LIQUID-LIQUID EXTRACTION (LLE) A.

PENDAHULUAN Pada percobaan penetapan kadar parasetamol, asam asetilsalisilat, dan kafein dalam obat simptomatis ini, pertama-tama dilakukan pemisahan senyawa berdasarkan gugus fungsional untuk masing-masing senyawa dengan menggunakan metode ekstraksi cair (liquid extraction). Ekstraksi adalah pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan dengan bantuan pelarut. Ekstraksi juga merupakan proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agen. Pemisahan terjadi atas dasar kemampuan larut yang berbeda dari komponenkomponen dalam campuran. Metode ekstraksi cair-cair ini bertujuan untuk memisahkan analit yang dituju dari pengganggu dengan cara melakukan partisi sampel antar 2 pelarut yang tidak saling bercampur, yang nantinya hasil pemisahan campuran menjadi senyawa tunggal yang diharapkan adalah senyawa aktif yang terkandung dari sampel. Perlunya ada pemisahan senyawa ini agar mendapatkan senyawa tunggal yang diharapkan dari suatu sampel obat (Martunus & Helwani, 2004;2005). Ekstraksi cair-cair dikenal sebagai kromatografi cair-cair. Prinsip ekstraksi cair-cair adalah pemisahan senyawa yang mempunyai perbedaan kelarutan pada 2 pelarut yang berbeda. Ekstraksi cair-cair digunakan untuk memisahkan satu atau lebih senyawa menggunakan 2 pelarut yang tidak saling bercampur, dimana senyawa akan terdistribusi di antara dua fase sesuai dengan derajat kelarutannya yagn kemudian masing-masing jenuh dan terjadi pemisahan. Pada ekstraksi cair-cair, satu komponen bahan atau lebih dari suatu campuran dipisahkan dengan bantuan pelarut. Ekstraksi cair-cair terutama digunakan, bila pemisahan campuran dengan cara destilasi tidak mungkin dilakukan (misalnya karena pembentukan azeotrop atau karena kepekaannya terhadap panas) atau tidak ekonomis. Seperti ekstraksi padat-cair, ekstraksi cair-cair selalu terdiri dari sedikitnya dua tahap, yaitu pencampuran secara intensif bahan ekstraksi dengan pelarut dan pemisahan kedua fase cair itu sesempurna mungkin (Martunus & Helwani, 2004;2005).

Untuk memisahkan kedua fase yang tidak saling bercampur digunakan corong pisah karena corong pisah merupakan operasi ekstraksi yang termasuk dari batch dimana seluruh material (parasetamol, asam asetilsalisilat, dan kafein) dimasukkan ke dalam corong pisahsolut akan larut dalam pelarut yang sesuai. Untuk menetapkan kualitas pemisahan digunakan HPLC. Kromatografi cairan kinerja tinggi atau dalam bahasa inggrisnyadikenal dengan sebutan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan salah satu teknik pemisahan campuran secara modern. Teknik HPLCini merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalamkromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya,pembandingan kurang

menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satustandar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan menggunakanteknik kurva kalibrasi (Tim Kimia Analitik Instrumen, 2010). Prinsip kerja HPLC dengan bantuan pompa fase gerak cair dialurkan melalui kolom ke detektor cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fase diam. Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukungoleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektoryang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikansecara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupuncampuran. KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
2

bidangantara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupunsenyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakanuntuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino,asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadarsenyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain.Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) padapemanasan dapat dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi atauHPLC karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organic teknik HPLC juga dapat menganalisis senyawa anorganik, cuplikan yang mempunyaiberat molekul tinggi atau titik didihnya tinggi seperti polimer. Kelebihan KCKT antara lain: Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran Resolusinya baik Mudah melaksanakannya Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis Dapat digunakan bermacam-macam detektor Kolom dapat digunakan kembali Mudah melakukan rekoveri cuplikan Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator danreprodusibilitasnya lebih baik Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif Waktu analisis umumnya singkat Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar Ideal untuk molekul besar dan ion

Kekurangan dari HPLC adalah: Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu. Hanya bisa digunakan untuk asam organik. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
3

(Putra, Effendy De Lux. 2004). Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa, fasagerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fasa gerak dengan penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponencampuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasadiam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar darikolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasadiam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluardideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram gas. (Hendayana,Sumar.2006:69)

Gambar 1. Diagram kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC; Gambar 2 Skema Alat HPLC Komponen-komponen atau instrumentasi dari HPLC ialah sebagai berikut : 1. Fasa gerak Berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerak selain bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut : a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. b. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yangdapat mengganggu interpretasi kromatogram. c. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada kolom.Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter 0,45m. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoransekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat mengganggubase line. d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun. e. Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centiPoise). f. Sesuai dengan detektor.

2. Pompa Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair malaluikolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLCharus memenuhi persyaratan : a. Menghasilkan tekanan sampai 600psi. b. Kelluara bebas pulsa. c. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit. d. Bahan tahan korosi.Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan dankerugian yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic.

Gambar B.4 Pompa 3. Pemasukan cuplikan Kebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkanband broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecilmungkin, beberapa puluh miroliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem HPLC melalui injeksi srynge, injeksi stop -flow, dan kran cuplikan.

Gambar B.5 Syringe Injeksi syringe Alat yang paling dulu ada dan paling paling mudah untuk memasukkancuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) danuntuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapiketerulangan injeksi syringe ini sedikit labih baik dari2-3% dan sering lebih jelek. Injeksi stop-flow Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliranpelarut dihentikan sementara, asambungan pada ujung kolom dibuka dancuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkankembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. Kran cuplikan
6

Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dualangkah : a. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop. b. Kran diputar untuk mengubah cuplikan load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 L. Dengansistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan padatekanan 7000 psi denga ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia denganvolume 0,5 hingga 5L.

