Fermentacin alcohlica La Fermentacin Alcohlica

Felipe Laurie Facultad de Ciencias Agrarias Universidad de Talca

Levaduras

C6H12O6
pm 180

2CH3CH2OH + 2CO2
pm 46

Primera decisin

Manejo de las fermentaciones

Inocular o no inocular?

Orgenes de Saccharomyces
Flora de la via Flora de la bodega Inculo

Fermentaciones con inculo

Levadura seca activa Cultivo lquido en el jugo Pie de cuba Nivel: 105 a 106 clulas/mL

Fermentaciones con flora nativa

No hay inoculacin deliberada con saccharomyces Beneficios? Perjuicios?

Beneficios de la inoculacin
Fermentacin predecible Menor probabilidad de defectos Neutralidad aromtica

Perjuicios de la inoculacin
Fermentacin muy rpida Menor complejidad Mucho aroma a levadura

Segunda decisin

Promover o reprimir flora de la uva?

Flora de la uva
Bacterias:
Bacillus Pseudomonas Micrococcus Bacterias lcticas Bacterias acticas

Flora de la uva
Bacterias: Hongos
Aspergillus Penicillium Rhizopus Mucor Botrytis

Hongos Levaduras

Levaduras

Flora de la uva
Bacterias: Hongos Levaduras
Kloeckera/hanseniaspora Metschnikowia pulcherrima Hansenula species Candida species Saccharomyces

Microflora de la baya
95 a 98 % de los microorganismos son bacterias y hongos 2 a 5 % son levaduras (principalmente del gnero Hanseniaspora and Metschnikowia Levaduras no Saccharomyces presentes a 105-106 organismos/mL, mientras que Saccharomyces: 102-103 clulas/mL

Factores que afectan la microflora de la baya

Lluvia Temperatura Insectos vectores Altitud Pesticidas en la via Variedad de uva (Ej. racimos cerrados) Etc.

Factores que afectan la persistencia de microflora en mosto/jugo

pH (<3.5 inhibe bacterias, no levaduras) Temperatura (baja temp inhibe bacterias y selecciona para levaduras no saccharomyces) Oxgeno (Falta de oxgeno inhibe hongos y bacterias aerbicas. Es estimulatorio para levaduras).

Factores que afectan la persistencia de microflora en mosto/jugo

Nutrientes (Composicin del mosto/jugo, correcciones, tiempo de adicin). Presencia de inhibidores (Fungicidas del campo y SO2).

Factores que afectan la persistencia de microflora en mosto/jugo

Prcticas de inoculacin (inoculacin temprana con dosis altas) Prcticas de bodega (sanitizacin, SO2, nutrientes, temperatura de fermentacin, etc.)

Interacciones microbianas (produccin de inhibidores, competencia x nutrientes, estimulacin).

Para promover fermentaciones con levaduras nativas

No inocular con Sacchamoryces Agregar nutrientes temprano (molienda) Mantener el mosto/jugo a bajas temperaturas No muy bajo SO2 Ajustar pH

Para reprimir fermentaciones con levaduras nativas

Adicin de SO2 temprana Inoculacin temprana con Sacchamomyces Dosis alta de Saccharomyces Agregar nutrientes despus del establecimiento de Sacchamomyces Evite incubaciones a bajas temps.

Monitoreo de:
Consumo de azcar Disponibilidad/consumo de nitrgeno Flora microbiana Actividad microbiana Cambios en acidez

Monitoreo de fermentacin

Cinetica de fermentacion Crmnere 2007

30 1110

Monitoreo de consumo de azcares:

Densmetros Evolucin de CO2 Prdida de glucosa/fructosa Evolucin del etanol Cambios de temperatura

25

1090

20 Temperatura C

1070 Densidad gr/l

15

1050

10

1030

1010

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Das de fermentacin Temperatuta Densidad

990

Monitoreo de niveles de nitrgeno:

Aminocidos Nitrgeno fcilmente asimilable NOPA (N por OPA)

Monitoreo de flora microbiana:

Observaciones al microscopio Conteos totales Evaluacin cualitativa Siembra (conteo en platos) Conteos totales viables Medios de cultivo diferenciales

Monitoreo de la actividad microbiana:

Acidez voltil Vinyl fenoles Ac. sulfhdrico Evaluacin olfativa

Monitoreo de cambios en acidez:

Acidez titulable pH Anlisis de cidos
Cromatografa Electroforesis capilar Mtodos enzimticos Etc.

Estrategia de monitoreo
Tiempo (oportunidad) Nmero de veces Costo Es toda esta informacin necesaria?

