J Bras Patol Med Lab v. 41 n. 5 p.

353-64 outubro 2005

ARTIGO DE REVISO REVIEW PAPER

Uso prtico da imuno-histoqumica em patologia cirrgica

Practical use of immunohistochemistry in surgical pathology

Primeira submisso em 23/05/05 ltima submisso em 13/08/05 Aceito para publicao em 20/09/05 Publicado em 20/10/05

Betina Werner, MD1; Antonio Carlos Campos, MD, PhD2; Mehdad Nadji, MD3; Luiz Fernando Bleggi Torres, MD, PhD4

unitermos
Imuno-histoqumica Neoplasia Carcinoma Diagnstico

resumo
Objetivo: avaliar o motivo para indicao e analisar o grau de auxlio da imuno-histoqumica (IHQ) para o diagnstico de neoplasias e leses pseudoneoplsicas. Material e mtodo: avaliao retrospectiva observacional e descritiva de 4.459 casos submetidos a anlise no laboratrio de IHQ do Departamento de Patologia do Jackson Memorial Hospital, Universidade de Miami, Estados Unidos, em 1999. Resultados: 3.706 casos possuam dados sucientes para o desenvolvimento dos objetivos propostos. Em 19% dos casos a IHQ foi utilizada para determinar fatores prognsticos ou ndices proliferativos; em 17% dos casos teve como objetivo identicar microrganismos, clulas, estruturas ou materiais; e em 64% dos casos teve aplicao diagnstica propriamente dita. Em 835 casos desta ltima categoria a IHQ contribuiu para um diagnstico especco em 83% das vezes e diminuiu o nmero de diagnsticos diferenciais em 12%. Em 5% das vezes a IHQ no auxiliou o patologista devido a exigidade de algumas amostras, presena de necrose extensa ou indiferenciao extrema de algumas neoplasias. Os principais problemas de diagnstico diferencial para os quais a IHQ foi utilizada foram: determinar o local de origem de carcinomas e adenocarcinomas e diferenciar entre hiperplasia mesotelial reacional, mesotelioma e adenocarcinoma, entre outros. Foram utilizados 4,1 anticorpos por caso, em mdia. Concluses: Quando bem indicada e aplicada, a imuno-histoqumica um mtodo diagnstico complementar til em 95% dos casos e muitas vezes contribui fundamentalmente para as condutas cirrgica e teraputica. Amostras muito exguas ou necrticas e neoplasias extremamente indiferenciadas so situaes que comprometem o exame imuno-histoqumico e seus resultados. Quando utilizada de maneira direcionada aos principais diagnsticos diferenciais, a tcnica apresenta uma relao custo/benefcio alta.

abstract
Background: Immunohistochemistry (IHC) is a valuable tool in diagnostic surgical pathology. We evaluated the frequency of IHC use and its contribution to the nal diagnosis of tumors and pseudotumors. Methods: A retrospective study of the 4,459 cases received in 1999 for immunoperoxidase study at the Immunohistochemistry Laboratory, Department of Pathology, University of Miami/Jackson Memorial Hospital, USA, was performed. Results: 3,706 cases yielded all data necessary for the study. In 19% of cases IHC was used for localization of predictive tumor markers or evaluation of proliferation indicators; 17% of cases performed IHC to identify organisms or acellular structures and in 64% of cases IHC examination was to aid the pathologists in differential diagnosis of tumors. In 835 cases of the latter category, IHC helped the pathologists to render a specic diagnosis in 83% of instances. In 12% IHC narrowed down the diagnostic possibilities to two or three entities. In the remaining 5% of cases, IHC had no contribution to the nal diagnosis due to limited diagnostic material, extensive necrosis or lack of tumor differentiation. The main differential diagnosis dilemmas included determination of the site of origin of carcinomas, differentiation between reactive mesothelial hyperplasia, mesothelioma and adenocarcinoma, and demonstration of cell phenotype in undifferentiated neoplasms. The average of antibodies per case was 4.1. Conclusions: Immunohistochemistry is a valuable tool in diagnostic surgical pathology capable of delineating the nature of disease in 95% of cases. In some instances, IHC is essential for the treatment decision-making. On the other hand, limited diagnostic material, extensive necrosis or lack of tumor differentiation can interfere in IHC performance. A well-designed differential diagnosis-driven utilization of the technique is extremely cost-effective.

key y words
Immunohistochemistry Neoplasm Carcinoma Differential diagnosis

1. Mdica patologista do Servio de Anatomia Patolgica do Hospital de Clnicas de Curitiba da Universidade Federal do Paran (UFPR). 2. Mdico cirurgio e professor titular do Departamento de Clnica Cirrgica do Hospital de Clnicas de Curitiba da UFPR. 3. Mdico patologista e chefe do Immunohistochemistry Laboratory, Department of Pathology, University of Miami/Jackson Memorial Hospital. 4. Professor-titular do Servio de Anatomia Patolgica do Hospital de Clnicas de Curitiba da UFPR. Trabalho apresentado como requisito parcial obteno do grau de Mestre pelo Curso de Ps-graduao em Clnica Cirrgica do Setor de Cincias da Sade da UFPR sob o ttulo Indicaes e contribuio diagnstica da imuno-histoqumica em patologia cirrgica, em 26 de novembro de 2002.

