Presentador: Med. Cir. Henry Aguiar Tutor: Dr.

Heriberto Correia
Actividad perteneciente a la Maestra en Ciencias Biomdicas y Biologa Molecular - Universidad de Carabobo BIOMED , Maracay, Edo. Aragua

Casas N. Identificacin del Virus del Papiloma Humano por los mtodos de captura de hbridos e inmunohistoqumica en muestras de mujeres con hallazgos colposcpicos anormales. Veracruz: Universidad Veracruzana; 2010.

WHO/ICO Information Centre on HPVpapillomavirus and Cervical Cancer Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, et al. Epidemiologic classification of human (HPV Information Centre). Human Papilloma virus and Related Cancers in Venezuela. types associated with cervical cancer. N Engl J Med. 2003 Feb 6;348(6):518-27 Summary Report 2010.[Date accessed]. Available at www.who.int/hpvcentre

Epidemiologa
VPH: Condicin necesaria pero no suficiente

2002
Agencia Internacional para la Investigacin del Cncer (IARC): 71.862 nuevos casos y 32.639 muertes por CaCu

2005
Venezuela: 3.659 casos nuevos y 1.612 muertes

2006
Venezuela:2.141 muertes.

2011: 50% de las

ITS en Venezuela

Nicita G. et al. Infeccin por virus del papiloma humano (VPH) en una poblacin indgena del Amazonas venezolano. Salus Online [serial on the Internet]. 2010; 14(1). http://www.lanacion.com.ve/salud/virus-papiloma-humano-ocupa-el-primer-lugar-en-las-infecciones-de-transmision-sexual/

Genotipificar el VPH mediante el ensayo RBH en mujeres que acuden a consulta ginecolgica en la red ambulatoria pblica de salud en Maracay, edo. Aragua y relacionar con hallazgos colpocito-histolgicos de las pacientes.

Estandarizar el ensayo de RBH (Reverse Blot Hybridization) para la genotificacin de VPH.

Genotipificar el VPH encontrado en muestras cito-histolgicas de mujeres que componen la muestra. Relacionar el genotipo de VPH encontrados con los resultados cito-histolgicos reportados de las muestras tomadas. Relacionar el genotipo de VPH encontrados con los hallazgos colposcpicos reportados de las pacientes examinadas.

Poblacin:
Sexualmente activas Edad: > 14 y < 70 aos Consentimiento (Autorizacin de informado representante si <18 aos)

Toma de muestra

Envo y procesamiento en Laboratorio pblico o privado

Toma de imagen

Anlisis y discusin con equipo especializado

Lisis celular Eliminacin de Protenas

Desproteinizacin

Tris (pH 8): 0,05 M; EDTA: 0,05 M; NaCl: 0,1 M; SDS: 1% Proteinasa K Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamlico 25:24:1 ARNasa Agregar Etanol al 100% y 70%, y NaCl 5M

Eliminacin de ARN Concentracin del ADN

Rivero, J. et al. Optimization of extraction procedure for mosquito DNA suitable for PCR-based techniques. International Journal of Tropical Insect Science. Vol. 24, No 3, pp 266-269, 2004. DOI: 10.1079/IJT200430

Cebadores PGMY09/PGMY1 1 marcados con Biotina + antgeno leucocitario humano (HLA)

5 L de ADN 1Xmuestra PCR II buffer + de 50 L de 0.2 mM dNTPs Mezcla de 80 nM del cebador reaccin PGMY09 y del HMB01
80 nM del cebador biotinizado PGMY11 2040 nM de cada cebador HLAdQ 3.01.5 mM MgCl

1.25 U Amplitaq Gold

desnaturalizacin 40 ciclos de 94C, 30 seg.,

amplificacin

alineacin 55C, 15 seg. extensin 72C, 30 seg, 4C para su almacenamiento. Desnaturalizacin inicial a 94 Cy elongacin final a 72 C por 4 min.

Kaufhold A et al. Rapid typing of group A streptococci by the use of DNA amplification and non-radioactive allele-specifc oligonucleotide probes. FEMS Microbiology Letters, 1994, 119:1925.

Banda 450 pb (VPH) Banda 230 pb (HLA)

Electroforesis en Gel de Agarosa al 2% teido con Bromuro de Etidio: Carril 1: Marcador de Tamao 100 pb. Carril 2-5: Muestra #18 con diferentes [ ] de ADN.