Temperatura de fermentacin

Alta temperatura
Alta tasa de fermentacin Reprime diversidad de flora Mejora extraccin (tintos) Mayor prdida de aromas por volatilizacin Aumenta riesgo de paralizacin de fermentacin

Baja temperatura
Favorece flora no Saccharomyces Mejor retencin de voltiles Tasa de fermentacin ms lenta

Ecologa de levaduras
Levadura = Hongo unicelular
Requiere fuente de carbono y nitrgeno No mvil Reproduccin vegetativa (gemacin y fisin) Reproduccin sexual en algunas especies (meiosis) Hetertrofos

Biologa de Levaduras

Ecologa de levaduras
Levadura = Hongo unicelular
Ascomicetes y basidiomicetes Saccharomyces cerevisiae : Primer genoma eucaritico secuenciado

Ecologa de levaduras
Anamorfos : Forma asexual de especies con reproduccin sexual. Ej. Brettanomyces Teleomorfos: Estado de reproduccin sexual. Ej. Dekkera

www.biochem.wisc.edu/

www.whatischurch.com

www.mansfield.ohio-state.edu/

Monopolar, multipolar, bipolar

Esporulacin
Asca

La fermentacin alcohlica: Biologa de levaduras

Espora Clulas vegetativa 2N 4 x 1N

Fermentacin alcohlica
Conversin microbiolgica de azcares de la uva (glucosa y fructosa) a etanol. En trminos genricos: Se produce fermentacin cuando un compuesto orgnico sirve como aceptor terminal de electrones.

Fermentacin alcohlica
Conducida por las levaduras:
Saccharomyces cerevisiae, o Saccharomyces bayanus

Saccharomyces
Eukariote: Posee una membrana nuclear
Ncleo Retculo endoplasmtico

Saccharomyces
No mviles

El ncleo est rodeado por una doble membrana. La membrana externa es contigua al retculo endoplasmtico

Gluclisis
Reacciones bioqumicas de conversin de hexosas (6 C) a compuesto tricarbonado (piruvato) con emisin de energa almacenada en la forma de ATP

Gluclisis
Glucosa + 2 ATP + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi

2 Piruvato + 4 ATP + 2 NADH + calor

Gluclisis

glucosa glucosa-6-fosfato fructosa-6-fosfato fructosa 1,6-difosfato

ATP

fructosa

Gluclisis
Consume 2 ATP Produce 4 ATP

ATP

dihidroxiacetona fosfato

gliceraldehido 3-fosfato 1,3 -difosfoglicerato 3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato fosfoenolpiruvato ATP piruvato ATP

NAD+ NADH

Produccin neta: 2 molculas de ATP

Formacin del etanol

Los productos terminales de la gluclisis son: Piruvato y NADH (cofactor reductor) Las levaduras regeneran el NAD+ transfiriendo una molcula de hidrgeno (electrn) al acetaldehdo

Formacin del etanol

CH3-CO-COOH
Piruvato

CO2 + CH3-CHO
H+

Acetaldehdo

NADH NAD+

CH3-CH2OH

Distribucin de Carbn al final de la fermentacin

Otros microorganismos usan distintas estrategias para regenerar NAD+, produciendo una amplia variedad de productos distintos al etanol. Etanol + CO2 = 95% Nuevas clulas = 1 % Otros productos terminales = 4%
Piruvato Acetato Acetaldehdo Glicerol Lactato

Fermentacin
1M glucose (fructose) 2 M CO2 + 2 M ethanol

Seleccin y nutricin de levaduras

Levaduras convierten azcares a etanol incluso en presencia de oxgeno

Eleccin de levaduras
Trmino de fermentacin ( a sequedad) Buena tasa de fermentacin Tolerancia a etanol Tolerancia a temperatura SO2 tolerancia

Eleccin de levaduras
Baja produccin de aromas/sabores no deseados
Voltiles de azufre cido actico Etilcarbamato

Baja inhibicin de otros microorganismos deseados Resistencia a factor killer Produccin de aromas deseados

Nutricin de levaduras
Macro nutrientes: Necesarios para la formacin de nuevo material celular Micro nutrientes: Catalizadores de rx bioqumicas

Macro Nutrientes
Carbn/fuentes de energa: Glucosa, fructosa, sacarosa, y sustratos oxidativos (piruvato, glicerol, etanol, etc.) Fuentes de nitrgeno: aminoacidos, amonia, bases nucleotdicas, pptidos Fuentes fosfatadas: Fosfato inorgnico y orgnico Fuentes sulfuradas: Sulfato inorgnico y compuestos de sulfato orgnicos

Micro Nutrientes
Minerales y elementos traza: Mg, Ca, Mn, K, Zn, Fe, Cu

Fases de fermentacin
Estacionaria

# cels Vitaminas: Biotina (la nica requerida. El resto son estimulatorias).

log

muerte

Acostumbramiento

Brix

Tiempo

10

Factores de supervivencia
Oxgeno cidos grasos Esteroles Factores nutricionales

Rol de los factores de supervivencia

Mantener viabilidad de clulas Aumentar la tolerancia a etanol Mantener la generacin de energa

11