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MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA

Asignatura de Microbiologa y Toxicologa Ambiental

Instituto Tecnolgico de Ciudad Madero Departamento de Ingeniera Qumica y Bioqumica

Carrera de Ingeniera Qumica Mdulo de Especialidad: Procesos Sustentables

Autores: M.G.C. Lorena Margarita Salas Ordaz. M.I.A. Guillermina Castillo Rivera. I.Q. Laura Isela Montoya Ortiz.

INTRODUCCION
En el laboratorio, al igual que en la otros lugares donde habitamos, nos enfrentamos a algunos peligros que debemos considerar para disminuir los riesgos de accidentes. Podramos clasificar a estos riesgos en Riesgos Biolgicos (virus, bacterias, clamidias, rickettsias, parsitos u hongos) y en No Biolgicos. Estos ltimos incluyen los riesgos qumicos (por ejemplo solventes inflamables o custicos), fsicos (por ejemplo cortaduras, ruido o exposiciones calorficas), que son comunes a otros laboratorios. La Microbiologa es la ciencia que estudia los microorganismos, tanto aquellos causantes de enfermedades como los saprofitos y beneficiosos. Engloba el estudio de bacterias, hongos, parsitos y virus. La finalidad de los contenidos de esta asignatura permitir al estudiante adquirir los conocimientos, habilidades y destrezas que le permitan comprender y manipular las tcnicas y procedimientos que contribuyen al anlisis microbiolgico, as como las diferentes funciones que desempean los microorganismos. El campo de accin del laboratorio de Microbiologa, presenta relacin con otras asignaturas, principalmente se ha diseado tomando como fundamento reas de Qumica, Bioqumica, Matemticas y Biologa e identificando los contenidos que tienen una mayor aplicacin en el perfil profesional del alumno. El laboratorio de Microbiologa provee las herramientas necesarias para la manipulacin y control de los microorganismos, indispensable para el diseo de equipos y procesos, estudio y aplicacin de nuevas tecnologas, y diseo de normas y programas en el mbito de las Ingenieras: En Industrias Alimentarias, Bioqumica y Ambiental. El estudio en el laboratorio de Microbiologa, ha dependido para su desarrollo de algunos instrumentos, principalmente el microscopio, tcnicas de esterilizacin, preparacin de medios de cultivo, mtodos de obtencin de cultivos puros y de conservacin de cepas aisladas. Con este manual de laboratorio el estudiante adquiere habilidades a travs de una serie de prcticas desarrolladas de acuerdo al conocimiento terico adquirido.

OBJETIVO(S) GENERAL(ES) DEL CURSO DE MICROBIOLOGIA Y TOXICOLOGIA AMBIENTAL. (Competencia especfica a desarrollar en el curso)
Aplicar conocimiento relacionados con la organizacin estructural de los microorganismos, con sus caractersticas qumicas, metablicas, genticas, alergnicas, y antignicas, facilitar su clasificacin, aislamiento, propagacin y conservacin, comprender y aplicar su funcin en los ecosistemas y en la Industria.

Comprender los efectos de sustancias txicas en el organismo, para poder realizar un diagnstico y evaluacin de riesgo toxicolgico, asimismo podr determinar la metodologa de la evaluacin de riesgos y representar su estructura en forma esquemtica.

Conocer los procesos a los que un frmaco es sometido a travs de su paso por el organismo, interpretar qu sucede con el frmaco desde el momento en el que es administrado hasta su total eliminacin del cuerpo y aplicar los conocimientos de la toxicologa ambiental para un correcto manejo de los frmacos.

SEGURIDAD
Las Normas de Seguridad Biolgica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo relacionado con la manipulacin de material peligroso, y su rigurosidad vara con la peligrosidad de los agentes. La seguridad biolgica se fundamenta entonces en tres elementos: Tcnicas de Laboratorio. Se refieren a todas aquellas prcticas y tcnicas microbiolgicas que se realizan dentro y fuera del laboratorio. Un buen seguimiento de las mismas ayuda a contener los riesgos biolgicos. Como prctica de mayor importancia se encuentra el desarrollo o adopcin por parte de cada laboratorio de un Manual de Seguridad Biolgica en el que se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que especifique los procedimientos que puedan minimizar esos riesgos, como as tambin las responsabilidades. Equipo de seguridad (Barreras Primarias). Se incluyen en este apartado tanto dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad (por ejemplo, las cabinas de seguridad biolgica), como las prendas de proteccin personal (guantes, mascarillas, batas, calzado, etc.). Diseo y Construccin de la Instalacin (Barreras Secundarias) . La magnitud de las barreras secundarias depender del tipo de agente infeccioso que se manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separacin de las zonas donde tiene acceso el pblico, la disponibilidad de sistemas de descontaminacin (autoclaves), filtrado del aire de salida al exterior, flujo de aire direccional, etc. El equipamiento y el diseo del laboratorio de microbiologa contribuyen a la seguridad slo si las personas que trabajan en l estn motivadas, conocen las normas de seguridad y las aplican. La actitud y el modo de proceder de sus trabajadores determinan su propia seguridad, as como la de sus compaeros y la de la colectividad. De nada sirven la mejor ingeniera sanitaria, un ptimo diseo arquitectnico o la tecnologa ms avanzada si el personal desconoce o incumple las medidas establecidas para su seguridad. La formacin es la clave de la eficacia de los programas de seguridad y sta debe ser facilitada a todas las personas que estn expuestas a los riesgos del laboratorio: personal del laboratorio, de mantenimiento, de limpieza, etc.

