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MUTAO E REPARO DE DNA

Prof. Ademilson Espencer E. Soares
A Natureza das Mutaes. Mutaes que ocorrem naturalmente incluem todas mudanas imaginveis na seqncia de DNA. As mutaes que tem somente um efeito sutil no produto gnico, como as mutaes para sensitividade a temperatura, so freqentemente simples trocas de uma base por outra. Entretanto, algumas mutaes naturais destroem completamente a funo de um gene. Essas mudanas mais drsticas, chamadas MUTAES NULAS , incluem no somente mudanas de bases, inseres ou delees de uma base, mas tambm, extensas inseres e delees e mesmo rearranjos grosseiros na estrutura cromossmica. Tais mudanas podem ser causadas, por exemplo, pela insero de um transposon, o qual tipicamente transfere (insere) algumas centenas de pares de bases de um DNA estranho numa seqncia codificadora de um gene, ou por aes aberrantes do processo de recombinao celular. Mutao pela Mudana de uma nica Base. Existem inmeras razes para se considerar primeiro o tipo mais simples de mutao, que muda uma base por outra. Primeiro: a mudana de uma base reflete a bsica fidelidade da replicao do DNA. Segundo: alguns importantes mutagnicos atuam promovendo mudana em uma nica base. Finalmente, mutaes numa nica base so crticas para a evoluo porque elas alteram o gene de uma maneira branda, produzindo variantes teis, como no caso da siclemia (anemia falciforme). Que tipos de mudanas de uma nica base ocorrem naturalmente? Observando a ocorrncia de alteraes nos cdons de parada, para o gene lac I, que fabrica a protena repressora no operon lactose, foi possvel identificar os diferentes tipos de alteraes que podem ocorrer em uma nica base, como as: TRANSIES que so mudanas de base prica por outra prica, ou de uma base pirimdica por outra pirimdica. TRANSVERSES que so mudanas de uma base prica por uma pirimdica ou vice-versa. transies (4) PRICA ADENINA GUANINA transverses (8) PIRIMDICA TIMINA CITOSINA

Um segundo fato importante que nem sempre os possveis stios mutantes mutam com a mesma eficincia, alguns so hot-spots que so pontos onde as mutaes ocorrem com uma freqncia mais alta (Figura 12.1).

As mudanas de uma base so comumente reversveis e, freqentemente, a taxa de mutao reversa (do mutante para a forma selvagem) so muito prximas da taxa de mutao do gene selvagem para o mutante. A TAXA DE INCORPORAO ERRADA DE NUCLEOTDEO VARIA DE 107 A 1011. Usando como referncia a molcula repressora codificada pelo gene lacI, foi possvel se estimar a taxa de incorporao errada de nucleotdeo, considerando-se 80 stios distintos como sendo de aproximadamente 109. Entretanto, nas regies de hot-spot, pode-se obter at 25 vezes mais mutantes. CONTROLE DOS NVEIS MUTACIONAIS PELA RELATIVA EFICINCIA DAS ATIVIDADES NUCLEASICA E DE POLIMERIZAO REALIZADA PELA DNA POLIMERASE. De incio, pode parecer que a freqncia de erros reflete diretamente a eficcia hereditria da formao dos pares de bases AT e CG.

Entretanto, fortes argumentos tericos contradizem essa idia: No existe diferena suficiente entre um par de base certo ou errado, para que a polimerase cometa um erro para 10 9 nucleotdeos incorporados. O limite inferior de uma insero de base errada, pode ser dado pela freqncia com que uma base assume a incorreta forma tautomrica (forma enol ao invs de cetonica, ou forma imino ao invs de amino), talvez uma em 104, que muito maior que a atual freqncia de mutao. Este dilema, entretanto, desapareceu quando se descobriu a capacidade revisora da DNA polimerase. Embora a freqncia de erros iniciais durante a seleo do par de base seja consistente com as medidas das taxas tautomricas, quase todas as inseres de bases erradas so, mais tarde, removidas pela atividade de exonuclease 3- 5 da DNA polimerase. De incio, essa associao parecia bizarra, mas hoje sabe-se que esta atividade exonuclesica 3- 5 necessria para garantir a fidelidade da replicao do DNA. Estudos com molculas mutantes da DNA polimerase mostrou que as taxas de mutaes pode ser controlada pela atividade exercida na direo 3- 5, ou pela capacidade de polimerizao realizada na direo 5- 3. Se a capacidade exonuclesica no sentido 3- 5 ineficiente, ento resultar uma alta taxa de mutao. Por outro lado, uma eficiente atividade exonuclesica produzir uma baixa taxa de mutao. Em E. coli, a atividade 3- 5 exonuclesica exercida pela DNA polimerase III conduzida numa pequena subunidade ( ) da holoenzima de, aproximadamente, 25.000 dltons, enquanto a atividade de polimerizao conduzida pela subunidade ( ) de 140.000 dltons. Em casos excepcionais, a atividade revisora da polimerase pode no existir e esta possibilidade tem sido aventada para explicar a alta taxa de mutao dos genes mitocondriais. Algumas enzimas de reparo do DNA reconhecem e reverte os danos produzidos no DNA: fotolase e O6-metilguanina metiltransferase. A radiao UV com um comprimento de onda de 260 nm absorvida fortemente pelas bases do DNA, e pode promover uma fuso fotoqumica de bases pirimdicas adjacentes, formando ou dmeros de timina ou um fotoproduto 64 mutagnico (Figura 12.5).