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Introduo
A imuno-histoqumica surgiu com as pesquisas em imunopatologia que comearam na dcada de 1940. S a partir de 1974, quando foi possvel demonstrar alguns antgenos tissulares pela tcnica de imunoperoxidase em tecidos xados em formalina e includos em parana, que a imuno-histoqumica foi aceita como um mtodo simples e prtico na rotina diagnstica de patologia cirrgica(3, 14, 23, 27, 30). O desenvolvimento de anticorpos monoclonais, que propiciaram uma enorme fonte de reagentes altamente especcos para a demonstrao de vrios antgenos tissulares ou celulares, e o advento da recuperao antignica foram fatos marcantes na evoluo da imuno-histoqumica(3). Houve tal avano na contribuio e na aplicao da imuno-histoqumica na patologia cirrgica que o fenmeno passou a ser conhecido como a revoluo marrom do laboratrio de histopatologia(14). As reaes imuno-histoqumicas podem ser utilizadas nas mais diferentes situaes dentro de um laboratrio de patologia cirrgica. As mais importantes so: 1) elucidao do tecido de origem de uma neoplasia indiferenciada; 2) determinao do rgo de origem de uma neoplasia diferenciada; 3) subclassicao de linfomas; 4) pesquisa de fatores prognsticos, teraputicos e ndices proliferativos de algumas neoplasias; 5) identicao de estruturas, organismos e materiais secretados pelas clulas; 6) deteco de clulas neoplsicas metastticas(1, 3, 12, 14, 23, 30, 37). Apesar de ser um mtodo relativamente simples, a imuno-histoqumica tem certas particularidades e seu resultado inuenciado por diversos fatores, comeando pela xao do espcime, passando pela escolha dos anticorpos a serem analisados em cada caso e pelas reaes propriamente ditas, e chegando at a interpretao das lminas. Ou seja, o grau de utilidade e contribuio da imuno-histoqumica para resoluo de problemas em patologia cirrgica diretamente proporcional experincia das mos que realizam as reaes e dos olhos que interpretam os resultados(1, 12, 14, 23, 30, 37). Os autores apresentam um estudo retrospectivo observacional e descritivo dos resultados das reaes imunohistoqumicas realizadas no Laboratrio de Imuno-histoqumica do Jackson Memorial Hospital, Miami, EUA, no ano de 1999, com a inteno de: 1) analisar a freqncia de casos quanto ao stio de origem da amostra colhida e o nmero de anticorpos utilizados em cada caso; 2) avaliar o motivo para indicao do exame imuno-histoqumico; 3) analisar o grau de auxlio da imuno-histoqumica para o diagnstico diferencial de neoplasias e leses pseudo-

neoplsicas; 4) determinar os fatores que inuenciam de maneira negativa o grau de auxlio da imuno-histoqumica para o diagnstico diferencial de neoplasias e leses pseudoneoplsicas; e 5) determinar os principais dilemas de diagnstico diferencial para os quais a imuno-histoqumica indicada. Os achados so correlacionados com dados da literatura e se discutem os aspectos prticos da aplicao da tcnica de imuno-histoqumica na rotina diria da patologia cirrgica.

Material e mtodo
Utilizaram-se 4.459 exames imuno-histoqumicos realizados durante o ano de 1999 no laboratrio de imunohistoqumica do Departamento de Patologia da University of Miami/Jackson Memorial Hospital, EUA. Todas as reaes foram realizadas naquele laboratrio e o mtodo imunoenzimtico usado foi o estreptavidina-biotina-peroxidase; a recuperao antignica foi realizada com aquecedor a vapor, quando necessrio. As reaes foram realizadas de maneira automatizada pelo aparelho Dako Autostainer Universal Staining System. As seguintes variveis foram analisadas: 1) rgo ou local da bipsia; 2) qualidade do material (bipsia ou preparado citolgico); e 3) nmero de anticorpos por caso. Os casos foram classicados de duas maneiras: uma em relao ao motivo da indicao para o exame imuno-histoqumico e outra em relao ao grau de contribuio da imuno-histoqumica para o diagnstico nal. Quanto ao motivo de indicao para o exame imuno-histoqumico, os casos foram classificados em trs categorias: A. determinao de fatores prognsticos ou ndices proliferativos (ex.: anlise do receptor de estrognio no carcinoma mamrio); B. identicao de microrganismos, clulas, estruturas ou materiais (ex.: deteco da presena do vrus da hepatite B em bipsias hepticas); C. denio diagnstica, onde os casos foram subdivididos em trs outras categorias: 1) categoria conrmatria: a imuno-histoqumica foi utilizada para conrmar a hiptese diagnstica formulada nas lminas coradas em hematoxilina e eosina (HE) (ex.: conrmao do diagnstico de melanoma em neoplasia com origem na epiderme); 2) categoria diagnstico diferencial: quando a imunohistoqumica foi utilizada no diagnstico diferencial de

