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8 LABORATORIO DE GENETICA
Dra. Carmen Ada Martnez
fue la ciencia que busc comprender estos procesos. Sin embargo debi pasar mucho tiempo para que se descubrieran los cromosomas en 1950, posteriormente con la introduccin de la tecnologa
del ADN fue posible conocer cada vez ms acerca del ADN y sus funciones. Por ello es que el desarrollo de nuestro conocimiento del ADN, los genes y sus funciones ha ido de la mano de la explosin tecnolgica para el anlisis clnico del ADN y ARN. El esfuerzo ms grande para conocer el genoma humano completo (denominado Proyecto del Genoma Humano) fue posible gracias a diversas tcnicas: en primer lugar, el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin, que permiti la diseccin de enormes molculas de ADN en fragmentos definidos. En segundo lugar, el desarrollo de las tcnicas de clonacin, que proporcionaron un mecanismo de amplificacin de secuencias de nucletidos especficas. Y por ltimo, la capacidad para sintetizar
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sondas especficas, que permitieron la identificacin y manipulacin de secuencias de nucletidos de inters. Estos enfoques experimentales y otros han permitido la identificacin de secuencias de nucletidos normales y mutantes en el ADN, y su conocimiento ha llevado al desarrollo de mtodos para el diagnstico prenatal de enfermedades genticas y a xitos iniciales en el tratamiento de pacientes mediante terapia gnica. La descripcin completa de todos los procesos est fuera del alcance de este documento, si bien examinaremos los que sern observados en la prctica de laboratorio.
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TECNICAS DE LABORATORIO USADAS EN GENETICA slo al ADN contenido en el ncleo, organizado en cromosomas. Pero no debemos olvidar que tambin la mitocondria contiene genes llamado genoma mitocondrial. El genoma humano est organizado en 46 cromosomas que constan de 22 pares de cromosomas autosmicos (que estn presentes en ambos sexos) y los cromosomas X y Y, que determinan el sexo. Un juego de cromosomas autosmicos procede de cada progenitor. Un cromosoma X procede de la madre, mientras que el otro cromosoma X, o el cromosoma Y, proceden del padre. Los cromosomas autosmicos se numeran en funcin de su tamao, de modo que el 1 es el ms grande. Cada cromosoma contiene genes entremezclados y a menudo con regiones grandes de ADN que no codifican protenas. La mayora de los genes de los mamferos constan de varios exones, que son las porciones que, a la larga, constituyen el ARNm maduro, y de intrones, que separan los exones y que son eliminados del transcrito primario mediante corte y empalme. Sorprendentemente, los clculos ms actualizados demuestran que los 3.000 millones de pares de bases que conforman el genoma humano solo albergan entre 20,000 y 25,000 genes codificadores de protenas.
No obstante, las clulas de los mamferos utilizan mtodos de corte y empalme alternativos, as como promotores gnicos alternativos para generar de 4 a 6 ARNm diferentes a partir de un solo gen, por lo que el nmero de ARNm codificadores de protenas, o transcriptoma, puede llegar a 100,000. Esta complejidad se amplifica an ms a nivel proteico gracias a las modificaciones postraduccionales y a la protelisis
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dirigida, que podran generar entre 500,000-1,000,000 de entidades proteicas funcionalmente diferentes, que constituyen el proteoma. Se calcula que entre un 10-15% de estas protenas actan en el metabolismo, en lo que, colectivamente, se conoce como procesos generadores de energa y los bloques de bajo peso molecular para la construccin celular, como aminocidos, cidos grasos y azcares. Tambin se incluyen los procesos que convierten las sustancias exgenas, como frmacos o sustancias qumicas ambientales. Se describen aproximadamente 2,500 metabolitos, que son el objeto de estudio del metaboloma, aunque se desconoce el tamao real. Este aumenta con el nmero de sustancias ambientales al que se ve expuesto un organismo.