EL FACTOR HUMANO EN LA PREVENCIN DE ACCIDENTES Un accidente puede ocurrir por diferentes causas, pero casi siempre, se deben a errores humanos y pueden ser evitados. Por ello, es que debe tenerse especial atencin en aquellos factores humanos que intervienen en la prevencin de accidentes: Prestar atencin a los estados de ansiedad, irritabilidad y apresuramiento. Reflexionar sobre las actitudes de negacin ante situaciones de riesgo. Considerar que las crisis de cambio pueden ser un factor especfico en la produccin de accidentes. Detenerse a investigar un accidente menor como predecesor de otro de mayor importancia. Detectar el desplazamiento de las crisis a las actividades laborales. Una vez ocurrido el accidente su consecuencia vara segn su gravedad, por ello es importante que el accidente no ocurra, dado que pueden ser evitados. El riesgo de que se produzca un accidente puede disminuirse a niveles muy bajos siempre y cuando se tenga en cuenta que se debe: Conocer los elementos de riesgo.

Conocer la forma de manejarlos. Contar con los elementos necesarios para aplicar tcnicas que disminuyan los riesgos. Aceptar consejos de aspectos tcnicos, de personas con experiencia en el trabajo de laboratorio. Transmitir dichos aspectos a quienes recin ingresan al laboratorio. Exigir de los superiores la implementacin de medidas de proteccin. Restringir el acceso de visitantes. Si a pesar de todo lo antes expresado, el accidente igual ocurre, es muy importante saber lo que se debe hacer y a quin hay que recurrir para comenzar en forma inmediata una tarea de reparacin.

ELEMENTOS DE RIESGO. HBITOS DE HIGIENE Manos: En algunos aspectos, son como las patas de las moscas, tocan la suciedad, las fuentes de infeccin y sin que tengamos una nocin clara de sus movimientos, las llevamos a la boca o a los ojos que son, a su vez, la puerta de entrada de muchas infecciones. Cuando estamos trabajando en un laboratorio, tenemos que cambiar ciertas costumbres, como la de llevarnos lpices a la boca, ya que normalmente se dejan en cualquier lugar pudindonos infectar con cualquier microorganismo all presente. Un paso importante en la proteccin de nuestra salud es aceptar e incorporar en nuestras prcticas la Regla de los 4 NO (o primer regla de oro de la bioseguridad), en ella se destaca que en el laboratorio se debe: No fumar No comer No beber No maquillarse Como una prctica diaria y en forma repetida, deben lavarse las manos con jabn (preferentemente lquido), cuantas veces sea necesario. Dado que las manos son susceptibles de recibir pinchazos, heridas y abrasiones, para realizar algunas tareas conviene utilizar guantes, dado que la posibilidad de que lo anterior ocurra se encuentra muy disminuida. Dos prcticas son necesarias cuando utilizamos guantes, el lavado con jabn y el sacrselos cuando se vayan a realizar otras tareas diferentes a las que estamos realizando, como por ejemplo, levantar el telfono, luego de trabajar. Cabello: Es conveniente usarlo corto o recogido durante el trabajo. Uso de ropa protectora: el uso de guardapolvo impide daos mayores, por ejemplo salpicaduras con material infeccioso o contaminado. Esta ropa debe ser higienizada peridicamente y permanecer siempre dentro del rea del laboratorio. Proteccin de ojos. Cuando se trabaja con sustancias corrosivas, es conveniente usar anteojos protectores o mscaras para disminuir el riesgo de lesionar la crnea con salpicaduras o por exposicin a vapores qumicos. Es importante trabajar bajo campana, al manipular solventes, como as tambin tener a mano soluciones y dispositivos especiales para el enjuague de los ojos. Otras protecciones. En las operaciones comunes del laboratorio se generan aerosoles y dado que la mayora de las bacterias y virus tienen como puerta de entrada al organismo la va area, hay que evitar la produccin de stos y es necesario usar mscaras de proteccin. Debe evitarse el pipeteo directo con la boca, por ello es conveniente usar aquellos dispositivos apropiados como lo son las pipetas automticas, las propipetas (peras de goma), dispensadores, etc. Otra regla importante, considerada la segunda regla de oro de la bioseguridad es Considerar que toda muestra es potencialmente peligrosa y tratarla como tal .

OTRAS RECOMENDACIONES: Proteger de sobrecargas los circuitos elctricos, usando disyuntores y polos a tierra. Utilizar una toma a tierra en la instalacin elctrica interior. Usar tomacorrientes simples en lugar de tomas mltiples. Colocar los interruptores y disyuntores en lugares accesibles. Usar calefactores con vlvula de seguridad. Revisar peridicamente los matafuegos. Mantener los corredores y pasillos libres de obstculos que puedan entorpecer las salidas. Controlar las plagas y artrpodos.

CLASIFICACIN DE LOS AGENTES BIOLGICOS POR GRUPOS DE RIESGO Segn la peligrosidad de los microorganismos infectantes, existe una clasificacin por grupos de riesgo: Agente Biolgico del Grupo I. Es aqul que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre y en la comunidad. Agente Biolgico del Grupo II. Es aqul que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la comunidad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente Biolgico del Grupo III. Aqul que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, pudiendo causar la muerte con riesgo de que se propague a la comunidad y existiendo frente a l generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente Biolgico del Grupo IV. Aqul que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas posibilidades de que se propague a la comunidad y sin que exista generalmente frente a l profilaxis o tratamiento eficaz. CLASIFICACIN DE LOS LABORATORIOS SEGN SU NIVEL DE SEGURIDAD BIOLGICA Nivel 1. Microorganismos no patgenos para el hombre. Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biolgicos del grupo I, es decir, los que no producen enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Es el habitualmente utilizado en los laboratorios de prcticas de universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patgenas. Se debe trabajar en condiciones mnimas de asepsia y esterilidad. Ejemplos tpicos son Escherichia coli, como as tambin todos aquellos microorganismos que se utilizan en la industria alimenticia, para la elaboracin de quesos, cerveza, embutidos, etc. Nivel 2. Microorganismos y procedimientos de riesgo moderado. En l se trabaja con agentes del grupo II, como as tambin con algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patologa infecciosa humana de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado y son los que con ms frecuencia se estudian en laboratorio de microbiologa clnica: Salmonella typhi, Mycobacterium tuberculosis, Virus de la Hepatitis B, etc. Otros aspectos que se deben considerar en este nivel son: - El rea de riesgo debe restringirse al personal, no permitindose el acceso a personas que tengan aumentado, por alguna causa, el riesgo de infeccin (Ej: inmunosuprimidos). - En el acceso al laboratorio figurarn seales de riesgo biolgico, condiciones de ingreso y responsables del mismo (nombre, telfono y domicilio). - El personal debe estar vacunado (si correspondiera) y entrenado para prevenir accidentes y actuar correctamente en caso de que ocurriere. - Uso de guardapolvo en el rea de trabajo exclusivamente (considerar que el guardapolvo es potencialmente un elemento contaminante). - Evitar el uso de jeringas o cualquier otra prctica que genere aerosoles.

