27-11-2007 16-16-07 Atividade Antioxidante de Flavonoides

__________________________________________________________________Avaliao da Atividade Antioxidante de Flavonides
___________________________________________________________________________________________
Dilogos & Cincia - Revista da Rede de Ensino FTC. Ano V, n. 12, dez. 2007. ISSN 1678-0493
http://www.ftc.br/dialogos
1

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONIDES

Clayton Queiroz Alves
1

Hugo Neves Brando
2

Jorge Maurcio David
3

Juceni Pereira David
4

Luciano da S. Lima
5

RESUMO: Este trabalho descreve a avaliao da atividade antioxidante de alguns flavonides
isolados de plantas da regio do semi-rido. Os flavonides selecionados foram submetidos aos
testes de inibio da oxidao do -caroteno promovido pelo cido oleanlico e o de seqestro do
radical DPPH. Esses testes foram acompanhados por espectrofotometria, utilizando-se como
controle positivo o pirogalol, cido glico e quercetina. Pelos resultados observados, pode-se
constatar que a atividade antioxidante dos flavonides dependente da presena de grupos
hidroxlicos como substituintes e de sua coplanaridade.

Palavras-chave: Atividade antioxidante; Flavonides; Seqestro de radicais.

ABSTRACT: This work describes the antioxidant evaluation of flavonoids isolated from plants of
Brazilian semi-arid region. The compounds were submitted to autooxidation of -carotene in the
system containing linollenic acid and the also the DPPH assays. These experiments were monitored
by spectrophotometry employing as positive control pirogalol, gallic acid and quercetin. The results
show that the antioxidant activities of the flavonoids is dependent of the presence of hydroxyl
groups and the coplanarity of the structure.

Key-words: Antioxidant activity; Flavonoids; Radicalar quenching

1 Introduo

Flavonides so substncias pertencentes a uma classe de produtos naturais que atualmente
podem ser consideradas micronutrientes. Esto presentes na dieta humana rica em vegetais e frutas,

1
Mestre em Qumica UFBA e doutorando do Programa de Ps-Graduao em Qumica do Instituto de Qumica
UFBA. E-mail: cleiroz@yahoo.com.br
2
Mestre em Qumica UFBA. Professor. Auxiliar do Departamento de Farmcia da UEFS, doutorando do Programa de
Ps-Graduao em Qumica do Instituto de Qumica UFBA.. E-mail: hugo@ufba.br
3
Doutor em Qumica USP. Professor do Instituto de Qumica da UFBA. E-mail: jmdavid@ufba.br
4
Doutora em Qumica USP. Professor do Instituto de Qumica da UFBA. E-mail: juceni@ufba.br
5
Mestre em Qumica UFBA e doutorando do Programa de Ps-Graduao em Qumica do Instituto de Qumica
UFBA E-mail: llima@ufba.br

___________________________________________________________________________________________
2
que so as principais fontes dessas substncias. De modo geral, os polifenis e em particular os
flavonides possuem estrutura ideal para o seqestro de radicais, sendo antioxidantes mais efetivos
que as vitaminas C e E. A atividade antioxidante dos flavonides depende da sua estrutura e pode ser
determinada por cinco fatores: reatividade como agente doador de H e eltrons, estabilidade do
radical flavanoil formado; reatividade em frente a outros antioxidantes, capacidade de quelar metais
de transio e solubilidade e interao com as membranas (BARREIROS et al, 2000). De modo
geral, quanto maior o nmero de hidroxilas, maior a atividade como agente doador de H e de
eltrons. Flavonides monoidroxilados apresentam atividade muito baixa, por exemplo, a 5-hidroxi-
flavona tem atividade no-detectvel (CAO et al, 1997). Entre os flavonides diidroxilados,
destacam-se aqueles que possuem o sistema catecol (3,4-diidroxi) no anel B. Os flavonides com
mltiplas hidroxilas como a quercetina (1), miricetina (2), luteolina (3), fustina (4), eriodictiol (5) e
taxifolina (6) possuem forte atividade antioxidante (Figura 1) quando comparados ao -tocoferol,
cido ascrbico, -caroteno (Yang et al, 2001).
Este trabalho descreve a avaliao da atividade antioxidante de flavonides isolados de
plantas do semi-rido nordestino quanto ao poder de seqestro do radical DPPH e da inibio da
oxidao do -caroteno no sistema -caroteno/cido linolico.
Figura 1: Flavonides com atividade antioxidante
O
O
OH
OH
OH
OH
O H

1
O
O
OH
OH
OH
OH
O H
OH

2
O
O
OH
OH
OH
O H

3
O
O
OH
OH
O H
OH

4
O
O
OH
OH
O H
OH
5
O
O
OH
OH
O H
OH
OH
6

___________________________________________________________________________________________
3
O
HO
OH
OH
OH
O
O OH
HO
O
OH
HO
2 Parte Experimental

Os flavonides testados (Figura 2) foram isolados das folhas de Cenostigma gardenerianum (Ref.
Clayton), Cratylia mollis (Ref. Luciano) e Moldenhawera nutans (VALE et al, 2005) a partir de seus
extratos metanlicos atravs de mtodos cromatogrficos usuais e foram caracterizados por mtodos
espectromtricos (IV, UV, EM e RMN). DPPH, -caroteno, cido linolnico foram obtidos da
Aldrich; o pirogalol da Merck e o cido glico isolado de fontes naturais (VALE et al., 2005). As
reaes foram monitoradas em espectrofotmetro Cary I da Varian.

