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INGEGNERIA GENETICA Modificazione dellingegneria genetica di un organismo attraverso la deliberata manipolazione del suo materiale genetico.

Ricerca di base purificare! esprimere! amplificare geni. "tilizzata Ricerca applicata#commerciale $biotecnologie% sviluppo microrganismi ingegnerizzati per la produzione di specific&e sostanze $ormoni! vaccini! farmaci! proteine%. 'er poter manipolare un gene ( necessario C)*NAR)* isolarlo! purificarlo e farlo esprimere $ovvero tradurlo in un sistema pi+ comprensibile per loperatore%. Gli strumenti dellingegneria genetica sono ,. -ettori di clonaggio $utilizzati per portare le se.uenze di /NA in batteri ricettivi e per amplificare la se.uenza desiderata% sono i plasmidi. 0ervono per inserire /NA esogeno al loro interno e al tempo stesso essere in grado di replicarsi nella cellula ospite. I vettori plasmidici sono p"C! p1R 233! pGEM e sono formatida circa 34 5b6 i batteriofagi! come lambda! costituiti da circa 37 5b6 cosmidici costituiti fino a 87 5b. 3. Enzimi di restrizione servono per tagliare in modo riproducibile il /NA da amplificare in punti precisi allo scopo di inserirlo nei vettori $sono le endonucleasi di restrizione%. Riconoscono se.uenze specific&e di /NA c&e sono rappresentate da 897 basi e tagliano solo .uando ci sono .uesti indicatori. I siti di taglio sono specifici e si &anno solo in presenza di una se.uenza 7 basi. 2. /NA ligasi ( il processo inverso in grado di unire molecole lineari di /NA riformando lunit: della catena nucleotidica. -ETT*RI /I C)*NAGGI* 'iccole! ben caratterizzate molecole di /NA6 Contengono almeno un sito dinizio $ori% replicazione nellospite prescelto6 Contengono uno o pi+ geni c&e ne consentano lidentificazione6

')A0MI/ICI Replicano indipendentemente6 'iccole dimensioni6 /NA circolare $stabile durante la manipolazione%6 Multiple copie per cellula6 Trasportano geni per la resistenza agli antibiotici6 Introdotti in batteri mediante trasformazione#elettroporazione $costosa! solo per alcuni batteri%6 Rimosso operone tra6 0iti per azione endonucleasi di restrizione $siti di taglio per gli enzimi! detto sito di policlonaggio ; multiple cloning site%. /anno le estremit: a cui far aderire il /NA da clonare.

Gli enzimi di restrizione $endonucleasi% riconoscono una se.uenza sitospecifica nelle molecole di /NA se - taglio sfalsato nella molecola di /NA generano estremit: coesive $sti<c= ends%6 ( pi+ facile linserimento6 - taglio non sfalsato nella doppia elica di /NA generano estremit: piatte $blunt ends%6 non c( lappaiamento delle basi e il plasmide non tende a ric&iudersi. )opera delle ligasi ( pi+ complicata. "n gene non viene manipolato direttamente $per esempio un gene costituisce lo 4.47> del genoma E. coli%! ma si utilizzano dei passaggi intermedi per aumentarne la .uantit: e facilitarne la manipolazione ??clonaggio. ,% Isolamento e frammentazione /NA. 3% Introdurre frammento desiderato. 2% Introdurre e mantenere il frammento clonato in ospite intermedio. 8% Identificare e purificare il clone desiderato. 7% 'rodurre grandi .uantit: di gene clonato per studiarlo.

)uso di enzimi di restrizione non ( sufficiente per clonare un gene. @uando le stic<= o blunt ends create dagli enzimi di restrizione sono allineate si formeranno solo dei legami idrogeno tra le basi appaiate e non saranno sufficienti a mantenere lintegrit: del /NA. A necessario ricostruire la continuit: dello sc&eletro della molecola di /NA utilizzando una /NA ligasi.

TRASFORMAZIONE E SELEZIONE /opo aver ottenuto il /NA ricombinante! si amplifica introducendolo in un ospite adeguato lintroduzione avviene mediante trasformazione in un ospite batterico $E. coli%. 'oi si deve rendere le cellule competenti $mediante trattamento c&imico o s&oc< termico%. 'roblemi B bassa efficienza B falsi positivi cellule trasformate da plasmidi circolarizzati ma senza inserto.