O DNA de uma pele exposta ao sol pode adquirir centenas de dmeros por dia, que so normalmente reparados. Entretanto, existe uma doena de pele XERODERMA PIGMENTOSUM, que causada por um

defeito gentico na enzima que remove os dmeros. A luz UV do sol promove normalmente nessas pessoas, o aparecimento anormal de mortes celulares e aumento de cncer de pele. No homem, esses dmeros so removidos pelo reparo por exciso e pela resposta SOS. Os dmeros de pirimidina so alvos de uma enzima universal fotolase, a qual se liga ao dmero e catalisa uma 2 reao fotoqumica usando a luz visvel, que muda o anel ciclobutano para bases pirimdicas normais. Esse processo chamado de fotoreativao. Um segundo tipo de dano resulta da ALQUILAO que a transferncia de grupos metil ou etil, que reagem com as bases do DNA, levando a uma alterao das bases e o conseqente pareamento errado. Entre os agentes alquilantes, se inclui as nitrosaminas e um potentssimo agente mutagnico usado em laboratrio, que o metil-nitrosoguanidina (Figura 12.6).

Um dos mais vulnerveis stios de alquilao a base guanina, que particularmente sujeita a metilao do oxignio-6 do tomo de carbono (Figura 12.7).

O produto O6-metilguanina normalmente se pareia erradamente com a TIMINA, mudando o par de base GC TA quando o DNA replicado. Esta leso removida pela enzima celular:O6-metilguanina-metiltransferase, codificada pelo gene ada, que reconhece O6-metilguanina do DNA fita dupla e remove o grupo metil, transferindo-o para um AA da enzima, possivelmente para a cistena. Essa mesma enzima possivelmente tambm remova os grupos metil, que esto ligados aos grupos fosfatos da cadeia de DNA. Uma bizarra e extravagante caracterstica dessa reao, que no existem meios de se recuperar a enzima metilada. Desta forma, uma nova molcula de enzima gasta para cada grupo metil removido. Resposta Adaptativa. Se durante o crescimento da E. coli elas forem expostas a uma baixa concentrao de nitrosoguanidina, elas se tornam, posteriormente, muito mais resistentes aos efeitos txicos e mutagnicos desse agente. Esta induo de resistncia chamada RESPOSTA ADAPTATIVA, e resulta de um aumento de centena de vezes da enzima O6-metilguanina-metiltransferase e uma concorrente induo de glicosilase, que remove bases alquiladas do DNA. A induo de ambas as enzimas so bloqueadas por mutaes no gene ada . A MAIORIA DOS REPAROS COMPLEMENTAR DO DNA. DEPENDE DA INFORMAO CONTIDA NA FITA

a prpria natureza da molcula, fita dupla de DNA que permite quase sempre que um erro seja reparado; pela possibilidade de se restabelecer a seqncia original de uma cadeia, usando como molde a fita complementar. Existem vrios caminhos para que o reparo por exciso atue removendo a base ou segmento de DNA. Todos eles levam, entretanto, ao mesmo produto intermedirio: uma quebra na fita simples ou um gap no DNA que proporciona o aparecimento de uma 3hidroxila terminal, onde a polimerase pode iniciar a sntese de uma nova seqncia. Clulas mutantes para o gene da DNA polimerase I so muito deficientes para realizarem o reparo por exciso. Somente esta enzima abundante e suficientemente mvel para localizar pequenas falhas (gaps), eficientemente, quando muitos stios devem ser reparados de uma s vez. Outra enzima comum e essencial no processo a DNA ligase (polinucleotdeo ligase) que liga os nucleotdeos aps a correo feita pela DNA polimerase I.