Figura 2: Flavonides testados

O
HO
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
O
O OH
HO
O
OH
OH

O
O OH
HO
OH
OH
HO
OH O
O

7 8 9
O
HO
OH
OH
O
O
OH
O
O OH
HO
O
OH
OH

O
O OH
HO
OH

O
O OR
2
HO
OH
MeO
OH
OR
1

10 11 12 R
1
=R
2
=H
13 R
1
=Glu, R
2
=H
14 R
1
=Gal, R
2
=H
15 R
1
=Xil, R
2
=galoil

Teste da Inibio da co-oxidao do -caroteno: A atividade antioxidante in vitro das substncias
selecionadas foi determinada pelo do mtodo da inibio da reao de co-oxidao do -caroteno,
___________________________________________________________________________________________
4
provocada pela adio de cido linolico. Este mtodo foi desenvolvido por Marco (1968) e
modificado por Miller (1971). Resumidamente, a mistura de 1,0mL de soluo de -caroteno
(0,2mg/mL em CHCl
3
); 20mg cido linolico e 200mg de Tween 60 foi submetida completa
evaporao do clorofrmio. Em seguida, ento adicionados 90mL de gua destilada, agitando-se
vigorosamente para promover a aerao. Substncias puras (50, 100 e 200 g) foram adicionadas s
cubetas contendo 2,5mL da emulso do sistema -caroteno/cido linolico, sendo a reao
acompanhada no espectrofotmetro em = 470nm, com leitura imediata e em intervalos de 15min,
durante 1h, incubando as cubetas a 50C. As anlises foram realizadas em triplicatas, empregando-se
quercetina (1) como padro positivo, acompanhadas por controle sem adio de substncia-teste. A
capacidade antioxidante foi expressa em percentual de inibio da oxidao atravs do decaimento da
absorbncia, medido em relao ao controle (quercetina ou cido glico).
Frmula para clculo de Atividade Antioxidante:

AA= 100 [1- (A
0
A
t
) / (A
0
0
A
t
0
)]
Onde:
A
0
= Absorbncia inicial da amostra
A
t
= Absorbncia final da amostra
A
0
0
= Absorbncia inicial do branco
A
t
0
= Absorbncia final do branco

Seqestro do radical livre DPPH: Esse teste avalia a habilidade que uma substncia tem de
seqestrar o radical livre estvel DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e est baseado no descoramento
de uma soluo composta pelo radical estvel, de cor violeta, quando da adio de substncias que
podem ceder um tomo de hidrognio (BRAND-WILLIAMS et al., 1995). Para esse procedimento,
foi preparada soluo etanlica de DPPH (45g/mL) e solues com as substncias-testes e padro
em trs concentraes diferentes (100, 50 e 25 g/mL) em EtOH. Nesse ensaio, tambm foram
utilizados quercetina (1), cido glico ou pirogalol como substncias-referncias considerando o
poder de seqestrar 100% dos radicais. As determinaes foram realizadas no sistema contendo
3,0mL da soluo de DPPH e 50L de etanol para o controle, ou o mesmo volume para as solues
de padro e amostras. As leituras das absorbncias, a =517nm, foram realizadas imediatamente e
___________________________________________________________________________________________
5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%

d
e

i
n
i
b
i
o
50 100 200
Concentrao
1 7 8 9 10
aps 30min de incubao da reao temperatura ambiente, protegida de luz, em espectrofotmetro.
Todas as anlises foram realizadas em triplicatas.

3 Discusso dos Resultados

Os resultados da atividade antioxidante das substncias avaliadas foram expressos em
percentual de inibio da oxidao (Figuras 3 e 4), mostram que algumas delas apresentam potencial
antioxidante, que varia de acordo com o tipo de composto e do mtodo utilizado.
No teste da inibio da oxidao do -caroteno, o potencial antioxidante da substncia
testada medido pela capacidade deste em seqestrar o radical livre, gerado durante a peroxidao
do cido linolico, ou seja, quanto mais fcil for sua oxidao, mais ele competir com o -caroteno
na reao com os radicais, protegendo-o. O teste utilizando o radical estvel DPPH mede a
capacidade das substncias testadas em doar hidrognio radicalar a este radical, assim, quanto maior
o nmero de hidroxilas presentes na amostra, maior sua atividade antioxidante. A estabilidade do
radical formado outro fator que influencia no potencial antioxidante, sendo maior nas substncias
que possuem maior capacidade de deslocalizar o radical pela estrutura (DUARTE-ALMEIDA et al.,
2006).
Nos testes realizados, observou-se que as substncias 7 e 8 apresentaram excelente atividade
antioxidante, chegando a ser, em algumas concentraes, mais efetivas que 1 utilizada como padro
(quercetina). A substncia 10 apresentou atividade moderada em ambos os mtodos e a substncia 9
no apresentou atividade.