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leses neoplsicas e pseudoneoplsicas suspeitadas nas lminas coradas em HE. Nesses casos foram determinados os dilemas de diagnsticos diferenciais para os quais a imuno-histoqumica foi aplicada (ex.: diferenciar carcinoma de melanoma, denir o stio primrio de adenocarcinomas, classicar linfomas, entre outros); 3) categoria miscelnea: a imuno-histoqumica foi utilizada para diagnstico em situaes no citadas anteriormente (ex.: denio de hormnios secretados por tumores de hipse, anlise dos ductos hepticos em fgados transplantados, entre outros). Quanto ao grau de contribuio da imuno-histoqumica no diagnstico nal, nos casos da categoria denio diagnstica, os mesmos foram classicados em: 1) a imuno-histoqumica rendeu um diagnstico especco; 2) a imuno-histoqumica diminuiu o nmero de diagnsticos diferenciais; ou 3) a imuno-histoqumica no contribuiu para a concluso diagnstica. Os motivos pelos quais a imuno-histoqumica no auxiliou no diagnstico nal foram igualmente avaliados.

Denio diagnstica (n = 2.363)

Em relao s trs categorias nas quais eles foram subdivididos, 179 casos zeram parte da categoria conrmatria, 117 da categoria miscelnea e 2.067 da categoria diagnstico diferencial. Anlise dos casos da categoria diagnstico diferencial Dos 2.067 casos dessa categoria, escolheram-se 835 casos que foram analisados pelo mesmo patologista (Mehdad Nadji), desde a formulao dos diagnsticos diferenciais nas lminas coradas em HE e escolha do painel de anticorpos at a interpretao dos resultados imuno-histoqumicos. Os trs locais de bipsias mais freqentes foram fgado, com 90 casos; pulmo, com 78 casos; e linfonodo, com 58 casos. Grau de auxlio da imuno-histoqumica no diagnstico diferencial (n = 835) A Figura 3 mostra os resultados desta categoria: a IHQ contribuiu para um diagnstico especco em 693 casos, diminuiu o nmero de diagnsticos diferenciais em 103 e em 39 vezes no auxiliou o patologista. Exigidade de algumas amostras (n = 22), presena de necrose extensa (n = 7) ou indiferenciao extrema de algumas neoplasias (n = 10) foram os motivos pelos quais a imuno-histoqumica no auxiliou o patologista, como mostra a Figura 4. O nmero de anticorpos, por caso, variou de um a 15, com mdia de 4,1 anticorpos por caso. Dilemas de diagnstico diferencial para os quais a imuno-histoqumica foi til (n = 796) Foram encontradas 12 situaes diferentes: determinao do rgo de origem ou stio primrio de carcinoma (ex.: hepatocarcinoma versus adenocarcinoma metasttico): n = 242; determinao do tipo de linfoma (ex.: linfoma B de grandes clulas versus linfoma anaplsico): n = 30; diagnstico diferencial entre processo neoplsico e pseudoneoplsico (ex.: tecido de granulao e carcinoma): n = 37; diferenciao entre hiperplasia linfide ou inltrado inamatrio e linfoma, ou plasmocitose reacional e plasmocitoma ou mieloma mltiplo: n = 32; diferenciao entre hiperplasia mesotelial reacional, mesotelioma e adenocarcinoma: n = 87; determinao o tecido de origem de neoplasias fusocelulares benignas e malignas (ex.: leiomiossarcoma versus tumor do estroma gastrintestinal): n = 61; diferenciao entre carcinoma e melanoma: n = 32;

Resultados
No ano de 1999, o Departamento de Patologia do Jackson Memorial Hospital realizou 32.558 bipsias, 41.432 citologias e recebeu 3.990 casos para consulta em patologia cirrgica e citopatologia, provenientes de outras regies dos EUA e de outros pases. Nesse mesmo ano, a unidade de imuno-histoqumica daquele hospital realizou 4.459 exames. A Figura 1 mostra um organograma que explica o modo pelo qual todos os casos foram classicados, analisados e quanticados. Em 3.706 casos foi possvel a obteno do mnimo de dados necessrios para o desenvolvimento dos objetivos propostos. Destes, 3.431 eram bipsias e 275 eram preparados citolgicos.

Motivo de indicao para o exame imuno-histoqumico

Nos 3.706 casos em que todos os dados necessrios para a realizao deste trabalho estavam disponveis, 699 tiveram como motivo de solicitao de exame imuno-histoqumico a determinao de fatores prognsticos ou ndices proliferativos; a imuno-histoqumica foi utilizada para identicao de microrganismos, clulas, estruturas ou materiais em 644 casos; e em 2.363 casos a imuno-histoqumica foi utilizada para denir o diagnstico (Figura 2).