A ENDONUCLEASE UvrABC REMOVE UM SEGMENTO DE 12 PARES DE BASES AO REDOR DO STIO ALTERADO. O isolamento de mutantes tem sido essencial para a compreenso dos mecanismos de reparo do DNA. Alm do gene (phr ) da fotolase, as mutaes em E. coli que as tornam sensveis a luz UV podem ocorrer, principalmente, em 3 genes uvrA, uvrB e uvrC. Diferentemente do processo de fotoreativao, o sistema de reparo exercido por estes 3 genes no especfico para danos provocados exclusivamente pela UV, mas por quaisquer alteraes que envolvam alteraes e distores espaciais na molcula de DNA. Esses 3 genes codificam separadamente subunidades de uma mesma enzima que corta e remove o segmento de uma fita de DNA que apresenta a alterao. Estudos de clonagem dos 3 genes uvr permitiram a obteno de grande quantidade de produtos polipeptdeos desses genes e a sua purificao separadamente. Quando eles foram misturados in vitro com DNA contendo dmeros de pirimidina, constatou-se uma complexa atividade dependente de todos os 3 genes: A enzima UvrABC corta em ambos os lados do dmero, liberando um oligonucleotdeo de 12 bases contendo o dmero e deixando um gap de 12 bases que restaurado pela DNA polimerase, usando a fita normal como complementar. A polinucleotdeo ligase ou DNA ligase completa a ligao lateral dos nucleotdeos, restabelecendo a informao correta novamente. Ficou claro dos trabalhos experimentais desta enzima com DNA apresentando diferentes tipos de leses, que a enzima UvrABC no detecta diretamente uma leso em particular, mas realmente ela reconhece a AUSNCIA de uma forma normal no DNA. Como isto ocorre? Foi observado que os dois cortes so feitos no mesmo lado de uma das fitas do DNA, distando um pouco mais de uma volta. Normalmente ficam 78 nucleotdeos do lado 5 do dmero, e 45 nucleotdeos do lado 3 do dmero. Imaginou-se que a enzima sente a forma do DNA no segmento de 12 pares, pelo alinhamento correto do centro de atividade nuclesica da enzima, possivelmente envolvendo a dupla fita. Se a enzima detecta uma forma espacial anormal num dos fios, a sua atividade nuclesica ativada e os cortes de restaurao so feitos (Figura 12.8).

ERROS NAS BASES PODEM SER REMOVIDOS PELAS GLICOSILASES. As clulas tem uma segunda maneira de retirar ou excisar a base alterada e este processo se inicia por uma enzima GLICOSILASE, que detecta uma base alterada e a remove do acar dexoribose, deixando intacta a estrutura helicoidal acar-fosfato. O buraco (falha) resultante dessa remoo de base chamado stio AP , que uma abreviao de stio APURINICO quando faltam as bases A ou G, ou de stio APIRIMIDICO, quando faltam as bases C ou T. Esses stios tambm podem resultar de perdas naturais de bases atravs de rupturas das ligaes glicosdicas. O buraco , ento, reconhecido por uma endonuclease AP que corta o esqueleto acar-fosfato (ligao fosfodiester) deixando um primer final, de onde da DNA polimerase inicia a sntese para substituir o nucleotdeo errado, junto com alguns poucos nucleotdeos adjacentes (Figura 12.9).

Quando a DNA polimerase I se liga ao primer final, a sua atividade exonuclease 5- 3 atua cortando (retirando) uns poucos nucleotdeos perto da base errada, e sua atividade polimersica se incumbe de completar o gap formado. Essa atividade, na qual a DNA polimerase I simultaneamente realiza a remoo dos nucleotdeos e faz a correta polimerizao, chamado de NICK TRANSLATION. Existem diferentes glicosilases que removem leses especficas, em particular, as bases aberrantemente metiladas. A URACILA-DNA GLICOSILASE corrige um problema causado pela instabilidade natural da citosina. A deaminao da citosina ocorre espontaneamente em uma baixa taxa, produzindo uracila. A glicosilase reconhece e remove os resduos de uracila do DNA, permitindo que a citosina seja restabelecida pela DNA polimerase. Este sistema de reparo frustrado de uma maneira eficiente se a citosina metilada no carbono-5, como ocorre, por exemplo, em seqncias protegidas de endonucleases de restrio. A 5-metil citosina se pareia normalmente no DNA e no removida pela glicosilase, entretanto, a deaminao da 5-metil citosina resulta em TIMINA e no em URACILA. A timina, sendo uma base natural do DNA, no removida pela URACILA-DNA GLICOSILASE ou por outra enzima qualquer (Figura 12.10).

Essa timina, produzida a partir da 5-metil citosina, ir se parear com a adenina, aumentando a taxa de mutao. Desta forma, a 5-metil citosina considerada como hot-spot para mutaes espontneas. REMOES DE ERROS DE PAREAMENTOS QUE ESCAPARAM DA REVISO. Alguns pareamentos errados de bases se mantm mesmo aps a atividade revisora exercida pela DNA polimerase, em bactrias. Assim como na polimerizao, a reviso dos erros pode ter um limite finito de eficincia. Uma boa estimativa que a DNA polimerase cometa um erro por 108 pares de bases replicados que, entretanto, no se manifestam como mutaes, visto que a taxa de mutao mais baixa e eqivale a 1 erro para cada 1010 10 11 nucleotdeos. Em E. coli, o grau final de fidelidade de responsabilidade de uma mismatch correction enzime codificada pelos genes: mutH, mutL e mutS. Esta enzima checa o DNA recentemente replicado para detectar o pareamento imprprio e remove um segmento fita simples do DNA contendo o nucleotdeo errado, permitindo a posterior ao da DNA polimerase para refazer o gap. O problema bvio de como a enzima detecta qual BASE de um par imprprio a ERRADA, visto que ambas so componentes naturais do DNA. Se qualquer uma das bases for removida ao acaso, claro que existe uma probabilidade de 50% ser removida a base certa (estabelecendo a mutao) e 50% de ser removida a base errada, e o DNA ser corrigido. Realmente, um sinal especfico atua para que o sistema de exciso da base errada acontea somente no filamento que foi recentemente sintetizado. A enzima de correo de pareamento remove um segmento de DNA que contm a base errada somente de uma cadeia, onde tambm ocorre uma seqncia GATC prxima (Figura 12.11).

