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PARDEAMIENTO ENZIMATICO ERICK FONSECA cod. 66346, ISAURA LATORRE cod.72687, KAREN PEZ cod72577. MARZO 3 DE 2014-MARZO 10 DE 2014 ________________________________________________________________________________ Resumen En la pos cosecha tanto del banano como la manzana, es usual que se acompaa de mltiples reacciones enzimticas, causantes de la degradacin de almidones y clorofila, de la sntesis de azcares y carotenos, y de los cambios en la acidez, ablandamiento de tejidos y pardeamiento enzimtico. Este pardeamiento es causado por la accin de la Polifenol Oxidasa (PFO) sobre los fenoles contenidos en el fruto y es considerado un cambio indeseable por el consumidor. La cintica del cambio de color en la manzana y banano por efecto del pardeamiento enzimtico, se evalo mediante condiciones de temperatura, pH, aditivos y sustancias que puedan o no inhibir el pardeamiento enzimtico, en la prctica desarrollada se analiz el efecto de aire, calor, agua, sal y cidos en contacto directo con la manzana y banano, con el fin de observar cualitativamente el comportamiento de la polifenol oxidasa, adems se pudo comprender el comportamiento ptimo del cido ascrbico como inhibidor y comprender las sustancias causantes del pardeamiento, como el fenol y catecol utilizado al 1% de su concentracin, que promueven la catlisis de di fenoles en presencia de oxgeno. Palabras clave: pardeamiento, fenol, polifenol oxidasa, di fenol, inhibicin enzimtica Abstract Therefore postharvest apple banana as is usual accompanying multiple enzymatic reactions, which cause the degradation of starch and chlorophyll synthesis sugars and carotene, and changes in acidity, browning and tissue softening enzyme. This browning is caused by the action of the polyphenol oxidase (PPO) of the phenols contained in the fruit and is considered undesirable by the consumer changes. The kinetics of the color change in the block by effect of enzymatic browning was evaluated by conditions of temperature, pH, additives and substances which may or may not inhibit enzymatic browning, in practice the effect of air carried analyzed, heat, water and salt, in direct contact with the block in order to observe qualitatively the behavior of polyphenol oxidase, could also understand the optimal behavior of ascorbic acid as an inhibitor and understanding the causes of browning substances, such as phenol and catechol used to 1% concentration, that promote catalysis of di phenols in the presence of oxygen. Keywords: browning, phenol, polyphenol oxidase, di phenol, enzyme inhibition 1. Objetivos. Identificacin y control del pardeamiento enzimtico Reconocer los cambios presentados en la fruta a travs del pardeamiento enzimtico.

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Identificar las condiciones ambientales que aceleran o retardan el pardeamiento Establecer el efecto del calor, pH y sustancias inhibidoras del pardeamiento Comprobar la eficacia de los aditivos que inhiben o retardan el pardeamiento Enzimtico.

2. Introduccin. El pardeamiento no enzimtico es el resultado de reacciones originadas por las condensaciones entre compuestos carbonilos y aminados o por la degradacin de compuestos con dobles enlaces conjugados a grupos carbonilo. Estas reacciones conducen a la formacin de polmeros oscuros que en algunos casos pueden ser deseables o en otros no. Cuando cortamos algunas frutas y exponemos su carne a la accin del aire, vemos que en unos instantes se oscurece. Esto ocurre con frutas como la manzana, la pera, el pltano y con otros alimentos como las patatas o los championes. Este proceso se llama oxidacin o pardeamiento enzimtico, pues es el resultado de la accin del oxgeno contenido en el aire en combinacin con los compuestos qumicos de la fruta, en concreto sobre los fenoles. En la reaccin interviene como catalizador una enzima, la polifenol oxidasa (PFO), po la cual los fenoles se combinan con el oxgeno para transformarse en quinonas, que se polimerizan o reaccionan con grupos amino de diferentes compuestos formando compuestos coloridos que reciben el nombre de melaninas y que tienen propiedades antimicrobianas, y que podran ser un mecanismo de defensa de los vegetales contra infecciones. El pardeamiento enzimtico, es producido por unas enzimas presentes en el vegetal denominadas polifenoloxidasas, que en un ambiente hmedo producen la oxidacin de los polifenoles incoloros, en una primera etapa a compuestos coloreados amarillos denominados teaflavinas, para concluir en tearrubiginas de colores marrones y rojos.4 3. Marco terico. 3.1. Manzana (Malus domestica)

