemia mielocítica crónica. Es transitoria y desaparece cuando el estímulo desencadenante se elimina, por ejemplo extirpación del tumor y control de la infección. Como sucede con la leucemia, la persona que presenta una reacción leucemoide presenta una proliferación desorganizada de glóbulos blancos inmaduros en la sangre y en la médula ósea.

REACCION LEUCEMOIDE NEUTROFILICA Se encuentra aumento de los PNN, acompañados de mielocitos y metamielocitos. Causas:

Neoplasias Broncopulmonares y gástricas

Tumores malignos de mama y próstata

Algunas infecciones bacterianas: Osteomielitis, tuberculosis.

ALTERACIONES CUALITATIVAS

1-ALTERACIONES NUCLEARES

Anomalía de Pelger Hüet

Es un trastorno nuclear hereditario autosómico dominante o adquirido debido a quimioterapia, síndromes mieloproliferativos agudos o crónicos, quemaduras, reacciones a fármacos e infecciones. Hay una falla en el desarrollo del núcleo durante la diferenciación terminal, el núcleo es en forma de nuez o maní. Hay hipercondensación de la cromatina. Se observa hiposegmentación nuclear .No hay pérdida de la función celular.

Hipersegmentación Nuclear

Trastorno hereditario (autosómico dominante) o adquirido. Se debe a una anormalidad en la maduración del núcleo (síntesis de DNA). Presentación de PMN con 6 o más lóbulos. Células de mayor tamaño que las normales. Se observa asociada a la eritropoyesis megaloblástica. También puede estar asociado a infecciones crónicas o a déficit de vitamina B12, folatos, etc.

2-ALTERACIONES CITOPLASMATICAS

Síndrome de Chediak – Higashi.

Esta rara enfermedad autosómica recesiva se caracteriza por albinismo parcial, gránulos lisosómicos gigantes en la mayoría de las células granulosas (aunque también se observan en linfocitos y monocitos), y mayor susceptibilidad a las infecciones. Es fácil observar las células sanguíneas anormales en los frotis sanguíneos de rutina. La enfermedad se diagnostica por lo general en niños. Hay diversas anomalías en los neutrófilos incluyendo neutropenia moderada, reducción en la quimiotaxis de neutrófilos. Además, en estudios microbicidas, se observa que los gránulos primarios gigantes se degranulan con lentitud, y por lo tanto, se retarda la muerte de las bacterias fagocitadas.

Anomalía de Alder Reilly.

Trastorno de tipo autosómico. Presencia de gránulos azurófilos agrupados en racimos en el citoplasma de granulocitos, monocitos y linfocitos. Se diferencian de las granulaciones tóxicas ya que se presentan en otras células diferentes a los neutrófilos y la ausencia de vacuolas tóxicas. Esta asociada a mucopolisacaridosis.

Anomalía de May – Hegglin.

Trastorno autosómico dominante. Asociado con hemorragias leves, macroplaquetas con escasos gránulos y trombocitopenia. Se caracteriza por aparición en los neutrófilos segmentados de unos cuerpos de inclusión muy similares a los cuerpos de Döhle; se observan coloreados azul

están

pálido, con la

hacia la periferia de la célula sino distribuidos indistintamente en el citoplasma.

diferencia

que

por

lo

general

no

Cuerpos de Döhle.

No son exclusivos de los neutrófilos, igualmente se pueden encontrar en el citoplasma de los monocitos, se observan como inclusiones redondeadas basófilas únicas o múltiples que se depositan en la periferia de las células y son poco nítidos. La presencia de estas inclusiones indica hiperactividad celular. Se encuentran en condiciones tóxicas tales como Fiebre escarlatina, sepsis, quemaduras, embarazo y tuberculosis

Granulaciones Tóxicas.

Las granulaciones tóxicas de los segmentados neutrófilos son gránulos hipertrofiados que le dan un aspecto hipergranular al citoplasma de los neutrófilos que junto con las vacuolas y los cuerpos de Döhle se encuentran en condiciones tóxicas como infecciones, septicemia, quemaduras. Son gránulos primarios que debido a algún desbalance en la maduración del neutrófilo no lograron ser eliminados eficazmente.

Cuerpos o bastones de Auer.

Inclusiones intracitoplasmáticas en forma de varilla o de bastón que se observa en los mieloblastos, promielocitos y monoblastos. Se cree que son gránulos azurófilos que se fusionan,

tienen afinidad por la eosina. Se encuentran en la leucemia mieloide aguda y durante la crisis blástica de la leucemia mieloide crónica.

Linfocitos atípicos

Llamados también células linfomonocitoides, linfocitos activados, inmuncitos, etc. Miden de 15µm a 30µm, núcleo irregular, indentado, excéntrico y puede observarse nucleolos. El citoplasma es amplio, color azul tenue o intenso, y puede presentar gránulos azurófilos y vacuolas. Estas células pueden observarse en mononucleosis infecciosa, hepatitis viral, herpes zoster, enfermedades autoinmunes y normalmente pueden hallarse hasta en 5%.

Vacuolas

Se pueden presentar en el citoplasma de neutrófilos tóxicos, monocitos, eosinófilos y menos frecuentemente linfocitos. Al MO se observan como puntos blancos en sacabocado. En frotis realizados del frasco de hemograma estas vacuolas se pueden presentar en muestras envejecidas por fagocitosis de las sales del anticoagulante, por lo tanto para su confirmación resulta imprescindible el extendido de punta de aguja.