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TOTAL 4.459 3. 706

275 Citologias

699 Fatores prognsticos e ndices proliferativos

644 Identificao de microrganismos, estruturas e materiais

2.363 Definio diagnstica

179 Confirmao 651 Carcinoma de mama 117 Miscelnea 2067 Diagnstico diferencial

502 Vrus

835
Neoplasia indiferenciada Resultados qualitativos (painis de anticorpos)

Neoplasia diferenciada

Resultados quantitativos Dilemas de diagnstico diferencial 693 Diagnstico especfico

rgo de origem

Nmero de anticorpos

Contribuio

103 Diminuio no diagnsticos

39 No contribuiu

Figura 1 Organograma dos resultados: maneira pela qual os dados foram classicados, analisados e quanticados

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64%

19%

Determinao de fatores prognsticos e ndices proliferativos Identificao de microrganismos, clulas, estruturas, materiais Definio diagnstica

17%

Figura 2 Resultados quanto ao motivo de indicao para o exame imuno-histoqumico (n = 3.706)

5% 12%
Diagnstico especfico Diminuiu o nmero de diagnsticos diferenciais No contribuiu

83%
Figura 3 Grau de contribuio da imuno-histoqumica para o diagnstico nal (n = 835)

Material limitado

26%

Necrose extensa Neoplasia indiferenciada

56% 18%

Figura 4 Motivos pelos quais a imuno-histoqumica no auxiliou no diagnstico nal (n = 39)

diferenciao entre carcinoma e linfoma: n = 59; diferenciao entre carcinoma e sarcoma: n = 51; determinao do tecido de origem de neoplasia maligna totalmente indiferenciada, com mais de dois diagnsticos diferenciais (ex.: carcinoma versus melanoma versus linfoma): n = 70;

diferenciao de neoplasia maligna de clulas pequenas e azuis(8), que inclui sarcoma de Ewing, tumor primitivo neuroectodrmico perifrico (PNET), neuroblastoma, rabdomiossarcoma, tumor desmoplsico de clulas redondas, linfoma/ leucemia, carcinoma de pequenas clulas, osteossarcoma de pequenas clulas e condrossarcoma mesenquimal: n = 19;

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resoluo de problemas de diagnsticos diferenciais no citados anteriormente (ex.: glioblastoma versus carcinoma metasttico): n = 76.

Discusso
Desde a sua introduo, na dcada de 70, as publicaes cientcas com aplicaes da imuno-histoqumica em patologia cirrgica aumentaram signicativamente (Figura 5). Esse fato apenas reete a posio que a imuno-histoqumica hoje ocupa em um laboratrio de patologia cirrgica, ou seja, a de tcnica complementar indispensvel na resoluo de certos problemas de diagnstico diferencial formulados nas lminas coradas com a colorao bsica de rotina de HE(1, 3, 11, 12, 14, 17, 20, 21, 23, 25, 29, 30-32, 36, 37).

contribuiu por excluir algum diagnstico diferencial; 4) a imuno-histoqumica no foi de auxlio nenhum para o diagnstico; e 5) a imuno-histoqumica rendeu um diagnstico no suspeitado previamente. Segundo os autores, a imuno-histoqumica foi particularmente de grande auxlio nos diagnsticos diferenciais entre linfoma anaplsico e carcinoma, e na identicao de melanoma amelantico; alm disso, a escolha de um painel de anticorpos baseado nos diagnsticos presumidos nas lminas coradas em HE de grande ajuda para a diferenciao de tumores de clulas anaplsicas e fusiformes. O presente estudo apresenta vrias semelhanas e algumas diferenas quando comparado ao artigo de Leong e Wright(14). A semelhana principal a motivao de se classicar por categorias os tipos de contribuio ou os motivos de indicao do exame imuno-histoqumico, para avaliar sua real contribuio no diagnstico denitivo de neoplasias. A principal diferena entre os dois estudos que neste no existe a categoria e a imuno-histoqumica rendeu um diagnstico no suspeitado previamente nas lminas coradas em HE. Quando os resultados da imunohistoqumica eram muito discrepantes do que foi suspeitado nas lminas coradas em HE, o diagnstico nal rmado no laudo se restringia a um diagnstico menos especco, do tipo neoplasia maligna pouco diferenciada, e uma nota sugeria alguns diagnsticos diferenciais suspeitados nas lminas coradas em HE. Nesses casos, a imuno-histoqumica era considerada no-auxiliar para o diagnstico nal. Isso enfatiza o papel complementar, e no principal, da imunohistoqumica na anlise histopatolgica.

Contribuio da imuno-histoqumica na soluo de problemas de diagnsticos diferenciais em patologia cirrgica

Leong e Wright, patologistas australianos, escreveram o primeiro artigo que avalia a contribuio da imuno-histoqumica na rea de diagnstico de tumores(14). Dos 958 tumores da rotina cirrgica que necessitaram de imunohistoqumica no Instituto de Cincias Mdicas e Veterinrias na cidade de Adelaide, em 1986, os autores escolheram 200 casos consecutivos e classicaram-nos em uma de cinco categorias: 1) a imuno-histoqumica conrmou o diagnstico suspeito nas lminas coradas em HE; 2) a imuno-histoqumica contribuiu para o diagnstico denitivo a partir de uma lista de diagnsticos diferenciais; 3) a imuno-histoqumica

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 430 1 19601969 22 19701975 88 19761980 19811985 19861990 19911995 1821 4661 9801