TECNICAS DE EXPLORACIN DEL ADN En el proceso de anlisis del ADN, se estudian las regiones polimrficas del ADN, de esta manera se comparan los genes biolgicos entre dos individuos. En cada gen humano, se encuentran fragmentos llamados locus y marcadores genticos que son examinados por los cientficos para detectar el patrn hereditario del gen. Anteriormente, la manera de estudiar los marcadores genticos en el anlisis de ADN (examen de ADN), era mediante la tcnica de hibridacin con sondas, pero este mtodo requera grandes cantidades de ADN y que no estuviera degradado. El avance en gentica ha permitido, mediante el mtodo por reaccin en cadena de polimerasa (PCR), la extraccin de ADN incluso desde cantidades mnima. Las estructuras de ADN se pueden extraer a travs de muestras de piel, uas, pelo, sangre, etc. Actualmente, utilizando laboratorios de alta tecnologa, el anlisis de ADN se puede realizar desde muestras muy pequeas. Una vez recibidas las muestras en el laboratorio, el proceso de anlisis se realiza inmediatamente. El procedimiento consiste en: 1. Extraccin y purificacin del ADN 2. Cuantificacin 3. Amplificacin del ADN por PCR 4. Separacin de las molculas
5. Anlisis
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PROCEDIMIENTO
En PCR, el cido desoxirribonucleico (ADN) es el analito. Por tanto, una buena muestra implica siempre un correcto proceso de obtencin de esta molcula a partir de material biolgico. La extraccin de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificacin, que implica la retirada de la solucin final de la mayora de elementos que pueden interferir en la PCR. La extraccin del ADN de las clulas o virus donde se halla confinado es un paso previo en muchos procedimientos analticos y diagnsticos.
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Cuantificacin:
Posterior a la extraccin de ADN se realiza la cuantificacin de ADN, es decir mesurar la cantidad de ADN aislado y valorar en qu estado se encuentra (completo o roto). Uno de los mtodos ms utilizados para la cuantificacin del ADN es el anlisis de la absorcin UV, ya que los nucletidos poseen mximos de absorcin alrededor de 260 nm (por ejemplo, dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247 nm). Este mtodo proporciona una estimacin simple y precisa de la concentracin de una muestra. Se considera una muestra adecuada entre 50-200 ng/l.
Amplificacin del ADN o tambin conocido como anlisis por reaccin en cadena de polimerasa (PCR):
Esta tcnica se utiliza para ampliar un fragmento de ADN, es muy til en caso de no tener suficiente muestra de ADN, en ese caso, se hacen copias de los marcadores del mismo ADN para proceder a estudiarlo (es posible amplificarlo hasta un milln de veces). De manera general, la cantidad ptima de ADN est en torno a los 5 ng, siempre y cuando se conozca una parte de la secuencia de los nucletidos. El proceso consiste en varias fases de altas y bajas temperaturas alternadas mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin. En estos tubos, se pone el ADN original junto con una mezcla que contiene nucletidos, polimerasa e iniciadores (conocido ms en ingls comoprimers). Los iniciadores o primers, son molculas de ADN sintetizadas de forma qumica que se adhieren a la plantilla del ADN, permitiendo reconocer la zona variable y propiciando el inicio de la reaccin de repeticin. Los nucletidos y polimerasa permiten la extensin y multiplicacin de la cadena de ADN.
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puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte slido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre). Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa. La electroforesis se usa en una gran mayora en los fragmentos del ADN amplificado por PCR, Se utiliza comnmente para el anlisis de
mezclas de protenas o de cidos nucleicos, como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la protena. Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida.
Anlisis:
Los fragmentos amplificados por PCR se corrieron en la electroforesis. Las molculas de DNA grandes viajan despacio a travs del gel, mientras que las molculas pequeas viajan ms aprisa. El gel est orientado de modo que las bandas ms lentas (molculas mayores) estn arriba. Se coloca en el primer carril de la derecha un conjunto de patrones de DNA, obtenidos por digestin de una molcula grande de DNA (49 kb) con una enzima de restriccin. Se conoce el tamao de todos estos fragmentos, y se ha anotado junto al gel. Se comparando los fragmentos desconocidos de la primera calle con estos patrones, pudiendo determinar el
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TECNICAS DE LABORATORIO USADAS EN GENETICA tamao de los fragmentos desconocidos y compararlos con varias muestras.
APLICACIONES
1. Secuenciacin Una de las razones ms comunes para el uso de la PCR es la formacin de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciacin. Es mucho ms sencillo y rpido que la clonacin en clulas. 2. Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir rboles filogenticos. El PCR tambin se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. 3. Huellas dactilares del ADN. Mediante esta tcnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta tcnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biolgicas, como sangre, semen, piel o cabellos. Tambin se utiliza en las pruebas de paternidad.