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Entretanto, se a metilase codificada pelo gene dam modificar primeiro a adenina na seqncia GATC transformando-a para N6-metiladenina, a enzima de correo no pode atuar e o reparo por exciso no ocorre. A maioria das seqncias GATC se tornam, assim, modificadas aps a sua sntese, mas somente aps um curto perodo, talvez por segundos ou minutos. Este tempo suficiente para a enzima de correo de pareamento se ligar nessa seqncia GATC da cadeia que foi recentemente sintetizada. A enzima de correo detecta no somente erros de pareamento como tambm pequenas adies ou delees, reduzindo a ocorrncia de frameshift mutation, bem como a substituio de bases. INDUO DOS GENES SOS DE REPARO DE DNA. Visto que a clula pode freqentemente regular a expresso de seus genes de acordo com a necessidade de seus produtos, no surpreendente que algumas enzimas de reparo possam ser induzidas pelos danos provocados no DNA. Por exemplo: As metiltransferases so induzidas pelo DNA anormalmente alquilado durante a resposta adaptativa. Entretanto, um grupo maior e mais importante de enzimas so codificadas pelos genes SOS. Os genes SOS so induzidos por um erro que suficientemente severo para bloquear a sntese de DNA, mais do que simplesmente alterar uma mudana nos pareamentos das bases. Um exemplo de induo da resposta SOS provocado pela ocorrncia dos dmeros de pirimidina, que no alteram o par de base. Quando a forquilha de replicao encontra o dmero, ela para e reinicia a sntese em um ponto distante do dmero, produzindo um gap no DNA que ir ser reconhecido pela enzima de recombinao recA, que se ligar nessa regio.

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Alm de iniciar a troca de cadeias de DNA, assim como no reparo recombinacional, a ligao da enzima recA a um pedao de fita simples do DNA, faz com que ela assuma uma outra funo inteiramente distinta da recombinao e passe a ter uma atividade proteoltica. Essa atividade proteoltica faz com que ela seja capaz de clivar os repressores dos genes da resposta SOS, produzidos pelo gene repressor LexA. Desta forma, a protena RecA promove tanto o reparo por recombinao, como mediadora da induo de aproximadamente 15 genes SOS. Alguns desses genes que esto relacionados com os reparos por exciso como uvrA, uvrB, uvrC e o prprio recA, aparecem normalmente expressos numa taxa significativa mesmo sem a induo; entretanto, eles so muito mais rapidamente expressos quando ocorre a leso do DNA. (Figura 2)

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(Figura 2) POSTREPLICATION REPAIR deals with a pyrimidine dimer (A) that interferes with replication, during which the parental strands (black) unwind at the replication fork and two daughter strands (color) are synthesized (1); other dimers (B, C) are handled by excision repair. Dimer A prevents base pairing along a stretch of one parental strand, producing a postreplication gap opposite a stretch of single-strand DNA (2). Rec A protein (light color) binds of the single-strand region (3) and aligns it with a mologous region of the sister duplex; when homologous pairing is achieved, an enzyme into the gap, producing a crossed-strand exchange (5). The upper heteroduplex can now be repaired by DNA polymerase. With the correct sequence in place opposite dimer A an with Rec A released, dimer A is delatl with by excision-repair enzymes (6). Finally, two cuts are made by a enzyme at the site of the crossed-strand exchange (7), resolving the recombination process and producing two intact heteroduplex molecules (8).