0elezionare cloni con frammento di /NA clonato utilizzando un mar<er c&e abbia una certa resistenza allantibiotico. CREAZIONE E SCREENING DI UNA LIBRERIA Abbiamo inserito un segmento di /NA in un vettore di clonaggio o espressore abbiamo trasformato e piastrato dei batteri. Come identific&iamo tra tutte le colonie ottenute .uella c&e esprime il segmento di /NA $GENE% c&e ci interessaC

Ibridizzazione delle colonie con probe di /NA marcato con radioattivo $'23%. 0creening immunologico per la proteina prodotta. 0creening enzimatico per lattivit: della proteina.

STRATEGIA PER CLONARE SEGMENTO DNA DA CELLULA PROCARIOTICA ,% Estrazione /NA ? frammentazione $digestione con specifici endonucleasi di restrizione% ?? identificare segmento di interesse ??? clonaggio. 3% Drammentazione $digestione con specifici endonucleasi di restrizione% /NA ??clonare tutti i frammenti $libreria% ??? identificare il gene giusto. 2% 0intetizzare il frammento di /NA desiderato $RT9'CR% ? clonaggio nellopportuno vettore.

STRATEGIA PER CLONARE SEQUENZA DI DNA DA CELLULA EUCARIOTICA ,% I geni delle cellule eucariote contengono EesoniF $se.uenze non codificanti di /NA% ?? non ( possibile clonare geni attraverso semplice digestione del /NA. 3% Isolato mRNA di interesse ? trasformato in ds/NA $c/NA% $transcriptasi inversa% ?? amplificato con RT9'CR ??? clonato.

RT-PCR 'ossibilit: di amplificare in vitro il numero di copie di una molecola di un segmento di /NA ? Clonare ; se.uenziare ; mutagenesi ; diagnostica "tilizza enzimi detti /NA ;polimerasi c&e sintetizzano un frammento di /NA partendo da una regione a doppia elica $primer%. E. coli TA@ 'fu con proof reading $il primer si puI attaccare dappertutto% senza proof reading $non ( in grado di polimerizzare e poi di controllare se &a commesso errori% G3#G7HC con proof reading $polimerizza e controlla se &a sbagliato linserimento di nucleotidi% ;&a un costo elevato9 2GHC G3HC

Ciclo 'CR - denaturazione /NA a doppia elica $J4HC% i ciclatori &anno sblocc&i in cui avviene la denaturazione. - appaiamento primer al template di /NA $84 ; G4HC% - estensione ad opera della polimerasi $2GHC% @uesto ( un processo esponenziale per cui il numero di copie del gene viene amplificata 3989J9,K9 L in maniera progressiva. -iene copiata .uella parte di /NA in cui la /NA polimerasi &a trovato linnesco. 0ervono primer specifici per le varie regioni. Il gene amplificato puI essere introdotto direttamente in un vettore di clonaggio ed essere poi inserito nella fase successiva di trasformazione e amplificazione. -iene evitato il processo di screening siamo gi: partiti dal gene c&e ci interessava.

SCELTA DEI VETTORI DI CLONAGGIO "n vettore di clonaggio ( un elemento genetico al cui interno i geni possono essere ricombinati e replicati. 'lasmide optimum ,4 5b. 'er frammenti pi+ larg&i batteriofago M o cosmidi. 'er se.uenziare batteriofago M,2 $E. coli e salmonella% ( un virus batterico a singolo filamento c&e gli conferisce notevoli vantaggi per il se.uenziamento. Neast artificial c&romosome vettori per lieviti 3449844 5b. -irali $per cellule eucariote% 0-846 adenovirus6 baculovirus $cellule insetto%6 retrovirus. 0TR"TT"RA /E) ')A0MI/E 'br233

'iccolo 892 5b. 0tabile in E. coli. Alto numero copie#cellule. Dacile da isolare. 'ossibilit: di inserire sino a ,4 5b. Completamente se.uenziato.
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0ingoli siti di clonaggio! ci sono i siti di taglio per enzimi diversi. Geni per antibiotico resistenze il plasmide presenta resistenza alle penicillina e alle tetracicline. Dacilmente trasformabile Non c( operone tra