Es el fruto del manzano, rbol de la familia de las rosceas. La piel puede ser de color verde, amarilla o rojiza, y la pulpa, harinosa o crujiente, presenta un sabor que vara entre el agrio y el dulce. Contiene E El 85% de su peso es agua. Los glcidos son predominantemente fructosa y en menor cantidad, glucosa y sacarosa. Es rica en fibras, especialmente pectina ideal para mejorar el trnsito intestinal, aporta Tiene escasa cantidad de vitamina C y E que son importantes antioxidantes. Es rica en Fito nutrientes: flavonoides y quercitina

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Segn como es consumida, puede actuar como laxante o astringente: cruda y con piel es ideal para la constipacin ya que se aprovecha la fibra insoluble de la piel para mejorar el trnsito intestinal. Pero como es rica en fibra soluble como la pectina que se caracteriza por retener agua, pelada y rallada es muy benfica para enlentecer el trnsito intestinal en las diarreas. Adems es rica en tanino que acta como astringente y antiinflamatorio. Estos taninos son los responsables del oscurecimiento de la pulpa cuando se ralla o corta en trocitos y se deja en contacto con el aire. 1.1. Banano (Musa paradisiaca)

Los bananos son susceptibles de dao mecnico durante la cosecha, transporte, almacenamiento o procesamiento, dichos cambios causan estrs fsico que afectan los tejidos de la planta y altera el metabolismo fenlico (3). Las enzimas son activadas al momento de la cosecha (4). Por lo tanto durante la maduracin se producen cambios en la actividad enzimtica que alteran las estructuras subcelulares.

Figura 1. Accin de la PFO sobre los compuestos fenlicos 1.2. Pardeamiento no enzimtico

El pardeamiento enzimtico puede seguir los tipos de mecanismos claramente diferenciados, los de carcter enzimtico, en los que intervienen enzimas propias del alimento, y los no enzimticos, debido a procesos estrictamente qumicos. Se conoce con el nombre de pardeamiento enzimtico a una alteracin qumica, aunque enzimtica en sus primeras etapas, que tiene como sustratos a los compuestos fenlicos que trasforman en estructuras polimricas poco aclaradas, por lo general con coloraciones pardas. Por su origen, apenas puede ocurrir en los alimentos de origen animal mientras que si puede ocasionar significativos problemas de calidad en la conservacin de frutas y verduras. En estos casos, las alteraciones aparecen sobre todo cuando los productos vegetales ha sufrido algn dalo den sus tejidos por contusiones ocasionales o bien debido a las agresiones propias de algunos de los tratamientos tecnolgicos: troceado, extraccin de zumos, deshidratacin, congelacin, etc., ejemplos de alimentos de origen vegetales pueden ser abundantes: papas, championes, manzana, melocotones, peras, pltanos y dems. No siempre la formacin de estos pigmentos coloreados se han de considerar como un fenmeno qumico indeseable, puesto que existen diversos casos dentro de la tecnologa de alimentos en los que precisamente se busca esta transformacin de los componentes fenlicos: procesos de

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maduracin de dtiles, fermentacin de las hojas de t, secado de granos fermentados de cacao, queso etc. El pardeamiento enzimtico se produce mayoritariamente en alimentos de origen vegetal y se basa en reacciones de oxidacin de sustratos de tipo fenlico, fcilmente oxidables, siendo catalizadas estas reacciones por enzimas genricamente denominadas fenolasas o polifenol oxidasa.

