Utpl Ingenieria Quimica 2010 Fernando Merida

Loja, Ecuador
Julio 26 al 31, 2010
LA INGENIERA DE BIOPROCESOS
Fernando Mrida
Ingeniero Qumico, Universidad de San Carlos de Guatemala MSc. Ingeniera Qumica, Universidad de Puerto Rico
AGENDA
1. Introduccin y definiciones 2. Estructura y funcin celular 3. Base bioqumica 4. Enzimas y cintica enzimtica 5. Cintica de fermentacin 6. Bioseparaciones 7. Procesos bioqumicos industriales
Mdulo I: Introduccin y Definiciones
INTRODUCCIN
Ciencias biolgicas
Bioqumica - Ingeniera Bioqumica - Bioingeniera - Biotecnologa Ingeniera Qumica - Ing. Bioprocesos - Ing. Biolgica
Ciencias qumicas
Ingeniera
INTRODUCCIN
Penicillium notatum
Bilogos + Ingenieros
Staphylococcus aureus
!1939: 1 ppm penicilina !Tanques sumergidos !1945: 100 mil pacientes/ao !Merck: Ing. Qumico + Microbilogo Produccin industrial de penicilina en la 2 guerra mundial !2000: 50 g/L penicilina
Ingeniero de Bioprocesos
Qumica Biologa
Qumica Bioqumica Microbiologa Diseo de Reactores
Ingeniera Qumica Ingeniera Mecnica Ingeniera Industrial
Operaciones Unitarias
(Extraccin, Filtracin, Centrifugacin)
Cromatografa Intercambio inico Seguridad Industrial Control de Produccin Diseo de Plantas Empaque
DEFINICIONES
Biotecnologa:
Cualquier aplicacin tecnolgica que usa sistemas biolgicos, organismos vivos o derivados de ellos, para hacer o modificar productos o procesos para un uso especfico.
Aplicacin de los principios de Ingeniera para hacer frente a los retos en los campos de Biologa y Medicina. Ingeniera Biolgica: nfasis en plantas y animales
Bioingeniera:
Ingeniera Biomdica: Aplicacin de los principios y

tcnicas de ingeniera a los campos de la medicina. Brecha muy corta entre ingeniera y medicina
DEFINICIONES
Ingeniera Bioqumica:
Rama de la Ingeniera Qumica o Ingeniera Biolgica que trata principalmente con el diseo y construccin de equipos que involucran organismos vivos y/o biomolculas.
Fusin entre biotechnologa y nanotecnologa. Uso de biomolculas para aplicaciones en nanotecnologa. Tecnologa sinttica basada en las rutas y principiios qumicos de los organismos vivos.
Bionanotecnologa:
Ingeniera de Bioprocesos: Rama de la Ingeniera

Bioqumica que adems incluye el trabajo de otras reas de la Ingeniera para el diseo y desarrollo de procesos basados en el uso de clulas vivas
MOTIVACIN
Qu hace un Ingeniero de Bioprocesos?
!Investigacin para la Industria Farmacutica Alimentos Cosmticos Biocombustibles Pinturas Agricultura Investigacin aplicada
North Carolina Community College Systems
!Ing. Qumicos -Bioprocesos!Eva Nelly Rubio: Universidad de Puerto Rico, Biotecnologa Industrial.
!Vitaminas, antibiticos, queso, pan, vino, tinta, cosmticos, shampoo, pinturas, etc.
Mdulo II: Estructura y Funcin Celular
DIVERSIDAD BIOLGICA
Dominios Bacteria Archea Eukarya Protista Fungi
Reinos
Plantae
Animalia
Procariotas
Eucariotas
!0.5 3 m dimetro !Bacteria y Archea !Nucleoide !ADN circular en citoplasma !No organelos !Ejemplo: Escherichia coli
!5 20 m dimetro !Protista, fungi, plantae y animalia !Ncleo con membrana !ADN en ncleo y organelos !Organelos especializados !Ejemplo: S. cerevisiae
Insulina Humana
Bebidas Alcohlicas
Clulas eucariotas
Micrografa de un glbulo blanco humano, amplificada 40,500 veces (organelos en proyeccin)
Micrografa de la clula de una hoja de rbol, amplificada 14,000 veces (organelos proyectados)
Organelos Eucariotas
NCLEO: NUCLEOLO:
Material gentico (ADN) ! Cromosomas Sntesis de ribosomas y rARN
Rugoso Liso
RETCULO ENDOPLSMICO:
Complejo de membranas incrustadas en el citoplasma. Rugoso: Ribosomas en superficies interiores Liso: Sntesis de Lpidos
APARATO DE GOLGI: Secrecin de protenas y glicosilacin. Sistema de transporte de molculas LISOZOMAS: Vesculas. Reparacin organelos. RIBOSOMAS: Sntesis de protenas
Organelos Eucariotas (cont..)

