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SDS-PAGE DISCONTINUO PER LA CARATTERIZZAZIONE DI UNA PROTEINA

ELETTROFORESI DI PROTEINE Per lelettroforesi di proteine si usa un gel di poliacrilammide come supporto perch presenta questi vantaggi: - Notevole resistenza meccanica sia quando sono idratati che quando vengono seccati - Completa trasparenza nel visibile che nellUV, la trasparenza resta anche quando sono seccati derisce bene al vetro evitando che si creino vie preferenziali - !a sua porosit" pu# essere controllata ed $ tale che si pu# modulare leffetto di setaccio molecolare%i pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio& - ' utilizzabile per lelettroforesi sia nativa che denaturante - inibisce i moti convettivi causati dal riscaldamento poliacrilammide fornendo un risultato dellanalisi riproducibile( Per la preparazione si fa polimerizzare una soluzione di acrilammide e bisacrilammide: lacrilammide fornisce polimeri lineari%polimerizzazione di tipo vinilico&, mentre la bisacrilammide permette la formazione di legami crociati%cross lin)ing& tra catene di poliacrilammide(*l +,-,. $ attivato dal P/ in assenza di ossigeno, si decompone con produzione di un radicale libero altamente reattivo che polimerizza con lacrilammide e la bisacrilammide con un meccanismo a catena di radicali liberi( Variando la percentuale di acrilammide e bisacrilammide variano le dimensioni dei pori del gel mentre con laumento della concentrazione diminuisce la mobilit" elettroforetica del gel( *n generale le proteine sono molecole formate sequenze di pi0 amminoacidi i quali possiedono gruppi amminici, carbossilici, e gruppi 1 % lifatici, romatici, Polari non carichi, Polari carichi&2 sono molecole anfotere cio$ possono comportarsi sia da acidi che da basi e la loro carica netta dipende dal p3 del mezzo nel quale si trovano sospese pH < pI pH > pI proteina carica 4 che migrer" verso il catodo proteina carica 5 che migrer" verso lanodo +

un dato p3 ed in condizioni non denaturanti la separazione elettroforetica dipende dalle dimensioni e dalla carica delle proteine(

SDS PAGE DISCONTINUO(elettroforesi in condizioni denaturanti /./ %sodio dodecil solfato& $ un detergente anfipatico, in quanto possiede una testa anionica polare formata da uno ione solfonato e una coda idrofobica apolare formata da una catena alifatica di 67 carboni2 esso lega le proteine non5covalentemente, con una stechiometria di circa una molecola di /./ per due di amminoacidi, conferendo alla proteina su cui si lega una carica negativa2 le proteine trattate con questo detergente denaturano%tranne i legami covalenti crociati& acquisendo una conformazione meno compatta, risultando caratterizzate dallo stesso rapporto massa8carica e durante una /./5P 9, tutte le proteine migrano verso l:anodo %l:elettrodo carico positivamente& e si separano solo sulla base dei loro peso molecolare2 le proteine pi0 piccole migrano pi0 velocemente( Prima della corsa, si procede al riscaldamento del campione che accellera la denaturazione consentendo all/./ di legare le regioni idrofobiche, e al trattamento con ;5mercaptoetanolo %o ditiotretolo& il quale effettua una riduzione dei ponti disolfuro presenti, determinando la completa perdita della struttura <. %terziaria& ( =uestultimo passaggio $ fondamentale affinch la separazione in base al solo peso molecolare( Nel tampone di caricamento $ presente anche *l glicerolo, utilizzato per rendere pesanti i campi e farli scendere nei pozzetti( !elettroforesi discontinua di proteine si basa sulluso di due differenti parti di gel aventi differente concentrazione di P e di differenti p3 e f(i( * gel discontinui consentono una pi0 netta separazione delle componenti del campione( !a visualizzazione delle proteine $ resa possibile mediante colorazione con Comassie >rillant il quale si lega alle proteine mediante interazioni idrofobiche /i possono individuare ; zone: 6( gel concentratore ?@ %stac)ing gel& tampone+1*/53Cl a p3 A(B: $ la parte superiore del gel e la sua funzione $ quella di concentrare il campione proteico caricato negli appositi pozzetti( *l gel spaziatore a p3 inferiore ha unelevata porosit" che riduce la mobilit" della glicina, ione di coda( !e proteine entrano facilmente e migrano insieme sulla base della carica, che $ resa uguale dal trattamento preventivo con /./ %isotacoforesi C hanno la stessa velocit"&2 gli anioni proteici vanno quindi a ridosso degli ioni Cl5, ioni di testa( ;( gel separatore %running& 6; @ tampone +1*/53Cl a p3 B(B: $ la parte inferiore e la sua funzione $ quella di separare le proteine dei vari campioni sulla base del loro peso molecolare, grazie al setaccio molecolare del gel pi0 concentrato( nel gel separatore laumentato p3, amplia la mobilit" del glicinato rendendo possibile il superamento degli anioni proteici2 gli ioni glicinato quindi si posizionano dopo gli ioni cloruro( Una volta usciti gli ioni Cl5, il p3 sale a D(E ed aumenta la carica negativa degli anioni proteici che migrano in base al rapporto carica8massa(