10698

19962000

20012004

Figura 5 Nmero de publicaes cientcas encontradas na pesquisa atravs do Medline, entre 1960 e 2004, onde o termo imuno-histoqumica aparece no ttulo ou resumo dos trabalhos (limitando-se a estudos realizados em humanos)

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No presente estudo existem duas categorias no utilizadas por aqueles autores: a categoria A (determinao de fatores prognsticos e ndices proliferativos) e a categoria B (identicao de microrganismos, clulas, estruturas ou materiais). Sobre a primeira categoria, vale a pena salientar que o carcinoma de mama, com a pesquisa dos receptores de estrognio e progesterona, alm de HER2/neu, p53 e Ki67 algumas vezes, foi responsvel por 93,2% dos casos. J a pesquisa de vrus foi o principal componente da categoria B, com 78% dos casos. Essa prevalncia de resultados esperada, uma vez que o carcinoma de mama uma das neoplasias mais comuns e a imuno-histoqumica consagrada na determinao de alguns ndices prognsticos e teraputicos(10, 33, 35, 37). Do mesmo modo, a deteco de vrus pelo mtodo imuno-histoqumico preenche uma lacuna diagnstica da colorao de rotina de HE, pois muitas vezes no h alteraes morfolgicas caractersticas que indiquem a presena de uma infeco viral(37). At onde se sabe, existem dois outros trabalhos baseados no estudo de Leong e Wright(14), ambos nacionais: o de Schmitt et al.(25), de 1991, e o de Torres et al., de 1998(32). Os dois trabalhos utilizaram as categorias propostas pelos primeiros autores, com algumas modicaes. Os patologistas do estudo de Schmitt et al.(25) apresentaram resultados muito semelhantes aos daqueles autores e ressaltaram que a experincia do patologista que escolhe os anticorpos e interpreta os resultados imuno-histoqumicos o fator mais importante para a ecincia da imuno-histoqumica no diagnstico de tumores. Torres et al.(32) expuseram a sua experincia de dez anos de uso da imuno-histoqumica num hospital geral de Curitiba em artigo publicado em 1998, revisando o artigo previamente publicado pelos autores em 1995(31). Os autores classicaram os casos de uma maneira semelhante de Leong e Wright(14); em 94,1% dos casos a imuno-histoqumica auxiliou de alguma maneira na denio do diagnstico. No presente trabalho a imuno-histoqumica rendeu um diagnstico especfico em 693 casos, ou 83%; a imuno-histoqumica diminuiu o nmero de diagnsticos diferenciais, auxiliando parcialmente o patologista em 103 casos, ou 12%; e a imuno-histoqumica no contribuiu para a concluso diagnstica em 39 casos, ou 5%. Isso signica que em 95% dos casos nos quais o patologista est diante de um caso de diagnstico difcil nas lminas coradas em HE, a imuno-histoqumica pode ajud-lo a rmar se no o diagnstico correto pelo menos um diagnstico apropriado.

Situaes em que a imuno-histoqumica no contribui na soluo de problemas de diagnsticos diferenciais em patologia cirrgica
No presente estudo a imuno-histoqumica no contribuiu para o diagnstico nal em 5% dos casos, e nos trabalhos de Leong e Wright(14), Schmitt et al.(25) e Torres et al.(32) as taxas foram de 13,5%, 12% e 5,9% respectivamente. As razes encontradas pelos autores daqueles estudos para explicar a falta de contribuio da imuno-histoqumica para a resoluo diagnstica foram diferentes. Segundo Leong e Wright(14) os principais fatores que impediram que a imuno-histoqumica contribusse para o diagnstico nal foram resultados inespeccos e contraditrios das coloraes imuno-histoqumicas em alguns tumores e a xao inadequada dos espcimes. J Schmitt et al.(25) apontam a xao inadequada em formol como o principal fator complicador, seguido da extrema indiferenciao de algumas das neoplasias estudadas. Torres et al.(32) culpam a xao inadequada, a exigidade da amostra estudada e a total indiferenciao de certas neoplasias como as razes da inutilidade da imuno-histoqumica na resoluo dos dilemas em diagnsticos diferenciais. Juntamente com os trs artigos mencionados anteriormente, vrias outras publicaes comentam a inuncia negativa do processamento tecidual e da fixao em formol, adequada ou no, sobre as reaes imuno-histoqumicas(2, 9, 15, 17, 21, 28, 29, 37). Apesar disso, aquele no foi um problema encontrado no presente estudo. Os motivos que impediram a imuno-histoqumica de auxiliar o patologista na deciso diagnstica nal foram: 1) extrema indiferenciao de algumas neoplasias, onde todos os marcadores testados tiveram resultados negativos; 2) presena de necrose extensa em determinadas neoplasias, onde alm de provocar intensa colorao inespecca, o pouco tecido neoplsico vivel foi insuciente para a interpretao das reaes; e 3) exigidade da amostra, cujo tecido disponvel no foi quantitativamente suciente para a realizao das reaes imuno-histoqumicas necessrias. Pode-se notar que o estudo de Torres et al.(32) possui a taxa mais semelhante do presente estudo, e , ao mesmo tempo, o mais recentemente publicado, em 1998. Os casos avaliados no trabalho de Schmitt et al.(25) eram na maioria da dcada de 80, e no caso de Torres et al.(32), os casos, em sua maioria eram da dcada de 90. Os casos usados no estudo de Leong e Wright(14) eram ainda mais antigos. A poca de realizao dos trs estudos pode ter inuenciado o grau de auxlio da imuno-histoqumica em cada caso, j que a disponibilidade de anticorpos e as tcnicas de recu-