Gambar B.6 Tipe injector katup putaran 4. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada jugayang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utma berisi fasa diam, tepatteradinya pemisahan camppuran menjadi komonen-komponennya. Bergantungkeperluannya koom utama dapat digunkan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector. Selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom). Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantungkeperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penularan ion.Kolom jenis C-18 dan C-8 paling banyak dipakai dalam HPLC. Fasa diam jenisterikat ini dapat dibuat dengan mereaksikan silika dengan alkilklorosilana yangdikenal dengan reaksi silanisasi. Fasa Diam
7

Dalam kromatografi cair-cair, fasa diam adalah cairan film yang dilapiskan padamaterial kemasan yang terdiri dari partikel silica berpori 3-10 . fasa diammungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasadiam ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasadiam diperoleh dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilanedengan bentukumu Si (CH3)2 RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang tersubstitusi. Untuk mencegah interaksi antara zat terlarut dengan gugus SiOH, silicasering direaksikan dengan Si(CH3)3Cl. Sifat dari fasa diam ditentukan oleh sifat organosilanes gugus alkil. Jika R adalah gugus fungsional polar, maka fasadiam akan polar. Contoh fasa diam polar, dimana R terdiri dari cyano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), atau amino (-C3H6NH2). Karena fasa diam polar, fasa bergerak adalah nonpolar atau pelarut yang cukup polar.Kombinasi dari fasa diam polar dan fasa gerak non polar disebut kromatografifasa normal. Dalam kromatografi fasa terbalik, sering ditemui dalam HPLC, fasadiam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa diam non-polar paling umummenggunakan organochlorosilane dengan R adalah n-octyl (C8) atau n-octyldecyl (C18) rantai hidrokarbon. Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena diletakkan sebelumsisem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter 4,6 mm dan biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran lebih besar dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu untuk menyaring kotoran yang terbawa dalam fasa diam dan untuk menjenuhkan fasa diam dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Dengan demikian, kerusakan kolom utama yang mahal dapat dihindarkan. 5. Detektor Berbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detektor harus memenuhi persyaratan berikut : a. Cukup sensitif b. Stabilitas dan ketrulangan tinggi. c. Respon linear terhadap solut d. Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung alir e. Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan6 f. Tidak merusak cuplikan.

Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis detektor yaitudetektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi denganadanya solut. Sebaliknya, detektor spesifik memberi respon terhadap beberapasifat solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang brsifatumum terhadap solut setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan

Tabel 2 Karakteristik detector HPLC

Detektor UV Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawaorganik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehinggapanjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jeniscuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UVyang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organik menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.

Gambar B.7 Diagram detector UV

9

(http://www.scribd.com/doc/77753708/PRINSIP-HPLC). Pada praktikum kali ini yang digunakan adalah HPLC fase terbalik karena fase gerak pada pemisahan ini menggunakan fase cair yaitu air : metanol : glacial acid acetic (69:28:3). Fase gerak ini berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fase gerak ini akan berinteraksi dengan solut-solut. Jenis HPLC yang digunakan adalah fase terbalik karena pada fase terbalik HPLC, silica dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Pada fase terbalik ini, fase diam kurang polar daripada fase gerak. Metode HPLC ini perlu dilakukan untuk memvalidkan metode ekstraksi cair-cair tersebut sehingga diharapkan mendapatkan hasil yang valid. Obat penghilang rasa sakit dilarutkan dalam dietileter, ekstraksi, kafein dengan HCl 3 M, dan ekstraksi asam asetilsalisilat dengan larutan NaHCO310 %. Untuk mengetahui kinerja pemisahan secara ekstraksi cair-cair, injeksikan masing-masing fraksi: esktrak HCl, ekstrak NaHCO3dan lapisan dietileter pada HPLC fasa terbalik setelah penggantian pelarut dengan fasa gerak yang digunakan. Teori yang mendasari setiap langkah yang dilakukan a) Validasi metode analisis Validasi metode menurut USP dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik,reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis. Menurut ISO 17025: Metode yang harus divalidasi adalah: 1. Metode tidak baku, misalnya dari diktat, texbook dan jurnal yang belum diakui secara luas. 2. Metode yang dikembangkan oleh laboratorium. 3. Metode standar yang digunakan diluar ruang lingkup 4. Perubahan sekecil apapun dari metode standar, misalnya perubahan prosedur dan perubahan volume reagensia. 5. Gabungan dari dua atau lebih metode standar. 6. Gabungan antara metode standar dan metode bukan standar. (Rohman, 2009).

b) Pemisahan merupakan sebutan yang menyeluruh bagi keadaan hipotesis apabila terjadi pengecilan yang lengkap atau komponen yang terkadang dalam suatu campuran. Tujuan
10

dari pemisahan adalah untuk mengasingkan bahan asing pada bentuk tulen. Pemisahan dapat dijalankan dalam 2 bentuk yaitu kualitatif dan kuantitatif. Langkah pemisahan antara lain : Memilih dan penyediaan sample Mengukur isi pada sampel Pelarutan sampel Penyesuaian pH , agen pengkompleksan , keadaan pengoksidan Memisahkan benda asing atau bahan yang mengganggu Mengukur analit yang diperlukan Menganalisis data dengan penafsiran hasil c. Praktek keselamatan pribadi yaitu kontaminasi dari makanan, minuman dan rokok merupakan rute yang potensial untuk terpapar zat beracun. tidak ada minuman atau makanan yang boleh dikonsumsi dilaboratorium manapun bahkan jika laboratorium untuk sementara digunakan sebagai ruang kantor. peralatan gelas dan perkakas yang pernah digunakan untuk operasional laboratorium tidak boleh digunakan untuk menyiapkan atau mengkonsumsi makan atau minuman. Peralatan keamanan yaitu, alat pemadam kebakaran yang tepat untuk bahaya kebakaran dilaboratorium harus dipasang dengan baik kebenda yang diam yang mudah dijangkau dan tidak bisa dijatuhkan, kacamata keselamatan dengan pelindung samping harus digunakan didaerah laboratorium setiap saat . Sifat fisika kimia tiap analit a. Kafein (C8H10N4O2)

- Sifat Fisika : wujud bubuk putih, tidak berbau, berat molekul 194,19 g/mol, densitas kafein 1.23 g/cm3 (solid), titik leleh antara 227-2280C (anhydrous) dan 234-2350C (monohidrat), titik didih 1780C subl, kelarutan dalam air 2.17 g/100 mL(250C), pKa -0.13 1.22, momen dipole 3.64 D.