PROCEDURA SPERI!ENTALE *l gel si compone di due parti: gel concentratore ?@ %stac)ing gel&: ? F upper buffer 7(G7ml <7@ crilammide8bis 7(<Eml P/67@ 6EHl +,-,. ?Hl cqua 6(Eml si versa tra le apposite lastrine fino allorlo e si inserisce il pettine formatore di pozzetti, lasciando polimerizzare il gel gel separatore %running& 6; @: ? F loIer buffer <7@ crilammide8bis P/ 67@ +,-,. cqua

6(<?ml ;(AEml <7Hl BHl 6(<<ml

/i versa tra le apposite lastrine fino a riempire circa due terzi della loro altezza2 si stratifica poi sulla soluzione lisopropanolo, che grazie alla maggiore densit" JschiacciaK il gel2 si lascia polimerizzare e dopo si rimuove lisopropanolo mediante assorbimento con carta da filtro(

Composizione -ar)er: -iosina ;77 ).a Losforilasib DG ).a >/ AA ).a Mvoalbumina ?? ).a nidrasi carbonica ;D ).a -ioglobina 6G ).a !isozima 6? ).a protina A ).a (

Pre"arazione del ca#"ione ("roteina a P! inco$nito % ?Hl proteina 4 7Hl di /./ reducing loading buffer %campione diluito 6:? nella soluzione di caricamento& 2Hl proteina 4 ;Hl acqua 4 7Hl /./ reducing loading buffer Composizione del /./ reducing loading buffer: A;(E m- +ris53Cl p3 A(B, ;7@ glicerolo, ;@ /./ , E@ ;5mercaptoetanolo, blu di bromofenolo(
L /i denatura per ; a DGNC e si caricano i campioni negli appositi pozzetti( /i caricano inoltre ; di mar)er, costituito da B proteine differenti legate covalentemente ad un cromoforo blu ed il cui peso molecolare $ compreso in un range da A a ;77 ).a(

/ar" quindi possibile seguire la corsa perch vedremo le proteine del mar)er colorate, mentre quelle del plasma saranno visibili solo a fine corsa con laggiunta del Comassie( Per la corsa elettroforetica servir" un tampone di corsa di 6F +9/, costituito da ;E m- +ris53Cl p3 B(<, 6D;m- glicina, 7(6@ /./( vendo a disposizione una soluzione 67F di +9/, per ottenere 6! di una soluzione 6F: C i Vi = C f Vf
Vi = C f V f Ci = 6@ 6777mL = 677mL 67@

bisogna prelevare 677 m! di soluzione 67 F e diluirli con D77 m! di 3 ; M ( /i procede quindi con la corsa elettroforetica, condotta a 6; m costanti nello stac)ing e ;E m costanti nel separating, fino alla separazione completa delle bande del mar)er: si passa alla colorazione con >lue di Comassie per E, sotto agitazione, che colora uniformemente tutto il gel %E7@ etanolo, ?7@ acqua, 67@ acido acetico 4 >lue di Comassie&( /uccessivamente, si decolora con la destaining solution %E7@ etanolo, ?7@ acqua, 67@ acido acetico& fino a completezza: rimane solo il Comassie legato alle proteine di interesse( Un modo semplice per determinare il peso molecolare relativo da elettroforesi consiste nel disegnare una curva standard della distanza percorsa in funzione del logaritmo in base 67 del Pper molecole note %quelle del mar)er&, ed estrapolare il log P- del campione dopo avere misurato la distanza da esso percorsa sullo stesso gel(

CONCLUSIONI !a proteina caratterizzata ha un P- di O6;E,D).2 considerando il peso medio di un amminoacido che $ di 667.a la proteina analizzata risulta essere costituita da 66?? residui amminoacidici %6;E,D).8667.a&