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perao antignica eram diferentes. Alm de ter um maior nmero de anticorpos sua disposio, todas as reaes efetuadas no Laboratrio de Imuno-histoqumica do Jackson Memorial Hospital, naquele ano, foram feitas de maneira automatizada, e todos os casos foram submetidos s tcnicas de recuperao antignica mais adequadas para cada anticorpo. Esses fatos podem explicar a menor importncia da condio de preservao do tecido e dos epitopos antignicos na qualidade das reaes imuno-histoqumicas e, conseqentemente, na contribuio da imuno-histoqumica para a deciso diagnstica nal(4, 18, 24).

que, por sua vez, o patologista de maior experincia na rea. Diagnsticos diferenciais mais simples necessitaram um menor nmero de anticorpos, e diagnsticos diferenciais complexos, como nos casos de neoplasias malignas indiferenciadas, solicitaram um maior nmero de anticorpos. Torres et al.(32) apresentam a mdia de 5,1 anticorpos utilizados por caso, nmero bastante semelhante ao do presente estudo. No presente estudo houve 70 casos de neoplasias indiferenciadas (9%); nesses casos a imuno-histoqumica indispensvel para o diagnstico correto, especialmente em tumores de partes moles(7). Seguindo o raciocnio para formular os diagnsticos diferenciais, primeiro as neoplasias indiferenciadas devem ser classicadas segundo o tamanho e o tipo celular e, em seguida, escolhe-se o painel com o nmero mnimo de anticorpos necessrios para a resoluo do problema em questo. A imuno-histoqumica no tem o poder de determinar se a neoplasia benigna ou maligna(3). Toda vez que um anticorpo for includo na lista de anticorpos a serem testados, a pergunta "o que um resultado positivo ou negativo para este anticorpo vai inuenciar no diagnstico nal?" deve ser formulada. Somente se a questo tiver uma resposta coerente o anticorpo deve ser usado. Essa medida, alm de reduzir os gastos de uma unidade de imuno-histoqumica, colabora para a manuteno da utilidade do mtodo em patologia cirrgica. Geralmente, quanto menor o nmero de diagnsticos diferenciais suspeitos nas lminas coradas em HE, ou seja, quanto maior a experincia do patologista, menor o nmero de anticorpos do painel imuno-histoqumico escolhido pelo mesmo. Conseqentemente, quanto menor o nmero de reaes a serem analisadas, menor o nmero de variveis, e mais preciso o diagnstico nal(4, 12, 24, 28, 29). Como mencionado por Linder(15), no existem anticorpos 100% especcos e sensveis. Geralmente, os anticorpos mais especcos podem ser pouco sensveis, anticorpos com grande sensibilidade podem se tornar inespeccos, e existem neoplasias que realmente so totalmente indiferenciadas, ou melhor, no apresentam qualquer positividade aos marcadores imunohistoqumicos hoje conhecidos.

Escolha dos anticorpos e interpretao dos resultados da imuno-histoqumica

Alm de todo cuidado tcnico necessrio para que as reaes imuno-histoqumicas sejam de qualidade e possam ser interpretadas de maneira correta pelo patologista, a fase de escolha dos anticorpos a serem testados, aps a anlise da lmina corada em HE, igualmente importante(4, 12, 17, 21, 24, 28, 29). Rudiger et al.(24) testaram a procincia de 172 patologistas alemes nos quesitos qualidade de reaes imuno-histoqumicas dos seus laboratrios e capacidade de interpretao dos resultados para a composio de um diagnstico nal adequado. Cada patologista recebeu uma lmina corada em HE e cinco lminas no-coradas, para escolher os anticorpos mais pertinentes e realizar as reaes imuno-histoqumicas. Apenas 57% dos casos enviados aos patologistas retornaram com os diagnsticos nais corretos, e a baixa sensibilidade de algumas reaes no foi relacionada com os erros diagnsticos. Os autores concluem que no a qualidade das reaes, mas a escolha dos anticorpos, a interpretao das coloraes e a integrao dos resultados imuno-histoqumicos ao diagnstico suspeitado nas lminas coradas em HE que so importantes para a formulao de um diagnstico nal pertinente. Essas observaes vo de encontro ao que demonstrado neste trabalho: a imunohistoqumica ecaz quando h uma escolha direcionada do painel de anticorpos e este ltimo fator extremamente dependente da experincia do patologista. No presente trabalho, a imuno-histoqumica foi aplicada tanto em casos inamatrios como em neoplsicos, e a escolha dos painis de anticorpos variou de caso para caso, tanto no tipo quanto na quantidade. Nos 835 casos estudados na categoria diagnstico diferencial, o nmero de anticorpos por caso variou de um a 15, com mdia de 4,1 anticorpos por caso. Como explicado anteriormente, esse grupo de 835 casos foi analisado por um nico patologista