Las muestras deben tratarse siempre como potencialmente infectadas y tenerse en cuenta las precauciones citadas.

Nivel 3: Microorganismos que pueden causar la muerte o aquellos de riesgo moderado En este nivel se trabaja con agentes biolgicos del grupo III, microorganismos que causan patologa grave, de difcil y largo tratamiento, que pueden dejar secuelas y ocasionalmente producir la muerte, en cuya manipulacin se aplican procedimientos de trabajo, que implican alto riesgo de infeccin. El mayor y ms frecuente peligro que entraan stos es la infeccin adquirida a travs de aerosoles y por fluidos biolgicos. Por ello las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulacin y la utilizacin de cabinas de seguridad (incluidas las medidas de los niveles anteriores como las condiciones mnimas de asepsia y esterilidad, adems del uso de batas, mscaras, respiradores, guantes, etc.). En los laboratorios de microbiologa clnica los ejemplos ms tpicos de este tipo de microorganismos son el Virus de la fiebre de Lassa, Brucella spp, Histoplasma capsulatum, etc. Solo pueden ser procesados por personal calificado, por ello se debe restringir el acceso al personal del laboratorio y llevar un registro de las visitas, del personal de servicio y de accidentes. La infraestructura apropiada para el nivel de contencin 3, incluye, adems, aire acondicionado independiente, sin recirculacin, con gradiente de presin, entre otras. Peridicamente se tomarn muestras de sangre a todo el personal. Nivel 4: Microorganismos exticos y/o altamente peligrosos y procedimientos de alto riesgo. Este nivel se requiere cuando se procesa con certeza y se sospecha un agente especialmente patgeno e infectocontagioso, extico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento o es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Este nivel tambin puede utilizarse para trabajar con animales de experimentacin infectados con microorganismos del grupo IV. Debe trabajarse en laboratorios especiales de mxima seguridad (contencin mxima), en los que es necesario ducharse y cambiarse de ropa tanto a la entrada como a la salida del mismo y en donde existen barreras de aire con el exterior. El manejo del material limpio y contaminado se realiza por canales altamente controlados. Ejemplos de este nivel son el virus Junn, virus bola, el virus de la fiebre aftosa, el virus del HIV, el Machupo y el Marburg. Adems, deben incluirse en este nivel de contencin los microorganismos propios del grupo 3 que adquieren propiedades patgenas que los elevan al grupo 4. Un ejemplo sera Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso teraputico.

En general, la naturaleza infecciosa del material clnico es desconocida y al Laboratorio de Microbiologa suelen remitirse muestras muy diversas. Es responsabilidad del Jefe del laboratorio, el establecimiento de prcticas normatizadas que de forma realista permitan su manipulacin.

GUIA DE OBSERVACION Y LISTA DE COTEJO PARA AL TRABAJO DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Y TOXICOLOGIA AMBIENTAL Nombre del alumno: Nombre del Profesor: Institucin: Fecha de realizacin: Nombre de la Prctica: M.G.C. Lorena Margarita Salas Ordaz Instituto Tecnolgico de Ciudad Madero

CRITERIOS DE EVLUACIN REPORTE DE PRACTICA DE LABORATORIO. Aspecto a Observar Introduccin Propiedades Fsico-qumicas de reactivos utilizados Diagrama de Flujo Resultados y Observaciones Conclusiones Cuestionario Bibliografa SI NO % 15 5 15 15 15 15 5 Observaciones

TRABAJO EN CLASE PRESENCIAL (DE LABORATORIO) Aspecto a Observar Tuvo disponibilidad, disciplina, trabajo de quipo Llev paso a paso el desarrollo SI NO % 8 7 Observaciones

El resultado de la evaluacin del contenido tiene un valor de 100 puntos. cumplimiento del alumno fue: _________puntos. Para una calificacin aprobatoria se requiere como mnimo 70 puntos.

El

PRACTICA N1 PRESENTACIN DEL MATERIAL DE LABORATORIO


OBJETIVO a) Reconocer y manejar el material de uso comn en el laboratorio de microbiologa. b) Tomar conciencia y aplicar las reglas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa.

INTRODUCCIN Adems de un ambiente apto para el trabajo microbiolgico, el laboratorio de microbiologa requiere de una instrumentacin bsica de uso corriente en microbiologa, como la siguiente (ver Figura 1.1).

