ROTEIRO DE AULAS PRTICAS CURSO TCNICAS AVANADAS DE MICROPROPAGAO DE PLANTAS Recife, 19 a 30 de novembro de 2001

Recife, Pe

NDICE

PREPARO DE ESTOQUES DE MACROELEMENTOS DO MEIO MS PREPARAO DE ESTOQUE DE MICRONUTRIENTES DE MS PREPARAO DE ESTOQUE DA MISTURA ORGNICA DE WHITE CULTURA DE CALO GERMINAO ASSPTICA DE SEMENTES IN VITRO CULTURA DE PICES CAULINARES MICROENXERTIA EM CITRUS PARA EXCLUSO DE VRUS DIFERENCIAO DE PARTE AREA EM EXPLANTES IN VITR MULTIPLICAO RPIDA IN VITRO CULTURA DE EMBRIES CULTURA DE FRUTOS POLINIZAO IN VITRO CULTURA DE ANTERAS CULTURA DE RAZES PROTOCOLO PARA PRODUO DE SEMENTE SINTTICA USO DE BIOREATORES DE IMERSO TEMPORRIA CULTURA DE PROTOPLASTOS

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PREPARO DE ESTOQUES DE MACROELEMENTOS DO MEIO MS

1. NH4NO3- pesar 165g de nitrato de amnio e dissolv-lo em 800ml de gua destilada deionizada. Agitar bem, completar o volume para 1000ml e agitar novamente.

2. KNO3 - Pesar 190g de nitrato de potssio e dissolv-lo em 800ml de gua destilada deionizada. Agitar bem. Completar o volume para 1000ml e agitar novamente.

3. CaCl2.2H20 - Pesar 44g desse sal e dissolv-lo em 800ml de gua destilada deionizada. Agitar bem. Completar o volume para 1000ml e agitar novamente.

4. MgS04.7H20 - Pesar 37g deste sal e dissolv-lo em 800ml de gua destilada deionizada. Agitar bem. Completar o volume para 1000ml e agitar novamente.

5. KH2PO4 - Pesar 17g deste sal e dissolv-lo em 800ml de gua. Agitar bem. Completar o volume para 1000ml. Agitar novamente.

6. NaH2PO4.H2O - Pesar 17g deste sal e dissolv-lo em 800ml de gua. Agitar bem. Completar o volume para 1000ml. Agitar novamente. Tomar 10ml de cada um dos estoques para cada litro de meio a ser preparado.

PREPARAO DE ESTOQUE DE MICRONUTRIENTES DE MS

1. Fe.EDTA - Pesar 3,73g de Na2EDTA e dissolv-lo em 800ml de gua destilada deionizada. Aps a dissoluo, manter a agitao e adicionar lentamente 2,78 de FeSO4.7H2O. Aps a dissoluo, completar volume para 1000ml e agitar novamente. Colocar em frasco escuro, coberto com papel alumnio e armazenar em geladeira.

2. Outros micronutrientes Em 300ml de gua dissolver: - 620mg de H3BO3; - 1690mg de MnSO4.H2O; - 860mg de ZnSO4.7H2O; - 83mg de KI; - 25mg de Na2MoO4.2H2O; - 2,5mg de CuSO4.5H2O; e - 2,5mg de CoCl2.6H2O. Completar o volume para 1000ml. Agitar bem. Colocar em frasco e armazenar em geladeira. Tomar 10ml de cada um dos estoques para cada litro de meio a ser preparado.

PREPARAO DE ESTOQUE DA MISTURA ORGNICA DE WHITE

- Pesar 100mg de Tiamina.HCl e dissolv-la em 300ml de gua destilada deionizada. Pesar 50mg de cido Nicotnico, 50mg de Piridoxina.HCl e 200mg de Glicina, e dissolv-los respectivamente, na soluo acima. Completar o volume para 1000ml. Agitar bem. Colocar em frasco e armazenar em geladeira. Tomar 10ml desta soluo estoque para cada litro de meio a ser preparado.

CONSIDERAES SOBRE O MEIO MS O principal enfoque da tese de PhD do Dr. Toshio Murashige, na Universidade de Wisconsin, em Madison, sob a orientao do Dr. Folke Skoog, foi a otimizao de um meio de cultura adequado para crescimento de calo de fumo. Murashige observou que culturas de calo, mantidas em meio de White modificado, suplementado com cinetina e cido indolactico, aumentavam quatro vezes em peso fresco, quando era adicionado ao meio extrato aquoso de folhas de plantas de fumo. As folhas de plantas de fumo eram congeladas, moidas e o suco extrado por prensagem, aquecido a 1000C, resfriado a 5-10oC, centrifugado e concentrado. O concentrado era armazenado em garrafas de polietileno, mantidas no congelador e usado quando necessrio. Subseqentemente foi observado que ao se adicionar cinzas do extrato ao meio de cultivo ocorria aumento de peso fresco dos calos, sugerindo ento, que a frao inorgnica era a que apresentava maior atividade neste fenmeno. Essa observao foi o ponto inicial para o desenvolvimento do meio MS. Diluies da formulao salina do meio MS, algumas vezes, so mais eficientes em determinadas circunstncias. Um precipitado pode formar no meio MS o qual passa despercebido quando o meio solidificado com gar. A composio deste precipitado principalmente de fosfato e ferro, com pequenas quantidades de Ca, K, N, Zn, Mn e traos de C, Mg, H, Si, Mo, S, Cu e Co (George & Sherrington, 1984). Para contornar a precipitao, Dalton et al. (1983), sugerem a reduo das concentraes de ferro em 1/3 da recomendada, mantendo o EDTA no mesmo nvel. Outra estratgia, para formulaes lquidas, ajustar o pH a 5.0.

CULTURA DE CALO Calo um tecido formado em resposta injria. A cultura de calo se refere a iniciao e proliferao contnua de clulas excisadas de tecidos da planta doadora. Trabalhos pioneiros para o estabelecimento e manuteno indefinida da cultura de calo iniciaram-se, independentemente, com Gautheret (1939) e Nobecourt (1939), com cenoura, em meio suplementado com cido indolilactico. Concomitantemente, White (1939) obteve calo a partir de explantes caulinares excisados de uma planta hbrida obtida pelo cruzamento entre Nicotiana glauca x N. langsdorfii. Com a descoberta da citocinina por Miller et al. (1955) foi possvel estabelecer calo da maioria das espcies de plantas. Calo tem sido o tecido mais empregado em cultura de tecidos de plantas. Hoje, pode-se estabelecer cultura de calo de praticamente qualquer planta e da maioria de suas partes. No passado falhas no estabelecimento da cultura de calo, em algumas espcies, poderiam ser atribudas s deficincias no meio nutritivo de certas substncias de crescimento. Em geral a iniciao de calo em explantes cultivados in vitro se verifica em meio nutritivo composto de sais minerais, acar, vitamina B1, suplementado com auxina e citocinina. Algumas espcies e rgos necessitam de meio mais complexo, composto de qumicos naturais no definidos, tais como: suco de frutas, preparao de endosperma, extrato de malte e levedura, protenas hidrolisadas, etc. A manuteno indefinida de calo in vitro, mediante subculturas, necessita que o meio nutritivo contenha auxina, citicinina, e algumas vezes, complexos naturais. A textura e morfologia do calo podem ser manipuladas pelas variaes dos constituintes do meio nutritivo. Meio contendo relativamente alta concentrao de auxina e baixa de citocinina produz calo macio, frivel e de aspecto mido, apresentando clulas grandes e vacuoladas. A adio desses mesmos reguladores, em relao inversa, produz um tecidos compacto, seco, formado de clulas pequenas. A friabilidade do calo, tambm pode ser aumentada pela incluso no meio de cultura de giberelina, caseina hidrolisada e alta concentrao salina. O crescimento do calo estimulado em meio contendo alta concentrao salina. Sacarose tem sido a fonte de carboidrato mais efetiva para o crescimento do calo. Em alguns casos, glucose pode dar melhor resultado do que a sacarose. A tiamina essencial. A piridoxina e cido nicotnico devem ser includos no meio de cultura. O mio-inositol no crtico, mas tambm estimula o crescimento do calo. A amplitude de temperatura onde as culturas de calo devem ser mantidas a mesma exigida para o crescimento e desenvolvimento da espcie em condies naturais. No escuro o crescimento do calo melhor, podendo ser paralisado quando esse tecido exposto luz. O calo no composto de clulas uniformes e indiferenciadas. As clulas constituintes do calo so desuniformes, apresentando heterogenidade em relao a forma, tamanho, caractersticas da parede celular, incluses citoplasmticas, grau de vacuolizao e ncleo menos proeminente. O nmero de cromossomos em um calo varivel. Manutenes prolongadas do calo, via subcultura, geralmente resulta em