Degranulación

Neutrófilo sin granulaciones, “citoplasma limpio”, indicativo de hemopatías severas, SMD y SMP. Sepsis de mala evolución, etc.

TRABAJO PRÁCTICO 4 Y 5

ALTERACIONES SERIE ROJA - ANEMIAS

HEMATIES NORMOCÍTICOS - NORMOCRÓMICOS Discos cuya biconcavidad hace que aparezcan con cierta palidez central. Miden aproximadamente de 7,2 µm a 7,4 µm.

Las alteraciones eritrocitarias se dividen en:

Alteraciones en tamaño (Anisocitosis)

Alteraciones en su forma (Poiquilocitosis)

Alteraciones de color (Anisocromía)

Inclusiones anormales.

Alteraciones en el tamaño.

Pueden ser de dos tipos:

Macrocitos: Hematíes que presentan un tamaño superior al normal (más de 9 µm) y su expresión máxima es el megalocito. Suelen aparecer en la anemia megaloblástica debida a déficit de vitamina B12 o ácido fólico. Se suele observar cuando hay un aumento de la actividad eritropoyética, como un mecanismo de compensación a la pérdida de los hematíes, sea por anemia severa o hemorragias. En la sangre periférica se pueden observar como hematíes grandes policromatófilos o reticulocitos.

Microcitos: Hematíes que presentan un tamaño inferior al normal (menos de 6 µm) y se encuentran en pacientes con anemia ferropénica y talasemias.

Alteraciones en la forma

Esferocitos: Son hematíes esféricos, no son bicóncavos, presentan un diámetro inferior al normal pero más grueso. Su vida media es de 14 días, producen taponamiento de los vasos sanguíneos. Se encuentran en la esferocitosis hereditaria o enfermedad de Mihkowski- Chauffard (defecto congénito de la membrana eritrocitaria). También pueden ser adquiridos por factores extraeritrocitarios (autoanticuerpos, quemaduras extensas, etc.)

Codocitos o Target cells: Llamados también dianocitos. En la región central presentan un área con mayor contenido hemoglobínico (zona densa). La interfase entre la membrana celular y el centro es transparente. Se encuentran en hemoglobinopatías (Hb C), talasemias, anemia ferropénica y en algunas hepatopatías crónicas con aumento de colesterol y fosfolípidos.

Drepanocitos:

Son hematíes

con

HbS

precipitada.

Su apariencia

es

propia

del

estado

homocigoto

de

la

hemoglobina

S,

aunque

también

se

puede

presentar

en

estados

de

heterocigozis.

Eliptocitos: Los hematíes son alargados (ovalocitos). Se encuentran en la eliptocitosis hereditaria. Su presencia se debe a una alteración congénita de la membrana del hematíe, aunque puede ser adquirida en caso de una anemia megaloblástica, ferropénica o arregenerativa.

Equinocitos: Son aquellos que presentan membrana ondulante e irregular. Se encuentran en algunas anemias hemolíticas. Este fenómeno puede ser inducido in vitro exponiendo los

hematíes a una solución hipertónica. También se pueden encontrar en pacientes con IRC, hepatopatías, déficit de PK, etc.

Acantocitos: Las prominencias de la membrana eritrocitaria son más aguzadas (alargadas) y distribuidas irregularmente. Se encuentran en la acantocitosis que se caracterizan por la ausencia de lipoproteínas plasmáticas. También pueden encontrase en pacientes con hepatopatías, dislipidemias, hipotiroidismo, etc.

Dacriocitos: Son hematíes en forma de lágrima. Se encuentran en la anemia ferropénica, anemia megaloblástica y talasemia. También se encuentran en situaciones en las que la MO padece alguna patología severa (SMD, MFI, etc) y en esplenomegalia.

Esquistocitos: Son fragmentos hemáticos. Se encuentran en anemias hemolíticas microangiopáticas (SUH, PTT, etc.), quemaduras, etc.

Estomatocitos: Son hematíes que en lugar de una depleción central clara tienen una banda pálida central que les da un aspecto de boca. Se hereda como carácter autosómico dominante. Esta enfermedad es causada por anormalidad hereditaria de la membrana eritrocitaria. También se pueden encontrar en pacientes con hepatopatías y dislipidemias.

Excentrocitos: Son hematíes con distribución irregular de la hemoglobina. Su tamaño es inferior al normal y se caracteriza por poseer contornos parcialmente arrugados, pero además se observa una distribución irregular de la hemoglobina que aparece desplegada de la parte interna hacia uno de los extremos.

Knocitos: Son hematíes que presentan un estoma o boca en la región central completamente coloreada y lo demás incoloro. Morfológicamente es todo lo contrario a las características del estomatocito. Se encuentran en algunas anemias como las ferropénicas.

Alteraciones de color

Aquí observamos las diferentes tonalidades de color de los hematíes dependiendo del contenido hemoglobínico u otros. Tenemos:

Hipocromía: Son hematíes con disminución del contenido de la hemoglobina y dependiendo de la cantidad de este pigmento es que observamos a los hematíes con diferentes caracteres de color. Aquí están incluidos los anulocitos, que son hematíes en forma de anillo en que solo la membrana eritrocitaria está coloreada y que se traduce en una hipocromía de grado severo (+++).