MITOCONDRIAS: Respiracin celular y fosforilacin oxidativa. Tienen su propio ADN CENTRIOLOS: Pares cilndricos. Intervienen en la divisin celular. VACUOLAS: Digestin, regulacin osmtica y almacenamiento de desperdicios. pH acdico. CLOROPLASTOS: Rodeados por membrana. Sitios donde ocurre la fotosntesis. Tienen clorofila. MEMBRANA PLASMTICA: Formada por fosfolpidos. Permeabilidad selectiva PARED CELULAR: Capa rgida de peptidoglicano. No presente en animales y protistas
LOS VIRUS
!Agentes o partculas biolgicas !No son organismos vivos !No son clulas ni constan de ellas !Infectan clulas procariotas y eucariotas
Lisis celular Bacteria
Ensamblaje
Absorcin o fijacin
Replicacin del virus vegetativo
Inyeccin material gentico viral
ADN viral integrado al bacterial
Reproduccin de bateria lisognica
BACTERIAS EN LA INDUSTRIA
PRODUCCIN DE INSULINA HUMANA
Fermentacin
!Tanques sucesivos !Protena de fusin !Disrupcin celular !Centrifugacin !Lavado con agua
Aislamiento de protena Plegamiento de protena Purificacin y concentracin Cristalizacin y liofilizacin
!Solucin de urea !Cistena !Adsorcin/Desorcin !Propanol !Cromatografa doble !Cristalizacin !Re-disolucin !Re-cristalizacin !Secado por congelacin
FUNGI EN LA INDUSTRIA
PRODUCCIN DE CERV CERVEZA RV RVEZA
a) PREPARACIN DEL INCULO DE LEVADURA
Saccharomyces cerevisiae
b) PROCESO DE PRODUCCIN
ANIMALIA EN LA INDUSTRIA
PRODUCCIN DE VACUNA CONTRA INFLUENZA
Clulas MDCK: Clulas epiteliales de rin canino Clulas VERO: Clulas de rin de mono verde africano
!Cultivo de clulas MDCK en matraces !Escalamiento en botellas de lab. !Inculo: 2E5 cel/mL !Biorreactores de 5 a 20 L !Medio con nutrienets y microcarriers !Cultivo y lavado de clulas !Adicin de virus Instituto Max Planck (Alemania) !Produccin de la vacuna
Aventis Pasteur, Francia
VIRUS EN LA INDUSTRIA
PRODUCCIN DE SPRAY CON BACTERIFAGOS !Intralytix Inc: nica compaa aprobada por la FDA !Bacterifagos lticos !Seguridad alimenticia !Controles ambientales !Terapias en medicina veterinaria y medicina humana
!Uno de los virus utilizados para la erradicacin de E. coli O157:H7
!6 diferentes fagos !Listeria monocytogenes !Salchichas, jamones, etc. !Rociar directamente !Superficies de trabamo
!3 diferentes fagos !Escherichia coli O157:H7 !Salchichas, jamones, etc. !Solucin salina fosfatada
Mdulo III: Base Bioqumica
AMINOCIDOS
!Bloques constructores de protenas !Amino, Carboxilo y tomo de Hidrgeno !Residuo diferente en cada aminocido !Polaridad, ionizacin, aromaticidad o funcin especial
Curva de titulacin de lisina Enlace peptdico
!Slo L-aminocidos en protenas !D-aminocidos son raros (pared celular, celular antibiticos)
Hidrgeno
Amino
Residuo Carboxilo
!Zwitterion: Carga + y !Punto isoelctrico: Ninguna carga neta
AMINOCIDOS ESENCIALES
Glutamato: Mejorador de sabor
Aspartame: Mejorador de sabor
Arginina: Suplemento para deportistas
PROTENAS
!Polmeros hechos de aminocidos !Dos aminocidos: Dipptido !Tres aminocidos: Tripptido !Polipptido: Peso molecular <10,000 !Protena: PM>10,000 (miles de aminocidos)
Dipptido Nonapptido Protena
Funciones: Catlisis,
defensa, transporte, movilidad y regulacin
Aspartame: Fenilalanina y Acido Asprtico (metil-ester) Oxitocina Hemoglobina
PROTENAS: Estructura
Primaria: Secuencia lineal de los
aminocidos
Secundaria:
Extensin de la cadena. Resultado de puentes de Hidrgeno entre los residuos cercanos. Pueden formar lminas plegables y hlices
Terciaria: Interacciones entre los

residuos ms separados que hacen que las cadenas de aminocidos se doblen (covalente, disulfuro, H, hidrofbicas, hidroflicas)
Cuaternaria: Ms de una cadena