tecidos contendo predominantemente clulas poliplides. Em geral, o calo constitudo por clulas aneuplides. Calo um tecido diferenciado mas no organizado, podendo ser manipulado para um desenvolvimento organizado. o caso da iniciao da parte area e raiz que pode ser obtida pelo balano conveniente de auxina e citocinina no meio nutritivo. A embriognese somtica ocorre ao se transferir o calo para meio desprovido de auxina. As clulas do calo distinguem-se das do embrio e das do meristema apical (tomadas como referncias para ao estado indiferenciado) por apresentarem maior tamanho, grau substancial de vacualizao, ncleo menor e proeminente. Referncias
Gautheret, R. J. Sur la possibilit de raliser la culture indfinie des tissus de tubercules carotte. C. R. Acad. Sci., Paris 208:118-120, 1939. Linsmaier, E. M. & Skoog, F. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 18:100-127, 1965. Monier, M. Induction of embryogenesis in callus culture. In: Pollard, J.W. & Walker, J.M. (Ed). Methods in molecular biology. Vol. 6. Plant cell and tissue culture. Clifton:Humana Press, 1990, p.141-157. Murashige, T. & Skoog, F. A revised medium for repid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497, 1962. Nobcourt, P. Sur la prennite de laugmentation de volume des cultures de tissues vgtaux. C. R. Soc. Biol., Paris 130:1270-1271, 1939. Brown, J. T. The initiation and maintenance of callus culture. In:Pollard, J. W. & Walker (eds). Methods in molecular biology. Vol 6. Plant cell and tissue culture. Humana Press, Clifton, New Jersey, 1990, pp.57-63. Skoog, F. & Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 11:118-131, 1957. Smith, R. H. Plant tissue culture. techniques and experiments. Academic Press, San Diego, 1992, 171p White, P. R. Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artificial nutrient. Amer. J. Bot, 26:59-64, 1939.

I. Iniciao da cultura de calo Neste experimento, testar-se- um meio contendo 0,1mg/l de cinetina, 0,3mg/l de 2,4D (cido 2,4-diclorofenoxiactico) para estimular a iniciao de calo em explantes de razes de cenoura, caule de fumo pices caulinares de batata-doce e alho. a. Preparo do meio de cultura Cada grupo preparar o seguinte meio de cultura: Em um frasco Erlenmeyer de 1000ml colocar 250ml de gua destilada deionizada, em seguida, adicionar: 5ml de macronutrientes MS; 5ml de micronutrientes MS; 5ml da mistura orgnica de White; 50mg de i-inositol; 15g de sacarose; 5ml de soluo estoque de cinetina 10mg/l (0,01mg/ml); adicionar 1,5 ml de uma soluo estoque de 2,4-D 100mg/l (0,1mg/ml); diluir para 450ml, utilizando gua destilada deionizada; ajustar o pH para 5,7; usando HCl ou NaOH 1N, e em seguida, diluir o meio para o volume final de 500ml com gua destilada deionizada; adicionar 3g de gar, e levar ao microondas para liquefao; misturar bem e distribuir em tubos de ensaio de 25mm de dimetro e 150mm de altura. Preparar 20 tubos; esterilizar o meio por autoclavagem, durante 15 minutos a 120C ; e deixar esfriar inclinado, para solidificao do gar.

b. Preparo dos explantes Cenoura. Remover as folhas, usando cabo de bisturi n 7 com lmina n 10. Cortar poro superior e inferior da raiz. Obter seo transversal da regio mediana, usando um furador de folha de 0,5cm de dimetro; Fumo. Remover todas as folhas, bases das folhas e gemas axilares. Esfregar o caule com gaze embebida em lcool a 95%, eliminando assim a pegajosidade do mesmo; Batata-doce. Utilizar pices caulinares com dois primrdios foliares; Tomate: Excisar segmentos de hipoctilo de 0,5 cm de tamanho, provenientes de plntulas germinadas em condies asspticas. c. Desinfestao dos explantes Colocar os explantes em frascos convenientes e imerg-los, em soluo de hipoclorito de sdio (gua sanitria diluda 5 a 10 vezes), dependendo da sua concentrao em cloro ativo, usualmente essa concentrao de 5%. Adicionar 1-2 gotas de Tween 20 para cada 100ml da soluo. Os tecidos a serem desinfestados devem estar submergidos na soluo desinfestante. Colocar o sistema sob leve vcuo,

durante 10 minutos. Decantar o desinfestante em um beaker grande. Lavar 3 vezes com gua destilada autoclavada. d. Inoculao As operaes subseqentes sero feitas em capela de fluxo laminar. Os explantes devero ser transferidos para placas de Petri estreis, separadamente. Usar pinas longas para transferncias. Utilizar 5 tubos de ensaio com meio de cultura para cada espcie. e. Esterilizao dos instrumentos As pinas e bisturis devem ser esterilizados imergindo-os em soluo de lcool a 95%, durante alguns minutos e, flamb-los em chama de gs. desejvel expor os instrumentos ao forte calor segurando-os pela extremidade oposta.

II. Exerccio com cultura de calo j estabelecida

a. Manuteno de cultura estoque de calo de cenoura Cada aluno receber 5 frascos contendo meio nutritivo composto de macro e microelementos de MS, mistura orgnica de White 0,3mg/l de 2,4-D e 0,1mg/l de cinetina. O meio foi gelificado com 2g/l de gelrite. Limpar o exterior do frasco com lcool etlico 70%. Fracionar o calo em pores. A transferncia ser feita segurando um tubo com a mo e transferindo com a outra. b. Induo de embriognese somtica em cultura de calo de batata-doce

Cada aluno receber 5 placas de petri contendo macro e microelementos MS, mistura orgnica de White, 170mg/l de NaH2PO4 e 2g/l de gelrite. Macerar o calo em beaker de 100-ml com auxlio de uma lmina de microscpio. Transferir o calo macerado para peneira com orifcios de 700. Lavar com soluo de sacarose a 3%. Transferir o calo macerado e lavado para beaker de 100-ml. Ressuspender com 10-ml de meio lquido. Com auxlio de uma pipeta de 5ml, transferir a quantidade de 10mg para placa de petri com meio de cultura.