PROCEIMIENTO Tubos de ensayo: destinados a conservar medios de cultivo en pequeos volmenes. Se utilizan tubos de vidrio de diversos tamaos, con tapa a rosca o a presin. El vidrio debe ser de buena calidad, neutro, transparente e inalterable a los tratamientos. Placas de Petri: cajas de vidrio de seccin circular, con tapa. Existen de diferentes tamaos segn su uso, aunque las ms frecuentemente utilizadas tienen 10 cm de dimetro. Pipetas graduadas: para su uso en el laboratorio de microbiologa se les coloca un tapn de algodn en el extremo superior, de manera de impedir que el operador aspire lquidos potencialmente contaminados, o que contamine el medio de cultivo al aspirarlo. Se utilizan para realizar inoculaciones y diluciones. Para manejar pequeos volmenes (menores de 1 ml) se recomienda el uso de pipetas automticas que miden exactamente el volumen deseado (500, 150, 50 Ul etc.); en el extremo se colocan puntas o tips estriles que se reemplazan cuando se desea. Pipetas Pasteur: son tubos de vidrio terminados en capilar. Se usan para transportar pequeos volmenes de lquido o para sembrar a partir de medios de cultivo lquidos. Esptula de Drigalsky: Se construye con una pipeta Pasteur larga o con una varilla de vidrio. Se calienta el extremo en la llama del mechero y se dobla en ngulo recto unos 4 cm, esta ltima porcin se dobla nuevamente del mismo modo. Se utiliza para distribuir una muestra lquida que se siembra sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Mango o cabo de Koll: sirve para sujetar al ansa, aguja o esptula de platino o aleaciones metlicas de lenta oxidacin y rpido enfriamiento. Est compuesto por un mango de un material aislante, que se prolonga en un vstago metlico que sostiene mediante una tuerca un alambre. Cuando el extremo del alambre tiene forma de anillo se denomina ansa; si se deja el extremo recto se llama aguja y si se dobla en ngulo recto al extremo libre se lo llama gancho. Marcador permanente al solvente: son marcadores resistentes al agua, se utilizan para marcar o escribir sobre superficies de vidrio. Portaobjetos: lmina rectangular de vidrio incoloro de 2,5 cm x 7,5 cm y aproximadamente 1 cm de espesor. Se utilizan para hacer observaciones microscpicas de los microoganismos, ya sea en fresco o fijados. Portaobjetos excavados: se utilizan para realizar exmenes con gota pendiente, para ello presentan una depresin de unos 10 a 12 mm de dimetro. En este caso el material a observar es una gota de lquido suspendido.

Cubreobjetos: pequeas lminas de vidrio transparente, de poco espesor (0,11 a 0,23 mm), usados para cubrir los preparados realizados sobre el portaobjetos para su posterior observacin microscpica. Tubos o campanitas de Durham: pequeos tubos (de unos 5x30 mm) que son colocados en forma invertida dentro de los tubos de ensayo que contienen medio de cultivo lquido, sirven para verificar la produccin de gas por parte de los microorganismos. Erlenmeyer: se utilizan para preparar los medios de cultivo, o para el desarrollo de microorganismos en medio lquido con agitacin o aireacin. Otros elementos y aparatos: Al material citado debe agregarse por su uso frecuente, mecheros y gradillas. Los aparatos ms comnmente usados en el laboratorio de microbiologa son: microscopios, lupas, autoclave, estufas de esterilizacin y cultivo, bao termorregulable, balanzas, espectrofotmetro, centrfuga, heladeras, etc.

NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 1. Todos los estudiantes deben usar guardapolvo durante las clases prcticas con el objeto de proteger su ropa de posibles contaminaciones. Deben proveerse de repasador, jabn de tocador, detergente, lavandina y marcador para vidrio. 2. Tener siempre a mano sobre la mesada: a) una probeta o similar llena con solucin desinfectante para introducir las pipetas luego de ser utilizadas; b) una olla o recipiente metlico para colocar el material contaminado o sucio; c) mechero. 3. Lavarse las manos antes y despus de trabajar. 4. Limpiar su sector de mesada con un algodn embebido en solucin desinfectante. Para ello se puede emplear bicloruro de mercurio, solucin de formol al 2%, alcohol 50-70 grados, etc. (no corrosivas para la piel). 5. Tener en cuenta que el cultivo con el que se trabaja puede ser patgeno, razn por la cual hay que manejarlo siempre como si lo fuera. 6. Al recibir el cultivo NO LO DESTAPE, tome el tubo por su parte media apoyado sobre la palma de la mano de manera de ver fcilmente el contenido y la inscripcin que lo identifica. 7. Cualquier accidente con los cultivos, como rotura de tubos sembrados, debe alarmar lo suficiente como para subsanarlo, evitando la diseminacin del material. Comunique el hecho al personal de la ctedra. 8. En caso de heridas por accidentes durante el manipuleo del material infectado, debe prevenirse la posibilidad de infeccin. Comunique el hecho al personal de la ctedra. 9. Realice las tcnicas bacteriolgicas al abrigo de las corrientes de aire, con movimientos pausados, poco amplios y sin brusquedad. Evite hablar mientras realiza maniobras microbiolgicas a fin de evitar que se contaminen los cultivos. 10. Debe siempre llevarse el ansa al rojo antes y despus de toda operacin que se realice con ella. 11. No deben depositarse los tapones sobre la mesada, para evitar contaminaciones de y con los cultivos de trabajo. 12. Los tubos con medio de cultivo, ya sean lquidos o slidos, sembrados o no, deben colocarse siempre sobre una gradilla y nunca sobre la mesada. 13. Los cultivos de descarte deben colocarse siempre en recipientes adecuados para luego ser esterilizados. 14. Tanto las placas como los tubos deben ser identificados con marcas o rtulos. 15. Los papeles de envoltura de material de vidrio deben arrojarse en los cestos destinados a tal fin. 16. Anotar concisamente todo lo nuevo que se observe en cada experiencia, completando con dibujos. 17. Al abandonar el laboratorio, debe controlar que los mecheros y picos de gas del autoclave queden cerrados, as como las luces y los picos de agua, de manera de evitar accidentes.

18. REQUIERA LA PRESENCIA DEL DOCENTE PARA QUE LO ASESORE CORRECTAMENTE TODA VEZ QUE TENGA DUDAS SOBRE LA REALIZACIN DE UNA TCNICA.