Aplicao diagnstica direcionada da imunohistoqumica

Adenocarcinomas e carcinomas primrios versus adenocarcinomas e carcinomas metastticos A combinao dos resultados imuno-histoqumicos das citoqueratinas 7 e 20 pode ajudar bastante na denio do

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stio primrio da neoplasia: adenocarcinoma metasttico de clon caracteristicamente negativo para a citoqueratina 7 e positivo para a citoqueratina 20; positividade para ambas as citoqueratinas sugere ovrio (quando a neoplasia mucinosa), pncreas, trato biliar ou urotlio como stios primrios; j a positividade apenas para a citoqueratina 7 no rende diagnstico especco, pois a grande maioria dos adenocarcinomas comporta-se imuno-histoquimicamente dessa maneira(1, 13, 16, 34, 36). Outros anticorpos que podem ser inseridos em um painel para determinao de stios primrios de adenocarcinomas so o antgeno de membrana epitelial e o antgeno carcinoembrionrio. O primeiro especialmente til para se descartarem hipteses diagnsticas de carcinoma hepatocelular, adrenal ou embrionrio, j que o antgeno de membrana epitelial quase nunca positivo nessas neoplasias(1, 36). O antgeno carcinoembrionrio positivo em alguns adenocarcinomas, como o de origem gastrintestinal, pulmonar e o carcinoma medular de tireide, e exibe um padro de colorao canalicular nos hepatocarcinomas. O valor diagnstico do antgeno carcinoembrionrio est no fato de ele ser quase sempre negativo em carcinomas renais, prostticos, ovarianos e no mesotelioma maligno(1, 13, 16, 36). Alm dos j comentados, o fator de transcrio da tireide (TTF-1) dene origem pulmonar ou tireoidiana, o antgeno prosttico especco demonstra a origem prosttica de uma neoplasia, e o receptor de estrgeno sugere origem mamria, uterina ou ovariana de algumas neoplasias(1, 26, 36). Em 242 casos deste estudo, o maior grupo da categoria analisada, foram utilizados um ou mais anticorpos citados anteriormente. Por esse motivo, o domnio do signicado dos resultados positivos ou negativos para as reaes com as citoqueratinas 7 e 20, antgeno carcinoembrionrio, antgeno de membrana epitelial, TTF-1, antgeno prosttico especco e receptor de estrgeno so fundamentais para o patologista que solicita o exame imuno-histoqumico. Outros marcadores que passaram a ser utilizados mais recentemente so: HLA-DR, para o diagnstico de carcinoma nasofarngeo indiferenciado; p16 como marcador de infeco por HPV de alto grau em carcinomas de colo uterino; AMACR humana (P404S), que expressa apenas em glndulas prostticas neoplsicas; e antgeno de Thomsen Freidenheich (T-F), que marca o carcinoma sebceo (comunicaes pessoais de Mehdad Nadji). Diferenciao entre hiperplasia mesotelial reacional, mesotelioma e adenocarcinoma Ordonez(19) fez uma ampla reviso sobre todos os anticorpos que podem ser teis para a diferenciao da-

quelas duas neoplasias. O autor conclui que os melhores marcadores para serem utilizados na diferenciao entre mesotelioma epitelial e adenocarcinoma so a calretinina e a citoqueratina 5/6, que so expressas nos mesoteliomas e no nos adenocarcinomas; e o antgeno carcinoembrionrio, que expresso nos adenocarcinomas e no nos mesoteliomas epiteliais. Apesar de existirem algumas controvrsias na literatura(5, 6, 22), a hiperplasia mesotelial reacional geralmente negativa para o antgeno da membrana epitelial ou apresenta fraca positividade, negativa para o antgeno carcinoembrionrio e reage positivamente com a calretinina; o mesotelioma difuso e intensamente positivo para o antgeno da membrana epitelial e a calretinina, sendo negativo para o antgeno carcinoembrionrio. No presente estudo, a imuno-histoqumica foi indicada para a tentativa de diferenciar hiperplasia mesotelial reacional, mesotelioma e adenocarcinoma em 11% dos casos usando calretinina, antgeno carcinoembrionrio e antgeno de membrana epitelial. Denio de tecido de origem de neoplasias fusocelulares Segundo diversos autores(1, 30, 36), os anticorpos teis para denio de tecido de origem de uma neoplasia fusocelular so a protena S100, a desmina, o CD34 e o CD31, e esses foram os marcadores usados em 61 casos deste trabalho. Por via de regra, leiomiomas e leiomiossarcomas so positivos para a desmina, que o lamento intermedirio das clulas musculares, e negativos para a protena S100 e para o CD34; schwanomas e sarcomas neurognicos so negativos para a desmina e o CD34 e positivos para a protena S100; tumores estromais gastrintestinais so positivos para o CD34 e geralmente negativos para a desmina e a protena S100; e tumores de origem vascular so positivos para CD31 e negativos para os outros marcadores citados(1, 30, 36). A caldesmonina (caldesmon/h-CD/protena contrtil celular) um novo marcador de clulas musculares lisas e vem sendo utilizada em algumas situaes de diagnstico diferencial; alm disso, o HHV-8 passou a ser utilizado para conrmao de sarcomas de Kaposi relacionados infeco pelo HIV (comunicaes pessoais de Mehdad Nadji). Neoplasia maligna de clulas pequenas e azuis Esse grupo inclui o sarcoma de Ewing, o tumor primitivo neuroectodrmico perifrico (PNET), o neuroblastoma, o rabdomiossarcoma, o tumor desmoplsico de clulas redondas, alguns linfomas ou leucemias, o carcinoma de pequenas clulas, o carcinoma de Merkel, o osteossarcoma de pequenas clulas e o condrossarcoma mesenquimal(1, 8, 30, 36).