Figura 2. Etapas de la reaccin de pardeamiento enzimtico.1 La polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este ltimo caso especialmente cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato. Tambin se ha utilizado el trmino cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. Se descubri primero en los championes, en los que el efecto de pardeamiento tras un dao mecnico, como el corte, es muy evidente. Los fenoles oxidados sufren a continuacin reacciones de polimerizacin dando lugar a los pigmentos oscuros responsables del cambio de color, que aparece, por ejemplo, al realizar una incisin en frutas (manzana, peras, melocotones y hortalizas como papa o zanahoria.) 1.2.1. Efecto del calor sobre la reaccin de pardeamiento En cuanto la temperatura ptima de actividad que ha sido mucho menos investigada que el pH ptimo, los datos disponibles indican que la temperatura ptima depende de los mismos factores que depende el pH ptimo. La actividad en melocotones se incrementa de 3C- 37C y decrece arriba de 45C. 1.2.2. Efecto del pH sobre la reaccin del pardeamiento El valor de pH ptimo de actividad de PPO vara dependiendo la fuente de la enzima, as como tambin el sustrato en un intervalo relativamente amplio, en la mayora de los casos va desde pH

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4.0 a 7.0. Muchas preparaciones muestran un slo pH ptimo de actividad y en algunos casos se presenta un segundo pH ptimo que puede ser atribuido a una insuficiente purificacin 1.2.3. Inhibidores Debido a que la PPO es una metaloprotena con cobre puede ser inhibida por agentes metalo quelantes tales como cianuro, monxido de carbn, dietil- ditiocarbamato de sodio( DIECA), mercaptobenztiazol , dimercaptopropanol, azide o xanato metilpotasio. Algunos de estos reaccionan tambin con las quinonas formadas. 3 1.2.4. Control qumico de pardeamiento con cido ascrbico El cido ascrbico es probablemente el ms ampliamente utilizado como agente antipardeamiento, y adems a sus propiedades reductoras, disminuye ligeramente el pH. El cido ascrbico reduce a las micro-benzoquinonas a micro-di fenoles, y tambin tiene un efecto directo en PPO. (Whitaker, 1994; Golan-Goldhirsh et al., 1992). La prevencin del oscurecimiento en el jugo de manzana a y superficies cortadas se logra con combinaciones entre cido ascrbico y quelantes (Sapers etal., 1989). Los productos de descomposicin resultantes de la oxidacin del cido ascrbico causan una coloracin marrn, y la prdida de valor nutritivo. El cido ascrbico se somete a una reaccin qumica similar a la de los azcares, salvo que los aminocidos no son necesarios para el pardeamiento. El cido ascrbico es muy reactivo, se degrada a travs de dos rutas, las cuales permiten la formacin de intermediaros de dicarbonil y por este motivo forman productos de pardeamiento.3 1.2.5. Sustancias causantes del pardeamiento La polifenoloxidasa, conocida como catecol oxidasa, fenolasa, o o-difenol oxigeno oxireductasa (E.C. 1.14.18.1), cataliza la oxidacin difenoles en presencia de oxigeno molcular. Se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza generalmente en plantas. La localizacin de la enzima en las clulas de las plantas depende de la especie y estado de madurez. La distribucin de PPO en diferentes partes de frutas y vegetales puede ser diferente ya que la proporcin de enzimas solubles vara con la madurez.

Figura 3. Mecanismo que describe la reaccin catalizada por PPO.3

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4. DATOS PRUEBA 1

Figura 4. Fotografas de muestra de la primera prueba TIEMPO (min) 0 2 15 30 45 60 MUESTRA AMBIENTE NULA 1% 15% 40% 50% 70% AGUA FRA NULA NULA NULA 1% 2% 3% SOLUCIN NaCl 2% NULA NULA 1% 3% 5% 6%

1%= Inicio de pardeamiento 2%= Pardeamiento leve con puntos concentrados del mismo 3%= Pardeamiento leve con superficie amarillo levemente oscura 5%= Pardeamiento medio con superficie amarillo medio oscura 6%= Pardeamiento medio, con superficie amarillo medio oscura y puntos concentrados del mismo 15%= Pardeamiento medio con superficie amarilla oscura 40%= Pardeamiento fuerte con superficie amarilla oscura 50%= Pardeamiento fuerte con superficie amarilla oscura y zonas pardas 70%= Pardeamiento fuerte con superficie pardo oscura

ANLISIS PRUEBA 1. El pardeamiento enzimtico a temperatura ambiente se manifest alrededor del minuto dos de iniciar la muestra; al llegar al minuto quince el pardeamiento se expandi de forma significativa y continu avanzando hasta llegar al minuto sesenta.