polipeptdica (subunidad) y las interacciones entre ellas.
CARBOHIDRATOS
MONOSACRIDOS: Los ms simples. !Almacenamiento de energa y estructura Contienen de 3 a 9 carbonos !C:H:O ! 1:2:1 Frmula: (CH2O)n
Ismeros estructurales y pticos
!Origen: Fotosntesis en plantas y algas
C6H12O6
Glucosa: El ms importante monosacrido y el ms abundante en los sistemas vivos.
CARBOHIDRATOS (cont..)
DISACRIDOS: Condensacin de dos
monosacridos formando enlace !-1,4glicosdico.
POLISACRIDOS: Ms de dos
monosacridos formando enlace glicosdico tipo !-1,4
Bio-polisacridos importantes Amilosa
Celulosa Amilopectina
LPIDOS
!Insolubles en ambientes acuosos !Presentes en membrana plasmtica celular !Mayores componentes: cidos grasos
Esteroides
Triglicridos
Fosfolpidos
CIDOS NUCLICOS
NUCLOTIDO Estructura tridimensional
Puentes de hidrgeno entre pares de !Enlace fosfodister bases nitrogenadas !C-5 ! C-3 en azucar
!Nucleosido: Nucletido sin el fosfato
CIDOS NUCLICOS (cont..)

CIDO RIBONUCLICO (ARN) CIDO DESOXIRIBONUCLICO (ADN)
!Formado por transcripcin de ADN !Sntesis de peptidos y protenas !Molcula larga no ramificada !ARN en clula es 6 veces ADN !Varias especies de ARN: t, m, n
!Estructura 3D en doble hlice !Bases nitrogenadas: Info gentica !Dimetro de hlice: 2 nm !Adenina se une siempre a Timina !Guanina se une siempre a Citosina
REPLICACIN DEL ADN

Mecanismo por el cual una molcula de ADN se duplica, creando copias idnticas de la molcula original
Mdulo IV: Enzimas y cintica enzimtica
QUE SON LAS ENZIMAS?

!Protenas de alto peso molecular (15000 millones) !Catalizan sustratos especficos sin consumirse !Sitios activos donde se forma complejo enzima-sustrato !Adicin del sufijo asa al final del sustrato
El modelo llave-y-cerradura
k1
+ E + S
k2
ES
ENZIMAS
!HOLOENZIMAS: Apoenzima + Co-factor
Protena con ms de una subunidad polipeptdica
Zinc: Cofactor
Anhidrasa carbnica
!ISOZIMAS: Forma molecular distinta pero catalizan la misma reaccin
Glucoquinasa
Glucosa
Hexoquinasa
ENZIMAS (cont..)
Fosforilacin de glucosa por hexoquinasa
1. Oxidoreductasas: Transf de electrones. Ej. Alcohol deshidrogenasa Transf grupos funcionales Ej. Glucoquinasa Reacciones de hidrlisis Ej. Sacarasa Adicin o eliminacin de grupos para formar o romper doblesenlaces. Ej. Piruvato descarboxilasa Reacc. de isomerizacin Ej. Glucosa isomerasa Formacin de enlaces C-C, C-S, C-O, C-N Ej. DNA polimerasa
2. Transferasas:
3. Hidrolasas:
Primera reaccin de la ruta metablica Gluclisis
4. Liasas:
5. Isomerasas:
6. Ligasas:
Cambio de conformacin de la enzima (Se cierra hacia los lados)
CINTICA ENZIMTICA
E + S
k1 k-1
ES
k2
E + P
Postulados:
!Sustrato limita la velocidad de reaccin ![S] bajas ! V aumenta linealmente ![S] altas ! V aumenta muy lentamente !Vo nunca llega a su valor mximo !Km: Valor al cual Vo es ! de su mximo Constante de Michaelis-Menten
[S]: Concentracin de sustrato V: Velocidad de reaccin Vm: Velocidad mxima de reaccin Km: Constante de saturacin
DERIVACIN DE LA ECUACIN DE M-M

[ES] no se puede medir
Tasa de variacin del complejo ES:
Asuncin del estado cuasiestacionario:

En un reactor batch, a t=0 [Eo] es tan pequea, por lo que d[ES]/dt"0
Asuncin de equilibrio rpido:

Constante de equilibrio:
DERIVACIN DE LA ECUACIN DE M-M (opc b)

[ES] no se puede medir
Paso 1: Anlisis del complejo enzima-sustrato Velocidad de formacin de [ES] = Velocidad de ruptura de [ES] = Paso 2: Equilibrio rpido
Paso 4: Vo en funcin de [ES]
Vmax ! Enzima saturada [ES] = ET ! Vmax=k2[ET]
Paso 3: Resolver para [ES]
Km: [S] a la cual Vo es la mitad de Vmax.
PARMETROS CINTICOS
El plot del doble-recproco
Grfico de Lineweaver-Burk
y = m x + b
VENTAJAS Y LIMITACIONES DEL MTODO !Buena estimacin para Vm !No es la mejor estimacin para Km !Se basa en mediciones a concentraciones bajas de sustrato: No es tan exacto
PARMETROS CINTICOS (continuacin)