11

- Sifat Kimia : kafein termetabolisme disalam hati menjadi 3 metabolit utama yaitu paraxoxathine (84%), theobromine (12%) dan theophyline (4%).

b. Aspirin

- Sifat Fisika : Kristal putih, berbentuk seperti jarum, berwarna putih mengkilap, dalam alkohol panas larut, titik leleh 135-1360C. Bilangan molekul 180g/mol. - Sifat Kimia : Aspirin + NaOH 10% terhidrolisis menjadi asam salisilat bebas, dengan air terhidrolisis menjadi asam salisilat bebas dan asam asetat, tidak terhidrolisis dalam asam lemak

c. Paracetamol

- Sifat Fisika : bentuk padat (serbuk hablur), berwarna putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit, BM 151.17g/mol, titik lebur 1700C, larut dalam air mendidih dan NaOH 1 N - Sifat Kimia : Paracetamol adalah suatu amida yang tidak kuat untuk bereaksi dengan basa atu asam. Paracetamol akan tertinggal sepanjang ekstraksi di pelarut organik

B. TUJUAN 1. Mengenalkan teknik pemisahan secara ekstraksi cair-cair. 2. Melakukan analisis kualitatif dan analisis kuantitatif terhadap pemisahan yang menggunakan HPLC.

12

C. SKEMA KERJA 1. Liquid-liquid Extraction Serbuk obat 200-300 mg Pelarutan dalam erlenmeyer - 20 ml dietileter + 5 ml pembilasan Larutan dalam dietil eter Ekstraksi dengan corong pisah 20 ml HCl 3 M + 15 ml HCl 3 M

Lapisan atas (eter)

Lapisan bawah dimasukkan dalam beaker (HCl)

Ekstraksi dengan corong pisah -20 ml NaHCO310 % + 15 ml NaHCO310 %

Lapisan atas (eter) Pencucian

Lapisan bawah dimasukkan dalam beaker (NaHCO3)

-NaCl jenuh 20 ml

Lapisan atas (eter)

Lapisan bawah (air)

Pengeringan 5 menit dalam erlenmeyer -Na2SO4anhidrat Lapisan eter Penyaringan ke erlenmeyer 50 ml -dengan corong dan kapas

Lapisan eter Penguapan di lemari asam

13

Salisilamid Pelarutan - Pelarut yang sesuai

Salisilamid hasil ekstraksi

Ekstrak HCl dalam tangas es Pembasaan hingga pH 10 dengan indikator universal 8 M NaOH

Ekstrak amina (kafein) Penuangan dalam corong pisah dan

pembilasan wadah dengan 5 ml dietileter

Ekstrak amina Ekstrak dengan corong pisah 20 ml dietileter

Lapisan bawah (air) dalam corong pisah lain Ekstraksi - 25 ml

lapisan atas I (eter) dalam erlenmeyer

Lapisan atas II (eter)

lapisan bawah (air)

Penggabungan dengan lapisan atas I (eter) dalam erlenmeyer Lapisan eter Pengeringan 5 menit dalam erlenmeyer
14

- Na2SO4 anhidrat Lapisan eter Penyaringan ke flakon - Dengan corong dan kapas

Lapisan eter Larutan eter Penguapan di lemari asam

Kafein Pelarutan -pelarut yang sesuai Kafein hasil ekstraksi

Ekstrak bikarbonat dalam tangas es pengasaman hingga pH 1 dengan indikator universal dan 6 M HCl Ekstrak aspirin penuangan dalam corong pisah dan pemisahan wadah dengan 5 ml dietil eter lapisan bawah (air) dalam corong pisah lain lapisan atas 1 (eter)

15

ekstraksi 25 ml dietil eter

lapisan atas 2 (eter)

lapisan bawah (air)

penggabungan dengan lapisan atas 1 (eter) dalam erlenmeyer

lapisan eter pengeringan 5 menit dalam erlenmeyer dan Na2SO4 anhidrat lapisan eter penyaringan ke flakon dengan corong dan kapas

lapisan eter penguapan di lemari asam

aspirin (asam asetil salisilamit) pelarutan (pelarut yang sesuai)

aspirin hasil ekstraksi

HPLC Fase terbalik A. Pembuatan larutan stok standar Ditimbang masing-masing 100 mg, asam asetil salisilat, parasetamol, kafein, dan asam salisilat, dilarutkan dalam methanol ad 50,0 ml dalam labu takar

B. Kondisioning HPLC Dialiri HPLC dengan fase gerak air:methanol:asam glacial (69:28:3) selama 30 menit dengan kecepatan alir 1ml/menit

Diinjek masing-masing larutan stok , dicatat waktu retensi masing-masing standar

Diamati sistem suitability requirement USP : tailing factor <1,2 , rs antar analyt dan i.s i.s >1,4

Didiskusikan hasilnya untuk langkah selanjutnya

16

Dioptimasi fase gerak ( jika diperlukan )

C. Kinerja pemisahan secara ekstraksi cair- cair Dibuat campuran larutan stok (asam asetil salisilat, kafein dan parasetamol, asam salisilat dan standar internal asam benzoate

Diinject larutannya dan dihitung resolusinya

Dibuat seri pengenceran larutan stok untuk membuat kurva bakuy. Diinjek masingmasing dan dicatat waktu retensi dan luas puncak

Divalidasi metode pengukuran secara HPLC

D. ALAT dan BAHAN a. Ekstraksi Cair (Liquid-Liquid Extraction) Alat Bahan : corong pisah, beaker glass, flakon, corong, erlenmeyer 50mL : Paracetamol, Asam Asetilsalisilat, Kafein, Dietil eter, HCl 3M, Natrium Bikarbonat, Sodium Klorida, Natrium Sulfat Anhidrat, NaOH 8 M, HCl 6 M B . Pemisahan dengan HPLC fase terbalik Kondisi HPLC menurut USP Column used Mobile phase Flow rate Detection Temperature Injection Sampel Standar preparation : 100x4,6 mm 5 : water / methanol/ glacial acetic acid (69:28:3) :2,0 ml/min : UV @ 275 nm :45C :mikro L :paracetamol, caffeine, aspirin, benzoid acid,salicylic acid :benzoic acid 0,1 mg/ml

17

E. HASIL DAN PEMBAHASAN I. Hasil 1. Ekstraksi cair-cair Penimbangan bahan sampel uji (paracetamol, aspirin, kafein,) Berat kertas = 1.4 gram

Berat kertas + zat = 1.8 gram Berat kertas + sisa = 1.5 gram Berat zat 2. HPLC Penimbangan bahan paracetamol Berat kertas (g) Berat kertas +zat (g) Berat kertas + sisa (g) Berat zat (g) 0.4072 0.4578 0.4072 0.0506 aspirin 0.4086 0.4590 0.4098 0.0492 kafein 0.4107 0.4610 0.4118 0.0492 Asam salisilat 0.3973 0.4490 0.3973 0.0517 Asam benzoat 0.4039 0.4542 0.4039 0.0503 = 0.3 gram = 300mg