___________________________________________________________________________________________
6
0
20
40
60
80
100
120
%

d
e

s
e
q
e
s
t
r
o
25 50 100
Concentrao
1 7 9 10 11
0
20
40
60
80
100
30 60 120
Concentrao
%

d
e

s
e
q
u
e
s
t
r
o
Ac. Glico 12

Figura 3: Grfico do teste da inibio da oxidao do -caroteno dos flavonides 7-10

Figura 4: Grfico do teste do seqestro de radicais livres (DPPH) dos flavonides 7-10

Figura 5 Grfico do teste do seqestro de radicais livres (DPPH) do flavonide 12 em relao ao
cido glico

Nas Tabelas 1 e 2 encontram-se descritos os resultados de atividade antioxidante observados
para as substncias 12-15. Dentre esses flavonides, o que apresentou atividade mais considervel foi
a laricetrina 5-galoil-3--D-xilopiranosdeo (15) para o teste de inibio da auto-oxidao do -
caroteno e a laricetrina (12) no seqestro do DPPH. Estes resultados esto de acordo com os
observados para os flavonides, de um modo geral, uma vez que substncias planares, com grupos
catecis e sistema conjugado so melhores seqestrados de radicais livres. A presena de
substituintes em 13-15 (resduos de acares e grupos galoil) diminui a atividade seqestradora de
___________________________________________________________________________________________
7
radicais, pois a estrutura do flavonide perde a coplanaridade devido a presena de grupos
volumosos. digno de nota que a presena do galactosdeo em 15, quando comparado com o
glicosdeo (13), diminue a atividade antioxidante da substncia.

Tabela 1: Determinao da AA de 13-16 atravs do mtodo da autooxidao do -caroteno

Substncia AA*
% AA Intervalo de confiana 95%
Laricetrina (13) 15.5 13.7 17.3
Substncia AA*
Laricetrina 3--glicosdeo (14) 17.8 16.0 19.6
Laricetrina 3--galactosdeo (15) 25.9 23.1 28.7
Laricetrina 5-galoil-3--D-
xilopiranosdeo (16)
55.3 54.2 56.4
* 1mg/mL. % em relao ao cido glico (100%)

Tabela 2: Determinao do IC
50
a partir do teste de seqestro do DPPH para 13-16*

Substncia IC
50
(M) Intervalo de confiana 95%
Laricetrina (13) 1.8 1.7 1.9
Laricetrina 3--glicosdeo (14) 7.5 7.1 7.9
Laricetrina 3--galactosdeo (15) 3.0 2.8 3.2
Laricetrina 5-galoil-3--D-
xilopiranosdeo (16)
6.5 6.2 6.8
* dados obtidos a partir da comparao com o pirogalol

Referncias

BARREIROS, A. L. B. S.; DAVID, J. P.; DAVID, J. M.. Estresse Oxidativo: Relao entre gerao
de espcies reativas e a defesa do organismo. Qumica nova v. 29, p. 113-123, 2006.
CAO, G. H.; SOFIC, E.; PRIOR, R. L. Antioxidant and Prooxidant Behavior of Flavonoids:
Structure-Activity Relationships. Free Radical Biology & Medicine v. 22, p. 749-760, 1997.
___________________________________________________________________________________________
8
YANG, B.; KOIANI, A.; ARAI, K.; KUSU, F.. Relationship of electrochemical oxidation of
catechins on their antioxidant activity in microsomal lipid peroxidation. Chemical Pharmaceutical
Bulletin v. 49, p. 747-751, 2001.
VALE, A. E. Do; DAVID, J. M. ; BRANDO, H. N. ; DAVID, J. P.. A New Flavonol Glycoside
Derivative from Leaves of Moldenhawera nutans. Zeitschrift Fr Naturforschung C-A Journal Of
Biosciences v. 60c, p. 45-49, 2005.
MARCO, G.J. A rapid method for evaluation of antioxidants. Journal of the American Oil
Chemists Society v.45, p.594-598, 1968.
MILLER, H.E. A simplified method for the evaluation of antioxidants. Journal of the American
Oil Chemists Society v. 48, p.91, 1971.
BRAND-WILLIAMS, W.; CUVELIER, M.E.; BERSET, C. Use of free radical method to evaluate
antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft Und-Technologie v. 28, p. 25-30, 1995.
DUARTE-ALMEIDA, J. M.; SANTOS, R. J. Dos; GENOVESE, M. I.; LAJOLO, F. M. Avaliao
da atividade antioxidante, Cincia e Tecnologia de Alimentos v. 26, p. 446-452, 2006.

Agradecimentos
Os autores agradecem a FAPESB, CNPq e CAPES pelos auxlios financeiros e bolsas de estudos

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