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Devoe e Weidner(8) revisaram os aspectos imuno-histoqumicos aplicados a esses tumores e discutiram os anticorpos mais teis em cada situao. Os anticorpos utilizados para o diagnstico diferencial em 19 casos do presente estudo e os resultados mais comumente encontrados esto expostos na Tabela. Carcinoma mamrio Nos 699 casos em que a imuno-histoqumica foi utilizada para determinao de fatores prognsticos ou ndices proliferativos, a pesquisa de receptores hormonais e de marcadores de proliferao celular em carcinomas de mama foi o grupo mais prevalente, com 651 casos (93,2%). O receptor de estrgeno e o HER2 so os nicos marcadores solicitados de rotina desde 1999 (p53, Ki67 e receptor de progesterona apenas so utilizados quando requisitados). No entanto, mais recentemente, a e-caderina passou a auxiliar na diferenciao entre carcinomas ductal e lobular, sendo positivo no primeiro. Outras inovaes foram: o uso do p63 para diagnstico diferencial entre carcinoma tubular e adenose esclerosante (onde ele positivo no carcinoma) e entre carcinoma metaplsico e carcinoma ductal (onde ele positivo no metaplsico) e a introduo do HLA-DR, que positivo no carcinoma medular e negativo no carcinoma ductal (comunicaes pessoais de Mehdad Nadji).

agentes infecciosos e denir a linhagem celular de origem da neoplasia. J quando a imuno-histoqumica aplicada para determinao de fatores prognsticos ou ndices proliferativos, na opinio dos autores, o mtodo tem valor questionvel quando se analisa a importncia do resultado na deciso teraputica. Por outro lado, Leong e Wright(14) concluem que a imuno-histoqumica um teste que apresenta relao custo/benefcio positiva, mas que as reaes devem sempre ser interpretadas com cautela, levando em conta os achados morfolgicos das lminas coradas em HE e os dados clnicos. Raab(20) tomou como exemplo trs situaes com pacientes e tumores diferentes, e analisou hipoteticamente as diferentes conseqncias e os custos de tratamento se a imuno-histoqumica fosse ou no realizada, com relao expectativa de vida dos pacientes, exatido diagnstica e ao prognstico. O autor prova que mesmo se a imuno-histoqumica custasse cinco a dez vezes mais, ainda assim traria grandes vantagens no seu uso. Em contrapartida, no estudo de Torres, Noronha e Telles(31) o percentual de casos do laboratrio que foram submetidos a reaes imuno-histoqumicas foi de 0,73% (todos casos de bipsias), apontando a diligncia na indicao da tcnica. J no Jackson Memorial Hospital de Miami, por ser hospital de referncia em patologia e em imuno-histoqumica nos Estados Unidos, essa taxa foi de 9,3% nas bipsias e 0,6% nos preparados citolgicos. Esses valores mostram, especialmente no caso do estudo brasileiro, que a imuno-histoqumica contribui positivamente na balana custo/benefcio numa pequena parcela de casos, e consolida a sua posio de ferramenta complementar e no essencial para o exerccio da patologia cirrgica de um modo geral(14, 20).

Indicao do exame imuno-histoqumico e relao custo/benefcio

Wick, Ritter e Swanson(38) discutem o impacto dos resultados da imuno-histoqumica na deciso do tipo de tratamento a ser oferecido ao paciente. Dentro desse contexto, eles comentam que a imuno-histoqumica tem papel fundamental quando usada para identicar

Tabela 1

Painel bsico de anticorpos utilizados para diferenciao de algumas neoplasias malignas indiferenciadas de clulas pequenas KER LCA S100 DESM CD99
+ + + + +

Carcinoma Linfoma Melanoma Rabdomiossarcoma Sarcoma de Ewing

KER: queratina; LCA: antgeno leucocitrio comum; S100: protena S-100; DESM: desmina; CD99: glicoprotena MIC 2; +: resultado positivo na grande maioria dos casos; -: resultado negativo na grande maioria dos casos.

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Endereo para correspondncia Luiz Fernando Bleggi Torres Servio de Anatomia Patolgica Hospital de Clnicas de Curitiba Rua General Carneiro, 181 CEP 80600-900 Curitiba-PR

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