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FENMENOS rec-lex. Com diplides parciais em E. coli que apresentavam duas verses de um mesmo gene, foi observado que lexA era dominante sobre lexA (selvagem) e que a clula apresentava caracterstica de lexA como, por exemplo, a sensibilidade aos efeitos das radiaes X. A dominncia de um gene mutante freqentemente indica que ele pode estar relacionado com a regulao gnica, como ocorre, por exemplo, com alguns mutantes do gene lacI, do operon lactose em E. coli. Por analogia, imaginou-se que o lexA poderia codificar uma protena repressora que regulasse certas enzimas envolvidas no reparo do DNA. Os mutantes lexA podiam ser sensveis a UV, porque eles fariam molculas repressoras que no seriam clivadas e manteriam os genes responsveis pelo reparo, totalmente bloqueados. Os trabalhos subseqentes mostraram que as enzimas de reparo e do sistema SOS so controladas ao mesmo tempo. Atravs de tcnicas do DNA recombinante, foi possvel se isolar o gene lexA, inser-lo num plasmdeo, clon-lo e identificar uma protena feita por ele que tinha um PM: 24.000 dltons. Ela foi isolada e verificaram que essa protena repressora podia ser clivada pela protease do gene recA. Mark Ptashne & Roger Brent demonstraram que o gene lexA reprimido pela prpria protena LexA, que ele fabrica. Se o lexA um gene repressor, quais genes ele reprime alm dos seus? Verificaram que lexA atua reprimindo um grupo de genes envolvidos no reparo por exciso, reparo ps-replicao e na prpria resposta SOS. Quando as clulas so expostas a UV, ocorre a formao dos dmeros de pirimidinas, que no podendo ser removidos por algumas poucas molculas presentes no estado no induzido, vo permanecer perto da forquilha de replicao e vo ocasionar o aparecimento de fitas de DNA com gaps. Uma protena RecA j presente na clula se liga ao fio de DNA fita simples oposto ao gap, e a presena do DNA fita simples estimula a atividade de clivagem das protenas RecA, desencadeando a resposta SOS. A protena RecA cliva os repressores LexA, liberando outros genes que estavam reprimidos. Grande quantidade de protena RecA so sintetizadas e passa a se ligar prximas a regio do gap, inclusive ocupando regies adjacentes de DNA fita dupla. Sob estas condies, a protena LexA clivada to logo ela sintetizada e os genes recA, uvrA, uvrB, uvrC ficam liberados para promoverem os reparos: por exciso e ps-replicao. Enquanto houver DNA fita simples na regio do gap, a atividade protease da RecA mantida e vai clivando continuadamente os repressores formados pelo gene lexA. Aps ser executado o reparo ps-replicao, a regio do gap de fita simples restaurada e agora, nessas condies com todo o DNA na forma de fita dupla, a protena RecA diminui sua atividade protease. A protena LexA, recm-sintetizada, no mais clivada e volta a funcionar como repressora, e a clula retorna ao seu estado normal sem resposta SOS induzida. Claramente, a resposta SOS promove um eficiente reparo do DNA, aumentando a eficincia das enzimas do reparo por exciso e promovendo condies para o reparo ps-replicao. No reparo por exciso, as enzimas codificadas pelos genes uvrA, uvrB e uvrC atuam juntas para reconhecer as bases erradas e iniciam o processo de exciso. Visto que as clulas podem sobreviver aps a ocorrncia de milhares de leses, necessrio que um grande nmero dessas molculas sejam sintetizadas para atuar no processo. Em uma clula normal, sem estar no estado induzido, ocorrem de 10-20 molculas dessas enzimas. A protena RecA tem duas diferentes funes nesses mecanismos de reparos induzidos: atua como protease clivando as protenas repressoras LexA, e atua como enzima de recombinao que manipula os fios de DNA. Na recombinao, tal como ocorre no reparo ps-replicao, a sua primeira funo a de promover o pareamento homlogo entre 2 molculas de DNA, isto , posicionar corretamente alinhando regies de seqncias de bases complementares, para que se efetue uma mudana de fios. Uma grande quantidade da protena RecA, 1 molcula para cada 5 pares de bases necessria para promover o pareamento homlogo, e ser suficiente para dar ao fio com o gap uma estrutura fibrosa de suporte, que aproxima as molculas de DNA, pondo-as em contacto e movendo-se para que seja feito um contacto complementar.

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O movimento relativo no estilo caterpilhar, o DNA com gap se elonga e se contrai com a RecA ligada a ele, que depois liberada pelo ATP. Tendo colocado as molculas de DNA no alinhamento numa regio particular, a RecA inicia a efetiva mudana dos fios. A recA efetua uma mudana recproca nas duas regies de dupla fita do DNA e o resultado so 2 heteroduplex, nos quais os 4 fios apresentam segmentos com as informaes corretas. (Figura 3)

Figura 3

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MUTAGNICOS NA NATUREZA E SUA DETECO. importante identificar mutagnicos aos quais o homem se expe por duas razes: 1. As mudanas genticas ocorridas ao acaso so mais provveis de serem danosas (malficas), do que benficas para as prximas geraes. 2. Mesmo que as mutaes ocorram nas clulas somticas (linhagens no germinativas) e no passem para as geraes seguintes, elas podem eventualmente afetar o organismo portador. Agora j se sabe como h muito se suspeitou, que o cncer freqentemente resultado de mutaes nas clulas somticas que levam a um crescimento celular desordenado. E um nmero de alteraes associadas com a idade, como a aterosclerose, pode ser o reflexo do acmulo de erros de DNA que no foram reparados. De fato, tem sido sugerido que o processo de envelhecimento global possa ser o reflexo de danos irreversveis da molcula de DNA em clulas somticas. A clara demonstrao que a maioria das substncias mutagnicas so carcinognicas (e vice-versa), significa que h uma maneira de se poder determinar se a substncia provavelmente carcinognica. Ns determinamos se ela mutagnica em bactrias, as quais apresentam um tempo curto entre geraes e que permite que o teste possa ser feito em um ou dois dias (Figura 12.2).

Figura 12-2 Small additions and deletions are caused by slippage at the replication growing point.

Este mtodo, agora chamado de Teste de Ames, foi desenvolvido e refinado por Bruce Ames, o qual usou vrias artimanhas para faz-lo muito sensvel. A taxa de REVERSO ao tipo selvagem (prototrfico) de uma mutao que causa um crescimento anormal, tal como o requerimento (auxotrfica) para o aminocido histidina, quantificada. Mesmo entre aquelas poucas clulas que crescem em meio sem histidina, pode-se desenvolver colnias que podem ser quantificadas (revertentes espontneos) (Figura 12.12).