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GERMINAO ASSPTICA DE SEMENTES IN VITRO

Uma maneira simples de se obter explantes, sem contaminantes, para trabalhos de cultura de tecidos, retir-los de plntulas germinadas in vitro, em condies asspticas. Essa metodologia tambm pode ser usada para rastreamento e/ou seleo de transgnicos resistentes a herbicida ou outro agente seletivo. Por exemplo: sementes de soja transgnica resistente ao herbicida glifosato germinaro e desenvolvero em meio com at 200 M de glifosato. Sementes no transgnicas germinaram, mas tero o desenvolvimento do sistema radicular inibido. Sementes de Lactuca sativa L. sero desinfestadas imergindo-as em soluo de hipoclorito de sdio a 0,5%, contendo 1-2 gotas de Tween 20 por 100 ml de soluo, durante 15 minutos. Decantar o desinfestante e lavar as sementes 3 vezes com gua destilada autoclavada. As sementes sero semeadas em plataformas de papel de filtro, colocadas previamente em frascos convenientes, contendo macro e microelementos MS. Em geral, no h necessidade de incluir sacarose nesse meio.

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CULTURA DE PICES CAULINARES PARA ELIMINAO DE PATGENOS Explantes compostos da cpula meristemtica caulinar apical, com um ou dois primrdios foliares e poro subjacente do caule (Figuras abaixo), podem ser usados na recuperao de plantas livres de viroses ou outros agentes causadores de doenas, com grande chance de sucesso. Na maioria dos casos, excluso de viroses s verificada quando o explante menor do que 0,3 mm de tamanho. As plantas oriundas da cultura de pices caulinares devem ser rigorosamente testadas, pois este mtodo no garante a excluso de patgenos. 1. Cultura de pices caulinares de Solanum tuberosum O meio nutritivo consiste de formulao lquida contendo macro e microelementos MS, mistura orgnica de White, 30g/l de sacarose e 0,5 mg/l de GA3. Distribuir a quantidade de 3-4 ml por frasco de 80 ml. Coletar pices caulinares com aproximadamente 2,0 cm de tamanho de plantas de batata desenvolvendo em casa de vegetao e em crescimento ativo. Remover as folhas maiores. Enrolar os explantes com gaze e imerg-los em soluo de hipoclorito de sdio a 0,5%, contendo 1-2 gotas de Tween 20 para cada 100-ml de soluo, durante 10 minutos. Decantar o desinfestante em um beaker. Lavar 3 vezes com gua destilada autoclavada. Com o auxlio de um estereomicroscpio, excisar o pice caulinar contendo dois primrdios foliares (Figuras abaixo).

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2. Cultura de pice caulinar de Ipomoea batatas O meio nutritivo consiste de formulao lquida de macro e microelementos MS, mistura orgnica de White, 30 g/l de sacarose, 2 g/l de GA3. Distribuir a quantidade de 3-4 ml de meio por frasco de 80-ml. A exciso e cultura de explante semelhante a do exerccio anterior.

3. Cultura de pice caulinar de Allium sativum O meio nutritivo consiste de sais minerais de MS, mistura orgnica de White, 30 g/l de sacarose, 0,2 mg/l de 2ip, 0,2 mg/l de AIB e 2g/l de gelrite. pices caulinares constitudos do meristema apical contendo um ou dois primrdios foliares e poro subjacente do caule sero excisados de bulbilhos brotados e, cultivados in vitro. As figuras abaixo exemplificam esta operao.

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MICROENXERTIA EM CITRUS PARA EXCLUSO DE VRUS pices caulinares de rvores adultas geralmente no enraizam in vitro. Isto dificulta a recuperao de plantas livres de patgenos de uma srie de espcie. Uma estratgia para contornar este obstculo consiste na garfagem destes pices em um porta-enxerto de plntula germinada em condies asspticas. Os alunos treinaro esta prtica, embora no haja necessidade de colocar o material enxertado em cultura. Esta tcnica apresenta as seguintes etapas: 1) germinao em condies asspticas das sementes do porta-enxerto de origem certificada; 2) preparo da plntula porta-enxerto para a garfagem; 3) exciso do pice caulinar (enxerto) da rvore infectada; 4) garfagem do pice (enxerto) na plntula porta-enxerto; 5) manter a plntula enxertada em cultura; e 6) manter a planta doadora de explantes via garfagem tradicional em casa de vegetao. Indexar as plantas obtidas e confirmar as caractersticas da cultivar. Para identificar facilmente o sucesso da microenxertia em Citrus utiliza-se a espcie trifoliata como porta-enxerto, entretanto outros gentipos podem ser utilizados. Caractersticas associadas ao porta-enxerto As sementes do porta-enxerto devem ser germinadas de forma assptica, no escuro, sob temperatura de 27C. Para facilitar a germinao, os integumentos da semente devem ser removidos. O meio de germinao consiste de macro e microelementos de MS, 0-1% de sacarose, solidificado com 2g/l de gelrite. As sementes devem ser colocadas apenas na superfcie do meio. A anaerobiose prejudica a germinao. Em duas semanas, as plntulas esto em condies de serem usadas como porta - enxerto. O sucesso da microenxertia maior quando as plntulas do porta- enxerto so originadas de sementes germinadas no escuro. Neste caso, as plntulas so estioladas, desprovidas de folhas expandidas e maiores do que as desenvolvidas na luz (Navarro et al., 1975). Caractersticas associadas com o enxerto pices caulinares devem ser exisados de plantas em crescimento ativo, cultivadas em casa de vegetao com boas condies fitossanitrias. Processo da microenxertia Plntulas do porta enxerto com duas semanas de idade, so decapitadas, deixando aproximadamente 1,5-2,0cm do epictilo. Uma poro da raiz tambm deve ser removida. pices caulinares contendo o meristema apical com 2-3 primrdios foliares e tecidos subjacentes (0,1 - 0,3mm de tamanho) so exisados do gentipo de interesse e introduzidos no corte em forma de T invertido feito na superfcie do epictilo decapitado do porta-enxerto (ver ilustraes abaixo) A plntula microenxertada colocada em tubo de ensaio (25X150 mm), contendo meio lquido e uma plataforma para suporte feita com papel de filtro com 9,0

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cm de dimetro. O meio nutritivo consiste de sais MS, mistura orgnica de White, 7,5% de sacarose e 100 mg/l de i-inositol. Incubar em cmara de crescimento temperatura de 27C, fotoperodo de 16 horas e fluxo luminoso de 60 Em-2S-1. Entre 45 a 60 dias, a planta microenxertada est em condio de ser aclimatizada para posterior transferncia para casa de vegetao. As plantas so ento indexadas e testadas para as caractersticas da cultivar em questo.

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DIFERENCIAO DE PARTE AREA EM EXPLANTES IN VITRO

A formao de gemas, parte area e razes em explantes mantidos em cultura tem sido usada para estudar os processos de diferenciao e morfognese. Trabalho pioneiro nessa rea foi desenvolvido por Skoog & Miller (1957). Esses autores mostraram que a diferenciao de parte area, raiz ou ambos em calo de fumo regulada pelo balano auxina/citocinina. Concentraes relativamente elevadas de auxina favorecem a formao de razes, enquanto que a relao inversa induz a regenerao de parte area. Subseqentemente, essas observaes tiveram aplicao em vrias outras espcies de plantas. Solanum tuberosum Explantes: Entre-ns (segmentos internodais) de propgulos de batata desenvolvidos in vitro. Meio de cultura: Sais MS, vitaminas, 100 mg/l de i-inositol, 3% de sacarose, 2,5mg/l de zeatina e 2,0 g/l de phytagel. Lactuca sativa Explantes: Cotildones excisados de plntulas germinadas em condies asspticas. Meio de cultura: MS sais, vitaminas, i-inositol, 3% sacarose, 0,05 mg/l de ANA e 0.2 mg/l de BA. Violeta Africana Explantes: Retirar da planta folhas desenvolvidas com 2-4 cm de pecolo. Desinfestar em soluo de hipoclorito de sdio a 0,5%. Decantar o desinfestante e lavar os explantes 3 vezes com gua destilada autoclavada. Cortar pedas da lmina foliar com aproximadamente 1 cm2, contendo poro da nervura principal. Meio de cultura: Macro e micronutrientes MS, vitaminas, i-inositol, 0,25 mg/l de BA, 0,1 mg/l de GA3.