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En la muestra donde se sumergi la manzana en una solucin con NaCl al 2%, el pardeamiento se present al minuto tres, aunque de forma leve; adems a partir de aquel minuto hasta el sesenta dicha coloracin avanz muy poco y muy lento. En la muestra con agua fra, el pardeamiento fue casi nulo, demostrando la efectividad que posee la temperatura para alterar la velocidad de reaccin enzimtica. Esto es debido a que la temperatura ptima para la polifenol oxidasa es de 30.

PRUEBA 2

Figura 5. Fotografas de muestra de la segunda prueba ANLISIS PRUEBA 2. El banano al ser diluido en agua y trasvasado a un tubo de ensayo, no presenta un pardeamiento fuerte o evidente. Las muestras diluidas en agua sometidas a un aumento de temperatura no presentaron pardeamiento de forma inmediata, de hecho tardaron alrededor de unos treinta minutos para iniciar el cambio en la coloracin; sin embargo, aquel cambi organolptico no fue muy pronunciado en comparacin al banano macerado. El banano macerado al ser sometido a cambios de temperatura manifestaba un cambio en su coloracin, pero dicho cambio se observaba con mayor facilidad en el rea superficial que quedaba en contacto directo con el oxgeno del ambiente. Esto es evidente, ya que la enzima polifenol oxidasa se activa con el oxgeno.

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PRUEBA 3

Figura 5. Fotografas de muestra de la tercer prueba cido ctrico al 1.5% pH 2 cido ctrico al 0.5% pH 2 Zumo de limn pH 2 Agua destilada pH 6 Bicarbonato de sodio 1% pH 8 Bicarbonato de sodio 2% pH 9 Concentracin (%) pH Nivel Pardeamiento 2 4 0 3 2 2 de

Soluciones

cido ctrico 1.5 2 cido ctrico 0.5 2 Zumo de limn Puro 2 Agua destilada Pura 6 Bicarbonato de sodio 1% 8 Bicarbonato de sodio 2% 9 Escala de nivel de pardeamiento usado para la prctica (prueba 3)

Nivel 0= Nulo Nivel 1= Muy leve Nivel 2= Leve Nivel 3= Medio Nivel 4= Fuerte Nivel 5= Muy fuerte Dichas caracterizaciones en el nivel de pardeamiento hace referencia a la coloracin tomada por la fruta, en este caso la manzana.

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ANLISIS PRUEBA 3. El pardeamiento de la fruta con el cido ctrico al 1.5% fue leve, sin embargo con el cido ctrico al 0.5% fue fuerte, es decir que a pesar de ser el mismo compuesto la concentracin de stos afectan considerablemente el desarrollo de la actividad enzimtica en la carne de la fruta. En el agua destilada el pardeamiento fue menor que el manifestado en el cido ctrico al 0.5%, posiblemente se deba a la cohibicin del libre movimiento de las partculas de oxgeno en un medio acuoso. El pardeamiento presentado en la fruta sumergida en soluciones de bicarbonato al 1 y 2% fue similar, algo leve. Esto en s es algo controversial, ya que el pH ptimo para la enzima polifenol oxidasa es 7 y el pH de la solucin de bicarbonato es 8 y 9, respectivamente ante las concentraciones expresadas al inicio del prrafo; si el pH de la manzana como tal fuese 7 y no rondara entre 5,4 y 6 se podra afirmar que con la solucin el pH se convertira en uno muy alcalino y disminuira la velocidad de reaccin de la enzima, pero como tal situacin es irreal, podemos decir que en este caso hubo factores externos que a su vez inhiban el desarrollo adecuado del pardeamiento en la fruta. Observando el inexistente pardeamiento de la manzana por accin del zumo de limn que posee un pH que vara entre 2 a 2.3 podremos decir que en unas condiciones tan cidas y concentraciones tan altas (ya que el zumo se exprimi y utiliz puro) en definitiva la enzima se inactivar.