CARATERI0CTICOE ')A0MI/E 'ER C)*NARE /NA ,. 'iccole dimensioni6 3. 0ingoli siti per endonucleasi di restrizione6 2. Mar<ers per identificare le cellule c&e contengono il contenuto. C*0MI/I -ettori di clonaggio c&e possono clonare segmenti di /NA pi+ larg&i! fino a 84 5b6 e possono essere mantenuti sotto forma di plasmidi $ circolare%! ma anc&e sotto forma di fagi. 0i utilizzano solo le estremit: della struttura del batteriofago . 0ono delle estremit: C*0 $nel genoma del fago % e contengono dei segnali per limpaccamento del /NA nella testa del fago. @uando il materiale genico viene introdotto in .ueste strutture viene replicato6 tra un segmento e laltro ci saranno le se.uenze C*0 c&e ne consentono lintroduzione nella testa del fago. 'er cui vi saranno due estremit: C*0. SCELTA DELLOSPITE PER IL CLONAGGIO P Cellule procariote E. coli 1. subtilis P Cellule eucariote Q facili da manipolare # poco costose # crescono rapidamente. 9 difficili trasformare $di solito si riesce ad eliminare% # potenzialmente patogene # produce endotossine # ritiene proteine. 9 instabilit: plasmidica # elimina /NA estraneo. 9 facili da manipolare.

0.cerevisiae ( cellula di lievito c&e presenta una serie di problemi! cellule mammifero! cellule insetto. VETTORI DI ESPRESSIONE -ettori di clonaggio c&e contengono delle se.uenze regolatorie per garantire la trascrizione e la traslazione $possibilmente in maniera regolata% di un gene. 'ossono essere impiegati sia in cellule procariote c&e eucariote.

Nella scelta del vettore da utilizzare si deve valutare ,. Numero copie vettore per cellula6 3. Tipo promotore e sua attivit: # possibilit: regolarlo6 2. 0egnali di inizio trascrizione6 8. 0tabilit: peptidi prodotti.
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'R*M*T*RE P Re.uisito cruciale per il funzionamento di un sistema di espressione ( la presenza di un forte e regolabile promotore. ???regione $estremit: 2 di un gene% regola lefficienza # fre.uenza con cui un gene viene trascritto $lega RNA 9 polimerasi% nei batteri ( generalmente costituita da un promotore e da un operatore. P P 'roblemi ?? promotori di E. coli sono deboli promotore di cellule eucariote forti non funziona in batteri porre il gene sotto controllo promotore sempre attivo puI essere negativo e puI causare deficit energetici o tossica da accumulo . promotore ideale efficiente # attivit: regolabile dallo sperimentatore. )ac Tac Trp ') 1atteriofago TG ?? promotore fago TG e fago TG RNA polimerasi. 0EGNA)I /I INIRI* TRA0CRIRI*NE Nei procarioti il ribosoma si lega ad una specifica se.uenza $ 0&ine 9 /elgarno% seguita da uno start codon6 c( unadeguata reading frame. 0TA1I)ITA 'R*TEINE 0INTETIRRATE /egradate6 Tossic&e se si accumulano ne citoplasma6 Non vengono secrete.

Dondere una proteina con una C*/A codificata dal vettore stabilizzi la proteina6 faciliti la purificazione6 segnale per secrezione.

PROBLEMI ASSOCIATI ALLUSO DI PROCARIOTI PER LESPRESSIONE DI PROTEINE DI ORIGINE EUCARIOTICA: instabilit: proteine sintetizzate# difficolt: secrezione6 contaminanti potenzialmente pericolosi $tossici%6 assenza di attivit: biologica modificazioni post ; translazionali cellule eucariote Q ponti disolfuro Q rimozione proteolitica di frammenti Q glicosilazione $*9lin<ed ser#tre6 N9lin<ed aspar% Q modificazione di residui AA $ acetilazione#metilazione# sulfatazione#fosforilazione% sistema espressione in cellule eucariotic&e. @uesti sistemi necessiatno di promotore per cellule eucariotic&e6
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mar<er selezionabile6 se.uenza c&e segnala pol= A nellmRNA formato6 se.uenza di inserzione ed origine di replicazione.

S. CEREVISIAE *rganismo unicellulare facile da far crescere in larga scala6 Genoma ben conosciuto6 'romoter potenti e ben caratterizzati6 Capace di eseguire diverse modificazioni post9traslazionali6 0ecerne poc&e proteine non interferendo con purificazioni6 0icuro.