Eadie-Hofstee Hanes-Woolf Cintica Batch
!Se usa cuando no hay varios experimentos batch a diferentes [S]
Km es funcin de T y pH
y=
b +
m x
y=
b +
m x
Vmax es funcin de k2 y de [Eo]
!Errores ambos lados contienen Vo: !Menos desviaciones a bajas [S]
!El mtodo ms usado para determinar Vmax con mayor exactitud
SUMARIO DE Km y Vmax
"!Km da una idea del rango de [S] al cual la reaccin ocurre. Mientras ms alta sea Km, ms dbil ser la anidad del sustrato para unirse a la enzima.! "!Vmax da una idea de qu tan rpido ocurre la reaccin bajo circunstancias ideales.! "!k2 / Km da una idea prctica de la eciencia cataltica, por ejemplo, qu tan a menudo una molcula de sustrato que est unida, reacciona para dar productos.!
INHIBICIN ENZIMTICA
COMPETITIVA NO COMPETITIVA UNCOMPETITIVA
MODELOS COMPLEJOS
Inhibicin competitiva Inhibicin No competitiva
Vm,ap Km,ap
!Incremento en Km,ap !Reducc de velocidad !Solucin: Alta [S]
Inhibicin Uncompetitiva
Km,ap
!Reduccin en Vm !Reducc de velocidad !Alta [S] no es solucin !Reducc en Vm y Km
ENZIMAS ALOSTRICAS
Determinacin de n:
n = Coef de cooperatividad
m x
EFECTOS DE pH & T
VARIACIONES DE pH
!Grupos inicos en sitios activos !Cambios en actividad de enzima !El sustrato tambin puede ionizarse
E- + H+ K2 EH + S Km EHS k2 EH + PZ
VARIACIONES DE TEMPERATURA
!Grupos inicos en sitios activos !Cambios en actividad de enzima !El sustrato tambin puede ionizarse
+
H+ K1 EH+2
Desnaturalizacin
Aumento de 30C a 40C

!Aumenta 1.8 veces actividad enzimtica !Aumenta 41 veces la desnaturalizaci{on
EJERCICIO DE CINTICA ENZIMTICA
ENZIMAS INMOVILIZADAS
!Restriccin de la enzima en un espacio cerrado !Reutilizacin de la enzima (Ahorro) !Recrear reacciones enzimticas biolgicas !Eliminar etapa de purificacin !La cintica enzimtica cambia por los efectos de difusin
ENZIMAS INMOVILIZADAS -AplicacionesAplicacin

Jarabe de maz alto en fructosa Industria de vinos y jugo de frutas Edulcorantes Aceite de palma
Sustrato
Glucosa
Enzima
Glucosa isomerasa #-glucosidasa Termolisina Lipasa
Producto
Isomerizacin de glucosa a fructosa Monoterpenos Aspartame Aceites ms ligeros
Terpenos cido Asprtico Triglicridos
Bio-sensores
BIOENERGTICA
Catabolismo: Degradacin de una molcula compleja a una ms simple. Produce energa
Anabolismo: Sntesis de molculas complejas a partir de una ms simple. Requiere energa.
Almacenamiento y transferencia de energa
Intercambio de electrones e hidronios en la produccin de energa
RUTAS METABLICAS
Secuencia de reacciones bioqumicas, catalizadas eficientemente por una enzima especfica.
Catabolismo aerbico de glucosa
1.! Gluclisis o Ruta Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) 2.! Ciclo de Krebs (Ciclo del cido ctrico o TCA) 3.! Fosforilacin oxidativa o Respiracin
Otras rutas
! Gluconeognsis (mas o menos lo contrario a Gluclisis) ! Fotosntesis
GLUCLISIS
Reaccin General de la Gluclisis:
Mdulo V: Crecimiento microbiano y fermentacin
Macronutrientes:
Concentraciones mayores de 10-4 M !Carbono ! Fotosntesis, azcares, molculas orgnicas
!Nitrgeno ! Amonio, urea, aminocidos, protena !Oxgeno ! O2 o aire !Hdrgeno ! Carbohidratos !Fsforo ! Fosfatos inorgnicos
Micronutrientes:
Concentraciones menores de 10-4 M (elementos traza) !Fe, Zn, Mn ! Cofactores de enzimas intracelulares
!Cu, Co, Mo, Ca, Na, Cl, Ni, Se ! Cofactores !B, Al, Si, Cr, V, Sn, Be, F, Ti, Ga, Ge, Br, Zr, W, Li, I ! son raramente requeridos. (Txicos a ms de 10-4 M ) !Vitaminas y hormonas
Substratos + clulas ! productos extracelulares + ms clulas
!Sustratos !Prod. Secund
!S + X
!P + nX
Substrato P1 P2
!Temperatura !pH !Aereacin ![S]
ESTRUCTURADO:
Representacin celular multicomponente
NO ESTRUCTURADO: Representacin celular como un solo componente Asume: Crecimiento balanceado
SEGREGADO: Clulas heterogneas discretas NO SEGREGADO: Propiedades celulares en promedio
No Estructurado
Estructurado
No segregado
COMPLEJIDAD
Soluto de un solo componente Caso + idealizado Un solo componente, Clulas heterog e individuales REALIDAD
Promedio celular multicomponente Heterogeneidad multicomponente clula a clula Caso real
Segregado
Hemocitmetro
Conteo en plato
Contador de partculas
Citometro de flujo
Mtodo gravimtrico
Volmen de clulas empacadas
Densidad ptica
!OD no discrimina entre clulas viables y no viables !Inculo pobre ! Fase de adaptacin larga !Inculo: 10% del volumen total de fermentacin
Fase Exponencial
Fase Estacionaria
Fase de Muerte
Velocidad especfica de crecimiento celular
Cte. de metabolismo endgeno
Cte. de muerte celular
!No estructurado No segregado !Dependencia de un nico sustrato !El sustrato limita velocidad de X !Cintica de saturacin !Similar a Michaelis Menten
Un nico sistema enzimtico controla el consumo del sustrato