PRUEBA 4

Figura 5. Fotografas de muestra de la cuarta prueba ANLISIS PRUEBA 4 El pardeamiento fue casi inexistente, se debe tener en cuenta que el pH del cido ascbirco ronda entre 2.1 y 2.6 y las concentraciones fueron significativas, al menos las del

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5 y 2.5%, adems en el caso del HCl los resultados aunque no fueron iguales, s fueron similares; sin embargo se tiene que observar que estos elementos no afectan solo por su condicin sino por su comportamiento qumico para con la enzima. PRUEBA 5

Figura 6. Fotografas de muestra de la quinta prueba TIEMPO (MIN:SEG) NIVEL DE NIVEL DE NIVEL DE NIVEL DE PARDEAMIENTO EN PARDEAMIENTO PARDEAMIENTO PARDEAMIENTO MUESTRA AMBIENTE EN AGUA EN CATECOL EN FENOL

0:17 0 0 1 0 9:43 1 0 2 0 27:36 1 1 4 2 36:02 1 1 4 2 43:31 2 1 5 3 58:30 2 1 5 3 Nivel 0= Nulo Nivel 1= Muy leve Nivel 2= Leve Nivel 3= Medio Nivel 4= Fuerte Nivel 5= Muy fuerte

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ANLISIS PRUEBA 5 Estructuras del fenol y catecol

CUADRO COMPARATIVO FENOL Cuando uno de los hidrgenos del benceno se sustituye por un grupo hidroxilo se obtiene el fenol CATECOL Cuando dos hidrgenos del anillo del benceno se sustituyen por grupos hidroxilos, se dice que son di hdricos (catecol, resorcinol, hidroquinona). En su estructura presenta un grupo funcional Por la accin de la enzima fenol hidroxilo unido a un radical arilo. monooxigenasa, se adiciona un grupo OH al anillo aromtico del fenol, dando como resultado la formacin de una anillo con dos grupos OH. El grupo OH del fenol est en posicin orto- Los grupos OH estn en posicin orto entre si para Se pude observar distintos tipos de coloracin en las muestras debido a que el proceso de oxidacin sobre las enzimas polifenol oxidasas, varan segn el medio en que se encuentren. Por ejemplo: la muestra en el ambiente presento oxidacin leve, pues al estar colocada en una caja petri no exista acumulacin de oxigeno que acelerara el proceso; mientras que la muestra sumergida en catecol presento un pardeamiento excesivo, ya que el catecol es un acelerador del pardeamiento que acta sobre la polifenol oxidasa de una manera muy rpida y las melaninas se producen exageradamente. Bibliografa

1. Manzana Informacin nutricional expofrut Citado el dia 06 de marzo de 2014 < en lnea> http://www.expofrut.com.ar/PDF/ficha_manzana.pdf 2. Citado el dia 06 de marzo de 2014 < en lnea> http://www.scielo.org.co/pdf/vitae/v15n1/v15n1a02

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3. Cano, MP0; Marn, MA & Fster, C (1997) Differences among Spanish and Latn-American banana cultivars: morphological, chemical and sensory characteristics. Food Chemistry, 59:411-419 4. DETERMINACIN DE ENZIMAS RELACIONADAS CON LA MADURACIN DE PRODUCTOS VEGETALES Citado el dia 06 de marzo de 2014 < en lnea> http://www.actiweb.es/postcosecha/archivo8.pdf 5. pardeamiento Citado el dia 06 de marzo de 2014 < en lnea> http://controldecalidadenfrutasyverduras.blogspot.com/2009/08/pardeamientoenzimatico.html 6. http://www.uam.es/departamentos/ciencias/qorg/docencia_red/qo/l14/fenol4.html

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