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MULTIPLICAO RPIDA IN VITRO

Tem como objetivo produzir plantas uniformes, em grande nmero, sem variaes genotpicas ou fenotpicas,. Em geral emprega-se gemas axilares como fonte de explantes. Solanum tuberosum Segmentos nodais de plantas desenvolvidas in vitro Sequoia Segmentos nodais de plantas desenvolvidas in vitro Ananas comosus Propgulos de plantas desenvolvidas in vitro Mini-rosas Segmentos nodais de propgulos desenvolvidos in vitro.

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CULTURA DE EMBRIES A terminologia cultura de embries tem sido empregada para descrever os processos de crescimento e desenvolvimento do embrio zigtico in vitro, independente da idade, tamanho e estdio de desenvolvimento em que o embrio foi excisado (Rappaport, 1954). Essa tcnica tem sido usada para superar dormncia de sementes, em virtude da imaturidade do embrio ou da presena de substncias inibidoras no endosperma; estudar os aspectos nutricionais e fisiolgicos do desenvolvimento do embrio; testar viabilidade de sementes; recuperar hbridos raros de cruzamentos incompatveis; e com fonte de explantes com tecido de elevada totipotncia. Primeiramente todos devem praticar o isolamento de embries de frutos de tomate em vrios estdios de desenvolvimento. Sero distribudos frutos de vrios tamanhos. Procurar isolar e identificar os seguintes estdios de desenvolvimento do embrio: globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar. Seguir como orientao a figura abaixo. Representao da embriognese em tomateiro

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Prtica: Cultura de embries em tomateiro excisados em diferentes estdios de desenvolvimento Meio de cultura: O meio bsico consiste de macro e microelementos de MS; mistura orgnica de White; 3% de sacarose; 0,2% de gelrite, com pH ajustado a 5,7. Sero testados os seguintes suplementos: 1. Meio bsico (controle) 2. 0,1 mg/l de AIA, 0,01 mg/l de cinetina e 0,01 mg/l de sulfato de adenina 3. Aumentar para 6% a concentrao de sacarose 4. Aumentar para 12% a concentrao de sacarose Obs: Cada estudante receber dois frascos com cada meio. Desinfestar frutos em soluo de hipoclorito de sdio. Seccionar os frutos ao meio. Remover os vulos e transfer-los para placa de Petri estril. Isolar embries globulares e cordiformes e inocul-los, respectivamente em cada tubo.

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CULTURA DE FRUTOS

Esta tcnica permite ter um sistema controlado para estudar os fatores nutricionais e fisiolgicos envolvidos no crescimento e desenvolvimento de frutos e formao de sementes. Em adio essa tcnica pode ser usada na induo de haplides partenognicos. Nesta prtica compararemos o efeito da sacarose (0 e 12%) e, respectivamente, das auxinas AIA 2 mg/l, 2-4-D 2 mg/l e NOA 2 mg/l, no desenvolvimento de frutos de tomate in vitro. Flores de plantas de tomateiro desenvolvendo em casa de vegetao sero polinizadas e, cinco dias aps, usadas como explantes. As flores sero desinfestadas em soluo de hipoclorito de sdio a 0,5%, por 15 minutos. Em seguida, lavar com gua destilada autoclavada. Remover corola e estames, se necessrio. Transferir explantes para tubos contendo 25 ml de meio e plataforma suporte de papel de filtro. Meio bsico de cultura: macro e microelementos MS, mistura orgnica de White, 100 mg/l de i-inositol e 3% de sacarose.

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POLINIZAO IN VITRO A polinizao in vitro empregada para recuperar hbridos raros, onde barreiras de incompatibilidade pr-zigticas impedem a hibridao. Essa tcnica envolve a cultura de vulos isolados ou juntamente com a placenta, nos quais so depositados os gros de plem em germinao ou no. Essa ntima associao elimina as barreiras de incompatibilidade que porventura estejam presentes no estigma, estilete ou ovrio. Os gametas masculinos e femininos combinam-se para produzir o zigto. Para esta prtica, plem de Nicotiana tabacum ser coletado assepticamente, com antecedncia. Flores prximas antese sero colhidas, desinfestadas e lavadas. As anteras sero excisadas, colocadas em placa de Petri estril e o conjunto mantido em capela de fluxo laminar para permitir a deiscncia das anteras. As anteras em deiscncia, sero colocadas em tubos Eppendorf e armazenadas em dessecador, em geladeira. Flores de N. tabacum no incio da antese sero utilizadas como fonte de vulos. Remover os ovrios das flores, desinfest-los com soluo de hipoclorito de sdio a 0,5%, por 15 minutos. Em seguida, lavar com gua destilada autoclavada. Em capela de fluxo laminar transferir os ovrios para placa de Petri. Fazer uma inciso longitudinal no ovrio para remover a parede externa. Usar estereomicroscpio para ajudar nessa inciso. Expor os vulos. Transferir os vulos para o tubo contendo meio nutritivo. Com auxlio de um cado de bisturi acoplado com uma lmina no. 15, polinizar os vulos com o plem assptico. Outra modalidade introduzir os vulos e placenta em um recipiente contendo gros de plem em germinao. Meiode cultura: macro e microelementos MS, mistura orgnica de White, 100 mg/l de i-inisitol, 3% de sacarose e 0,2% de gelrite. Incubar a 27C e fotoperodo de 16 horas. Examinar as culturas periodicamente, observando o crescimento dos vulos.

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CULTURA DE ANTERAS

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O desenvolvimento de plantas haplides, via cultura de anteras, determinado, dentre outros fatores, pelo estdio de desenvolvimento do plen, no momento em que as anteras so cultivadas. A determinao do estdio de desenvolvimento desejvel do plen facilitado pela correlao deste, quando possvel, com caractersticas morfolgicas do boto floral. Dentre estas citam-se: comprimento do clice ou corola, tamanho da antera,ou do boto floral, etc. Colorao do plen para observar seus diferentes estdios de desenvolvimento Vrios mtodos esto disponveis na literatura. Um bom procedimento de colorao a utilizao da soluo de carmin actico a 0,5%. Essa soluo corante preparada adicionando-se 0,5 g de carmin a 100 ml de cido actico a 45%. Outro mtodo alternativo foi desenvolvido pelo Dr. W. B. Storey (comunicao pessoal). A soluo corante preparada adicionando 0,5 - 0,8 g de orceina em 45 ml de cido propinico em incio de ebolio, deixando ferver por alguns segundos. A esta soluo adiciona-se 35 ml de gua destilada. Deixar esfriar e, em seguida, colocar 10 ml de cido ltico. Deixar a soluo na geladeira por uma noite e filtr-la. 1. Protocolo para o cultivo de anteras de milho Introduo Nesta tcnica, anteras imaturas, contendo micrsporos em um estdio particular de desenvolvimento, so excisadas e inoculadas em um meio de cultura. Esse processo inibe a diferenciao gametoftica tpica e permite a ocorrncia de mltiplas divises celulares e posterior regenerao de plantas haplides, em uma parte dos micrsporos (Dunwell, 1986).