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O teste de bactria tem revelado que a mutao faz com que a parede celular fique defeituosa e altere a sua permeabilidade, permitindo, assim, que a maioria dos compostos a serem testados passem por ela e atuem sobre o material gentico. Elas tambm carregam um plasmdeo que expressam uma eficiente variante dos genes umuC e umuD, os quais so essencialmente mutagnicos. Uma condio final para carcinognios serem ativos como mutagnicos nos testes com bactrias, revelou um princpio importante da mutagnese em organismos superiores. A maioria dos compostos carginognicos, particularmente os produtos naturais, eles no so mutagnicos se eles so aplicados diretamente no crescimento de bactrias. Primeiro, eles precisam ser ATIVADOS por incubao com um extrato de fgado de mamfero, um processo que ocorre naturalmente quando substncias estranhas so metabolizadas no fgado. A ativao converte os carcinognios para derivados eletroflicos, que podem reagir diretamente com as bases do DNA. Quais so os mais importantes mutagnicos revelados pelos testes como provveis carcinognicos? Est provado, por meio de testes epidemiolgicos, que a fumaa do tabaco um dos mais importantes carcingenos que os homens utilizam, e a fumaa do tabaco altamente mutagnica para o teste de Ames. O perigo potencial de certos resduos qumicos industriais serem mutagnicos, como o dicloro etileno bem conhecido, e alguns outros contaminantes ambientais podem ser significantes carcinognios. Mas a maior constatao recente, que ns estamos expostos continuadamente aos mutagnicos e aos carcingenos que entram via alimentao; que no so necessariamente encontrados em comidas exticas, mas nos mais simples vegetais. As plantas recebem substncias qumicas, como os defensivos usados contra as pragas, principalmente insetos, e essas substncias, aps serem metabolizadas no fgado, se constituem em potentes agentes mutagnicos. Os reais mutagnicos freqentemente so OXIDANTES, tais como aqueles radicais oxigenados, que reagem como as bases do DNA.

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Uma outra fonte de mutagnicos que entram via alimentao e so considerados como potenciais carcingenos so os lipdios, que so metabolizados e produzem oxidantes reativos no fgado. Uma nota otimista, entretanto, que existem ANTIOXIDANTES naturais como o glutation, que pode minimizar alguns desses efeitos produzidos pelos alimentos.

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INFORMAES ADICIONAIS SOBRE AS AULAS TERICAS.

DNA MICROSATELLITES: Agents of Evolution Scientific American, 1999, 280(1):72-77.

slide 1.

CDIGO GENTICO HUMANO: 3 bilhes de bases de DNA.

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Apenas 10-15% esto relacionadas com PROTENAS DE MANUTENO, RGULAO GNICA E EMPACOTAMENTO DOS CROMOSSOMOS. E O RESTO? "SUJEIRA EVOLUTIVA" ?

slide 2. "SUJEIRA EVOLUTIVA" - seqncias altamente repetitivas 4- at 8 bases: MICROSSATLITES 15 ou mais bases: MINISSATLITES HOMEM: 100.000 microssatlites

slide 3

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Caractersticas dos microssatlites - altamente repetitivo - alteraes de tamanho - DELEO E INSERO - alta taxa de mutao: 10 mil X > que a taxa de mutao do gene da anemia falciforme.

slide 4 Hemophilus influenzae - LINHAGEM DO TIPO b RESPONSVEL PELA MENINGITE BACTERIANA

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membrana externa: LIPOSSACARDEOS (LPS) CONTENDO COLINA FOSTATADA - que permite a bactria se aderir em clulas do NARIZ E GARGANTA - sem provocar sintomas.

Nota: 1/750 crianas menores de 5 anos tinham meningite do tipo B. slide 5. A MEMBRANA EXTERNA (LPS) CODIFICADA POR TRS GENES - QUE APRESENTAM MICROSSATLITES DE 4 BASES: CAAT. Chop + alto nmero de repeties Chop - pouco nmero de repeties

slide 6. Chop + ==.> EFICIENTE PARA CONTAMINAR O HOMEM (NARIZ - GARGANTA) (TIPO MAIS FREQENTE NO HOMEM) Chop - == > MAIS RESISTENTE AOS ATAQUES IMUNOLGICOS - NO SE ADERE AS CLULAS.

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slide 7 INFECO VIRAL - PROCESSO INFLAMATRIO A BACTRIA IR TER QUE SE DEFENDER AO ATAQUE IMUNOLGICO E A A SITUO ChopSER VANTAJOSA.

slide 8 GENES CONTINGENTES - pequena frao do genoma bacteriano responsveis por estas duas condies. Se somente 10 dos 2000 genes de uma bactria forem contingentes, ela poder ter a cada diviso pelo menos um dos tipos Chop+ ou Chop-

slide 9 DOENA DE HUNTINGTON DEGENERATIVA CARACTERIZADA POR DEMNCIA, PERDA DO CONTROLE MOTOR E MORTE RPIDA APS A SUA EXPRESSO. MANIFESTAO OCORRE GERALMENTE APS A IDADE REPRODUTIVA.

