ALTA RESOLUCI ALTA RESOLUCI N N CLAR o HPLC CLAR o HPLC 2 Caractersticas: Elevada sensibilidad. Elevada aplicabilidad. Permite realizar anlisis cuantitativos exactos. Es adecuada para la separacin de especies termolbiles o no voltiles. Junio 2011 2 3 Tipos de cromatografa segn el mecanismo de separacin Slido Interaccin bioqumica Afinidad Gel Tamao de partcula Exclusin Lquido Resina F. Electrostcticas Intercambio inico Lquido Solubilidad Reparto Slido F. de Van der Waals Adsorcin F. mvil F. estacionaria Mecanismo Cromatografa de 4 Cromatografa de ADSORCIN Fase estacionaria Fase mvil Slice o almina Mezcla de disolvente apolar (hexano) con otros ms polares (acetona, cloruro de metilo) Junio 2011 3 5 Cromatografa de REPARTO Fase normal Fase reversa Fase estacionaria polar Slice o Almina Fase mvil apolar Fase estacionaria apolar Slice o Almina Fase mvil polar Con grupos polares Ciano, diol, amino Series eluotrpicas Con grupos apolares CH 3 , C 8 H 17 , C 18 H 37 Disolventes polares (MeOH, MeCN, THF) y disoluciones acuosas. 6 Cromatografa De INTERCAMBIO INICO Fase estacionaria Resina de intercambio inico Fase mvil Poliestireno con grupos ionizables Disoluciones acuosas con especies inicas + pequeas cantidades de disolventes miscibles Intercambio catinico (grupos cido) Intercambio aninico (grupos amino) Previo paso al anlisis cromatogrfico las resinas precisan de un proceso de lavado, que se denomina REGENERACIN. Junio 2011 4 7 Resinas de intercambio inico. Clasificacin. cidos orgnicos y aminocidos 1-9 -C 2 H 4 N(C 2 H 5 ) 2 Base dbil Alcaloides y cidos grasos 1-12 -(CH 3 ) 3 N + Base fuerte Aninico Elementos de transicin y bases orgnicas 5-14 -COOH cido dbil Aminocidos y compuestos inorgnicos 1-14 -SO3H cido fuerte Catinico Aplicacin Rango de pH Grupo activo Comportamiento Intercambio 8 Cromatografa de EXCLUSIN* GPC orgnica GPC acuosa Fase estacionaria Fase mvil Fase estacionaria Fase mvil Poliestireno/divinilbenceno PS/DVB Disolventes orgnicos de muy distinta polaridad Polmero de superficie hidroflica (slice, vidrio poroso) con grupos OH Disolventes polares (MeOH, MeCN, THF) y disoluciones acuosas. *Cromatografa de permeabilidad de gel (GPC) o filtracin en gel. Junio 2011 5 9 Fase estacionaria: Geles Propiedades: Qumicamente inerte. Mecnicamente estable. Tamao de partcula uniforme. Estructura de poros reproducible. 10 Cromatografa de exclusin. Mecanismo. Separacin por tamao. Sin interaccin fsico-qumica entre analito y fase estacionaria. Tamao > Valor crtico. Elucin con el disolvente. Tamao < Valor crtico. Todas las molculas eluyen juntas. Junio 2011 6 11 Cromatografa de AFINIDAD Resinas polimricas con grupos funcionales bioespecficos Elevada especificidad y selectividad para el aislamiento y purificacin de biomolculas. Mecanismo: antgeno- anticuerpo, enzima-sustrato, etc. 12 Instrumentacin: Cromatgrafo HPLC Depsito de disolventes. Sistema de bombeo. Sistema de inyeccin. Columna cromatogrfica. Horno termostatizado. Detector. Registrador de datos. Junio 2011 7 13 Depsito de disolventes Frascos de vidrio inerte Tubos de tefln con filtro Sistema de desgasificacin (N 2 ,He) Disolventes: Exentos de partculas slidas FILTRACIN A VACO de la fase mvil 14 Disolventes. Caractersticas. Elevada pureza y estabilidad. Baja viscosidad. Buen disolvente de la muestra. No degradar o disolver la fase estacionaria. Compatible con el detector empleado. Buena disponibilidad comercial y precio. Junio 2011 8 15 Modo de trabajo. Elucin Isocrtica: Composicin de la fase mvil constante. En gradiente: Composicin de la fase mvil variable en funcin del tiempo. 16 Tabla de miscibilidad Catlogo de cromatografa Scharlab Junio 2011 9 17 Tuberas y conexiones De acero inoxidable, resistente a la corrosin. PEEK (PoliEterEterCeterona), resistente a disolventes, sales de haluro, tampones fuertes y fases mviles agresivas. 18 Sistema de bombeo Sistema necesario para conseguir una presin y velocidad de flujo de la fase mvil regular durante todo el proceso analtico. Componentes resistentes a la corrosin por disolventes. Capaz de generar presiones por encima de 6000 psi. Flujo libre de pulsaciones. Caudales reproducibles en el intervalo 0,1 - 10 mL/min. Fcil de desmontar y reparar. Junio 2011 10 19 Tipos de bombas De presin constante o neumticas. De flujo constante: De jeringa o desplazamiento. Recprocas: Son las ms empleadas. 20 Bombas neumticas Baratas. Flujo sin pulsaciones. Limitada capacidad y presin de salida. Caudal depende de la viscosidad y contrapresin de la columna. Ruidosa. Difcil reparacin. No permite trabajar en modo gradiente. Junio 2011 11 21 Bombas de jeringa Flujos independientes de viscosidad y sobrepresin. Flujos libres de pulsaciones. Volumen de la cmara pequeo (aprox. 