Avaliao do estdio de maturao do gro de plen: A inflorescncia masculina deve ser coletada em plantas com aproximadamente 50 dias aps a semeadura, depois da confirmao do estdio de desenvolvimento do gro de plen. Para tanto, o caule da planta deve ser apalpado na altura da emisso da pancula e, nessa regio, deve-se fazer uma inciso que permita a amostragem de flores masculinas para exame do gro de plen. A avaliao do estdio de desenvolvimento do gro de plen feita tingindo-os com carmim actico (0,5 g de carmim dissolvidos em 100 ml de cido actico 45%) e visualizando-os em microscpio tico. As flores coletadas devem ser delicadamente abertas para retirada das anteras. Ento, sobre uma lmina de vidro adicionam-se 1 a 2 gotas do carmim actico e maceram-se as anteras para expor os gros de plen. Sobrepe-se uma lamnula e leva-se ao microscpio. Devem ser coletadas inflorescncias cujas flores apresentem micrsporos em estdio mononucleado e com o ncleo migrando para o plo oposto ao poro (Figura 2).

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Salienta-se que esta seleo faz-se necessria porque o grau de maturao do plen difere entre distintas zonas de uma mesma pancula.

H D

H E F

Figura 2: Desenvolvimento do gro de plen; (a) ttrades; (b) micrsporo mononucleado com ncleo migrando p/ o plo oposto ao poro ( G ); (c) plen com vrios ncleos e acmulo de amido. (Fotos de Lilia Willadino).

Coleta do material vegetal: Plantas previamente selecionadas quanto ao grau de maturao do gro de plen so coletadas, s primeiras horas da manh, com o auxlio de uma faca ou tesoura limpa e afiada. O corte dado na altura da insero da 5a folha (folha +5) com o caule. Eliminam-se as extremidades das folhas completamente expandidas e mantm-se intacta a folha bandeira. Logo em seguida, a parte da planta coletada deve ser envolta em papel toalha mido e em papel de alumnio, para evitar a dessecao da inflorescncia. As inflorescncias so, ento, submetidas a choque frio por um perodo de 14 dias, a uma temperatura de 8 oC. Desinfestao, inoculao e incubao das anteras: Transcorrido o perodo de tratamento a frio, as inflorescncias so submetidas a desinfestao em soluo de hipoclorito de sdio (HClO) a 7%, com uma gota de Tween 20, por 3 minutos, sob agitao. Depois, em cmara de fluxo laminar, so feitas 3 lavagens em gua destilada autoclavada, para eliminar o excesso de hipoclorito. Com auxlio de pinas e bisturis esterilizados, separam-se as anteras das flores e faz-se a inoculao em meio de cultura Yu-Pei modificado (Wan et al., 1989. A inoculao, em geral, feita em placas de Petri (60 x 15 mm), contendo 5,0 ml de meio de cultura. Inoculam-se, em mdia, 60 anteras por placa (Figura 3).

Figura 3: Anteras de milho inoculadas em meio Yu-Pei. (Foto de Lilia Willadino).

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 Aps a inoculao, as placas so seladas com filme plstico, cobertas com papel de alumnio e mantidas no escuro, a 25oC, durante uma semana. Transcorrida a primeira semana de incubao no escuro, as placas so mantidas em luz tnue (5 a 10 mols m-2 s-1) durante 4 a 5 semanas, at o aparecimento dos embries somticos (Figura 4).

I J KL M)NPO6QSR/LTVUWLXMNPYZ[N'\U]ZMN ^_YZa`bJTcdQ6YZ^Z\1e)dTeJ`fZ\Ugd[YZ[Z`ihMJVjZ^k^d `fl1U J2m]d'^n / oqp rs]r tvuw!xyzy{!|}yzz{ uy~Cr 

Os embries, ao apresentarem indcios de polarizao (Figura 5), devem ser transferidos para o meio de regenerao de plantas (MS modificado por Torn et al., 1984). Aps o subcultivo para o novo meio, devem ser mantidos em sala de crescimento com fotoperodo de 16h e intensidade luminosa de 90 a 110 mols m-2 s-1.

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- Meios de cultura: Meio de incubao das anteras (Yu-Pei modificado por Wan et al., 1989) Constituintes Macronutrientes: 2.500 mg L-1 KNO3 165 mg L-1 NH4 NO3 176 mg L-1 CaCl2.2H2O 510 mg L-1 KH2PO4

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370 mg L-1 MgSO4.7H2O Micronutrientes: 4,40 mg L-1 MnSO4.4H2O 1,50 mg L-1 ZnSO4.7H2O 0,80 mg L-1 KI 1,60 mg L-1 H3BO3 27,85 mg L-1 FeSO4.7H2O + 37,25 mg L-1 Na2-EDTA Componentes orgnicos: 2,00 mg L-1 glicina 0,50 mg L-1 tiamina 0,50 mg L-1 piridoxina 0,50 mg L-1 cido nicotnico 500,00 mg L-1 casena hidrolisada 2,87 mg L-1 L-prolina Reguladores de crescimento: 0,1 mg L-1 cido triodobenzico (Tiba) Fonte de carbono: 60 g L-1 sacarose Gelificante: 6,0 g L-1 Bacto-Agar (Difco) Carvo ativado: 5,0 g L-1

Preparo do meio Dissolver em gua deionizada os macronutrientes, os micronutrientes, a sacarose, os componentes orgnicos, o gar e o carvo ativado. Ajustar o pH a 5,8 com NaOH 0,1N, e esterilizar em autoclave, a 121oC (1kg cm-2), por 20 a 30 minutos. Esterilizar o Tiba por filtrao, em filtro Millipore com poro de 0,22, em cmara de fluxo laminar. Misturar as solues (autoclavada e filtrada) em condies estreis, antes que a soluo autoclavada esfrie e gelifique; verter nas placas de Petri, fechar e deixar esfriar na cmara de fluxo laminar, antes de selar com filme plstico.

Meio de regenerao de plantas (MS com componentes orgnicos modificados por Torn et al.,1984) Constituintes Macronutrientes: 950 mg L-1 KNO3 825 mg L-1 NH4NO3

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220 mg L-1 CaCl2.2H2O 85 mg L-1 KH2PO4 185 mg L-1 MgSO4.4H2O Micronutrientes: 11,15 mg L-1 MnSO4.4H2O 4,30 mg L-1 ZnSO4.7H2O 0,415 mg L-1 KI 0,125 mg L-1 NaMoO4.2H2O 0,0125 mg L-1 CoCl2.6H2O 0,0125 mg L-1 CuSO4.5H2O 3,10 mg L-1 H3BO3 13,925 mg L-1 FeSO4 + 18,625 mg L-1 Na2-EDTA Componentes orgnicos: 2,00 mg L-1 glicina 0,10 mg L-1 tiamina 0,50 mg L-1 piridoxina 1,30 mg L-1 cido nicotnico 0,50 mg L-1 pantotenato de clcio 1,89 mg L-1 asparagina Fonte de carbono: 20 g L-1 sacarose Gelificante: 2,0 g L-1 Gelrite (Chemical Dynamics Coorporation)

Preparo do meio Dissolver em gua deionizada os macronutrientes, os micronutrientes, a sacarose e o gar. Ajustar o pH a 5,8 com NaOH 0,1N, e esterilizar em autoclave, a 121oC (1kg cm-2), por 20 a 30 minutos. Dissolver, por separado, as vitaminas e os aminocidos; misturar as solues e esterilizar por filtrao, em filtro Millipore com poro de 0,22, em cmara de fluxo laminar. Misturar as solues (autoclavada e filtrada) em condies estreis, antes que a soluo autoclavada esfrie e gelifique; verter em tubos de ensaio, 10 ml de meio/tubo.