Pseudo - Hipercromía: Son hematíes ávidos de hemoglobina. Pueden encontrarse en caso de enfermedades como la policitemia vera o la policitemia fisiológica y esferocitosis hereditaria

Policromatofilia: Presencia de hematíes con tonalidad (azul y rojo) morada. Se le relaciona con inmadurez celular, células nucleadas, presencia de reticulocitos, macrocitos, etc. Esto debido a su elevada cantidad de ARN.

Anisocromía: Diferentes tonalidades de color como hematíes hipocrómicos, hipercrómicos, normocrómicos y policromatófilos. Se encuentran en ciertas anemias refractarias.

Inclusiones anormales

Punteado basófilo: Son gránulos basófilos presentes en el citoplasma de los hematíes. Indica una alteración de la eritropoyesis más que un aumento de la misma. Se produce en muchas enfermedades sanguíneas: talasemia, anemias megaloblasticas, infecciones, hepatopatías,

intoxicación por plomo y otros metales pesados, hemoglobinas inestables y deficiencia de pirimidina-5´-nucleotidasa. Actualmente el consumo de ciertos fármacos también puede producir este fenómeno.

Cuerpos de Heinz: Son formaciones redondeadas de hasta 3 µm de diámetro localizadas habitualmente en la periferia de la célula. Se observan con colorantes para reticulocitos. Estos cuerpos son abundantes en sujetos esplenectomizados.

Anillos de Cabot: Se cree que sean restos de membrana nuclear eritroblástica o restos después de una mitosis anormal. Se observan en forma de anillo u ocho invertido. Pueden ser precipitados de ARN o proteína carente de importancia diagnóstica. Su presencia indica severas signos de diseritropoyesis.

Cuerpos de Howel-Jolly: Son restos de cromatina nuclear, resultados de la pérdida del núcleo por parte del eritroblasto ortocromático hasta la conversión del hematíe. Se les considera signos de regeneración celular. Pueden observarse (habitualmente aislados) en un pequeño porcentaje de hematíes en la anemia perniciosa. Las células que los contienen aparecen habitualmente tras la esplenectomía y cuando se ha producido una atrofia esplénica. En general, solo se encuentran unas cuantas células de este tipo, pero pueden ser muy numerosas en los casos de enfermedad celiaca, en la que hay una atrofia esplénica y una deficiencia de folato concomitante.

Cuerpos de Pappenheimer: Los cuerpos de Pappenheimer son pequeñas inclusiones eritrocitarias basòfilas (casi negras) dispuestas periféricamente. Habitualmente, solo hay una pequeña cantidad en el interior de la célula. Están formados por hemosiderina y su presencia se relaciona con una sobrecarga de hierro y con hipoesplenismo. A veces, se encuentran en la mayoría de los hematíes circulantes. Su naturaleza puede confirmarse por medio de una tinción de Perls. Corresponden a los gránulos sideroticos de los siderocitos y nunca se encuentran en grandes cantidades en el interior de las células, como el clásico punteado basofilo. Sin embargo, en una sola célula se pueden encontrar ambos elementos, es decir, el punteado basofilo y los cuerpos de Pappenheimer. Con la tinción de Perls, los primeros de estos gránulos se tiñen de rosa mientras que los últimos lo hacen de azul.

Siderocitos: Son hematíes con contenido de hierro libre no hemoglobínico de color verde azulado.

Gránulos de Shuffner: Son gránulos que presentan algunos hematíes en caso de parasitismo por plasmodium vivax. Gránulos de Maurer: Son gránulos de color violeta oscuro que se encuentran en pacientes con parasitismo por plasmodium falciparum.

ANEMIA:

Se define anemia como la incapacidad de la sangre para transportar oxígeno. Según la definición de la OMS se acepta que existe Anemia cuando la concentración de HEMOGLOBINA se halla por debajo de los límites establecidos en función de la edad y el sexo; independientemente de que la concentración de eritrocitos se encuentre normal o incluso elevada.

EDAD

CONCENTRACION DE HEMOGLOBINA (g/dL) MENOR A ….

Recién nacidos (a termino)

14,0

Niños de 3 meses

9,0

Niños de 2 años

11,0

Mujeres (no embarazadas)

11,5

Varones

12,0

Mujeres embarazadas

11,0

CLASIFICACION MORFOLÓGICA:

Se debe recordar que el VCM se correlaciona con la HCM (que informa el contenido medio hemoglobínico de los eritrocitos circulantes) de forma que disminuirá la HCM al hacerlo el VCM (anemia microcítica hipocrómica) y aumenta cuando aumente el VCM (anemia macrocítica “hipercrómica”). Siempre se debe recordar que en determinadas situaciones el VCM puede estar afectado por factores no debidos al tamaño de los eritrocitos, como alteraciones en la forma o la deformabilidad celular, lo que obedece a los métodos automatizados para medir el VCM por lo tanto, siempre que analicemos un histograma, debemos tener en cuenta que el VCM es un valor medio y no informa sobre la homogeneidad celular y es necesario correlacionarlo con el índice ADE y hacer una inspección al microscopio del frotis para que una posible anisocitosis no pase desapercibida.

a) ANEMIAS MICROCITICAS (VCM< 82 fl)

Anemia Ferropénica. Deficiencia de Hierro.