Kondisioning HPLC - Membuat fase gerak air : metanol : asam asetat glasial (69 : 28 : 3) dalam 250 ml labu ukur - Membuat fase gerak air : metanol (60:40) dalam 200 ml labu ukur. optimal pada UV = 246 nm overlaping pada HPLC = 264 ; pressure : 92 - Tailing factor (Tf) dan Retention Time (tR) - Paracetamol fase gerak air : metanol - Tf yang baik adalah 1,2. Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom kromatografi. Peak 1 tR = 1.842 Tf = = 1 Tf bagus

18

Peak 2 tR = 2,500 Tf = = 1,5 Tf kurang baik

- Asam benzoat fase gerak air : metanol : asam asetat glasial Peak 1 tR = 1,806 Tf = = 1,5 Tf kurang baik - Aspirin fase gerak air : metanol : asam asetat glasial Peak 2 tR = 1,804 Tf = Peak 4 tR = 2,850 Tf = Peak 6 tR = 4,460 Tf = = 1 Tf baik Data kromatogram Fase gerak air : metanol : asam asetat glasial - Paracetamol tidak bisa dihitung nilai Tf tR peak 4 : 2,809 - Kafein tidak bisa dihitung nilai Tf = 0,8 Tf baik = 1 Tf baik

19

tR peak 6 : 4,389 - Aspirin tidak bisa dihitung nilai Tf tR peak 6 : 13,704 - Campuran 5 tidak bisa dihitung nilai Tf tR peak 3 = 1,807 ; peak 5 = 2,824 ; peak 6 = 4,409 - Campuran 3 tidak bisa dihitung nilai Tf tR peak 1 : 2,043 tR peak 2 : 2,946 tR peak 4 : 4,580 Perhitungan Resolusi:

Paracetamol= Aspirin= Kafein= Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang baik (base line resolution). Fase gerak air : metanol - Kafein tidak bisa dihitung nilai Tf tR peak 1 : 1,849 tR peak 4 : 3,316 Pembuatan pelarut untuk ekstrak metanol 50% air : metanol (50 : 50) dalam labu takar 50 ml

20

 5 ml metanol 50% diambi untuk melarutkan ekstrak. Membuat fase gerak air : metanol (7 : 3) dalam labu takar 250 ml dan 300 ml pH fase gerak = 5 Baku kafein 2 mg/ml diambil : a) 0,1 ml ad 10 ml metanol b) 0,3 ml ad 10 ml metanol c) 0,5 ml ad 10 ml metanol d) 0,7 ml ad 10 ml metanol e) 0,9 ml ad 10 ml methanol

Konsentrasi Baku : = = 1,968 mg/ml

Perhitungan konsentrasi seri larutan baku : a) C1 . V1 = C2 . V2 1,968 mg/ml . 1ml = C2. 6 ml C2 b) C1 . V1 = C2 . V2 1,968 mg/ml . 2ml = C2. 6 ml C2 c) C1 . V1 = C2 . V2 1,968 mg/ml . 3ml = C2. 6 ml C2 d) C1 . V1 = C2 . V2 1,968 mg/ml . 4ml = C2. 6 ml C2 e) C1 . V1 = C2 . V2 1,968 mg/ml . 5ml = C2. 6 ml
21

= 0,328 mg/ml

= 0,656 mg/ml

= 0,984 mg/ml

= 1,312 mg/ml

C2

= 1,64 mg/ml

Data Kurva Baku Kafein C AUC

(mg/mL) (mg/jam.mL) 0,328 0,656 0,984 1,312 1,64 3215945 5963328 10598081 11163833 17554898

Kurva Baku Kafein

20000000 18000000 16000000 AUC (mg/jam.mL) 14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 0 2 C (mg/mL) 4 6 y = 10328783,84x- 46430 r = 0,975

Sensitifitas Persamaan kurva baku y = 10328783,84x- 46430 Diambil 3 titik dari kurva baku 5 larutan baku kafein, kemudian dibuat kurva bakunya.
22

AUC

(mg/mL) (mg/jam.mL) 0,328 0,656 0,984 3215945 5963328 10598081

Kurva Baku Kafein 3 Titik

12000000 10000000
AUC (mg/jam.mL)

8000000 6000000 4000000 2000000 0 0 1 2 C (mg/mL) 3 4

Nilai SDA dan SDB SDA SDB : 1,46831E + 006 : 1,34973E + 006 = a + 3SDB = 10328783,84146 CLOD

Y LOD

a + 3SDB = -464306,30000 + 10328783,84146 CLOD 3SDB

= 3 x 1,46831 = 1,1200 x 10-6

Kuantifikasi

23

Konsentrasi sampel kafein 1) Sampel 1 y = - 464306,30000 + 10328783,84146x

x = 0,84046 mg/ml

2) Sampel 2 y = - 464306,30000 + 10328783,84146x

x = 0,8599136 mg/ml

3) Sampel 3 y = - 464306,30000 + 10328783,84146x

x = 0,904639 mg/ml SD = 0,032893 = 0,86835 mg/ml Kadar = SD

= 0,86835 0,032893 mg/ml

Kandungan masing-masing senyawa pada sampel Paracetamol Aspirin Kafein Jumlah total = 1,192 g = 1,468 g = 0,805 g = 3, 465 g

24

Kadar Sebenarnya dari Sampel Kadar sebenarnya = 100%

Paracetamol=

100%

= 34,401% b/b Aspirin = 100%

= 42,367% b/b Kafein = 100%

= 23,232% b/b

Perhitungan % kesalahan dari Sampel (Hanya Kafein karena yang diukur adalah Kafein saja) % kesalahan = = = 100% 100% 100%

= 7,870%

25

II.