Referncias Bibliogrficas: BRISIBE, E. A.; OLESEN, A.; ANDERSEN, S. B. Characterization of anther culturederived cell suspensions exclusively regenerating green plantlets in wheat (Triticum aestivum L.). Euphytica, Dordrecht, v. 93, p. 321329, 1997. GARRIDO, D.; MATILLA, A.; CHIBI, F. Expresin gnica durante el desarrolo del grano de polen: revisin. Madrid: Sociedad Espaola de Fisiologa Vegetal, 1994. p. 31 41 (Boletn n. 20). HU, T.; ZENG, J. Z. Development of new varieties via anther culture. In: AMMIRATO, P. V.; EVANS, D. A.; SHARP, W. R.; YAMADA, Y. Handbook of plant cell culture.

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New York: Macmillan, 1984. v. 3, p. 6590. NITSCH, C. Pollen culture a new technique for mass production of haploid and homozygous plants. In: KASHA, K. J. Haploids in higher plants: advances and potential. Guelph: University of Guelph Press, 1974. p. 123135. KOVCS, G.; LSZL, M.; RAIJKAI, G.; BARNABS, B. Monitoring of haploid cell suspension culture conditions in bioreactors. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Dordrecht, v. 43, p. 123126, 1995. REINERT, J.; BAJAJ, Y. P. S. Anther culture: haploid production and its significance. In: REINERT, J.; BAJAJ, Y. P. S. Plant cell, tissue and organ culture. New York: Springer Verlag, 1977. p. 252267. SHARP, W. R.; DOUGALL, D. K.; PADDOCK, E. F. Haploids plantlets and callus from immature pollen grains of Nicotiana and Lycopersicon. Bulletin of the Torrey Botanical Club, New York, v. 98, p. 219222, 1971. TORNE, J.M.; SANTOS, M.A; PONS, A.; BLANCO, M. Regeneration of plants from mesocotyl tissue culture of immature embryos of Zea mays. Plant Science Letter, v.17, p.339-344. 1984. WAN, Y; PETOLINO, J.F.; WIDHOLM, J.M. Efficient production of doubled haploid plants through colchicine treatment of anther-derived maize callus. Theoretical Applied Genetic, v.77, p.889-892. 1989.

2. Determinao dos diferentes estdios de desenvolvimento de plen de Lycopersicon esculentum Remover anteras de flores de tomate em diferentes estdios de desenvolvimento e coloc-las em uma lmina de microscpio. Colocar 1-2 gotas do lacto-propiono-orceina sobre cada antera. Abrir as anteras com auxlio de uma pina ou macer-las para liberao dos gros de plen. Remover os tecidos maternos, deixando apenas plen ou micrsporos. Cobrir a preparao com uma lamnula e observar no microscpio. Caso os gros de plen ainda no estejam coloridos, aquecer a lmina, delicadamente, numa lamparina. Correlacionar o estdio de desenvolvimento do plen com o tamanho do boto floral.

Parmetro morfogentico Tamanho do boto

% de gros de plen em diferentes estdios de desenvolvimento CMGP Dades Ttrades Uninuclear Binuclear

Flores abertas

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3. Determinao dos diferentes estdios de desenvolvimento de plen de Nicotiana tabacum Sero distribudos botes florais de N. tabacum nos seguintes estdios de desenvolvimento: Corola menor que o clice Corola de mesmo tamanho do clice Corola maior que o clice Flores em antese

Correlacionar estas caractersticas morfolgicas com os diferentes estdios de desenvolvimento dos gros de plen. Andrognese em cultura de antera de Nicitiana tabacum Flores de N. tabacum, com os gros de plen entre primeira mitose e incio de estdio binuclear, sero retirados de plantas cultivadas em casa de vegetao e utilizados para produo de haplides. Desinfestar as flores conforme prticas anteriores. Para excisar as anteras, primeiramente, segure os botes, logo abaixo do ovrio com uma pina pequena. Corte o receptculo,juntamente com a parte basal do clice, corola e estames, usando um cabo de bisturi com lmina N. 10. Faa uma pequena inciso longitudinal atravs do clice e corola. Com outra pina, remover as spalas e ptalas para expor os estames. Retire os estames, um de cada vez, segurando-os pelo filamento para inocul-los no meio nutritivo. Evite injuriar as anteras. Inocular 4 anteras por tubo contendo meio nutritivo. Deixar uma antera para anlise citolgica. Aps 5 semanas, coletar os dados do nmero de anteras que produziram embries ou plantas.

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CULTURA DE RAZES A cultura de razes fornece um sistema controlado para o estudo dos fatores nutricionais e fisiolgicos envolvidos no crescimento e desenvolvimento das razes. A importncia da vitamina tiamina para cultura de tecidos foi demonstradausando esse sistema (white, 1934)

Dois exerccios sero feitos, um na iniciao de cultura de razes e o outro com cultura estabelacida. Os alunos trabalharo individualmente. As solues estoques de nutrientes a serem usadas nos experimentos sero preparadas como se segue (concentrao em mg/l):

Estoque Salino A de White Ca(NO3)2. 4H2O KNO3 KCL KI H3BO3 Estoque Salino B de White KH2PO4 Estoque Salino C de White MgSO4.7H2O MnSO4.H2O Na2SO4 Estoque Salino D de White Fe2 (SO4)3 30.000 8.000 6.500 75 150

2.000

72.000 530 20.000

250

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Estoque de Fe-EDTA de Murashige-Skoog 2.7 FeSO4.7 H2O Na2EDTA Estoque Orgnico de White Glicina Tiamina-HCl cido nicotnico Piridoxina-HCl 3.7

3.000 100 500 100

A. Iniciao da cultura de razes de tomate a partir de plntulas desenvolvidas em condies asspticas. Este processo ser feito em 3 etapas: 1) preparar os frascos de germinao; 2) semear as sementes assepticamente nos frascos; e 3) excisar explantes de pices radiculares das plntulas e iniciar as culturas. 1. Preparo dos frascos para germinao: Formar plataforma com papel de filtro. Tomar um papel de filtro Whatman n0 42, de 9,0 cm de dimetro e fazer dobras sanfonadas em toda a periferia. Perfurar o centro. Inserir a plataforma em frasco Erlenmeyer de boca larga, de 250ml de capacidade. A soluo de germinao para as sementes de tomate foi preparada previamente, e sua composio a de macro e microelementos de Murashige e Skoog (1962). O pH foi ajustado a 5,0. Adicionar 50ml desta soluo em cada frasco de germinao. Fech-lo com tampa de algodo e autoclav-los durante 15 minutos, a 1.05 Kg/cm2.

2. Semear as sementes de tomate no frasco: Enrolar 25 sementes de tomate em gase, cortada em quadrados de 10 cm2, e introduzir o conjunto em tubo de ensaio de 25x150 mm. Adicionar a soluo desinfestante (0.5% hipoclorito de sdio, contendo 2 gotas de Tween-20 por 100ml). Fechar o tubo e deixar o desinfestante atuar por 20 minutos. Pode-se usar um leve vcuo para aumentar a eficincia da desinfestao. Lavar 3 vezes com gua destilada autoclavada, e colocar as sementes, em placa de petri estril, em capela de fluxo laminar. Transferir as sementes para os frascos contendo o meio nutritivo. Utilizar pinas para fazer esta operao. Colocar os frascos no escuro a 27 0C. 3. Obteno de explantes de pices radiculares para incio da cultura de razes: O meio de cultura foi preparado previamente. Tomou-se 10ml, respectivamente, dos estoques A, B, C, Orgnico de White e Fe-EDTA de Murashige e Skoog. O pH foi ajustado a 5,0.