max: Velocidad mxima especfica dd de crecimiento celular g = max cuando [S] >> KS KS: Constante de saturacin g = ! max cuando [S] = KS
max: Tipo de organismo, depende ffffffff de pH y T KS: Naturaleza del substrato
-!Regresion exp -!Pendiente: g -!net = g - kd y = b + m x
Plot Lineweaver-Burk Varios experimentos batch para diferentes concentraciones de sustrato
Inhibicin por substrato
Inhibicin por producto
Inhibicin por toxicidad
Substrato 2
!Interacciones entre subcomponentes celulares. !Algunos se enfocan en un crecimiento no balanceado
Substrato 1
Modelo Ciberntico
Cintica aditiva de Monod:
!Aproximacin muy simple !Pobre cuantificacin !No toman en cuenta la dinmica intracelular
!Simultneamente con el crecimiento celular !Formacin es directamente proporcional a g!Ejemplo: Produccin de etanol
!Resultado de mantenimiento intracelular !Toma lugar en la etapa estacionaria, donde g=0 !Ejemplo: Metabolitos secundarios, antibiticos
!Etapa estacionaria o previa a ella !Ejemplo: cido Lctico, Xantanos, Metabolitos secundarios
TEMPERATURA
! disminuye por encima de la T optima ! se duplica aprox a cada $T=10C !Afecta tambin formacin de producto
pH
!pH ptimo para cada tipo de clula !Fluctuacin aceptable de pH 1 a 2 !Cercano a 7.00 !Control importante por medio de buffers
Oxgeno disuelto
!Fermentacines aerbicas !Baja solubilidad de O2 !Concentracin depende de agitacin !Velocidad de transferencia !Velocidad de consumo
Frmula celular
Un mol de material biolgico se define como la cantidad que contiene 1 gramo-tomo de C, por ejemplo CH1.8O0.5N0.2
Conversin de sustratos a biomasa
Carbohidrato
Material celular
Composicin de E. coli (92% de su masa seca)
Balances molares
Reflejan la cantidad de producto (P) clulas (X) formadas por unidad de substrato (S) consumido por las clulas. $S = $S(clulas) + $S(producto) + $S(energia) + $S(mantenim)
Molar
YX/S = mol C-equiv en cel producidas mol-C equiv en subs consumido = 1
Msico
YX/S = masa cel producidas masa subs consum = -$X
!
%
$S
= -$P
YP/S = mol C-equiv en prod acumulado = mol-C equiv en subs consumido
YP/S = masa prod acumulado masa subs consum
!
%
$S
YP/X = mol C-equiv en prod acumulado = mol-C equiv en cel producidas
YP/X = masa prod acumulado masa cel produc
$P
$X
DETERMINACIN GRFICA DE COEFICIENTES TOTALES
Proceso catablico de oxidacin incompleta total o casi totalmente anaerbico, cuyo producto final es un compuesto orgnico
In + Generation = Out + Accumulation
Clulas
Muerte celular
Substrato
Formacin de producto Crecimiento celular Mantenimiento
Producto
Asociado a crecimiento
@ t = 0, X(0) = Xo
@ t = 0, S(0) = Xo
@ t = 0, P(0) = Po
!Predecir el comportamiento de X, S, P !Optimizacin !Control del proceso y diseo de plantas Sistema diferencial no lineal de primer orden
Resolucin del sistema por mtodos numricos, por ejemplo, Runge-Kutta 4 orden
Simulacin de la fermentacin de glucosa con S. cerevisiae
-Yeast Y ! Yeast east Extract: -!Peptone: -!Malt Extract: -!MgSO4: -!(NH4)2SO4: -!KH2PO4: -!Sugar: pH=5.5
3 5 3 2 3 2 25
Inoculacin en varias etapas T = 32C 200 rpm
10% v/v del Volumen total
HPLC
YSI
Cells
V = 800 mL T = 32C 100 115 rpm pH=5.5 Hasta agotamiento de azucar
Medio Cultivo
Cultivo semilla
Inoculacin
Fermentacin
Anlisis
Modelaje
Entrada - Salida + Generac Consumo = Acumulacin Tasa de Dilucin (D) D = Fv / V ! Recproco del tiempo de residencia
Clulas
!Clulas removidas a la misma tasa que su crecimiento !Velocidad de crecimiento celular = Tasa de Dilucin !Manipulacin de g como un parmetro independiente
Si se impone un factor de dilucin D > max, las clulas no se podrn reproducir lo suficientemente rpido para mantenerse. Por lo tanto se lavan o el quimiostato se vaca (washout)
Substrato
Entrada - Salida + Generac Consumo = Acumulacin
Producto
Entrada - Salida + Generac Consumo = Acumulacin
Recordar que:
A diferencia del sistema batch, las ecuaciones que representan X, S y P ahora son algebricas, lo que hace ms facil la resolucin del sistema y su correspondiente simulacin matemtica.
Si aplica el modelo de Monod, despreciando metabolismo endgeno y formacin de productos extracelulares, la productividad ser el factor de dilucin por la concentracin de clulas: DX
Dilucin que maximiza la produccin de clulas se obtiene derivando DX respecto a D y luego igualar a cero: !Ks<<So ! Dop(X) se convierte en D=max !D=max sucede en el punto de wash-out !Usualmente D es menor que Dop(X) ya que es dificil lograr D=max
!Adicin de nutrientes frescos !Reduce inhibicin por substrato !El volumen no es constante en toda la operacin !Habr concentraciones iniciales, intermedias y finales Etapa 1: (Carga)
Al finalizar etapa 1 S<<So y Xo<<Xmax