Pembahasan Tujuan praktikum kali ini praktikan dapat mengetahui teknik pemisahan secara

ekstraksi cair-cair dan menetapkan kualitas pemisahan menggunakan HPLC. a. Pemisahan Ekstraksi adalah metode yang banyak digunakan untuk memisahkan suatu senyaawa dari suatu campuran. Ekstraksi melibatkan proses pengambilan suatu senyawa dari campuran (dalam bentuk cair atau padat) menggunakan pelarut yang sesuai. Prinsip dasar ekstraksi adalah distribusi zat terlarut dalam dua pelarut yang tidak bercampur. Pada praktikum kali ini, metode ekstraksi yang digunakan adalah ekstraksi cair-cair terhadap suatu senyawa campuran. Ekstraksi cair-cair didasarkan pada transfer zat terlarut dari satu fase cair menjadi fase cair lain sesuai dengan kelarutan. Prinsip ekstraksi cair-cair adalah pemisahan senyawa yang mempunyai perbedaan kelarutan pada 2 pelarut yang tidak saling campur, di mana senyawa akan terdistribusi di antara 2 fase sesuai dengan derajat kelarutannya yang kemudian masing-masing jenuh dan terjadi pemisahan. Ekstraksi cair-cair terutama digunakan, bila pemisahan campuran dengan cara destilasi tidak mungkin dilakukan (misalnya karena pembentukan aseotrop atau karena kepekaannya terhadap panas) atau tidak ekonomis. Seperti ekstraksi padat-cair, ekstraksi cair-cair selalu terdiri atas sedikitnya dua tahap, yaitu pencampuran secara intensif bahan ekstraksi dengan pelarut, dan pemisahan kedua fasa cair itu sesempurna mungkin. Pada saat pencampuran terjadi perpindahan massa, yaitu ekstrak meninggalkan pelarut yang pertarna (media pembawa) dan masuk ke dalam pelarut kedua (media ekstraksi). Sebagai syarat ekstraksi ini, bahan ekstraksi dan pelarut tidak saling melarut (atau hanya dalam daerah yang sempit). Agar terjadi perpindahan masa yang baik yang berarti performansi ekstraksi yang besar haruslah diusahakan agar terjadi bidang kontak yang seluas mungkin di antara kedua cairan tersebut (http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/kimia-

industri/teknologi-proses/ekstraksi-cair/). Pada ekstraksi cair-cair terdapat 2 fase, yaitu 1 fase organik, 1 fase air. Pertimbangan pemakaian proses ekstraksi sebagai proses pemisahan antara lain: (1) Komponen larutan sensitif terhadap pemanasan jika digunakan distilasi

meskipunpadakondisi vakum (2) Titik didih komponen-komponen dalam campuran berdekatan (3) Kemudahan menguap (volatility) komponen-komponen hampir sama.
26

Untuk mencapai proses ekstraksi cair-cair yang baik, pelarut yang digunakan harusmemenuhi kriteria sebagai berikut (Martunus & Helwani, 2004;2005): 1. kemampuan tinggi melarutkan komponen zat terlarut di dalam campuran. 2. kemampuan tinggi untuk diambil kembali. 3. perbedaan berat jenis antara ekstrk dan rafinat lebih besar. 4. pelarut dan larutan yang akan diekstraksi harus tidak mudah campur. 5. tidak mudah bereaksi dengan zat yang akan diekstraksi. 6. tidak merusak alat secara korosi. 7. tidak mudah terbakar, tidak beracun dan harganya relatif murah. Pertimbangan-pertimbangan dalam pemilihan pelarut yang digunakan adalah: (1) Selektifitas (factor pemisahan = ) Agar proses ekstraksi dapat berlangsung, harga harus lebih besar dari satu. Jika nilai =1 artinya kedua komponen tidak dapat dipisahkan. (2) Koefisien distribusi

Sebaiknya dipilih harga koefisien distribusi yang besar, sehingga jumlah solvent yang dibutuhkan lebih sedikit. (3) Recoverability (kemampuan untuk dimurnikan) Pemisahan solute dari solvent biasanya dilakukan dengan cara distilasi, sehingga diharapkan harga relative volatility dari campuran tersebut cukup tinggi. (4) Densitas

27

Perbedaan densitas fase solvent dan fasa diluent harus cukup besar agar mudah terpisah. Perbedaan densitas ini akan berubah selama proses ekstraksi dan mempengaruhi laju perpindahan massa. (5) Tegangan antar muka (interfasia tension) Tegangan antar muka besar menyebabkan penggabungan (coalescence) lebih mudah namun mempersulit proses pendispersian. Kemudahan penggabungan lebih dipentingkan, sehingga dipilih pelarut yang memiliki tegangan antar muka yang besar. (6) Chemical reactivity Pelarut merupakan senyawa yang stabil dan inert terhadap komponen-komponen dalam system dan material (bahan konstruksi). (7) Viskositas tekanan uap dan titik beku dianjurkan rendah untuk memudahkan penanganan dan penyimpanan. (8) Pelarut tidak beracun dan tidak mudah terbakar. Pada praktikum kali ini, ekstraksi dilakukan pada suatu campuran senyawa yang mengandung 3 analit, yaitu parasetamol, asam asetil salisilat, dan kafein. Sifat Fisika dari Paracetamol yaitu Densitas:1.263 g/cm ; Titik Lebur:169 C (336 F) ; Massa Molar:151.17 g/mol; Ksp:1.4 g/100 ml or 14 mg/mL (20 C); berwujud butiran kristal putih, rasa pahit ; Larut dalam air, alkohol, aseton, gliserol, propylene glycol,gliserol,kloroform,metil alkohol, dan hidroksida alkali, tak larut dalam benzena dan eter ; Stabil pada pH > 6, dan tidak stabil pada pH asam atau pada kondisi alkaline ; Ikatan jenuh mudah putus, menjadi asam asetik dan p-aminophenol. Sifat kimia dari Parasetamol yaitu formula:C8H9NO2 ;Senyawa turunan benzena tersubstitusi oleh 2 gugus fungsi yaitu hidroksil dan amida( acetamida/ ethenamida ) ; Tersusun dari senyawa N-acetyl-para-aminophenol dan para-acetyl-amino-phenol. Sifat fisika dari Aspirin yaitu bentuk kristal seperti jarum; berwarna putih mengkilat ; larut dalam alkohol panas ; Titik leleh 135-136 o C ; Bilangan molekul: 180 g/mol. Sifat Kimia Aspirin yaitu Aspirin+ NaOH 10% Terhidrolisis menjadi asam salisilat bebas, dengan air terhidrolisis menjadi asam salisilat, tidak terhidrolisis dalam asam lemak. Sifat fisika Kafein yaitu Wujud bubuk putih,tidak berbau , berat molekulnya194,19 g/mol ; Densitas kafein :1,23 g/ cm3 (solid) ; Titik leleh antara 227-228 C(Anhydrous) , 234-235 C (monohydrate) ; Kelarutan
28