LIMPIEZA Y PREPARACIN DEL MATERIAL El material que se emplea en microbiologa debe estar perfectamente limpio y estril. La limpieza es importante ya que restos de sustancias que permanecen en los tubos, placas y dems elementos, pueden impedir el posterior desarrollo de los microorganismos; la esterilizacin es fundamental para evitar la presencia de microorganismos extraos o contaminantes. Para ello el material deber ser acondicionado de tal forma que mantenga estas condiciones por tiempo indeterminado. 1. Tubos de ensayo. Para su uso deben estar perfectamente limpios. Si en ellos se ha realizado algn cultivo deben esterilizarse previamente a su limpieza, para lo cual deben colocarse boca abajo y sin tapn en un recipiente para favorecer que escurran los medios de cultivo en ellos contenidos. Se lava con agua caliente jabonosa o con detergentes neutros con la ayuda de cepillos limpiatubos. Luego se enjuaga abundantemente con agua potable y finalmente con agua destilada. Posteriormente se colocan en canastos u otros recipientes para su escurrido y secado. 2. Placas de petri. Se las esteriliza y lava de la misma manera que se describi anteriormente y se las coloca boca para abajo para su secado. Luego, cada caja con su respectiva tapa, se envuelve individualmente en papel, realizndose un doblez con el mismo en la parte superior para evitar que entre polvo hacia el interior. Luego pueden envolverse de a grupos para garantizar la esterilidad ante una eventual rotura del papel. As preparadas se esterilizan en autoclave y se secan en estufa. 3. Pipetas. Para su uso deben estar limpias desengrasadas, estriles y secas. Luego de ser utilizadas se deben colocar en probetas u otro recipiente destinado a tal fin, que contenga solucin desinfectante (hipoclorito, formol 4%, fenol 5%); se quita el trozo de algodn colocado en la boquilla con un alambre. Se colocan luego en solucin de detergente para asegurar su limpieza. Se enjuagan primero con agua corriente y luego con agua destilada, y posteriormente se secan. Para volver a prepararlas se coloca en la boquilla un pequeo tapn de algodn lo suficientemente ajustado como para aspirar con facilidad sin que se salga. Luego se colocan en portapipetas metlicos o se envuelven individualmente, y luego en paquetes, y posteriormente se esteriliza. 4. Portaobjetos. Para lograr que estn limpios y desengrasados se los sumerge en soluciones de detergentes en las que se hierven, luego se enjuagan y dejan secar.

Figura 1.1: Los instrumentos bsico de uso corriente en el laboratorio de Microbiologa son: a y b) Tubo de ensayo con tubo o campana Durham, c) Placa de Petri, d) Pipeta graduada con tapn de algodn, e) Pipeta Pasteur, f) Esptula de Drigalsky, g) Aguja, h)Ansa, i) Portaobjeto y j) Erlenmeyer

PRACTICA N 2

MEMBRANA SEMIPERMEABLE.

Objetivo: Identificar el concepto de semipermeabilidad de una membrana Introduccin: La membrana celular es una membrana semipermeable, que envuelve directamente el contenido celular. Es constituida por protena y lpidos y tiene la funcin de proteger el contenido celular y controlar la entrada y salida de sustancias de la clula. Material: 1 Soporte universal 1 Vaso de precipitado 250 o 500 ml 1 Piceta 1 pinzas para bureta Papel celofn (membrana) Elstico, liga o hilo Cuchara Jeringa desechable Reactivos: Azcar o Sal Agua Destilada

Procedimiento. Atencin: el agua y los dems componentes deben ser aptos para el consumo y el experimento debe guardar las respectivas medidas de higiene. 1) Colocar agua pura o destilada hasta la mitad del vaso de precipitado. 2) Mezclar agua y tres cucharas de azcar en un vaso de precipitado. Introducir una cantidad de esta mezcla en el material que funcionar como membrana semipermeable, y que previamente se ha sellado de uno de sus extremos. Puede usarse una jeringa para facilitar el llenado. 5) Marcar el nivel del agua en el tubo estrecho y cerrar la abertura con un pedazo de algodn o sellar con otro tramo de hilo. 6) Colocar el montaje realizado en los puntos 1 y 2 en el vaso de precipitado, pendiendo de uno de sus extremos y fijndolo a un soporte para que tenga una altura fija. 7) Dejar el sistema en reposo hasta el da siguiente. Observar y anotar lo que ocurri. 8) Probar el agua del vaso.

PRACTICA N3 MICROSCOPA. ESTUDIO MORFOLOGICO DE LOS MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL


OBJETIVO a) Conocer las partes y funcionamiento de un microscopio. b) Tomar conocimiento del cuidado, manejo y utilidad de un microscopio en el Laboratorio de Microbiologa. INTRODUCCIN Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano, y para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es indispensable en el Laboratorio de Microbiologa para el estudio de la morfologa y estructura de los microorganismos, as como su reaccin a diferentes colorantes, lo cual junto con otros criterios, permitir su identificacin, por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo. Adems de la ampliacin de la imagen, en microscopa, hay que tener en cuenta dos factores ms: el contraste y la resolucin. Los objetos deben poseer un cierto grado de contraste con su medio circundante para poder ser percibidos a travs del microscopio. Por ello es que la mayora de los organismos necesitan ser previamente teidos para poder distinguirlos del medio (tinciones simples). Para contrastar o realzar de forma especfica distintas caractersticas morfolgicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales. Estas tcnicas tienen un gran inters en la identificacin y clasificacin de las bacterias. La tincin diferencial ms utilizada es la tincin de Gram. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian bacterias cido- alcohol resistentes, las que diferencian estructuras significativas como las esporas o la tincin negativa de cpsulas. Por otra parte, el grado de resolucin (la capacidad para ver separados dos objetos adyacentes muy prximos entre s), depende de las caractersticas del sistema de lentes que posea el microscopio. ste se encuentra limitado por la longitud de onda de la luz emitida, el ndice de refraccin del medio en el que se realiza la visualizacin y la apertura numrica del objetivo.