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slide 10 DOENA DE HUNTINGTON - DOMINANTE Alterao em um protena normal chamada HUNTINGTIN que tem no seu incio 10-30 GLUTAMINAS (Gln). Microssatlites - alteram a protena colocando 36 - ou mais Gln na cadeia.

slide 11 DETECTANDO CNCER

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MUTAES nos genes p53 e ras Pode-se detectar 1/10.000 clulas normais. Mas no ocorrem em todos os tipos de cnceres e nem mesmo em cnceres do mesmo tipo. Slide 12 AVANO NO DIAGNSTICO PELA ALTERAO NO TAMANHO DOS MICROSSATLITES PODE-SE DETECTAR 1/500 CLULAS NORMAIS.

Nota: Microssatlites como base evolutiva. Neisseria gonorrhoeae - uma bactria que causa gonorria - uma doena sexualmente transmissvel (DST) 12 ou mais genes Opas (formam colnias opacas de Bactrias) esto relacionados com as protenas da membrana - que ajudam a bactria aderir e invadir clulas epiteliais como as do trato respiratrio e sistema imune.

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Genes opas - apresentam microssatlites com 5 bases CTCTT - com alta frequncia de alteraes no nmero dessas repeties. Produzem 1 alterao a cada 100-1000 clulas filhas. Inseres ou delees - alteram a informao gentica, por mudana ou cdons de leitura. -Algumas delees - alteram protenas da bactria que impedem que elas entrem nas clulas. - Essas delees podem ser revertidas na gerao segunte. - Variaes de fase - podem ser adapativas e permitem ou no a possibilidade de entrar nas clulas e serem fagocitadas.

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UNIDADES DE RADIAO ROENTGEN = R DOSE DE EXPOSIO QUE PROMOVE NUM CM3 DE AR (0,001293 g) UM TOTAL DE ONS = 1 STAT-C.

2,082.10

rad = ROENTGEN ABSORVED DOSE - A

QUANTIDADE DE ENERGIA ABSORVIDA POR UNIDADE DE MASSA DO MATERIAL IRRADIADO.

rad= 100 erg/grama

RELAO =

rad=0,877 R

GRAY = Gy - Dose Absorvida

1Gy= 100rad

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RADIAO DIRETAMENTE PROPORCIONAL AO TEMPO E INVERSAMENTE PROPORCIONAL AO QUADRADO DA DISTNCIA.

(D1) ------------(D2) D = DISTNCIA =

R2 -----------R1 R= ROENTGEN

FONTE DE CO-60 DA GENTICA

Nvel de Radiao: 2220 R/hora/10 cm Calcular qual a quantidade de radiao recebida por um cromossomo de linfcito humano depois de 20 min, considerando que o sangue foi irradiado dentro de um tubo, posicionado a 50 cm da fonte.

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SUNLIGHT AND SKIN CANCER

David J. Leffel and Douglas E. Brash Scientific American, July 1996, 38-43.

clulas basais,.clulas escamosas e melancitos - MELANOMA MALGNO (menos comum)

CNCER DE PELE:

USA - 38.000 casos em 1995 e apenas 7 000 mortes. Danos no gene p53 parece ser crucial aos cnceres de clulas basais e cluas escamosas que tambm esto associados a radiao UV-B do sol.

O GENE P53 - QUE UM GENE SUPRESSOR DE TUMOR E QUE EST MUTADO EM MAIS DA METADE DAS PESSOAS QUE TEM CNCER.
CONSTATOU-SE UMA INTRIGANTE CONEXO ENTRE CNCER DE PELE NO MELANOMA (DE CLULAS BASAIS OU ESCAMOSAS) COM UMA RARA ALTERAO:

EPIDERMODISPLASIA VERRUCIFORMIS
QUE CAUSA O APARECIMENTO E CRESCIMENTO DE VERRUGAS NA PELE E QUE ELAS APRESENTAVAM DNA DO

VRUS DO

PAPILOMA HUMANO - E QUANDO ESSAS VERRUGAS ESTO EXPOSTAS

AO SOL, PODEM EVOLUIR PARA UM CNCER DE CLULAS BASAIS OU DE CLULAS ESCAMOSAS.

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FOI DEMONSTRADO POSTERIORMENTE QUE UMA DAS PROTENAS FEITAS PELO VRUS DO PAPILOMA HUMANO

INATIVA A PROTENA p53.

ESTUDANDO CARCINOMAS DE CLULAS ESCAMOSAS, QUE SO INEGAVELMENTE ASSOCIADOS AO SOL - POIS ACONTECEM NAS FACES E NAS MOS DE PESSOAS BRANCAS NOS TRPICOS - DESCOBRIU-SE QUE 90% DELES TINHAM UMA MUTAO EM ALGUM PONTO DO GENE SUPRESSOR DE TUMOR P53.
HAVIA A OCORRNCIA DE EM STIOS ADJACENTES AOS DMEROS DE BASES PIRIMDICAS, NOTAMENTE DO TIPO C-C, QUE LEVA A MUTAO DE PONTO C-T, TPICAS DE EXPOSIO A UV.