Kaufhold A et al. Rapid typing of group A streptococci by the use of DNA amplification and non-radioactive allele-specifc oligonucleotide probes. FEMS Microbiology Letters, 1994, 119:1925.

Deteccin de genotipos Aplicacin de las e hibridacin Preparacin de lamuestras membrana

Se prepara la cmara de hibridacin y se precalientan los Membrana C precortada de 16 cm x 14 cm. EDAC Biodyne (N-Ethyl-N -(3-dimethylaminopropyl) Se lava la membrana y se coloca a en una reactivos 50 C en bao de mara. Activacin de la membrana con 20 ml de EDAC al 16%. Se carbodiimide hydrochloride) bolsa de plstico. incuba Se desnaturalizan aade la Se 515 L del amplicn de la muestra en una bolsa plstica. 0.5SSPE, M EDTA estreptavidina en 20 mLLavado 2X 0.5% positiva a VPH con 110 L de agua nanopure, 5 min a 95 C, 20X saline phosphate EDTA (SSPE); 3.0 SDS eliminando las burbujas. luego se enfran 4 C el y se aade 110 L 8X SSPE, Se coloca ysodium fijaa en miniblotter cubrindola con 0.4% una M 0.2 M sodio NaH2PO4 Se incuba en agua a 42 CNaCl, por 45 min dodecilsulfato de (SDS). , y 0.02 M EDTA pH 7.4. almohadilla. con agitacin prepara las el miniblotter y se rota la del membrana usando Se colocan sondas en cada ranura miniblotter en orden Reactivos para deteccin por quimioluminiscencia delas Se lava la membrana dos veces a 42 C burbujas. lneas de nucleicos tinta como gua para conseguir 90 . creciente, evitando cidos (ECL) Deteccin genotipos en 250 mL dede 2X SSPE, 0.5% SDS en colocan las muestras y los controles positivos y negativo. Se dejan interactuar por 1 min y luego se aspiran. Tinta china Se contenedor aaden 45de mL de solucin de ECL se mL 10 mM NaOH y se un vidrio con agitacin Se inactiva ladeteccin membrana con y 250 Estraptividina peroxidasa, coloca en una transparencia A5 , se incuba min. por 10 min. Se coloca el miniblotter en la cmara de hibridacin por 1,5 h a incuba por 10 min a por TA. 2 30% H2O2 Se retira seca la seC. coloca entre dos 2X transparencias Se el membrana exceso de y lquido con papel 50 Lavado con 250 mL SSPE, 0.1% SDS,5 min a 60 C con Agua nanopure A5. absorvente evitando que la membrana Despus de la hibridacin se desmonta el miniblotter y se agitacin. Sondas modificadas con un grupo Amino-C6 en el SDS Se seque lleva al cuarto oscuro seDebe se adjunta papel fotogrfico, se complertamente. coloca laquedar membrana en 250 mL 8.0 2X SSPE, 0.5% Lavado con 100el mL 20 mM EDTA pH a TA por 15 min. por aproximadamente 1-2 h. extremo 5.con hmeda. precalentado a 50 C en de vidrio. Se almacena 100 mLun 20recipiente mM EDTA pH 8.0 en refrigerador. (a d) ) Streptavidin, ECL detection reagents 1 and 2 are mixed togetherreagent 1 decays hydrogen peroxide Se lava la membrana agitndola a 50 Cbinds yto luego se enfra a ( c labeled with peroxidase, is incubated with the membrane and withepidemiological high affinity to Amine labeled probes are bound covalently to an activated, charged Biodyne C b ) Biotin products (amplicons) hybridized to thenegatively probes. Kong F,labeled Gilbert GL.PCR Multiplex PCR-based reverse line blotare hybridization assay (mPCR/RLB)[mdash]a practical and (substrate) and is reduced by the peroxidase (enzyme). This reduction reaction causes luminol in -] the biotin-labeled PCR product. 42 C con hielo. diagnostic tool. Nat Protocols. [10.1038/nprot.2006.404]. 2007;1(6):2668-80 (nylon) membrane (through amine [NH carboxyl [COO groups). 2] and
detection reagent 2 to be oxidized, producing light to which light sensitive film is exposed.