EL MICROSCOPIO El microscopio compuesto (figura 2) es aquel que dispone de dos o ms lentes de aumento. Un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema ptico. 1. Soporte. Es la pieza fija en la que slo la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Sus principales partes son: a. Base. Normalmente alberga la fuente de iluminacin, en determinados modelos b. incorpora adems, un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. c. Brazo. Soporta todo el sistema ptico, el cabezal portaoculares y el revlver portaobjetivos. En l se dispone tambin un sistema de anclaje de la platina (movimiento de enfocado de la preparacin). d. Platina. Es la pieza donde se coloca la preparacin microscpica para su observacin. e. El Macromtrico y el Micromtrico. Ambos permiten enfocar la preparacin. El primero se emplea para un enfoque rpido cuando se trabaja con objetivo de menor a de mayor aumento (x40, x100).

2. Sistema ptico. Est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.

FIGURA 2: MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO 1. Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos estn limpias: de no ser as, lmpielas cuidadosamente con papel especial para ptica. No tocar las lentes con los dedos. 2. Coloque la preparacin (sin cubreobjetos y con la muestra en la parte superior) sobre la platina sujetndola con el dispositivo mvil. Compruebe previamente, que el objetivo de menor aumento est en posicin de empleo. 3. Para bacteriologa, iluminar la preparacin bajando el condensador (ms contraste), y con el diafragma abierto. 4. Ajuste los binoculares a la distancia interpupilar y ajuste el foco de cada ocular si el microscopio lo permite. 5. Coloque el objetivo de 10 aumentos (x10) y enfocar: a. Acerque al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando para ello el macromtrico. No realizar dicha operacin mirando por el ocular, pues correra el riesgo de clavar el objetivo en la preparacin con el consiguiente destrozo de ambos. b. Enfoque con el micromtrico observando por el ocular hasta obtener un enfoque ntido 6. Pase al objetivo de 40 aumentos (x40). Suba ligeramente el condensador. La imagen debe estar casi enfocada, afine el foco con el micromtrico. Si la imagen no est ni medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de x10. El objetivo de x40 trabaja muy cerca de la preparacin y por ello es susceptible de dos tipos de accidentes: ser clavado en la preparacin y resultar manchado con aceite de inmersin si se observa la preparacin ya usada con ste ltimo. 7. Empleo del objetivo de inmersin: a. Gire el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el objetivo de x40

b. Coloque una gota de aceite de inmersin sobre el punto de la luz. c. Termine de girar el revlver hasta la posicin del objeto de inmersin, asegurndose de que ste no toca la preparacin, pero s la gota de aceite. d. Enfoque cuidadosamente con el micromtrico. Recuerde que la distancia entre el objetivo y la preparacin es mnima. e. Una vez que ya ha puesto aceite de inmersin sobre la preparacin ya no puede volverse a colocar los objetivos de x10 y de x40 sobre ese campo. Por lo tanto, si desea enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersin girando el revlver hacia el objetivo de menor aumento (x10), seleccionando otro campo y empezando a enfocar desde ste ltimo. f. Finalizada la observacin de una preparacin, y antes de retirarla de la platina, se colocar el objetivo de menor aumento girando el revlver en el sentido hacia la lupa. Nunca retire la preparacin con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. g. Retire la preparacin y limpie el objetivo de inmersin cuidadosamente con un papel especial para ptica. Compruebe tambin que el objetivo de x40 est limpio.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. No se deben tocar nunca las lentes con las manos, sino con pauelos especiales para lente. 2. No dejar nunca una preparacin sobre la platina cuando no est usando el microscopio. 3. Para cambiar el objetivo, utilice siempre el revlver. 4. Despus de utilizar el objetivo de inmersin lmpielo. En caso de que el aceite se haya secado, avise al docente para limpiarlo con xilol. 5. No fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio (macro y micromtricos, platina, revlver y condensador). 6. No cambie nunca de objetivo mientras est observando a travs del ocular. 7. Cuando finalice el trabajo ponga el objetivo de menor aumento en posicin de observacin. 8. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin de prctica.

MATERIAL 1 microscopio 3 portaobjetos 1 cubreobjetos 1 asa de platino 1 mechero 1 piceta

REACTIVOS aceite de inmersin una tortilla o pan con hongo agua estancada fibras de algodn solucin de azul de metileno

PROCEDIMIENTO. 1. Observe el pan o tortilla, la fibra de algodn y el agua estancada a travs del objetivo de bajo poder. Es ms fcil mantener las fibras de algodn en posicin fija para su observacin si se coloca en medio una gota de agua sobre el portaobjetos. 2. Repita las observaciones utilizando el objetivo de alto poder en seco, al observar con este objetivo coloque un cubreobjetos sobre cada una de sus preparaciones acuosas para proteger la lente del agua. Esto se le conoce como montaje hmedo. 3. Finalmente observe un frotis bacteriano. a. Poner una gota de agua sobre el portaobjetos. Esterilizar un asa de platino calentndola a la llama de un mechero bunsen hasta que se ponga de color rojo; dejarla enfriar. b. Con el extremo del asa de platino, tocar una colonia bacteriana y mezclarlas con el asa y con la gota de agua del portaobjetos. Extender la gota lo ms que se pueda sobre el portaobjetos. Secarlo calentndolo sobre la llama del mechero. Cuando el portaobjetos este seco pasarlo dos veces a travs de la llama con el objeto de fijar el microscopio.

c.