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situ Fluorescente (FISH). Comparada con la determinacin convencional del cariotipo, la tcnica de FISH es ms sensible, y no necesita clulas en metafases, aunque como inconveniente cabra sealar que detecta nicamente la alteracin especfica que buscamos. Por lo tanto, es un complemento adecuado cuando no se ha podido disponer del cariotipo (por ausencia de metafases) o bien ste es muy complejo (caso de algunos tumores). El inters de esta tcnica consiste en que permite diagnosticar alteraciones cromosmicas o gnicas indetectables mediante la citogentica convencional, o hacerlo de manera ms rpida.
CARIOTIPO
El anlisis espectral de los cariotipos (o SKY) se trata de una tecnologa de citogentica molecular que permite el estudio y visualizacin de los 23 pares de cromosomas en forma simultnea.
Sondas marcadas fluorescentemente son hechas para cada cromosoma al marcar DNA especfico de cada cromosoma con diferentes fluorforos. Debido a que hay un limitado nmero de fluorforos espectralmente distintos, un mtodo de etiquetado combinatorio es usado para generar muchos colores diferentes. Las diferencias espectrales generadas por el etiquetado combinatorio son capturadas y analizadas usando un interfermetro agregado a un microscopio de fluorescencia. El programa de procesamiento de imgenes entonces asigna un pseudocolor a cada combinacin espectralmente diferente, permitiendo la visualizacin de cromosomas coloreados.4 Esta tcnica es usada para identificar aberraciones estructurales cromosmicas en clulas cancergenas y otras patologas cuando el bandeo con Giemsa u otras tcnicas no son lo suficientemente precisas. Este tipo de tcnicas mejorar la identificacin y diagnstico de las aberraciones cromosmicas en citogentica prenatal as como en clulas cancerosas.
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INMUNOHISTOQUMICA
La inmunohistoqumica es un procedimiento histopatolgico que se basa en la utilizacin de un anticuerpo especfico, previamente marcado mediante un enlace qumico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antgeno, aplicado a una muestra de tejido orgnico, correctamente fijada e incluida en parafina. Con la utilizacin de alguna de las tcnicas especficas (peroxidasa, antiperoxidasa, fluorescena, etc.), el complejo antgeno - anticuerpo as formado puede localizarse e identificarse en las muestras tisulares o citolgicas a estudiar, con lo que se identifican los marcadores antignicos caractersticos de distintas lneas de diferenciacin y funcionalismo celular y se determina el tipo de clula involucrado en la muestra. Esto puede utilizarse para localizar una protena de inters.
GLOSARIO
Realice su glosario con los trminos con la letra en color celeste y con aquellos que desconozca.
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Caso forense:
Un caso de violacin llega a juicio y en el proceso la vctima no puede reconocer a su agresor, y el abogado defensor del sospechoso asegura que a su defendido se le est acusando sin evidencia. Sin embargo al momento de su arresto se le encontr con la ropa ensangrentada a lo cual el argumento que era suya pues se haba cortado trabajando. Se analiz la sangre encontrada en su ropa y se compar con la de la vctima y con la propia.
Anlisis forense: La imagen a la par es una fotografa de la electroforesis de la prueba de ADN que se le realiz a la ropa del sospechoso. Comentario: Despus de la extraccin del ADN de las manchas de sangre se purific y se cuantific, como la muestra era muy escasa se amplific con la tcnica de PCR, posteriormente se corri la electroforesis donde se evidenci que ADN de la sangre encontrada en la ropa corresponda con los patrones de banda del ADN de la vctima.
E= Escala allica (referencia) V=Perfil Victima S=Perfil sospechoso m= Mancha de sangre en el sospechoso
Lecturas recomendadas:
1. Baynes J. y Dominiczak M. (2011) Bioqumica Mdica. 3era. Edicin. Editorial Elsevier Mosby. 2. Jorde L. et. al. (2009) Gentica Mdica. 3era Edicin. Editorial Elsevier 3. Harvey R. y Ferrier D. (2011) Bioqumica. 5ta Edicin. Editorial Lippincott. 4. Turnpenny P y Ellard S (200). Elementos de Gentica Mdica. 13 Edicin. Editorial Elsevier.
Pginas Web:
1. http://www.microbialsystems.com 2. http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp5.pdf 3. http://es.wikipedia.org/wiki/Gentica
4. http://www.easydna.es/dnanews.php/analisis-adn
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