Etapa 2: (Realimentacin)
Ecuacin para el cambio de volumen
Porque el substrato se consume casi todo
D " porque V #, va disminuyendo continuamente
Etapa 1:
Variacin de las concentraciones, velocidad de crecimiento y volumen en funcin del tiempo para el primer ciclo de un fed-batch
Etapa 2: Realimentacin
Mdulo VI: Biorreactores
Cultivo Batch
1." Preparacin: Limpieza, proceso de esterilizacin, llenado. 2." Sembrado: Inoculacin y perodo de induccin. 3." Crecimiento exponencial 4." Recuperacin de producto
Tiempo ciclo para completar ciclo batch
Cultivo Continuo
! Esterilizacin continua ! Suspensin celular se retira a la misma tasa que la alimentacin de nutrientes ! Volumen se mantiene constante
Concentracin celular ptima:
Productividad ptima: Total cel producidas
Veloc. produccin de biomasa
Proporcin entre velocidades de formacin de clulas

Procesos con E. coli:
!Xm/Xo=20 !tl=5 h !max=1.0 h-1 !Proporcin = 8
Usualmente, Xm/Xo es 10 20
Por qu la mayora son procesos batch?

!La productividad de productos secundarios supera a la de un quimiostato. !Inestabilidad gentica: Quimiostato impone seleccin severa. !Operabilidad y confiabilidad: Cualquier falla en un quimiostato es ms grave y las prdidas son mayores. !Economa: Procesos que requieren pequeas cantidades con demanda dificil de proyectar. El mismo reactor puede usarse para distintos productos
SISTEMAS BATCH
!Etanol celulsico !Antibiticos !Insulina a partir de Escherichia coli !Cerveza !Extracto de levadura (fed-batch) !Acetona-Butanol a partir de C. acetobuylicum
Gases
SISTEMAS CONTINUOS
!Protenas !Procesos con enzimas inmovilizadas !Etanol !Productos a gran escala: cido Lctico
Por qu reciclar clulas? !Incremento de productividad y estabilidad !Minimizacin de efluentes