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Foi distribudo 25ml deste meio em frascos de 125 ml. Plntulas com 5 dias de idade sero usadas como fonte de explantes. Plntulas com mais idade fornecem explantes no adequados. Com auxlio de pina, transferir as plntulas para uma placa de petri estril, recoberta com papel de filtro. Usando cabo de bisturi n0 7, acoplado com uma lmina n0 15, excisar segmento de 1.0 cm de comprimento a partir do pice primrio. Transferir 3 pices por frasco. Colocar os frascos em agitador orbital, operando continuamente a 80 rpm. Aps 7 dias, medir o comprimento do pice primrio e a soma do comprimento de todas as razes laterais. Qual a mdia de crescimento obtida? Como diferentes gentipos desenvolvem em cultura?

B. Repicagem de culturas estabelecidas: Obter razes de tomate das culturas estoques e transfer-las para placas de Petri estreis revestida com papel de filtro. Dividir razes em setores, cada um contendo razes laterais com 10 mm de tamanho. Trasferir 3 setores por frascos e coloc-los no agitador orbital, no escuro.

Referncias
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PROTOCOLO PARA PRODUO DE SEMENTE SINTTICA

Miguel Guerra UFSC/Florianpolis-SC 1. ENCAPSULAMENTO DE EMBRIES SOMTICOS EM HIDROGEL 1.1 Materiais - Alginato de sdio de 0,5 a 5,0% - Cloreto de clcio ou nitrato de clcio de 30 a 100mM - Nitrato de potssio de 100 a 200mM - Solues nutritivas (Meio de cultura) - Reguladores decrescimento - Fungicidas e/ou antibiticos (agentes protetores) - Estereomicroscpio - Micropipetador - Ponteiras de 1 ml - Becker - Placas de petri - Pinas de ponta fina - Agulhas cirrgicas - Bisturis - Papel filtro 1.2. Material Vegetal - Embries somticos no estdio de torpedo a pr-cotiledonar 1.3. Mtodos a) - Identificar os embries que se encontram nos estdios de torpedo a prcotiledonar, ou seja, estdios que possibilita a evoluo para maturao e formao de plantas completas; b) - Com auxlio do esteomicroscpio, isolar os embries somticos em placas de petri alinhado com papel filtro embebido em gua; c) - Mergulhar os embres somticos em soluo de alginato de sdio a 2%, acrescido de solues nutritivas (meio de cultura), reguladores de crescimento em baixas concentraes (BAP- 0,05M e + GA3- 0,5M), e aditivos qumicos como os fungicidas, para a proteo dos embries somticos contra o ataque de patgenos; d) - Com o uso de um micropipetador, retirar cada embrio somtico juntamente com uma gota da soluo de alginato (preparado qumico ou endosperma artificial); e) - Mergulhar a gota em soluo de CaCi2 ou Ca(NO3)2 a 50 mM, para permitir a formao do complexo alginato de clcio, pela sada de Na+ e antrada de Ca++ (agente gelificante), formando uma gota solidificada (cpsula);

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f) - Retirar a cpsula de gel da soluo de clcio, aps 20-30 minutos, e/ou tempo necessrio para que a gota adquira consistncia firme, que o fator de proteo do embrio somtico; g) - Enxaguar em gua por 5 minutos para retirar o excesso de Ca++; h) - Armazenar em geladeira a 4C, por um perodo pr-estabelecido para cada sistema e/ou espcie desejada para produo de semente sistmica; i) - Antes da transferncia dos embries encapsulados para converso, estes podero passar por um processo de desgelificao, atravs da imerso em soluo de KNO3 a 100 mM, para novamente haver a substituio dos Ca++ por K+ descomplexando o alginato de clcio, possibilitando a entrada de gua e a converso dos embries somticos, em plantas.

PREPARAO DO REAGENTE DE FEULGEN: 1 - 0,35 g de Fuccina bsica; 2 - 1,9 g de Metabissulfito de sdio (ou Potssio); 3 - Diluir os mesmos em 100 ml de HCl 0,15 N e agitar por 2 horas e 30 minutos em um erlenmeyer fechado, pois os gases liberados so txicos; 4 - Deixar em repouso por 24 horas no escuro a 4C; 5 - Adicionar 0,25 g de carvo ativado e agitar por 2 minutos; 6 - Filtrar; 7 - O lquido deve estar totalmente incolor aps ser filtrado, caso contrrio deve-se repetir os itens 5 e 6 at que fique incolor; 8 - Guardar em frasco escuro (frasco normal coberto com papel alumnio) a uma temperatura de 4C (geladeira). Obs.: Vlido por 2-4 meses; Quando o lquido apresentar colorao dentro do frasco uma indcio de que est estragado.

PREPARAO DO CARNOY (3:1) 1 - 3 partes estanol e 1 parte de cido actico glacial; 2 - Agitar bastante a soluo antes e depois de acrescentar o material; 3 - A soluo deve ser preparada imediatamente antes de ser usada; 4 - O volume do fixador deve ser de aproximadamente 10 vezes o volume do material.

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PROTOCOLO PARA VISUALIZAO CROMOSSOMICA E NDICE MITTICO EM SUSPENSES CELULARES EMBRIONRIAS

1 - Material utilizado so massas suspensor/embrionrias de Araucaria angustifolia e Picea abia; 2 - Fixar o material utilizando carnoy 3:1 por 3-5 horas. Antes da hidrlise e colorao, essencial substituir o fixador por 2 - 3 lavagens em lcool 70%, caso as amostras precisem ser armazenadas. As amostras podem ser armazenadas em etanol 70% em geladeira (4C); 3 - Lavar com gua destilada por 5 minutos; 4 - Hidrolizar em HCl 5 N em temperatura ambiente por 18 minutos; Obs.: A partir desta etapa a rapidez essencial, 18 minutos, est includo o tempo necessrio para retirada do hidrolizador. Em nosso laboratrio, aos 16 minutos, colocamos os eppendorfs na centrfuga a 7.500 rpm por 2 minutos. Aps este processo, retira-se o hidrolizador com papel absorvente (pode ser usado papel higinico de boa qualidade). 5 - Adicionar o corante Feulgen logo aps a eliminao do hidrolizador. Deixar de 1:45 2 horas; 6 - Retirar o contedo do eppendorfs utilizando uma micropipeta com ponteira cortada; 7 - Preparar as lminas, adiciona-se uma gota de cido glacial e posteriomente gotejase duas gotas do material corado com a micropipeta; 8 - Inclina-se a lamnula suavemente, fazendo leve toque sobre a mesma. O toque utilizado com o objetivo de deixar as clulas no mesmo plano; 9 - Observar em microscpio. Obs.: a delicadeza com as clulas em todo o processo essencial.

PROTOCOLO PARA VISUALIZAO DE PR-EMBRIO SOMTICO 1 - Em uma pequena quantidade de massa suspensor/embrionria adiciona-se gotas de azul de Evans deixando de 2 a 3 minutos; 2 - Retira-se o excesso de azul de Evans e adiciona-se carmin actico por mesmo perodo de tempo; 3 - Retira-se o excesso e coloca-se parte do material em lmina, coloca-se a lamnula e deve-se realizar leves batidas com um lpis borracha ou similar, para espalhar o material.