Teir el microorganismo fijado en el portaobjetos. Esto consiste en colocar el portaobjetos cobre el soporte para cubrirlo con la solucin de azul de metileno. Dejarlo as durante dos minutos. Lavar con agua y secar el portaobjetos. d. Observar los microorganismos al microscopio. Esto consiste en utilizar el objetivo de inmersin con el cual se obtiene una mayor precisin. Para ello se pone previamente una gota de aceite sobre la preparacin a observar (no se necesita cubreobjetos), bajando entonces el objetivo de inmersin sobre el portaobjetos hasta que toque la gota de aceite.

PRACTICA N 4. ESTERILIZACIN.
OBJETIVO a) Realizar la prctica de envoltura y acondicionamiento de los materiales para su posterior esterilizacin. b) Llevar a la prctica los pasos necesarios en el uso del autoclave, la estufa y el mechero Bunsen. c) Comparar los resultados obtenidos entre el material esterilizado y el no esterilizado.

INTRODUCCIN Para poder desempear correctamente las tareas en un laboratorio de microbiologa, es indispensable contar con conocimientos tericos acerca de los diferentes mtodos de control del crecimiento microbiano (mtodos de esterilizacin, desinfeccin, apepsia, etc.). Tambin con un buen manejo prctico de los aparatos destinados a tal fin, del flameado de tubos y esterilizacin de ansas y agujas a la llama del mechero. Por control del crecimiento microbiano, se entiende tanto la inhibicin del crecimiento microbiano (evitar su multiplicacin) como la destruccin de aquellos. En este contexto se emplean una serie de trmino: esterilizacin, desinfeccin, antisepsia, asepsia, microbiostasis, microbiocida. Hay una serie de posibilidades para el control de los microorganismos basadas en el empleo de agentes fsicos como: el calor, las radiaciones, la filtracin. AGENTE FSICO: EL CALOR El calor es uno de los agentes fsicos ms usados. Su accin depende de la temperatura alcanzada y del tiempo de aplicacin. De la consideracin de stos dos aspectos surgen las siguientes expresiones: Punto trmico mortal: es la menor temperatura capaz de matar una suspensin bacteriana en 10 minutos (tiempo constante y temperatura variable). Tiempo trmico mortal: es el menor tiempo necesario para matar una suspensin bacteriana a una temperatura determinada (tiempo variable y temperatura constante). Para medir el efecto del calor se debe tener en cuenta si se trata de formas vegetativas o esporuladas (de resistencia). Para eliminar las formas vegetativas no se requiere de temperaturas muy altas ya que la mayora se destruye a los 50 y 70C, especialmente las patgenas. Las bacterias esporuladas requieren de temperatura superiores a los 100C. Adems de la temperatura y el tiempo de exposicin es importante tener en cuenta la humedad, el pH y la naturaleza del material a esterilizar. La humedad hace ms efectivo el poder de penetracin del calor; en cuanto al pH, el agregado de ciertas sales alcalinas aumenta la temperatura de ebullicin.

FORMAS POSIBLES DE LA UTILIZACIN DEL CALOR COMO AGENTE ESTERILIZANTE El calor puede ser aplicado para la esterilizacin de tres maneras diferentes: CALOR SECO. Es aire a temperatura elevada. Existen tres tipos: a) Fuego directo: Consiste en exponer directamente a la llama el material a esterilizar, lo que se logra por oxidacin violenta. Este mtodo se utiliza para ansas, agujas, flameado de bocas de tubos u otros recipientes y destruccin de material contaminado. En las llamas de los mecheros Bunsen se alcanzan temperaturas superiores a los 2.500C, por lo que una breve exposicin es suficiente. Sin embargo, cuando las ansas de siembra estn muy cargadas con microorganismos,

la aplicacin directa de la llama provoca la dispersin irregular del contenido de aqullas, con el consiguiente peligro de la contaminacin. Un sistema alternativo a los mecheros son los incineradores elctricos bacterianos, en los que el riesgo de contaminacin no existe., ya que la dispersin es recogida en el tubo del aparato. b) Incineracin en hornos crematorios: Se aplica a elementos contaminados de los que no importa su destruccin, como apsitos, cadveres de animales infectados o material plstico contaminado. Se utiliza la combustin directa o el horno crematorio. Fundamento de la esterilizacin por calor: El calor acta desnaturalizando (coagulando) las protenas. En las formas esporuladas (de resistencia), esta accin se ve disminuida por la presencia de lpidos formando parte de su estructura qumica, que acta protegiendo las uniones peptdicas de las protenas.

c) Aire caliente (ej. Horno Pasteur): Se emplean las estufas de calor seco, en las que el aire caliente circula por el espacio que existe entre la doble pared, transmitiendo as el calor a los objetos que se encuentran en su interior. Los microorganismos se mueren por oxidacin de sus estructuras previa deshidratacin, pudindose llegar a una ligera carbonizacin. Tiempo requerido: Una hora y media a dos horas, a una temperatura de 160 a 180C. El tiempo se mide desde el momento en que se alcanz la temperatura indicada y est condicionado por la cantidad de material y su distribucin dentro de la estufa. El aire caliente no tiene mucho poder de penetracin, por esta razn es que se requiere mayor temperatura y tiempo que con otros mtodos. Aplicacin: se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio. Recordar que todo el material debe ir perfectamente acondicionado, preferentemente envuelto en papel blanco de modo tal que una vez retirado de la estufa, permanezca estril hasta el momento de ser usado. Descripcin de la estufa: La estufa de esterilizacin a seco es una caja metlica de paredes triples. La pared interior es generalmente de acero inoxidable y presenta orificios para la libre circulacin del aire caliente. La pared intermedia encierra, junto con la externa, el material aislante, que puede ser lana de vidrio o amianto. La fuente de calor es una resistencia elctrica aunque tambin existen estufas a gas. Viene provista de un termorregulador para graduar la temperatura deseada. En la cara superior de la estufa existen orificios para permitir la salida de gases y vapores, pudiendo existir otro para la colocacin de un termmetro en caso de no traerlo incorporado. En el interior posee rejillas metlicas de altura graduable para acondicionar sobre ellas el material a esterilizar. Uso: esterilizacin de material de vidrio y otros materiales termorresistentes que interese mantenerlos secos. Todo el material a esterilizar debe estar debidamente empaquetado con papel de estraza o contenido dentro de cajas metlicas.