dalam air 2,17 g/ 100 ml (25 C ). Sifat kimia kafein yaitu Kafein termetabolisme didalam hati menjadi 3 metabolit utama yaitu paraxoxanthin (84%), theobromine (12%), theophyline (4%). Pertama-tama yang dilakukan adalah menimbang serbuk sampel obat sebanyak 300 mg atau 0,3 gram, kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai yaitu dietil eter yang bersifat non polar. Praktikan menggunakan pelarut dietil eter karena dietil eter ini dapat melarutkan berbagai senyawa organik ,memiliki titik didih yang rendah (380) (sehingga mudah diuapkan) dan memiliki keterbatasan kelarutan dalam air. Selanjutnya diekstraksi menggunakan corong pisah dengan penambahan larutan HCl. Penambahan larutan HCl bertujuan untuk memisahkan kafein (bersifat basa) dengan senyawa yang lainnya, dimana akan terbentuk garam. Setelah terbentuk dua lapisan yaitu lapisan atas (eter) dan lapisan bawah (air). Untuk lapisan bawah yang mengandung senyawa kafein dipindahkan ke

beaker yang lain untuk diekstraksi ke tahap selanjutnya (pemurnian kafein). Selanjutnya lapisan atas (eter) ditambahkan NaHCO3 10% untuk memisahkan aspirin dengan senyawa yang lainnya. Aspirin yang terjadi dapat bereaksi dengan NaHCO3 membentuk garam natrium yang larut dalam air, sedangkan pada lapisan atas (eter) digunakan untuk proses ekstraksi salisilamit. Perbedaan sifat ini digunakan untuk pemurnian aspirin.

Proses ekstraksi ini dilakukan 2 kali dengan menggunakan 20 mL NaHCO3 10% dan 15 mL NaHCO3 10% dengan tujuan untuk mengoptimalkan pemurnian aspirin. setelah penambahan NaHCO3 didapatkan 2 lapisan yaitu lapisan atas (eter) dan lapisan bawah (garam natrium). Untuk lapisan bawah yang mengandung senyawa aspirin dipindahkan ke beaker yang lain untuk diekstraksi ke tahap selanjutnya (pemurnian aspirin). Selanjutnya lapisan atas (eter) ditambah NaCl jenuh 20 mL, dengan tujuan untuk mengambil senyawa salisilamid dari larutan sampel.Setelah diekstraksi terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan atas (eter) dan lapisan bawah (air).Lapisan yang diambil adalah lapisan eter yang mengandung salisilamid. Kemudian menambahkan Na2SO4 anhidrat yang digunakan untuk menarik sisa air yang berada dalam larutan eter, ini dilakukan selama 5 menit yang merupakan waktu optimal untuk pengeringan/menarik air dari larutan eter. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring dan corong, yang bertujuan untuk memisahkan Na2SO4 anhidrat
29

dengan larutan eter yang diinginkan. kemudian dilakukan tahap penguapan larutan eter pada lemari asam, untuk mendapatkan ekstraksi salisilamid. Tahap terakhir dari proses ini adalah dengan menampung hasil ekstrak salisilamid dalam flakon. Proses ektraksi kafein dilakukan dengan mengambil ekstrak HCl dari lapisan bawah tahap pertama yang diletakkan dalam penangas es, yang bertujuan untuk mencegah ekstrak HCl menguap. Tahap selanjutnya membasakan hasil ekstrasi sampai pH 10 dengan menggunakan indikator universal dan larutan NaOH 8 M .Pembasaan ini bertujuan untuk mengubah senyawa dari bentuk garam menjadi senyawa molekulkafein. Apabila dalam bentuk garam akan mengakibatkan penguapan air menjadi lebih lama, bisa saja merusak bentuk molekul akibat pemanasan yang berlebih. Ekstrak kafein lalu dituang kedalam corong pisah dengan 5 ml dietil eter yang merupakan hasil pembilasan wadah. Ekstrak kafein kemudian di ekstraksi 2 kali dengan masing-masing tahap ekstraksi menggunakan 20 ml dietil eter. Terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan atas (eter) dan lapisan bawah (air), dari hasil ekstraksi ini yang diambil lapisan atas (eter), karena molekul kafein larut dalam pelarut organik atau eter. Kemudian menambahkan Na2SO4 anhidrat yang digunakan untuk menarik sisa air yang berada dalam larutan eter, ini dilakukan selama 5 menit yang merupakan waktu optimal untuk pengeringan/menarik air dari larutan eter. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring dan corong, yang bertujuan untuk memisahkan Na2SO4 anhidrat dengan larutan eter yang diinginkan. kemudian dilakukan tahap penguapan larutan eter pada lemari asam, untuk mendapatkan ekstrak kafein. Tahap terakhir dari proses ini adalah dengan menampung hasil ekstrak kafein dalam flakon. Proses ekstraksi aspirin dilakukan dengan mengambil ekstrak bikarbonat dari lapisan bawah tahap kedua yang diletakkan dalam penangas es, yang bertujuan untuk mencegah ekstrak bikarbonat menguap. Tahap selanjutnya mengasamkan hasil ekstraksi sampai pH 1 dengan menggunakan indikator universal dan larutan HCl 6 M. Pengasaman ini bertujuan untuk mengubah senyawa dari bentuk garam menjadi senyawa molekul aspirin. Apabila dalam bentuk garam akan mengakibatkan penguapan air menjadi lebih lama, bisa saja merusak bentuk molekul akibat pemanasan yang berlebih. Ekstrak aspirin lalu dituang kedalam corong pisah dengan 5 ml dietil eter yang merupakan hasil pembilasan wadah. Ekstrak aspirin kemudian di ekstraksi 2 kali dengan masing-masing tahap ekstraksi

menggunakan 20 ml dietil eter. Terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan atas (eter) dan lapisan bawah (air), dari hasil ekstraksi ini yang diambil lapisan atas (eter), karena molekul aspirin larut dalam pelarut organik atau eter. Kemudian menambahkan Na2SO4 anhidrat yang digunakan untuk menarik sisa air yang berada dalam larutan eter, ini dilakukan selama 5
30

menit yang merupakan waktu optimal untuk pengeringan/menarik air dari larutan eter. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring dan corong, yang bertujuan untuk memisahkan Na2SO4 anhidrat dengan larutan eter yang diinginkan.