250 mL) Cambio de disolvente complicado. 22 Bombas recprocas Las ms empleadas. Volumen interno muy pequeo (35-400 L) Altas presiones de salida. Caudales constantes e independientes de la viscosidad. Permiten trabajo en gradiente. Flujos con pulsaciones. Junio 2011 12 23 Sistema de inyeccin Vlvulas de inyeccin con bucles de muestra de volumen pequeo y constante (5-500 L) Posicin de carga Posicin de inyeccin 24 Columna cromatogrfica Elemento clave del sistema. Donde se produce la separacin. Tubo de acero inoxidable, de dimetro interno uniforme y relleno variable. Su capacidad de separacin vendr marcada por: Propiedades qumicas: estabilidad qumica y sensibilidad (tiempo de retencin). Fase estacionaria: tipo de superficie, tamao de poro y tamao de partcula (5 m estndar) Propiedades fsicas: eficiencia y velocidad. Dimensiones: Longitud: 10-30 cm. y dimetro interno: 4-10 mm. Junio 2011 13 25 Sistemas de proteccin Para eliminar partculas en suspensin. Para saturar la fase mvil de fase estacionaria. Pueden ser de dos tipos: Pre-filtros en lnea: Para el disolvente. Para la columna. Pre-columnas: De cartucho. De columna. 26 Tipos de rellenos Pelicular: Bolas de vidrio o polmero, no porosas y esfricas. Recubiertas de una capa delgada de slice, almina o resinas de intercambio inico. De partcula porosa: Micropartculas porosas de slice, almina o resinas de intercambio inico, con dimetros entre. Superficie especfica. 300-600 7-14 Superficie especfica (m 2 /g) Alta Baja Capacidad de carga 1-3 m Espesor (m) 3-10 30-40 Dimetro (m) Partculas porosas Pelicular Junio 2011 14 27 Hornos termostatizados Lo ms habitual es trabajar a Temperatura ambiente. Aplicaciones especiales, se trabaja a temperatura constante y controlada. Los hornos alcanzan hasta 150C. 28 Detectores. Caractersticas. Sensibilidad adecuada. Respuesta lineal a varios rdenes de magnitud. Universal o de respuesta selectiva. Buena estabilidad y reproducibilidad. Tiempo de respuesta corto e independiente del caudal. Volumen interno mnimo. Bajo coste, fiable y de sencillo manejo. No destructivos de la muestra. Junio 2011 15 29 Detectores. Clasificacin. En funcin de que respondan a una propiedad fsica de La fase mvil: ndice de refraccin Conductividad Del soluto: Absorbancia UV-Visible Fluorescencia Electroqumicos 30 Detector de ndice de refraccin Elucin isocrtica. Responden a casi todos los solutos pero con baja sensibilidad. Anlisis termostatizado. Muy sensible a la variacin de temperatura. Junio 2011 16 31 Detector de conductividad Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta. Empleados fundamentalmente en cromatografa de intercambio inico. Baja sensibilidad. Sensibles a impurezas de la fase mvil. 32 Detector de absorbancia UV-Visible El ms utilizado. Vlido para determinar sustancias que absorben radiacin UV-Visible. Lmparas de Deuterio, Xenon o Wolframio. desde 190-900 nm. Camino ptico de la celda del detector suele ser de 0.5 cm. La capacidad de 8 L. Junio 2011 17 33 Detector de Fila de Diodos (PDA) Permite registrar simultneamente la absorbancia en todo el rango de longitudes de onda UV/VIS. La luz policromtica atraviesa la muestra, llega a la red de difraccin y se divide en las diversas A que la componen. Cada A incide en un diodo diferente. 34 Detector de fluorescencia Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes. Se seleccionar la Aexc y la Aem. Son de alta sensibilidad. No se ven interferidos por los disolventes al no tener stos naturaleza fluorescente. Junio 2011 18 35 Detectores electroqumicos Formados por 3 electrodos: De referencia: Ag/AgCl o calomelanos Auxiliar: Platino o carbn vtreo De trabajo: Para reduccin: Mercurio Para oxidacin: Carbn en sus distintas formas. Mtodos electroanalticos: Amperometra Voltamperometra Coulombimetra 36 Registrador de datos La representacin grfica de los datos obtenidos en funcin del tiempo, es el cromatograma. Anlisis cualitativo: Identificacin mediante el tiempo de retencin. Anlisis cuantitativo: El rea o la altura de pico son proporcionales a la concentracin. Junio 2011 19 37 Aplicaciones Medioambiente: Pesticidas, herbicidas, fungicidas, HAPs, anilinas, fenoles, dioxinas, etc. Anlisis de alimentos: Composicionales (vitaminas, azcares, antioxidantes, alcoholes), colorantes, edulcorantes, residuos (pesticidas, herbicidas, HAPs, antibiticos), aditivos (BHA, BHT, srbico, benzoico), toxinas (aflatoxinas, ocratoxinas), histamina. Alcaloides. Anlisis farmaceticos: principios activos (analgsicos, antidepresivos, aminocidos, vitaminas, nucletidos, protenas, antibiticos), impurezas, drogas, hormonas, esteroides.