9 HOT SPOTS

COMO TUDO ISTO ACONTECE?

p53 NORMAL E APOPTOSE (MORTE CELULAR PROGRAMADA)- EM CLULAS
INJURIADAS PELO SOL.- SEGUIDAS DE SUBSTITUO.

p53 MUTADO RETARDA O MECANISMO DE REPARO DE CLULAS DIMERIZADAS E COM MUTAES. IMPEDE QUE ELAS SE DESTRUAM E PERMITE A MULTIPLICAO DESSAS CLULAS MUTADAS QUE IRO OCUPAR OS ESPAOS DEIXADOS PELAS CLULAS NORMAIS INJURIADAS QUE MORRERAM. - LEVANDO A UM CRESCIMENTO DESORDENADO E APARECIMENTO DO TUMOR.

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A LUZ DO SOL ATUA DUAS VEZES PARA CAUSAR O CNCER:

UMA PARA MUTAR O GENE P53 E OUTRA PARA INJURIAR AS CLULAS SADIAS PRXIMAS DE CLULA MUTADA LEVANDO A SUA MORTE E CONSEQUENTE SUBSTITUIO POR CLULAS COM O P53 MUTADO.

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RISCOS DE UM BRONZEAMENTO RPIDO - CINCIA HOJE, 1989 - 9(54):26. CARMEN BOTO QUEROL & JOO ANTNIO PGAS HENRIQUES. CLASSIFICAO: UV curto UV longa germicida luz negra !------------------! !----------------------! 200-------------290-----320----------400 nm UVC UVB UVA

UVA - luz negra - usada na PUVA terapia. PUVA -terapia - consiste na associao de UVA longa + PSORALENOS PSORALENOS OU FUROCUMARINAS - CONSTITUEM UM GRUPO DE COMPOSTOS AROMTICOS TRICCLICOS DE ORIGEM NATURAL OU SINTTICA.. EM COMBINAO COM O DNA PROPORCIONAM EFEITOS BIOLGICOS DIVERSOS: - SENSIBILIZAO DA PELE - ATIVAO DA PRODUO DE MELANINA - INATIVAO CELULAR

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- GENOTOXICIDADE - ALTERAM O CONTEDO INFORMACIONAL DOS GENES. A PUVA TERAPIA UTILIZADA PARA O TRATAMENTO: PSORASE - APARECIMENTO DE PLACAS SPERAS SALIENTES E FREQUENTEMENTE AVERMELHADAS, PRINCIPALMENTE NOS COTOVELOS E JOELHOS. VITILGO - DESPIGMENTAO DE REAS DA PELE PELA AUSNCIA DE MELANINA. PSORASE: TRATAMENTO CONSISTE EM TOMAR 2 CPSULAS DE PSORALENOS E VOLTAR CLNICA DEPOIS DE 2 HORAS PARA UM BANHO DE RADIAO UV LONGA APS 20 SESSES PELA INIBIO DA DIVISO CELULAR, COME-SE A VERIFICAR OS EFEITOS DA PUVA-TERAPIA.. NECESSITA - TERAPIA DE MANUTENO, COM CONSTANTES DESLOCAMENTOS E POSSIBLIDADES DE EXPOR O PACIENTE AO SOL, AUMENTANDO OS RISCOS DE ERITEMA, QUEIMADURAS E LESES NOS OLHOS.

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USO CONTINUADO QUESTIONADO: -EFEITO CARGINOGNICO - ENVELHECIMENTO PRECOCE - TENDNCIA A APARECIMENTO DE CATARATAS. VITILGO: REMDIO VITICROMIN - CONTENDO BERGAPTENO UMA FUROCUMARINA DE AO FOTOSSEMBILIZANTE - EMPREGADA NO TRATAMENTO DA DESPIGMENTAO - E QUE PODE LEVAR AO APARECIMENTO DE CNCER DEPOIS DE 14-20 ANOS DE TRATAMENTO. TRISORALEM - PSORALENO ENCONTRADO NO LIMO, LIMA, BERGAMOTA OXARELEM OU 8-METOXIPSORALENO (8-MOP) SUBSTNCIAS QUE REAGE A LUZ UV, PROVOCANDO, VRIOS EFEITOS INCLUSIVE O ESCURECIMENTO DA PELE. CLNICAS ESTTICAS - PASSARAM A FAZER O BRONZEAMENTO RPIDO - USANDO A UV + PSORALENO.

CONTRA OS EFEITOS DA UV - SO USADOS FILTROS SOLARES OU PROTETORES, QUE DEVEM BLOLQUEAR 98% DA UVB. SEGUNDO LEGISLAO INTERNACIONAL.

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PARA EVITAR QUE OS PROTETORES IMPEAM O BRONZEAMENTO - OS FABRICANTES DE COSMTICOS PASSARAM A ADICIONAR OS PSORALENOS, QUE NA PRESENA DE UVA INTENSIFICAM A PRODUO DE MELANINA. ISTO PROIBIDO EM PASES DO PRIMEIRO MUNDO.!!!

Dr.VOLNER KIRCHHOFF - INPE - CRIA UM INDICE DE EXPOSIO ASSOCIANDO A COR DA PELE COM O TEMPO, PARA AS DIFERENTES REGIES DO BRASIL.