CALOR HMEDO. El vapor de agua es uno de los mtodos ms eficaces para destruir microorganismos y, a igualdad de temperatura, es mucho ms eficaz que el calor seco (aire). Hay varias formas de emplear el calor hmedo. a) Agua a ebullicin: Se colocan los objetos en el agua y se lleva a ebullicin durante un tiempo no menor de quince minutos. Se utiliza para jeringas, agujas, ampollas, etc. Precaucin: Los grmenes esporulados y ciertos virus no mueren con 15 minutos de ebullicin. b) Vapor a presin: Es uno de los mtodos ms utilizados; se emplea el autoclave para esterilizar material en general y particularmente para medios de cultivo y otros compuestos qumicos utilizados en el laboratorio de microbiologa. Este mtodo tiene gran poder de penetracin, razn por la cual la esterilizacin se puede llevar a cabo a menor temperatura y tiempo que cuando se emplea la estufa 30 (calor seco) y est especialmente recomendado para la eliminacin de formas esporuladas.

c) Vapor fluente: Consiste en colocar el material en el autoclave pero con la espita. Se utiliza para esterilizar sustancias que se descomponen por encima de los 100 C. Ejemplos: medios de cultivo que contienen ciertos glcidos, leche, antibiticos, etc. Este mtodo puede complementarse con la Tyndalizacin (se explica ms adelante). Descripcin del autoclave: El autoclave consiste en un cilindro de bronce, horizontal o vertical, con una tapa del mismo material que se apoya sobre una arandela de goma y se cierra por pestillos o cerrojos quedando hermticamente cerrado. Adems, posee en la parte superior una llave de vapor (o espita), un manmetro y una vlvula de seguridad. En el interior del autoclave se coloca un volumen de agua que se hace hervir, ya sea por medio de quemadores externos que se encuentran en la parte inferior del aparato, o mediante calentadores elctricos de inmersin. Se cierra luego la tapa, se atornilla dejando abierta la espita hasta que todo el aire del interior haya sido desplazado por el vapor. Debe dejarse que el vapor salga por la espita unos 5 minutos antes de cerrarla. Es muy importante que la eliminacin del aire ya que, de lo contrario, la presin marcada por el manmetro indicar la temperatura a la que se encuentra la mezcla vapor aire en el interior, que es menor a la esperada para el vapor saturado a esa presin. Una vez que se ha cerrado la llave de vapor (espita), comienza a elevarse la presin en el interior el autoclave; usualmente se fija la vlvula de seguridad para que se abra a 15 libras/pulgada2, estas presiones corresponden a 115 y 121C. Presin (Libras/pulg.2) 5 7 10 15 20 Temperatura (C) 107 110 115 121 126

Cuando el manmetro indica que se ha alcanzado la presin deseada, se disminuye la entrada de gas, y as la llama del mechero, ya que el calor necesario para mantener la presin es menor que el requerido para alcanzarla. La presin se mantiene durante unos 20 minutos momento en que se cierra el paso del gas. No deben abrirse ni el autoclave ni la espita hasta que el manmetro indique 0 (cero). Si la presin se libera violentamente los lquidos en el interior del aparato hierven tumultuosamente, pudiendo an reventar los elementos de vidrio. Una vez que el manmetro indique que no hay sobrepresin en el interior del aparato, se abre primero la llave de vapor y luego de algunos minutos se puede levantar la tapa del autoclave. No se debe retirar el contenido inmediatamente. Tiempo requerido: usualmente, para esterilizar medios de cultivo son necesarias temperaturas de 107-121C durante 10 a 15 minutos. Limitaciones: en funcin de la termolabilidad de ciertos materiales y componentes de medios de cultivo. Adems es inadecuado para sustancias que son inmiscibles en agua, como las grasas, en las que la penetracin del vapor es muy limitada.

d) Tyndalizacin: Es un procedimiento de calentamiento discontinuo creado por Tyndall, que permite esterilizar, a bajas temperaturas, aquellas sustancias que se alteran a altas temperaturas como algunos azcares. Se puede realizar a bao Mara o autoclave abierta. La temperatura utilizada es generalmente de 60-80 C; a esta temperatura se eliminan las formas vegetativas pero no las esporuladas. Por esta razn es que despus de un perodo de

calentamiento de 30 minutos, se deja el material a 30-37C hasta el da siguiente, y se lo somete nuevamente al tratamiento inicial. Esta operacin se repite despus de 24 horas (esterilizacin fraccionada). La discontinuidad de calor- reposo permite a las bacterias desarrollar nuevas clulas vegetativas a partir de sus esporas, hasta que por ltimo, en el tercer calentamiento, ya no quedarn formas esporuladas. e) Pasteurizacin: Debe su nombre a Pasteur quien fue el primero en utilizar este mtodo que actualmente presenta una serie de modificaciones. Tiene muy poca aplicacin en bacteriologa y es usada especialmente en leche, ya que destruye la totalidad de los grmenes patgenos y la mayora de la flora banal, respetando la estructura fsica y composicin qumica de la misma (otros ejemplos son la nata, bebidas alcohlicas, mosto, etc.). Consiste en someter el lquido a un calentamiento rpido seguido de un enfriamiento posterior. La temperatura aplicada es de 63C, durante 30 minutos con lo que se consigue la destruccin de las formas vegetativas, excepto las termfilas. Existe una pasteurizacin denominada alta o instantnea, en las que mantienen delgadas pelculas de leche vaporizada sobre tubos o placas a 71C, con lo que se requiere una exposicin de slo quince segundos.