Talasemias. Defectos en la síntesis de Hemoglobina.

Anemia secundaria a enfermedades crónicas. Mala disponibilidad del hierro orgánico.

Anemia Sideroblástica. Defectos en la síntesis del grupo HEM.

b) ANEMIAS NORMOCITICAS (VCM: 82 – 98 fl)

Anemias hemolíticas.

Aplasia Medular.

Invasión Medular.

Anemia secundaria a enfermedades crónicas.

Anemia secundaria a procesos hemorrágicos agudos.

Anemias tempranas de otras anemias.

c) ANEMIAS MACROCITICAS (VCM> 98 fl)

i. HEMATOLOGICAS. (VCM > 115 fl)

Anemias megaloblásticas. Deficiencia de folato o vit B 12

Anemias aplásicas.

Anemias hemolíticas con crisis reticulocitaria.

Síndromes mielodisplásicos.

ii. NO HEMATOLOGICAS. (VCM < 115 fl)

Anemia secundaria a abuso de alcohol

Anemia secundaria a Hepatopatía crónica

Anemia secundaria a Hipotiroidismo

Anemia secundaria a Hipoxia.

CLASIFICACIÓN FISIOPATOLOGICA DE LAS ANEMIAS

ANEMIAS ARREGENERATIVAS:

En este tipo de Anemias también llamadas Arregenerativas, la medula ósea no presenta una capacidad regenerativa normal y no se cumple una relación inversa entre la disminución de la concentración de la hemoglobina y el aumento de Reticulocitos. Esto es, la Medula Ósea no puede responder adecuadamente al grado de anemia.

Defecto de proliferación y diferenciación de stem cells: aplasia medular, leucemia, mielodisplasias.

Defecto de proliferación y diferenciación de progenitores de los GR: aplasia roja pura, insuficiencia renal, enfermedades endocrinas, etc.

Defecto en síntesis de DNA: deficiencia de vitamina B12 y folatos.

Defecto en síntesis de Hemoglobina: deficiencia de fierro, talasemias.

Mecanismos múltiples o desconocidos: anemia de enfermedades crónicas, infiltración medular (metástasis), anemias sideroblásticas.

ANEMIAS REGENERATIVAS:

En general, obedecen a una perdida periférica de eritrocitos por hemorragias o hemólisis. Son anemias regenerativas, es decir que la medula presenta una capacidad de respuesta normal y existe una relación inversa entre el grado de anemia y el aumento de Reticulocitos.

DEFECTOS INTRÍNSECOS:

- De membrana: esferocitosis, acantocitosis, etc.

- De enzimas: deficiencias de G-6-PD, piruvato kinasa, etc.

- De globinas: enfermedad de las células falciformes (HbS), Hemoglobinas inestables, etc.

DEFECTOS EXTRÍNSECOS:

- Mecánicos: microangiopatía, prótesis, etc.

- Químicos o físicos: hemólisis por drogas, venenos.

- Infecciones: clostridium, malaria, otras septicemias

- Anticuerpos: autoinmune, aloinmune, drogas.

- Hiperactividad monocito-macrófago: hiperesplenia.

- Pérdida de sangre: hemorragia aguda.

RECUENTO DE RETICULOCITOS

Los Reticulocitos son eritrocitos no nucleados, inmaduros, que contienen ARN y que continúan sintetizando hemoglobina después de la pérdida del núcleo.

hemoglobina después de la pérdida del núcleo. El carácter regenerativo o arregenerativo de una anemia

El carácter regenerativo o arregenerativo de una anemia puede conocerse a través del recuento de Reticulocitos. Además, el recuento de Reticulocitos sirve para el seguimiento en el tratamiento de ciertas anemias. Por ejemplo, la respuesta de los reticulocitos en el día 6 después

de la terapia confirma la respuesta a la terapia con folato o con B12 siempre que sólo se hayan dado dosis bajas, en una anemia por déficit de folato o cabalamina. Podemos observar los reticulocitos al microscopio óptico mediante la tinción con colorantes vital, azul de metileno o azul brillante de cresilo. Estos colorantes dan lugar a la precipitación de los restos de ARN, y se observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la célula. El número de reticulocitos en sangre circulante es, probablemente el mejor y más sencillo indicador de la eritropoyesis. Un aumento puede interpretarse como indicación de una elevada demanda de nuevos eritrocitos y un correcto funcionamiento de la médula ósea. Por el contrario cuando la demanda disminuye o la médula ósea falla en sus funciones, la cifra de reticulocitos baja. Según el grado de maduración que posea el reticulocito presentará un modelo de reticulocito distinto, de ovillo denso en el caso de los más inmaduros o de gránulos escasos para los más maduros

PROCEDIMIENTO:

1)

2) La sangre debe ser anticoagulada con EDTA-Na 2 . (Debido a que los Reticulocitos

Se prepara un tubo que ya contenga el colorante (azul brillante de cresilo).