Problematiche: perdita plasmidi6 iperglicosilazione proteine6 accumulo citoplasmatico proteine da secernere. Trasformare i lieviti mediante rimuovere parete cellulare trattare con acetato di litio elettroporazione

APPLICAZIONI INGEGNERIA GENETICA ,. Dermentazioni microbic&e $microrganismi modificati vengono utilizzati su scala industriale per la produzione di sostanze%6 3. -accini6 2. 'roduzione proteine6 8. Creazione di piante e animali transgenici6 7. Controllo in.uinamento6 K. Terapia genica $possibilit: di somministrare geni a scopo terapeutico%6 G. /iagnostica $infettiva e non%. Tutti gli antibiotici derivano da batteri e fung&i purificati le colture dei batteri rilasciano grandi .uantit: di .uesti prodotti. COLTURE BATTERICHE Mediante lingegneria genetica si manipolano microrganismi. Aumentare la produzione o produrre molecole opportunamente modificate antibiotici! endonucleasi di restrizione. Alterare pat&Sa= metabolici per ottenere maggiori .uantit: acido ascorbico6 coloranti6 aminoacidi6 biopolimeri. Agendo su sistemi di controllo si selezionano batteri in grado di dare .uesti prodotti. PRODUZIONE PROTEINE PER VACCINI 'roblemi legati ai vaccini tradizionali Agente infettivo problematico da produrre in coltura6 @uantit: limitata6 Misure di sicurezza complesse#costose6 Risc&io di incompleta inattivazione agente infettivo6 'ossibile riac.uisizione fenotipo ESildF6 'roblemi stoccaggio#emivita6 -accini tradizionali inefficaci Esempio Il vaccino per lepatite 1 ( basato sulla somministrazione di ununica proteina presente sulla superficie esterna del virus. @uesta proteina ( stata clonata e fatta esprimere in lieviti $0. cerevisiae% per la produzione di anticorpi )ormone della crescita serve per combattere il nanismo. )unico modo per ottenerlo era di estrarlo dai cadaveri .uesto! perI! comportava infezioni e malattie di tipo virale e neurotossico. )ingegneria genetica &a permesso di produrre lormone della crescita esprimendolo in E. coli. @uesto ormone presenta analogie con la prolattina $ormone c&e garantisce la produzione di latte materno dopo il parto%6 per cui lormone groSt& va ad attivare anc&e il recettore per la prolattina. )insulina! un ormone c&e serve per mantenere normale il livello di glucosio nel sangue! ( prodotta come ununica catena lunga6 prima di essere secreta dalle cellule del pancreas deve subire una serie di modificazioni $peptidasi e poi formazione di ponti disolfuro%. Non puI essere prodotta da cellule procariote poic&T produrrebbero n tipo di insulina inattivo.

CREAZIONE DI PIANTE E ANIMALI TRANSGENICI Mediante lintroduzione di frammenti di /NA in uova fecondate o in cellule di piante cresciute in coltura! ( possibile ottenere organismi transgenici per a% Aumentare la produzione agricola6 b% Alterare le caratteristic&e nutrizionali di vegetali e animali6 c% 'rodurre proteine non prodotte normalmente6 d% *rgani per eseguire Ueno9trapianti 0i parla di *GM *rganismo Geneticamente Modificato. DEGRADAZIONE DI SOSTANZE INQUINANTI Esistono microrganismi in grado di degradare#detossificare sostanze tossic&e sia naturali c&e sintetic&e $erbicidi! pesticidi! refrigeranti! solventi%6 Microrganismi $talora isolati da siti contaminati% normalmente contengono geni per la bio9 degradazione di sostanze tossic&e ed in.uinanti. )ingegneria genetica sfrutta .uesti geni per creare Esuper 9 batteriV per la pulizia ambientale.