Estandarizar el ensayo de RBH (Reverse Blot Hybridization) para la genotificacin de VPH.

PCR de deteccin genrica. Calidad y concentracin del ADN de muestra.

Cebadores
MgCl2 Genotipos ms frecuentes Cantidad de reutilizaciones de la membrana

Genotipificar el VPH encontrado en muestras citohistolgicas de mujeres que componen la muestra.

RBH

Secuenciacin

Diseo y elaboracin de nuevas sondas

Relacionar los genotipos de VPH encontrados con los resultados cito-histolgicos reportados de las muestras tomadas.

Microsoft Office Excel Epi Info versin 7.1.2.0 para Windows

Relacionar los genotipos de VPH encontrados con los hallazgos colposcpicos reportados de las pacientes examinadas.

Microsoft Office Excel Epi Info versin 7.1.2.0 para Windows

Estadisticos de la Muestra
Obs Edades Edad 14-19 20-39 40-59 >60 TOTAL 79 Total 2839 Mean 35,9367 Var 191,9318 Std Dev 13,8539 Min 18 25% 24 Median 37 75% 45 Max 70 Mode 19

Frecuencia 8 35 32 4 79

Porcentaje 10,13% 44,30% 40,51% 5,06% 100,00%

Porcentaje acum. 10,13% 54,43% 94,94% 100,00% 100,00%

95% CI Inf. 4,47% 33,12% 29,60% 1,40%

95% CI Sup. 18,98% 55,92% 52,15% 12,46%

Resultado PCR vs. N Parejas Sexuales

Resultado PCR Negativo Positivo TOTAL 1 14 10 24 2 23 9 32 3 10 4 14 p = 0,1868 4 4 1 5 5 0 2 2 10 0 1 1 TOTAL 51 27 78

Estandarizar el ensayo de RBH (Reverse Blot Hybridization) para la genotipificacin de VPH.

Extraccin de ADN
Relacin [ ] vs. Absorbancia [ ] ng/L [ ] ng/L
Obs 260/280 <1,6 ( )ng/L 1,6-<1,8 >1,8-2,0 >2,0 TOTAL Obs Total 79 Total Mean <250 4 1111,5532 5 3 3 15 Var 250-<500 7 1457259,434 8 0 1 16 Std Dev 500-<750 2 1207,17 5 2 0 Min 25% Median 75% Max 750-<1000 1000-<2000 >2000 1 26,8 341,8 2 0 0 3 11 727,1 14 0 0 25 1471 4 7923,5 7 0 0 11 Mode TOTAL 29 26,8 41 5 4 79 87812,7

260/280
Min

Mean

p = 0,0716 Var Std Dev

25%

Median

75%

Max

Mode

260/280

79

133,82

1,6939

0,1313

0,3623

1,31

1,55

1,63

1,72

3,74

1,66

Estandarizar el ensayo de RBH (Reverse Blot Hybridization) para la genotipificacin de VPH.

Mix para PCR de deteccin Inicial
1 2 3 4 5 6 REACTIVOS H2O (LN) Buffer 5x MgCl2 (25 mM) dNTPs (10mM) PGMY09 Mix (5M) PGMY11 Mix (5M) HLA_DQ (5M) TAQ_Poly (5U/L) Sub-total (L)
Electroforesis en Gel de Agarosa al 2% teido con Bromuro de Etidio: Carril 1: Muestra #7,. Carril 2: Muestras #8. Carril 3: Muestra # 18: Carril 4: Blanco. Carril 5: Control Positivo (VPH 18). Carril 6: Marcador de Tamao 100 pb.

1x 28,75 10 3 1 0,8 0,8 0,4 0,25 45 52,5 50

ADN (L) Total (L)

Estandarizar el ensayo de RBH (Reverse Blot Hybridization) para la genotipificacin de VPH.

1 2 3 4 5
REACTIVOS H2O (LN) Buffer 5x MgCl2 (25 mM) dNTPs (10mM) PGMY09 Mix (5M) PGMY11 Mix (5M) HLA_DQ (5M) TAQ_Poly (5U/L) Sub-total ADN
Electroforesis en Gel de Agarosa al 2% teido con Bromuro de Etidio: Carril 1: Muestra #18 con Mix A. Carril 2: Muestra #18 con Mix B. Carril 3: Muestra #18 con Mix C. Carril 4: Muestra #18 con Mix D. Carril 5: Marcador de Tamao 100 pb.