3)

también maduran in vitro, es aconsejable que la sangre utilizada se haya extraído recientemente, como máximo 6 horas antes de su análisis). Añadir 2 gotas de sangre a uno de los tubos ya preparados que contienen 100 ul de colorante. Mezclar e incubar durante 10-15 minutos a 37ºC.

4)

Volver a mezclar la suspensión

5)

Realizar un extendido

6)

Dejar secar al aire

7)

Una vez realizado todo esto observar al microscopio con el objetivo de 100x con aceite de inmersión. En la coloración, los hematíes se tiñen de color verde amarillento y los Reticulocitos se diferencian porque presentan en su interior unos hilos finos de color azul.

presentan en su interior unos hilos finos de color azul. 50 hematíes X= 5 campos Luego
presentan en su interior unos hilos finos de color azul. 50 hematíes X= 5 campos Luego

50 hematíes

X= 5 campos
X= 5 campos

X= 5 campos

Luego se procede a contar los Reticulocitos en 5 campos, por ejemplo:

procede a contar los Reticulocitos en 5 campos, por ejemplo: contar 10 campos homogéneos y luego
procede a contar los Reticulocitos en 5 campos, por ejemplo: contar 10 campos homogéneos y luego
procede a contar los Reticulocitos en 5 campos, por ejemplo: contar 10 campos homogéneos y luego

contar 10 campos homogéneos y luego sacar un promedio y se obtiene así

el porcentaje. Si se utiliza esta técnica conviene moverse aleatoriamente por el preparado buscando zonas de distribución homogénea realizando el recuento cada 2 o 3 campos. Recordar que los campos en los que no se encuentran reticulocitos deben considerarse en el cálculo final. Así por ejemplo para un paciente sano podríamos tener:

También se pueden

2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 2 =

10

1,1 %

Los Reticulocitos pueden expresarse de diferentes maneras:

PORCENTAJE DE RETICULOCITOS:

El porcentaje de Reticulocitos se determina en al menos 1,000 hematíes. El recuento de Reticulocitos se determina multiplicando el porcentaje de Reticulocitos por el recuento de hematíes. Los adultos normales muestran un recuento de Reticulocitos de 0.5 a 2 %. En los recién nacidos, el porcentaje oscila entre 2 a 6%.

VALOR ABSOLUTO:

Se expresa como Nº de Reticulocitos/mm 3 . Para adultos, el valor de referencia se sitúa entre 40.000 – 60.000.

VALOR CORREGIDO I:

Si se expresan los Reticulocitos en porcentaje van referidos a la concentración normal de eritrocitos y no tiene en cuenta la salida prematura de Reticulocitos desde la medula ósea, por ello siempre debe corregirse en función de la intensidad de la anemia:

% Ret x Hto paciente (%) Hto normal (%)

VALOR CORREGIDO II:

En condiciones normales los Reticulocitos permanecen 4 días en la medula ósea y tardan de 1-2 días en sangre periférica en madurar; pero si hay anemia, el estimulo eritropoyético compensador disminuye el periodo de maduración intramedular y se alarga en sangre periférica, haciendo que el recuento de Reticulocitos sea falsamente elevado. Esto se conoce como "desviación reticulocitaria" y se observa en el frotis por la aparición de hematíes grandes con un color azulado. Este es el motivo por el cual suele corregirse por el periodo en días que tardan los Reticulocitos en madurar a eritrocitos, y a esto se le llama índice de producción reticulocitaria (IPR).

IPR = Valor corregido I Factor

El factor en condiciones normales es de 1 y aumenta en 0,5 por cada 10% de disminución del Hto.

corregido I Factor El factor en condiciones normales es de 1 y aumenta en 0,5 por

Reticulocitos 100 x – Azul Brillante de Cresilo

TRABAJO PRÁCTICO N° 6

Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs

FUENTE: UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATAFACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS CATEDRA DE ANALISIS CLINICOS I (HEMATOLOGIA)

A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION

a)

Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2 % en salina fresca (véase más abajo el apartado C. Preparación de la suspensión globular al 2%).

b)

Agregar una gota de la suspensión globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti- AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn.

c)

Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A 1 , B y O al 2%

d)

Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.

e)

Leer primero los controles y luego los problemas microscópicamente en visor y macroscópicamente.

f)

Scores de lectura:

+++ un gran aglutinato ++ varios aglutinatos grandes

+

muchos aglutinatos pequeños

pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo - negativo no se observan aglutinatos

B.

TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO

a)

Tomar una muestra de suero libre de hematíes.

b)

En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los siguientes hematíes:

1)

hematíes A conocidos

2)

hematíes B conocidos

3)

hematíes del propio individuo

4)

hematíes O conocidos

c)

Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.

d)

Leer primero los controles y luego los problemas, microscópicamente en visor y macroscópicamente.

C.

PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2%

a)

Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn.

b)

Llenar el tubo con solución fisiológica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto.

c)

Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución fisiológica.

d)

Tomar una gota de culot (50 l) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la suspensión al 2%.

D. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA

a) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota.

b) Agregar una gota de anti-A absorbido y mezclar bien con una varilla de punta fina.

c) Al terminar de mezclar, disparar el cronómetro.

d)

Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto.

Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados:

 

Anti A

Anti B

Anti AB

Grupo ABO

Glóbulos

rojos

+

-

+

A

problema

-

+

+

B

-

-

-

O

+

+

+

AB

 

GR A

GR B

GR AB

Grupo ABO

-

+

+

A

Suero problema

+

-

+

B

+

+

+

O

-

-

-

AB

E. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh

a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn.

b) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra.

c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm.

d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se hará microscópicamente con un visor y macroscópicamente.

e) Proceda de la misma manera con los tubos controles.

E.1 Controles

a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D

b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D

c) Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB.

E.2 Reacciones

Positiva: los hematíes D (Rh o ) positivos permanecerán aglutinados al querer desprender el culot globular.

Negativa: los hematíes (Rh-rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar aglutinación.

F.

PRUEBA PARA DETECTAR D u

Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti –D. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo D u . Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs.

1)

Coloque dos gotas de suero anti –D (Rho) en un tubo de Kahn.

2)

Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en salina.

3)

Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C.

4)

Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Centrifugue y elimine el sobrenadante.

5)

Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana.

6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm, desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se hará macro y microscópicamente.

F.1

Reacciones

Positiva: los hematíes D u (Rho u ) positivos permanecerán aglutinados luego de intentar desprender el culot globular.

Negativa: los hematíes Rh-(rh) y D u (Rho u ) negativos se resuspenderán y no aglutinarán.

F.2

Controles utilizados

Se utilizan tres controles para

1. Probar la bondad del suero

2. Comprobar su especificidad

3. Para seudoaglutinación

Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con el antígeno E(rh”) presente ,dado que, en tales hematíes el factor D(Rho) es mas reactivo.

El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparación del suero). Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda falsear los resultados. El tercer control, es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti –D por suero de persona de grupo sanguíneo AB, se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados.

G. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE

LA PRUEBA DE COOMBS.

G.1 Prueba de Coombs indirecta

1)

Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes de grupo O Rh+ al 2%. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de 1 hora a 37 °C. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%.

2)

Centrifugar, quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica, eliminando completamente el sobrenadante en el último lavado.

3)

Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2

4)

Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.

5)

Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente.

G.2 Prueba de Coombs directa

6)

Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%.

7)

Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2

8)

Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.

9)

Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente.

RECOMENDACIONES:

*es importante realizar con cuidado los sucesivos lavados, la temperatura que sea 37°C, la ultima centrifugación no debe ser enérgica ni más de un minuto. *siempre que una prueba de Coombs directa de negativa de debe dejarla 15-20 minutos a 37°C y luego volver a realizar un corta centrifugación

Anti-A, Anti-B o Anti A,B Monoclonal Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO

SIGNIFICACION CLINICA En el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos altamente reactivos en su superficie. También demostró que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional. Por este motivo, la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los demás ensayos pretransfusionales.

FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes, se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. La ausencia de aglutinación en todos los casos, implica grupo O.

REACTIVOS PROVISTOS

Anti-A,

monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón.

Anti-B

o

Anti-A,B

monoclonal:

reactivos

preparados

a

partir

de

anticuerpos

REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente:

- Solución fisiológica

- Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS)

- Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS)

- Albúmina Bovina 30% de Wiener lab.

INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.

MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera

a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante.

b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido cítrico,

citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (2-10oC). Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la

muestra.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Centrífuga

- Tubos de hemólisis

- Placas

- Palillos mezcladores descartables

PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

PROCEDIMIENTO En las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solución fisiológica, PBS o LISS.

I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una placa

limpia, agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos. Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de

2)

2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. No debe emplearse microscopio.

II- TECNICA EN TUBO (por centrifugación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis, agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%.

III- TECNICA EN TUBO (por sedimentación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de

2)

hemólisis, agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.

3)

Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción positiva.

 

Antisuero

 

Grupo sanguíneo

Anti-A

Anti-B

Anti-

A,B

A

+

-

+

B

-

+

+

0

-

-

-

AB

+

+

+

Variants

débiles

+/-

-

+

del

grupo

A

como Ax

METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones:

- Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido. Por esta razón deben extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros.

- Leucemias u otros desórdenes malignos.

- Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no

idéntico.

- Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los

grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes, compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad.

- Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías, el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica, resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la tipificación. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de estas células con 2 gotas de solución fisiológica. No debe producirse aglutinación.

PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cód. 1443152). Anti-B: frasco x 10 ml (Cód. 1443154). Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. 1443153).

BIBLIOGRAFIA - Moore, S. et al. “Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use”. París, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59.

- Widman, F.K. “Technical Manual”. 9th Edition, Washington, D.C. American Association of

Blood Banks 1985. Chapter 8. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.

Wiener lab.

2000 Rosario - Argentina

Elaborado por:

Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944

2000 - Rosario - Argentina

http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola

Bioquímica Producto Inscripto M.S. Disp. Nº: 1076/89 (Anti-A) Disp. Nº: 1073/89 (Anti-B) Disp. Nº: 1071/89 (Anti-A,B)

Anti-D (Rho) monoclonal Reactivo para la detección de antígeno D (Rho)

SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en

el laboratorio de los anticuerpos anti-D.

Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno, ya sea por transfusión o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido.

Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antígeno

D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO.

FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente, se producirá una aglutinación visible macroscópicamente.

REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos.

REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente:

- Solución fisiológica.

- Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab.

INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar.

PRECAUCIONES

El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.

MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera

a) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes.

b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (ácido cítrico,

citrato, dextrosa),

CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa,

adenina).

c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (2-10oC).

Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

Dependiendo de la técnica que se emplee, podrán ser necesarios:

- Centrífuga

- Tubos de hemólisis

- Placa de vidrio

- Palillos mezcladores descartables

PROCEDIMIENTO I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos, o solución fisiológica. También puede emplearse sangre entera.

1)

Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia.

2)

Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.

3)

Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.

II- TECNICA EN TUBO

Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos, o en solución fisiológica.

1)

Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis.

2)

Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.

3)

Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm.

4)

Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o

ausencia de aglutinación. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos, luego centrifugar y volver a leer como se describió en 4). Las muestras que aún en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du.

III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos, o solución fisiológica.

1)

Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis.

2)

Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.

3)

Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos.

4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica, descartando perfectamente el

5)

sobrenadante y resuspender las células luego de cada lavado. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico), mezclar, centrifugar 20 segundos

6)

a 3500 rpm. Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos sensibilizados. Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-

50oC.

PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. 1443155).

BIBLIOGRAFIA

- Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940.

- Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959.

- Widman, F.K. - “Technical Manual” - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of

Blood Banks, Chapter 9, 1985.

- Race , R.R. and Sanger, R. - “Blood Groups in Man” - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific

Publications, pág. 178, 1975.

Wiener lab.

2000 Rosario - Argentina

Elaborado por:

Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944

2000 - Rosario - Argentina

http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S. Disp. Nº: 1074/89

Suero Anti-humano (poliespecífico)

Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta

SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a antígenos del sistema Rh. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica, siendo empleadas actualmente en los siguientes casos:

Prueba Antiglobulina Indirecta

- Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos.

- Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión.

- Fenotipo de glóbulos rojos.

- Identificación y titulación de anticuerpos encontrados en suero o eluatos.

Prueba Antiglobulina Directa

- Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido.

- Investigación de reacciones dudosas en una transfusión.

- Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glóbulos rojos.

FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinación de los glóbulos rojos visible macroscópicamente.

REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3.

REACTIVOS NO PROVISTOS

- Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos.

De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente:

- Solución fisiológica.

- Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS).

- Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS).

INSTRUCCIONES PARA SU USO

Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar.

PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminación del mismo.

MUESTRA

Glóbulos rojos

a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante.

b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido cítrico,

citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (2-10oC). Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extracción). Si los glóbulos provienen de coágulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Centrífuga

- Baño de agua a 37oC

- Tubos de hemólisis

PROCEDIMIENTO I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal).

1)

En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar.

2)

Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y

3)

resuspendidos en PBS. Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.

4)

Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el

sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente el sobrenadante luego del último lavado. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. Mezclar

perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm. Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente. Tener en cuenta que

6)

agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles. 7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados con IgG débiles.

II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica). El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos.

Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%.

1)

Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar.

2)

Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS.

3)

Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua.

Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I).

III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos.

1)

Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%.

2)

En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7) de la técnica I).

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas:

- Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba.

- Lavado inadecuado de las células.

- Tiempo o temperatura de incubación inadecuados.

- Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados.

- Concentración inadecuada de glóbulos rojos.

- Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados.

Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen.

PRESENTACION

Frasco x 10 ml (Cód. 1443156).

BIBLIOGRAFIA - Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945. - Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945. - Widman, F.K. - “Technical Manual”. 9th ed. Washington D.C. American Association of Blood Banks, pág. 376, 1985.

Wiener lab.

2000 Rosario - Argentina

Elaborado por:

Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944

2000 - Rosario - Argentina

http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S.

Disp. Nº: 2503/91

Determinación de anticuerpos inmunes

A. TITULACIÓN DE ANTICUERPOS

A.1 Técnica básica de titulación

A.1.1. Preparación de diluciones madres.

a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario).

b) En los tubos 2 al 10, colocar 0,100 ml de solución fisiológica (SF). Colocar 0,300 ml de suero a titular en el tubo N°1.

c) Tomar 0,100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2.

d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Luego se toman 0,100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. Homogeneizar y repetir la operación hasta completar las diluciones.

A.1.2 Titulación

a) Se toman 10 tubos de Kahn, numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. Con una pipeta Pasteur para cada dilución, colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos.

b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%. Agitar la mezcla.

c) Incubar a la temperatura apropiada, el tiempo requerido.

d) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del suero.

e) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilución. El grado de aglutinación se considerará según los scores anteriormente indicados.

El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación . Si en la última dilución, con aglutinación, el tipo de aglutinato es tr, el título se determinará promediando dicha

dilución con la precedente. Por ejemplo, si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16, el tipo de aglutinato es tr, el título será (16+8)/2=12.

a) Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de hematíes a usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes.

b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O con dos gotas del suero a titular.