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USO DE BIOREATORES DE IMERSO TEMPORRIA PARA INCREMENTAR A MICROPROPAGAO DE BANANA Eurico Eduardo Pinto de Lemos1 , Micheline de S. Ferreira2, Vandebilto S. Magalhes2, Liduna M. C. de Alencar1 e Juvenal G. L. Oliveira2
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Professor Laboratrio de Biotecnologia Vegetal-CECA-UFAL. BR 104 Norte Km 14, 57072-970, Macei, AL eurico@dialnet.com.br INTRODUO O mercado brasileiro de mudas de bananas micropropagadas tem crescido bastante nos ltimos anos. Tais mudas embora mais caras do que os propgulos naturais da bananeira tm a vantagem de serem isentas de pragas e doenas alm de apresentarem maior vigor e facilidade no transporte e plantio. Os principais obstculos enfrentados para o aumento do uso de bananeiras micropropagadas tm sido a falta de divulgao e oferta das mudas em algumas regies. Seu preo, embora mais elevado do que quele das mudas convencionais, geralmente compensado pela maior produtividade e qualidade das bananas produzidas. Um grande problema observado em alguns laboratrios que micropropagam a bananeira a variao somaclonal que pode aparecer em percentagens considerveis. Segundo Shepherd (1990), j se detectaram freqncias de variaes somaclonais em banana que variaram de 1 a 25% quando subcultivadas mais do que 5 ou 9 vezes in vitro. As variaes podem afetar caractersticas vegetativas ou reprodutivas das plantas, e sua freqncia depende da variedade, dos tipos de explantes, dos componentes do meio de cultura e do tempo de permanncia das plantas in vitro. Apesar da tcnica de propagao in vitro da bananeira ser bastante difundida, percebe-se que h deficincia em trabalhos que visem o aumento da taxa de multiplicao de algumas variedades menos prolficas levando em considerao, alm das variaes somaclonais, os custos de produo. No sistema tradicional de micropropagao da bananeira, utiliza-se meio semislido. A natureza fsica deste meio possibilita apenas a absoro dos nutrientes pelas partes da planta que esto em contato direto com o meio, refletindo em uma baixa produo de biomassa. Recentemente, um novo mtodo de cultivo in vitro foi idealizado por Teisson e Alvard (1994), que propuseram o cultivo de plantas em um sistema de imerso temporria vertical. Este sistema com modificaes vem sendo experimentado com sucesso na Frana, em Cuba e tambm no Brasil, para micropropagar banana e abacaxi (Ponce, 1997; Daquinta et al., 1997; Feria et al., 1998, Lemos, 2000). Este mtodo se baseia no princpio de que as plantas se desenvolvem melhor e rapidamente quando cultivadas em intervalos regulares de imerso em meio lquido seguido de drenagem. O maior contato das plantas com o meio de cultura aumenta, consideravelmente, a sua absoro uma vez que os nutrientes podem ser absorvidos diretamente pelos estmatos sempre abertos neste tipo de cultivo, caules e razes. Em tese, as plantas tm uma maior capacidade de absoro de nutrientes (acar, sais minerais, vitaminas etc) no sistema de imerso do no tradicional, e consequentemente, produzem mais biomassa. O sistema consiste em se transferir periodicamente o meio de cultura lquido de um recipiente para outro que contm os explantes mantendo-os assim submersos por

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um perodo de tempo pr-determinado e, em seguida, drenando o meio de volta para o seu recipiente original. Todo o movimento de transferncia de meio entre os recipientes feita com compressores de ar de potncia ajustada para o volume a ser movimentado. Pequenos sistemas podem ser movimentados mesmo com compressores de aqurios caseiros. Tubos de borracha de silicone fazem a conexo entre os frascos e as bombas e so intermediados por filtros (0,22 ) que impedem a contaminao do exterior por microrganismos (figura 1). O ciclo de transferncia deve ser ajustado para cada caso e vai depender da espcie utilizada, meio de cultura e objetivos do cultivo. Geralmente, ciclos de imerso de 10 minutos intervalados por 4 horas de drenagem funcionam bem para vrias espcies.

Ar M eio L qu id o

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Tabela 1. Efeito do Sistema de cultivo na produo de biomassa, nmero de brotos e comprimento do pseudocaule de explantes de banana (cv. Terra) cultivados in vitro por 60 dias em dois sistemas de cultivo. Mdia de trs repeties. Mdia Erro padro.
Sistema de cultivo Biomassa produzida/di a (g) 1,71 0.12 5,43 0.23 Nmero de brotos viveis produzidos 38 3,6 78 5,9 Comprimento mdio do pseudocaule (cm) 4,03 0,14 6,63 0,32

Tradicional Imerso

Referncias DAQUINTA, M.; LEZCANO, Y.; ESCALONA, M.; SANTOS, R.; DOMINGUEZ, Q. e BORROTO, C. Multiplication del banano FHIA-18 com PBZ y TDZ en diferentes formas de cultivo. In: Resumos do II Encontro Brasileiro de Biotecnologia Vegetal, REDBIO, 24 a 28 novembro 1997, Gramado. p.115.

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DEBERGH, P.C. Physical properties of culture media. In: Plant Tissue Culture. A. Fujiwara (ed.). Proc. 5th Int. Cong. Plant Tiss. Cell Cult., Japan. Jap. Assoc. Plant Tissue Culture, Tokyo. 1982. p. 135-136. FERIA, M.; JIMNEZ, E. and CHVEZ, M. Influencia de las densidad de inculo y la frecuencia de renovacin del medio de cultivo em la propagacion in vitro de la caa de azcar (Saccharum spp. Hbrido) utilizando sistemas de inmersin temporal. In: Resumenes III Encuentro Latinoamericano de Biotecnologia Vegetal, REDBIO, Junio/jun 1-5, 1998, Cuba. 112p. EORGE, E.F. Plant propagation by tissue culture. The technology. Exegetics Limited., London. 1993. 574p. LEMOS, E.E.P. Experimentos em micropropagao e organognese na graviola (A. muricata L.). Macei, Brasil. 1996. 43p. LEMOS, E.E.P.; MAGALHES, V.S.; FERREIRA, M.S. e ALENCAR, L.M.C. Micropropagao de cana-de-acar em sistema de imerso temporria (Saccharum spp.). In: Resumos da XXIII Reunio Nordestina de Botnica, 29 de maro a 01 de abril de 2000, Recife - PE. p.191. PONCE, J.P. Propagacion massiva de plantas: possibilidades e perspectivas. In: Resumos do II Encontro Brasileiro de Biotecnologia Vegetal, REDBIO, 24 a 28 novembro 1997, Gramado. p.17.

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CULTURA DE PROTOPLASTOS
Protoplastos so clulas vegetais desprovidas de parede celular. Protoplasto um estado transitrio das clulas, obtido em laboratrio. As clulas vegetais nessa condio podem ser manipuladas semelhana de clulas animais e microrganismos, conservando as potencialidades de clulas vegetais intactas. Os protoplastos vm sendo utilizados no melhoramento de espcies de interesse agronmico, para obteno de plantas transgnicas, de hbridos somticos e de mutantes ou variantes somaclonais. Em adio, os protoplastos constituem sistema vegetal para estudo da expresso de genes isolados e sua regulao.

Isolamento de protoplastos de tecidos cotiledonares Obter 500 mg de tecidos de cotiledones, respectivamente, das espcies Lactuca sativa e Lycopersicon esculentum e diger-los em 5 ml de soluo enzimtica contendo: 1% de cellulysin, 0,2% de macerase e sacarose a 0,5 M. 1% de cellulysin, 0,2% de macerase e manitol a 0,7 M. Aps, o perodo de digeto de 14 a 16 horas, observar no microscpio a liberao dos protoplastos. Se a reao for completa, passar a soluo de digesto em 2 camadas de gase e coletar o filtrado em tubo de centrfuga de 15 ml. Centrifugar a 500 g por 5 minutos. No caso da preparao com sacarose transferir 3 ml da parte superior do sobrenadante para para frasco de 50 ml. No caso da preparao com manitol eliminar o sobrenadante e ressuspender os protoplastos em 10 ml de soluo de manitol a 0,5 M.

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