kemudian dilakukan tahap penguapan larutan eter pada lemari asam, untuk mendapatkan ekstrak aspirin (asam asetilsalisilat). Tahap terakhir dari proses ini adalah dengan menampung hasil ekstrak aspirin (asam asetilsalisilat) dalam flakon. b. Validasi Setelah dilakukan ekstraksi cair-cair, hasilnya kemudian diuji dengan HPLC. HPLC adalah teknik pemisahan untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu senyawa. Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Langkah pertama yang dilakukan yaitu praktikan membuat larutan stok standar asam asetilsalisilat, paracetamol, kafein, dan asam salisilat. Larutan stok tersebut kemudian diuji dengan spektrofotometer UV untuk menentukan panjang gelombang optimum untuk semua senyawa yang nantinya akan digunakan pada HPLC. Panjang gelombang optimum yang diperoleh adalah 264 nm. HPLC yang digunakan adalah HPLC fase terbalik. Berbeda dengan HPLC fase-normal, kromatografi fase terbalik ini bekerja dengan gaya dispersi (hidrofobik atau interaksi van der Waals). Polaritas fase gerak dan fase diam adalah terbalik, sehingga permukaan fase diam di fase terbalik HPLC adalah hidrofobik dengan fase gerak bersifat polar. Peran utamanya adalah untuk membedakan senyawa yang berkaitan sangat erat dan kemudahan variasi retensi dan selektivitas. Pada sistem HPLC praktikum, kolom yang digunakan adalah C18. Sistem HPLC khas terdiri dari komponen utama berikut: Solvent reservoir: tempat penyimpanan sejumlah pelarut. Pompa: memberikan aliran konstan dan terus menerus dari fase gerak melalui sistem. Injector: memungkinkan pengenalan (injeksi) dari campuran analit ke dalam aliran fase gerak sebelum memasuki kolom. Kolom: Merupakan pusat sistem HPLC yang menghasilkan sebuah pemisahan analit pada campuran Detektor: alat untuk pencatatan secaraterus menerus dari sifat fisik tertentudari kolom buangan

31

Akuisisi data dan sistem kontrol: sistem berbasis komputer yang mengontrol semua parameter dari instrumen HPLC dan memperoleh data dari detektor dan monitor kinerja sistem. Kemudian dibuat fase gerak air : metanol : asam asetat glasial (69:28:3). Cara

pembuatannya yaitu dengan mencampurkan 138 ml air, 56 ml metanol, dan 6 ml asam asetat glasial dalam 250 ml labu ukur. Adanya pengotor dalam fase gerak dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Adanya partikel kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan dalam kolom atau tabung tersebut. Maka dari itu dilakukan penyaringan dengan kertas Whatman dan vacuum untuk menghindari adanya partikel-partikel kecil tersebut. Adanya gelembung gas yang dapat mengganggu hasil pengujian HPLC juga harus dihilangkan, sehingga dilakukan ultrasonifikasi. Tahap berikutnya adalah kondisioning HPLC dengan mengalirkan fase gerak selama 30 menit dengan kecepatan alir 1 ml/menit agar kolom dan pipa terbasahi sampai tidak ada gelembung udara yang mengganggu. Masing-masing larutan stok kemudian diinjek dan dicatat waktu retensinya. Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan oleh analit untuk berjalan dari awal kolom sampai ke detektor. Garis kromatogram pada fase gerak harus lurus. Apabila terdapat peak, nantinya dapat mempengaruhi hasil kromatogram pada larutan yang akan diuji. Praktikan membuat 3 fase gerak dengan berbagai perbandingan karena ditemukan peak pada kromatogram. Fase gerak yang kedua dan ketiga yang dibuat adalah air : metanol (60:40) dan air : metanol (7:3), hingga fase gerak yang kromatogramnya lurus adalah air : metanol (7:3). Praktikan lalu membuat larutan stok asam asetil salisilat, kafein, parasetamol, asam salisilat, standar internal asam benzoat, campuran 3 (asam asetil salisilat, parasetamol, dan kafein), dan campuran 5 (asam asetil salisilat, kafein, parasetamol, asam salisilat, standar internal asam benzoat). Standar internal adalah senyawa yang digunakan sebagai faktor koreksi dan memiliki sifat fisika kimia yang mirip dengan analit dari sampel yang dituju. Standar internal dapat mengoreksi kehilangan analit dari awal uji hingga akhir uji. Namun pada praktikum, standar internal tidak digunakan karena peak yang dihasilkan pada profil kromatogram antara asam salisilat dan asam benzoat (yang merupakan standar internal) memiliki resolusi yang tidak baik yang mana peak yang dihasilkan tidak terpisah. Larutan stok diinjek satu persatu tanpa replikasi. Hasil yang diperoleh dari semua larutan stok asam asetil salisilat, parasetamol, asam salisilat, standar internal asam benzoat,
32

campuran 3, dan campuran 5 peak tidak muncul, kecuali kafein. Padahal peak tersebut nantinya digunakan sebagai pembanding pada peak sampel. Hal ini disebabkan karena optimasi fase gerak yang dilakukan kurang sesuai untuk senyawa lain selain kafein. Profil kromatogram yang dihasilkan untuk senyawa lain selain kafein memiliki resolusi yang tidak bagus di mana peak yang dihasilkan tidak dapat memisah dengan baik akibat dari fase gerak tidak dapat memisahkan senyawa uji dengan baik karena senyawa masih terikat kuat dengan fase diamnya. Tetapi pada kafein pun peaknya terlalu tinggi, berarti larutan terlalu pekat sehingga dilakukan 5 kali pengenceran (0,1 ml; 0,3 ml; 0,5 ml; 0,7 ml; dan 0,9 ml dari larutan stok kafein dan ad metanol dalam labu takar 10 ml). Dalam pengukuran HPLC, seharusnya sampel yang diukur minimal 6 replikasi agar memperoleh presisi yang baik. Pada awalnya, praktikan melakukan 4 replikasi dari 2 kelompok. Namun, 2 replikasi dari salah satu kelompok tidak memperoleh hasil peak yang baik sehingga digunakan sampel dari satu kelompok saja. Dan hanya dilakukan 3 kali replikasi karena keterbatasan waktu. Parameter validasi adalah sebagai berikut: a. Akurasi : perbandingan nilai sebenarnya dengan nilai yang terukur. Akurasi berhubungan dengan perolehan kembali. Akurasi berhubungan erat dengan % recovery. Rumus dari % recovery adalah % recovery = Namun pada praktikum ini, tidak dilakukan penentuan akurasi karena tidak dilakukan perhitungan % recovery. % recovery tidak bisa dihitung dikarenakan tidak dilakukan proses adisi, yaitu proses penambahan baku di dalam sampel.

b.