TRABAJO PRÁCTICO N° 7

SEPARACION ELECTROFORETICA DE HEMOGLOBINAS

Fundamentos La electroforesis consiste en la separación de partículas aprovechando su traslado mediante la aplicación de campos eléctricos. La capacidad de movimiento de las diferentes moléculas depende de la intensidad del campo aplicado, su carga y su peso molecular. La hemoglobina, proteína presente en los glóbulos rojos, tiene varias formas moleculares, algunas normales y otras anormales. El proceso de electroforesis aprovecha el hecho de que las diferentes hemoglobinas migran a diferentes velocidades, permitiendo así su separación. En acetato de celulosa, a pH alcalino, la HbA migra hacia el ánodo, mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades) queda cercana a esta. La HbA 2 tiene una velocidad menor por lo que queda cerca del cátodo. Durante la electroforesis, una corriente eléctrica pasa a través de la muestra de sangre de una persona, lo cual hace que los tipos de hemoglobina se separen en diferentes momentos y formen bandas. Al comparar la forma en la que se separan con la de una muestra de sangre normal, se pueden ver los tipos y las cantidades de hemoglobina existentes en la muestra de sangre. Entre sus ventajas están, que constituye una microtécnica y el costo en reactivos y tiempo laboral es muy bajo; además mediante esta técnica pueden diferenciarse con precisión la presencia de las hemoglobinas A, S y C.

Soporte: Acetato de celulosa gelatinizado, en medio alcalino (pH= 8,5).

Las tiras deben conservarse en posición vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%.

Las tiras secas pierden las dimensiones y las características del gel.

La

superficie de las tiras que es penetrable a las proteínas se reconoce porque es más

opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro.

Reactivos

Solución buffer:

Tris-(hidroximetil)-amino etano

10,2

g

EDTA di sódico.……………………

0,6

g

Ácido Bórico.………………………………………3, 2 g Agua Destilada………………………………….1000ml

Solución colorante:

Amido Schwartz (0,5 g Amido Schwartz / 45 ml alcohol metílico / 10

ml ácido acético / 45 ml agua destilada)

Solución decolorante:

Ácido acético 5%. Ácido acético: metanol (1+9).

Solución deshidratante:

Metanol puro.

Solución de transparentización (preparar en el momento) :

Metanol

Ácido acético

85

ml

14

ml

Glicerol

1

ml

Solución disolvente: Ácido acético 80%

Preparación de solución de hemoglobina

Puede utilizarse sangre fresca con cualquier anticoagulante (EDTA di sódico).

Centrifugar la sangre a 3000rpm durante 10 min en tubo de centrifuga cónico.

Separar por aspiración el plasma sobrenadante y la capa de blancos y plaquetas.

Lavar los glóbulos rojos 3 veces con solución fisiológica 5 min.

Centrifugar cada vez a 3000 rpm.

El último centrifugado dejarlo 15 min.

Separar el sobrenadante.

Agregar a los GR igual volumen de agua destilada.

Mezclar bien por inversión con tapón.

Dejar reposar 10 min.

Agregar un volumen de tetracloruro de carbono igual a la mitad del volumen de GR.

Agitar enérgicamente 5 a 10 min.

Dejar reposar 30 min.

Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min.

Aspirar la solución límpida de Hb q queda en la parte superior del tubo.

Se determina la concentración de hemoglobina en el hemolizado obtenido, mediante el método de la cianometahemoglobina, se lleva la concentración hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada.

Esta solución de Hb debe procesarse inmediatamente si se sospecha de hemoglobina H. de no ser así puede conservase una semana a -20 °C.

Técnica

1.

Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos.

2.

Eliminar el exceso de líquido secando entre 2 papeles de filtro (suavemente).

3.

Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética. La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba. La tira debe estar bien tiesa y plana. Operar rápidamente para evitar evaporaciones.

4.

Sembrar las muestras: hemolizado obtenido siguiendo la técnica expuesta en el presente trabajo.

5.

Conectar la fuente de poder, realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts, durante 60 minutos.

6.

Desconectar la corriente y retirar las tiras.

7.

Colorear durante 5 minutos.

8.

Decolorar de la siguiente manera:

- 5 minutos en AcH al 5%.

- 5 minutos en AcH al 5%.

- 5 minutos en AcH: metanol (1+9).

9.

Determinación cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solución disolvente y agitar. Leer a 630 nm. si se usó colorante Amido Schwartz.

10.

Transparentización: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos, a continuación se las coloca en la solución transparentizadora durante 1 minuto como mínimo. Se colocan luego en una placa de vidrio, eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos, hasta la transparencia completa. Así se conserva para leer en densitometría.

El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatías

TIPO

Polo negativo

 

Polo positivo

 

ACLARACIONES

Normal

 

HbA

98%

 

Anhidrasas

Carbónicas

HbA 2

HbA

HbA

HbA 2 2%

Recién nacido

 

Anhidrasas HbA 2 Carbónicas

 
HbF HbA

HbF HbA

HbF Aprox 90%

HbA 10% HbA 2 1%

Drepanocitosis

   
Drepanocitosis       HbA 2 2%
 

HbA 2 2%

homocigota

 

Anhidrasas HbA 2 Hb S Carbónicas

HbS 98%

Drepanocitosis

   
Drepanocitosis           HbA < 50% HbS > 50% HbA 2 2%
     

HbA < 50% HbS > 50% HbA 2 2%

heterocigota

 

Anhidrasas HbA 2 Hb S Carbónicas

HbA

 

Hemoglobinopatía C homocigota

         

HbC 98%

Anhidrasas

HbC

HbA 2 2%

 

carbónicas

 

Hemoglobinopatía C heterocigota

 
Hemoglobinopatía C heterocigota     HbC > 50%