Aislacin y secuenciacin de microorganismos

Taller de Bioingenera

Nicols Caballero

Durante el Taller de bioingenera se trabaj en la unidad de microorganismos con muestras aisladas de suelos agrcolas y no agrcolas que haban sido tratadas o no con productos herbicidas. En el caso presente, se trabaj con colonias capaces aisladas de un suelo agrcola capaces de metabolizar el compuesto aromtico contaminante 2,4-D. Las colonias eran capaces de proliferar en el medio de cultivo y ocupar como fuente de carbono y energa principal este herbicida.

Posterior a la aislacin de estos sistemas biolgicos, se comprob su existencia del gen 16S mediante aislacon del DNA y posterior electroforesis y PCR con los partidores
8F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1392R: 5'-ACGGGCGGTGTGTAC-3'
Este gen es caracterstico a todos los grupos bacterianos debido que codifica para el rRNA (RNA ribosomal) y es una caracterstica filognetica que permite separar a los seres vivos en tres grandes dominios Eukarya, Bacteria y Archaea. Con el PCR realizado, se pudo identificar que las colonias aisladas si pertenecan a un grupo bacteriano, y con el producto de PCR se realiz una transformacin mediante la adicin de este gen a un plasmidio que fue insertado a bacterias E.Coli. Esto se realiz para conservar el material gentico para su posterior anlisis y secuenciacin. Al insertar material gentico en un plasmidio, se puede comprobar mediante genes marcadores la eficacia de la transformacin, y con esto aislar una colonia que contiene la transformacin. Es as como se puede conservar indefinidamente el gen obtenido y amplificado por PCR debido a que este plasmidio se replica como el material gentico genmico del organismo y la conservacin de la bacteria en s es simple y de rpida y fcil reproduccin. La secuenciacin es obtenida mediante los partidores M13 Forward y Reverse, partidores especficos al plasmidio insertado a la E.Coli. Las colonias transformantes fueron enviadas a USA para su posterior secuenciacin del gen 16S obtenido, permitiendo al alumno analizar la secuencia mediante el software BLAST y comprobar de qu organismo especfico se trataba. Las secuencias son las siguientes: Nicols M13Forward 1401 (Nucleotidos)

GGGATACTCCTTATAGGGCGAATTGGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGC GGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTACGGGCGGTGTG TACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTA GCGATTCCAGCTTCACGTAGTCGAGTTGCAGACTACGATCCGGACTACGA TGCGTTTTCTGGGATTGGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCTCTGTACG CACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCATGAGGACTTG ACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCTCTAGAGTG CCCTTTCGTAGCAACTAGAGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC

CCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCCA CTTTCCCTTTCGGGCACCTAATGCATCTCTGCTTCGTTAGTGGCATGTCA AGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCAC CGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGT ACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTGAAGAAATGA ATCCCCAACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATC TAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTCATGTCCC AGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCAC TGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGACACACTCTAGCCTTGCAGTC ACAAGCGCCATTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACGCCTGTCTTACAA AACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACC CTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTC CGGTACCGTCATCCCCCCACCGTATTAGGGCCAGGGTTTTCTTTCCGGAC AAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGG GATCAGGGTTGCCCCCATTGGCCAAAATTCCCCACTGGTGCCTCCCGTAA GAATCTGGGGCCGGGGCTCAGTCCCAGTGGGGCTGAACGTCCTCTCAAAC CAGGTACTGGTTGGTCCCCTTGGGTAAGGTCTTACCCCACCAACTAGGTA AACAGAAATCGGGCGGTCCTATCGGCGGGGGCGGTACCGGGCCCCCCTTT TCCCCCCAGGGGGGATGGGGGGTTAGGTAATCTTTTCACTAATTATCCCC CCGAAAGGGGCAGGTTCGATGGTTAATTACCCGTTGCCATTTCCCCAGGG G Nicolas M13 Reverse 977 (Nucleotidos)

CGAATCCCCTGGGTACGAGCTCGGATCCCTAGTAACGGCCGCCAGTGTGC TGGAATTCGCCCTTAGAGTTTGATCCCGGTTCAGATTGAACGCTGGCGGC ATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGCTTCGGCCTGGTGGC GAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTCGTGGGGGA TAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGC GGGGGACCGGTAACGGCCTCGCGCGATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAG CTAGTTGGTGGGGTAAGAGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTG AGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAA TGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGA AAGAAAACCCTGGCCCTAATACGGTGGGGGGATGACGGTACCGGAAGAAT AAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGA GCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAG ACAGGCGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCA AGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAAT GCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACAT GACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTC TTCAGTAACGTACCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCG CAAGATTAAAACTCATAGGAATTGACG

Mediante la utilizacin del programa Blast para nucletidos, se observan los siguientes resultados en el anlisis de las secuencias:

M13 Forward

M13 Reverse

Donde la mxima identidad, de un 99% se encuentra con el partidor M13 Reverse y corresponde a la cepa Ralstonia Eutropha JMP134, otro nombre que esta recibe es Cupriavidus pinatubonensis. Segn MicrobeWiki, la bacteria se clasifica de la siguiente manera Dominio: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase: Betaprotobacteria Orden: Burkholdeliares Familia: Burkholdeliaceae Gnero: Cupriavidus/Ralstonia/Wautersia Especies y Cepas 1. Cupriavidus necator 2. Wautersia eutropha 3. Ralstonia eutropha Ralstonia eutropha JMP134 Ralstonia eutropha H850 Ralstonia eutropha H16

Figura 1. Fotografa microscpica de la bacteria Ralstonia eutropha.

La bacteria es una gram negativa, proveniente tanto de suelos como del agua y se comenta su gran potencial para biorremediacin pues tiene la capacidad de degradar distintos compuestos aromticos contaminantes. La cepa Ralstonia eutropha JMP134 fue aislada gracias a su capacidad de degradar el compuesto contaminante herbicida cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D). Actualmente, se ocupa esta bacteria como tema de estudio para la produccin de polihidroxialcanatos o PHA, que son polisteres lineales producidos en la fermentacin bacteriana de azcar o lpidos. Estos polmeros se ocupan como plsticos biodegradables. Esto adems de las investigaciones respectivas debido a su accin quimiolitoautotrfica al degradar distintos compuestos clorados. Una nueva aplicacin que se est investigando sobre esta cepa es la capacidad que tiene adems, su capacidad de proliferar en medios hidrogenados, que puede tener futuras aplicaciones en la nueva industria de biotecnologa basada en hidrogeno para producir distintos productos comerciales como polmeros y metabolitos.