Presisi Menyediakan informasi bahwa adanya indikasi dari kesalahan acak. Presisi yang baik menunjukkan perbedaan antara masing-masing replikasi/keterulangan tidak jauh berbeda/tidak signifikan. Pada praktikum, tidak dapat dihitung % CV karena pada setiap sampel tidak diinjek minimal 6x pada HPLC. Seharusnya % CV yang baik adalah 2% (Damayanti, Sophi Damayanti, dkk., 2003). Setelah larutan baku diinjeksikan beberapa kali, simpangan baku relatif (relative Standard deviation, RSD) respon puncak dapat diukur, baik sebagai tinggi puncak atau luas puncak. Menurut monograp Farmakope Amerika, selain dinyatakan lain, sebanyak 5 kali injeksi harus dilakukan jika dinyatakan nilai RSD yang disyaratkan adalah 2,0 %;

33

sementara itu jika dinyatakan nilai RSD boleh lebih besar dari 2,0 %, maka dilakukan 6 kali replikasi injeksi.

c.

Spesifitas Spesifitas dapat dilihat pada kespesifikannya dalam percobaan di mana 1 alat digunakan untuk memisahkan 1 senyawa uji. Parameter yang digunakan yaitu waktu retensi (tR) dan AUC (Area Under Curve). Pada praktikum ini, tidak dapat ditentukan kespesifistasannya karena analit yang dapat dianalisis hanya kafein sementara senyawa yang lain tidak dapat dianalisis.

d.

Selektivitas Selektivitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran,hasil urai,senyawa sejenis,senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahanbahan tadi.Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya (Harmita,2004). Pengujian selektivitas digunakan untuk melihat apakah metode analisis yang diuji terpengaruh oleh senyawasenyawa lain selain senyawa uji. Selektivitas dapat dilihat dari banyaknya zat yang akan diuji yang akan menghasilkan berbagai peak pada kromatogram. Peak yang dihasilkan akan muncul pada waktu dan daerah yang tepat. Pada praktikum ini, dapat dilihat keselektivan dari senyawa-senyawa di mana tiap senyawa muncul pada peak yang berbeda-beda.

e.

Linearitas Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yangsecara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batasterendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengankecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima (Harmita,2004). Parameter dari linieritas yaitu kurva baku. Secara teoritis, nilai r-nya dari kurva baku harus 0,999. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan range kurva baku yang linier. Pada praktikum, nilai r yang didapat dari persamaan kurva baku adalah 0,975. Dari hasil tersebut, maka praktikan tidak dapat menghitung range linieritas.

f.

Sensitivitas
34

Parameter dari sensitivitas yaitu LOD. Sensitivitas berhubungan dengan kurva baku. Dari 5 titik yang ada pada kurva baku diambil 3 titik untuk menghitung SDA dan SDB. Nilai SDA dan SDB yang didapat berturut-turut 1,46831E + 006 dan 1,34973E + 006. Langkah selanjutnya adalah mensubstitusi persamaan kurva baku pada y LOD. Hal ini dapat dilihat dari persamaan berikut : Y LOD = a + 3SDB = 10328783,84146 CLOD 3SD 1032 3 4146 = 3 x 1,46831 = 1,1200 x 10-6

a + 3SDB = -464306,30000 + 10328783,84146 CLOD 3SDB

g.

Batas deteksi dan batas kuantifikasi Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004).

H. Kesimpulan Pada analisis kualitatif pada pemisahan dengan HPLC, tf dari Paracetamol, Aspirin, dan kafein pada baku tidak bisa terhitung, sedangkan nilai Rs dari Paracetamol, Aspirin, dan Kafein yaitu Pada analisis kuantitatif pada pemisahan dengan HPLC , dapat dilihati dari kadar sampel kafein yaitu 0,86835 0,032893 mg/ml.

35

I. Daftar Pustaka Agalloco,J.,dan Fredrick J.C., 2008, Validation of Pharmaceutical Process, 3rd, Informa Healthcare, London. Damayanti, Sophi, dkk., 2003, Penetapan secara Simultan Campuran Parasetamol dan Ibuprofen dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Unit Bidang Ilmu Farmasi Analisis, Departemen Farmasi Institut Teknologi Bandung, Bandung, hal. 10. Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi 4, Depkes RI, Jakarta, hal.31, 251,649. Gandjar, I.G., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Cetakan II, Yogyakarta, Pustaka Pelajar, hal.246. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, diakses tanggal 18 April 2013. Hendayana, Sumar, 2006, KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern, PT. Remaja Rosdakarya, Bandung, hal 69. http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/kimia-industri/teknologi-proses/ekstraksi-cair/ diakses tanggal 17 April 2013. http://www.scribd.com/doc/77753708/PRINSIP-HPLC, diakses tanggal 25 April 2013. Martunus & Helwani, Z, 2004, Ekstraksi Senyawa Aromatis dari Heavy Gas Oil (HGO) dengan Pelarut Dietilen Glikol (DEG).,J. Si. ,Tek., hal. 46-50. Martunus & Helwani, Z. 2005. Ekstraksi Senyawa Aromatis dari Heavy Gas Oil (HGO) dengan Pelarut Trietilen Glikol (TEG). J. Si. Tek., hal. 34-37. Putra, Effendy De Lux, 2004, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi, Jurusan Farmasi FMIPA USU , Sumatera Utara, hal. 8. Sanagi, 2001, Analitical Chemistry, Penerbit UTM, Malaysia, hal. 289,294.

Yogyakarta, 29 April 2013 Praktikan,

Lusia Drikti N. G (118114036)

Theresia Lenny L. (118114037)

Aviola Sartika S (118114038)

36

Brigita Wina R. P. (118114039)

Jolinna Michelia B. (118114040)

Lisa Sudaryanto (118114042)

Angela Irena S. (118114043)

M. M. Risa Puspitasari (118114044)

37