!:Relacin de reciclo basada en caudales volumtricos c: Factor de concentracin de la relacin de concentracin celular (reciclo/salida) Separador de clulas: Filtracin, centrifugacin o sedimentacin
Balance de clulas
ENTRADA SALIDA + GENERACIN CONSUMO = ACUMULACIN
Balance de substrato
ENTRADA SALIDA + GENERACIN CONSUMO = ACUMULACIN
Dividiendo entre V y con un poco de lgebra:
Dado que:
Usando Monod:
Despejando S:
!Separar crecimiento celular y formacin de productos. !Produccin de metabolitos secundarios, por ejemplo antibiticos. !Fijar diferente pH, T, concentracin de nutrientes, etc en cada uno de los tanques. !Crecimiento desbalanceado: Modelo no estructurado no es el ms apropiado
Ejemplo tpico: Cultivo de clulas modificadas genticamente Primer quimiostato: Produccin de clulas sin promotor Segundo quimiostato: Produccin de la protena (agregando el promotor)
Primer quimiostato
Segundo quimiostato Balance celular: Balance de substrato:
X1/X2 < 1 y 2 < D2
D2 = F/V2 y 2 = (maxS 2 /Ks+S 2)
INMOVILIZACIN CELULAR
!Altas concentraciones celulares !Re-utilizacin celular !Elimina el problema de wash-out a altos D !Altas productividades volumtricas !Minimiza dao celular por esfuerzo cortante Inmovilizacin activa: Fuerzas fsicas y/o qumicas
Atrapamiento en matrices
!Agar !Alginato !Carragenina !Pliacrilamida !Quitosano !Gelatina !Colageno
Cscara de naranja con S. cerevisiae
Cscara de naranja
Encapsulacin
Matrices porosas
Material de la cpsula
!Nylon !Colodin !Poliestireno !Acrilato !Acetato de Celulosa !Polister
Ligamiento a soporte
ADSORCIN: ! Contacto directo entre nutrientes y el material de soporte. !Obtencin de altas cargas celulares ! Proporcin recomendada de dimetros poro/clula: 4 a 5
Soportes
!Vidrio poroso !Slica porosa !Alumina !Gelatina !Carbn activo !Biruta de madera !Resinas de Int. Ionico
Unin covalente !Ms fuerte que la adsorcin: Mas estable ! Necesita un soporte que sea rgido, qumicamente inerte y unir a las clulas firmemente.
!Aldehdos !Aminas !Grupos epoxi !Grupos halocarbonilo !xido de zinc !xido de titanio
Soportes
1. Biorreactores con agitacin mecnica interna

!Clsico CSTR batch o quimiostato !Altos coeficientes de transf de masa !Proporcin de altura-dimetro: 2 3 !Volumen de trabajo: 75% vol total !Flujo axial y radial, y uso de baffles !Desventaja: Formacin de espuma
Produccin de etanol
2. Columnas de burbujas
!Fluidos newtonianos de baja viscosidad !Mejor transferencia de oxgeno !Ambiente con bajo esfuerzo cortante !Desventaja: Coalescencia de burbujas !Desventaja: Rango estrecho flujo de gas.
Produccin de extracto de levadura
3. Biorreactores Loop
!El mezclado y la circulacin de lquido es inducido por la inyeccin de un gas, una bomba mecnica o ambos. !El ms comn: air-lift !Fludos viscosos, no coalescencia !Creacin de microburbujas
Produccin de etanol celulsico
4. Biorreactores Trickle-bed
!Reactores donde coexisten las 3 fases !Lecho empacado de catalizador y un gas esparcindose en el lquido !Alta rea de superficie en el lecho !Fciles de construir !Deventaja: Baja utilizacin del catalizador
!Tratamiento de aguas !Elaboracin de vinagre
VENTAJAS: !Reduccin de contaminacin !Volumen pequeo = Reducc. costos !Fcil separacin de productos !Eficiencia energtica DESVENTAJAS: !Naturaleza heterognea de la mezcla !Pobre control de pH, oxgeno, T
PRODUCTOS PRINCIPALES: !Salsa soya !Miso (arroz y soya) !Hamanatto (soya y trigo) !Enzimas (A. oryzae)
Biorreactor rotatorio para alimentos fermentados
Singularidades: !Tamao grande

!Lento crecimiento !Sensibles a esfuerzo cortante !Concentracin de productos en g/L
REACTORES UTILIZADOS: !CSTR modificado (10 40 rpm) !Lecho fluido y lecho empacado con clulas inmovilizadas por atrapamiento y encapsulacin !Reactores de burbujas y air-lift !Reactores desechables
Requerimientos del biorreactor:

!Levemente agitado y aereado !Riguroso control de pH, T, pO, CO2 !Material de soporte para el anclaje !Remocin amonio y lactato (txicos)
Mdulo VII: Purificacin de productos
!Downstream es el conjunto de etapas del bioprocesamiento industrial que sigue a la fermentacin. !Estas etapas varan dependiendo del producto final
1." Separacin de productos insolubles 2." Aislamiento primario 3." Purificacin 4." Producto final
a) Coagulacin y Floculacin
Coagulacin: Formacin de pequeos flculos a partir de coloides. Coagulantes: cidos, Bases, iones multivalentes, carbn activado.
Floculacin: Aglomeracin de los flculos en agregados ms grandes. Floculantes: CaCl2 y otros polielectrolitos
b) Filtracin
!El mtodo ms costo-efectivo para separacin !Filtros rotatorios de vaco, los ms utilizados !Separacin de micelios en produccin de antibiticos !Filtracin cruzada se usa con bacterias y levaduras
c) Centrifugacin
!Separacin de partculas 0.1-100 m por accin de fuerza centrfuga. !Flujo del medio de fermentacin es el parmetro ms importante
!Cuando el producto deseado es intracelular las clulas necesitan someterse a la ruptura de su membrana (y pared, si aplica) Mtodos mecnicos
Vibracin ultrasnica !Usados para bacterias (pared celular) !Ruptura de bacilos mayor que cocos !No efectivo para hongos !Desventaja: Desnaturalizacin
Mtodos no mecnicos
!Shock osmtico !Ruptura con cristales de hielo !Shock trmico !Liofilizacin despus de tratamiento qumico (acetona, butanol y buffers. !Lisozima: pared celular de bacterias gram-positivas !Productos liberados pueden oxidarse con el aire!! ! Agregar agente reductor con agente quelante (EDTA) !Asepsia rigurosa!!!
Homogenizadores con perlas !2000 kg/h ! 340 dw/h levadura !Las perlas rompen a las clulas !Mejor control de la temperatura
!Productos se degradan con la temperatura !Asepsia durante todo el proceso de downstream !Concentraciones altas (productos de alta pureza) Extraccin Lquido-Lquido
! Acetato de amilo o isoamilo como solvente extractor ! Extraccin a T ambiente ! Solvente: No txico, selectivo, barato, inmisicible con el caldo ! Aplicacin: Antibiticos ! Separacin posterior: Centrifugacin o Decantacin
Precipitacin
Precipitar protenas ! ! Adicin de sales inorgnicas Adicin de solventes orgnicos a baja temperatura Desventaja: Solventes pueden causar desnaturalizacin de protenas.
Adsorcin
! Fsica: Fuerzas Van der Waals ! Qumica: Inicos fuertes ! Resinas intercambio inico ! Lecho empacado, lecho fluido
Membranas
! Dilisis ! Osmosis Inversa ! Ultrafiltracin ! Microfiltracin
Electroforesis
! Separacin de biomolculas segn su tamao y carga. ! Matriz de gel poliacrilamida ! Protenas cubiertas con surfactante aninico ! Deteccin por tintura
Separacin de mezclas en sus componentes puros, utilizando una fase mvil y una fase estacionaria. Cromatografa de Elucin
!Componentes o solutos eluyen a distintos tiempos
Cristalizacin
!Bajas temperaturas !Minimiza degradacin trmica !Bajo costo en equipo !Factores de separacin altos !Cristales de alta pureza
Cristalizador Nutsche
Secado
!Remocin del solvente utilizado !Producto sensitivo al calor !% humedad final !Parmetros que afectan el secado: a) Propiedades fsicas b) Propiedades del soluto c) Condiciones del secado d) Parmetros de transf de calor
Liofilizador
Secador de bandejas al vaco
BIOETANOL CAA DE AZCAR

Melaza
!Subproducto de industria azucarera !Rica en hexosas y sacarosa
Mdulo VIII: Bioprocesos Industriales
!Saccharomyces cerevisiae !Fermenta hexosas y disacridos como la sacarosa
BIOETANOL MAZ
PRODUCTOS ALMIDONCEOS
!Un paso extra: Hidrlisis de los enlaces en amilosa y amilopectina. !Actualmente el proceso que produce la mayor cantidad de etanol en el mundo
BIOETANOL LIGNOCELULOSA
Celulosa
Hemicelulosa
Pichia stipitis
Lignina
Pichia stipitis
BIODIESEL DE MICROALGAS
Ventajas del proceso
Chlorella vulgaris
!No compite por utilizacin de espacio !Ms del 70% de biomasa utilizable !Buen reemplazo para soya y canola !Abundancia de especies celulares !No contamina el ambiente
Reactores usados
Reaccin de Esterificacin
Estanques abiertos
Fotobiorreactores tubulares
Extraccin de los aceites con un solvente
SINGLE CELL PROTEIN
Mezcla de protenas (o clulas secas) extradas de cultivos puros o mezclados de algas, levaduras, bacterias u hongos, y son usados para suplementos alimenticios humanos o para animales Substratos utilizados
!Hidrocarburos lquidos y gaseosos !Alcoholes !Productos de desecho: Plantas, madera, almidones, lcteos, etc.
Microorganismos utilizados
Desventaja principal:
!Acumulacin de cidos nuclicos
BIOETANOL
BIOETANOL
BIOETANOL
BIOETANOL
BIOETANOL
BIOETANOL
BIOETANOL

Utpl Ingenieria Quimica 2010 Fernando Merida

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Loja, Ecuador

Julio 26 al 31, 2010

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Reproduccin de bateria lisognica

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Aislamiento de protena Plegamiento de protena Purificacin y concentracin Cristalizacin y liofilizacin

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Aspartame: Mejorador de sabor

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