)a decomposizione microbica di idrocarburi $ossidazione% ( operata da batteri $pseudomonas! corinebatteri! micobatteri%! fung&i! muffe e alg&e6 metano $da batteri metanotrofici%6 idrocarburi alifatici i microrganismi si sviluppano in superficie formando una pellicola6 ossidano gli idrocarburi a C*3 in presenza di *3 $in anaerobiosi gli idrocarburi sono stabili%6 gocce decomposte $optimum! pO! temperatura! nutrienti inorganici come ' e N% idrocarburi policiclici e a catene ramificate sono stabili. 'esticidi declorazione riduttiva. TERAPIA GENICA ,. Regolare espressione di geni terapeutici per terapia anti9 tumorale! anti9 infiammatoria6 3. Anti9 sense t&erap= si cerca di modulare lespressione di un gene a livello dellmRNA. 0i somministra un oligonucleotide complementare alla molecola di RNA c&e si vuol distruggere e cosW si crea una molecola ibrida con un RNA a doppia catena. 2. 0omministrare gene terapeutico per malattie genetic&e $talassemia poca produzione di globuli rossi6 malattie di accumulo nei macrofagi manca lenzima deputato alla degradazione di determinati metaboliti6 fibrosi cistica deficit nel trasporto elettrolitico attraverso la membrana6 distrofia muscolare%. INGEGNERIA GENETICA NELLE PIANTE Maggiore produzione # alto valore nutritivo6 ( gi: applicata a granoturco! riso! grano. )e piante possono essere ingegnerizzate introducendo un gene in cellule mantenute in coltura in vitro e .uindi si puI rigenerare una pianta fertile dalle cellule trasformate. Come introdurre il gene di interesse in una cellula vegetaleC ,. Elettroporazione6
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3. Gene gun ( un approccio pi+ cruento! il /NA ( sparato allinterno delle cellule6 2. 'lasmide Ti $Tumor inducing%! formato da ,7 ; 38 5b! da batterio Agrobacterium tumefaciens6 la sua *RI non ( riconosciuta in E.coli Il metodo pi+ semplice per introdurre un gene di interesse in una cellula vegetale ( il plasmide Ti. 'roblemi produzione di fitormoni previene maturazione cellulare6 produzione opine distoglie energie e risorse6 Ti ampie dimensioni aggiunta di geni da clonare diviene instabile6 plasmide Ti non si replica in E.coli 0oluzioni aggiunto sito di replicazione per E.coli6 aggiunto pol=lin<er6 mar<er per selezionare cellule transfettate $neomicina fosfotransferasi ?<anamicina R% eliminati geni per opine! auUine! cito<ine e vir.

Il plasmide tumefaciens riesce a trasferirsi dal batterio alle cellule vegetali. Riesce a trasferire materiale genetico da una cellula procariotica ad una eucariotica. @uando il plasmide ( trasferito ( responsabile di determinare masse pseudotumorali $vicino a delle piante si formano dei rigonfiamenti dovuti al rapporto instaurato tra il batterio#pianta. 0e si verifica un taglio nello stelo della pianta! la pianta stessa opera una riparazione e produce sostanze $ferormoni% c&e sono in grado di aumentare la proliferazione delle cellule o di favorire la c&iusura della lesione. )e opine sono AA modificati c&e servono per il metabolismo del batterio. Nella regione -IR $sta per virulenza% ci sono 7 ; K geni indispensabili affinc&T ci possa essere ladesione del batterio alla cellula vegetale e ci sia il trasferimento del materiale genetico della cellula batterica a .uella vegetale. Nella regione T9/NA si verifica il processo di coniugazione. )a capacit: di spostamento nel plasmide ( molto interessante! ma lo si doveva modificare tenendo conto solo delle caratteristic&e c&e servivano. 0ono stati eliminati i geni di virulenza. 0i ( costruito un plasmide c&e assomiglia al T9/NA ma di esso conserva solo le estremit:. Il plasmide modificato si fa passare nel tumefaciens. Il batterio &a due plasmidi e per .uesto viene detto EbinarioF! poic&T un plasmide non puI funzionare senza laltro T9/NA Trasporta informazioni genetic&e c&e vogliamo trasferire alla cellula vegetale *RI9-IR Controlla il processo

Gen Gun ed elettroporazione funzionano bene con pomodori e patate! meno bene con le graminacee.

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APPLICAZIONI DELLINGEGNERIA GENETICA IN AGRICOLTURA 'iante resistenti a patogeni Bacillus thuringiensis ? 1t ;ToUin le piante possono essere indotte a produrre tossine contro i parassiti! si difendono solo dagli acari. Coat protein virus tabacco. 'iante resistenti a erbicidi Erbicida EglifosfatoF uccide piante bloccando la sintesi di AA aromatici $trasferire il gene per sintesi di AA aromatici di origine batterica c&e ( resistente allazione del EglifosfatoF% agisce come un antibiotico in cui il target ( la cellula vegetale. Ridurre up9ta<e erbicida. 0i agisce a livello delle membrane cellulari dove si possono creare processi di assorbimento della sostanza tossica. Ridurre labilit: dellerbicida di legare la proteina target nella pianta. Resistenza stress ; senescenza consente lirrigazione con ac.ue ricc&e di sali $vantaggio per le regioni semi desertic&e%. 0i parla di senescenza nei frutti .uando si bloccano i fenomeni di maturazione per cui il frutto marcisce e .uesto va a vantaggio dei produttori. )impatto ambientale ( forte poic&T si introducono nellambiente piante geneticamente modificate. Modificare pigmentazione dei fiori. Modificare il contenuto nutritivo delle piante a scopo vaccinologico $far esprimere a piante zucc&eri#proteine oppure utilizzate per esprimere un vaccino. fonte di zucc&eri#lipidi

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