Curva de dNTPs
1x A 14,925 5 1,2 0,35 0,4 0,4 0,3 0,125 22,5 2,5 25 1x B 14,625 5 1,2 0,65 0,3 0,3 0,3 0,125 22,5 2,5 25 1x C 14,425 5 1,2 0,85 0,3 0,3 0,3 0,125 22,5 2,5 25

1x D
14,775 5 1,2 0,5 0,3 0,3 0,3 0,125 22,5 2,5 25

Total

Estandarizar el ensayo de RBH (Reverse Blot Hybridization) para la genotipificacin de VPH.

1 2 3 4

Curva de Cebadores
REACTIVOS H2O (LN) Buffer 5x MgCl2 (25 mM) dNTPs (10mM) PGMY09 Mix (5M) PGMY11 Mix (5M) HLA_DQ (5M) TAQ_Poly (5U/L) Sub-total 1x A 14,575 5 1,2 0,5 0,4 0,4 0,3 0,125 22,5 2,5 25 1x B 14,775 5 1,2 0,5 0,3 0,3 0,3 0,125 22,5 2,5 25 1x C 14,875 5 1,2 0,5 0,3 0,3 0,2 0,125 22,5 2,5 25

Electroforesis en Gel de Agarosa al 2% teido con Bromuro de Etidio: Carril 1: Marcador de Tamao 100 pb. Carril 2: Muestra #18 con Mix A. Carril 3: Muestra #18 con Mix B. Carril 4: Muestra #18 con Mix C.

ADN Total

Estandarizar el ensayo de RBH (Reverse Blot Hybridization) para la genotipificacin de VPH.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Curva de Concentracin de ADN

REACTIVOS H2O (LN) Buffer 5x MgCl2 (25 mM) dNTPs (10mM) PGMY09 Mix (5M) PGMY11 Mix (5M) HLA_DQ (5M) TAQ_Poly (5U/L) Sub-total 14,775 5 1,2 0,5 0,3 0,3 0,3 0,125 22,5 2,5 25 1x

Electroforesis en Gel de Agarosa al 2% teido con Bromuro de Etidio: Carril 1-3: Muestras #7, #8 y #18 con Mix sin Cebador para HLA. Carril 4-6: Muestras #7, #8 y #18 con Mix sin Cebador PGMY09 y 11. Carril 7: Marcador de Tamao 100 pb. Carril 8: Muestra con [ ] de ADN sin diluir. Carril 9: Muestra #18 con [ ] 100 ng/L de ADN. Carril 10: Muestra #18 con [ ] 50 ng/L de ADN. Carril 11: Muestra #18 con [ ] 30 ng/L de ADN.

ADN Total

Estandarizar el ensayo de RBH (Reverse Blot Hybridization) para la genotipificacin de VPH.

1 2 3 4 5 6 7 8

Deteccin Genrica de VPH

REACTIVOS H2O (LN) Buffer 5x MgCl2 (25 mM) dNTPs (10mM) PGMY09 Mix (5M) PGMY11 Mix (5M) HLA_DQ (5M) TAQ_Poly (5U/L) Sub-total 14,775 5 1,2 0,5 0,3 0,3 0,3 0,125 22,5 2,5 25 1x

Electroforesis en Gel de Agarosa al 2% teido con Bromuro de Etidio: Carril 1-5: Muestras. Carril 6: Blanco. Carril 7: Control Positivo (VPH 18). Carril 8: Marcador de Tamao 100 pb.

ADN Total

Estandarizar el ensayo de RBH (Reverse Blot Hybridization) para la genotipificacin de VPH.

Resultado PCR vs Relacin 260/280 Relacin PCR vs. [ ] ng/L

Resultado PCR Resultado PCR Resultado PCR Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo TOTAL TOTAL TOTAL Frecuencia 0<1,60 <250 250-<500 52 15 11 12 4 15 14 27 29 79 4 16 Porcentaje 1,60-<1,80 500-<750 65,82% 30 6 11 3 34,18% 41 9 100,00% Porcentaje Acum 95% CI Inf. 1,80-<2,00 >2,00 750-<1000 1000-<2000 65,82% 54,29% 4 3 1 14 1 100,00% 2 3 5 100,00% p = 0,5947 p = 0,2464 1 11 23,87% 25 4 95% CI Sup. TOTAL >2000 TOTAL 76,13% 52 8 52 3 11 27 45,71% 79 27 79

Relacionar los genotipos de VPH encontrados con los resultados cito-histolgicos reportados de las muestras tomadas.
Resultado PCR vs. Dx Previo de VPH Resultado PCR vs. Citologa Dx Previo de VPH vs Resultados de Citologa VPH / Dx Resultado PCR Previo Negativo Negativo Positivo Positivo TOTAL TOTAL Inflamatorio Inflamatorio Inflamatorio Inflamatorio Normal Normal PCR Leve Resultado Positivo Moderado Leve Moderado 6 Positivo 6 Fila %
Col %

Inflamatorio Inflamatorio LIE Bajo Grado Insatisfactoria Bajo Grado Insatisfactorio NegativoLIE Total Severo Severo 8 24 11 88,89%
32,88%

TOTAL TOTAL 52 27 79 79

8 1 9

11,11% 50,00%

3 28 38 15 3 5 43 43

2 6 8

100,00% 34,18%

27 1 0 1 1

73

0 6

Negativo 0
Fila% Col %

5,77% 50,00%

4 1 49 12 12 73

94,23% 67,12%

100,00% 65,82%

52 0

6Total
Fila % Col %

79 1
100,00% 100,00%

7,59% 100,00%

92,41% 100,00%

p = 0,0224 p = 0,7033

Relacionar los genotipos de VPH encontrados con los hallazgos colposcpicos reportados de las pacientes examinadas.
Resultado PCR vs. Colposcopia Resultado PCR vs. Lugol Epitelio
24 20 44 21 8 29 2 p = 0,0019 p = 0,0327 1 1 14 18 32 6 3 3

Resultado PCR Resultado PCR Negativa Negativo Positivo Positiva TOTAL TOTAL

Sano Positivo 2214 2 0

Leucoplasia Miscelneos Insatisfactoria Acetoblanco Positivo Dbil Negativo No realizado 3 1 4 3 2 1

TOTAL TOTAL 52 52 27 79 79 27

14 24

1. Rivero, J. et al. Optimization of extraction procedure for mosquito DNA suitable for PCR-based techniques. International Journal of Tropical Insect Science. Vol. 24, No 3, pp 266-269, 2004. DOI: 10.1079/IJT200430 2. Casas N. Identificacin del Virus del Papiloma Humano por los mtodos de captura de hbridos e inmunohistoqumica en muestras de mujeres con hallazgos colposcpicos anormales. Veracruz: Universidad Veracruzana; 2010. 3. Centre HI. Human Papilloma virus and Related Cancers in Venezuela. 2010; Available from: www.who.int/hpvcentre. 4. Corbaln-Vlez R, Ruiz-Maci JA, Brufau C, Carapeto FJ. Carcinoma espinocelular cutneo y papilomavirus (VPH). Actas Dermo-Sifiliogrficas. 2007;98(9):583-93. 5. Kaufhold A et al. Rapid typing of group A streptococci by the use of DNA amplification and non-radioactive allele-specifc oligonucleotide probes. FEMS Microbiology Letters, 1994, 119:1925. 6. Kong F, Gilbert GL. Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB)[mdash]a practical epidemiological and diagnostic tool. Nat Protocols. [10.1038/nprot.2006.404]. 2007;1(6):2668-80. 7. Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med. 2003 Feb 6;348(6):518-27. 8. Schiffman M, Castle PE. The promise of global cervical-cancer prevention. N Engl J Med. 2005 Nov 17;353(20):2101-4. 9. Schiffman M, Wentzensen N, Wacholder S, Kinney W, Gage JC, Castle PE. Human papillomavirus testing in the prevention of cervical cancer. J Natl Cancer Inst. 2011 Mar 2;103(5):368-83. 10. World Health Organization . Human Papillomavirus Laboratory Manual. Geneva. 2010:124.

El principio de la sabidura es el temor a Dios.

La Biblia