Laboratorio N 4 Enzimologa - Actividad de la Amilasa Salival

INTRODUCCIN Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metablicos a velocidades compatibles con la vida, contribuyendo adems a su regulacin. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar la estructura molecular de la enzima, provocando su desnaturalizacin. En general una reaccin qumica aumenta su velocidad de reaccin al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, este efecto se observa slo entre 0 y 40C, ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces dbiles, principalmente puentes de hidrgeno, y por lo tanto, pierde su conformacin nativa. Debido tambin a su naturaleza proteica las enzimas presentan numerosos grupos ionizables, los que derivan de los grupos funcionales de sus aminocidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden cambiar el grado de ionizacin de los grupos qumicos involucrados en el sitio activo de la enzima, afectando su actividad cataltica. Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad mxima a un valor de pH denominado pH ptimo. Por tal motivo, la actividad enzimtica se mide en presencia de tampones o amortiguadores de pH. OBJETIVOS Esta actividad prctica tiene como objetivos que los alumnos: 1. Conozcan algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en muestras biolgicas. 2. Comprueben el efecto que tienen las variaciones de pH y temperatura en la actividad de una enzima, la amilasa salival. ACTIVIDADES Estudiar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de la amilasa salival. La amilasa salival es una enzima que rompe especficamente los enlaces glicosdicos 1 -4 de los polisacridos. La hidrlisis del almidn por la amilasa salival da como producto una mezcla de maltotriosa (dextrinas), maltosa, y glucosa. El almidn es un polisacrido formado por 2 tipos de cadenas: la amilosa (lineal), que presenta slo enlaces 1-4 y la amilopectina (ramificada), con enlaces 1-4 y 1-6. El almidn se reconoce qumicamente por el color azul intenso (dependiendo de la concentracin) que desarrolla en presencia de yodo, por lo tanto, la hidrlisis enzimtica del almidn se puede determinar por la prdida del color azul en una mezcla de reaccin.

PROCEDIMIENTO A.- Efecto de la Temperatura sobre la hidrlisis enzimtica del almidn 1. Disponga de 4 tubos de ensayo, rotlelos y coloque en ellos los volmenes indicados en la siguiente tabla en el orden indicado. Aada al final el almidn. Tubos Rtulo Preparacin enzimtica Tampn Fosfato PH 7,0 NaCl 0,03M Almidn Color despus de 15min 2. 0 C 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml T. ambiente 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml 38 C 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml 100 C 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml

3. 4.

Inmediatamente despus de preparar, mezcle suavemente e incube durante 15 minutos en las siguientes condiciones: (1) el tubo rtulo 0C colocarlo sobre hielo, (2) el tubo rtulo T. ambiente dejarlo a temperatura ambiente, (3) el tubo rtulo 38C ubicarlo en bao termoregulado a 38C y (4) el tubo rtulo 100C colocarlo en bao termoregulado a 100C. Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y observe. Anote sus resultados.

B.- Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival 1. Disponga de 4 tubos de ensayo, rotlelos y coloque en ellos los volmenes indicados en la siguiente tabla en el orden indicado. Aada al final el almidn. Tubos Rtulo Preparacin enzimtica NaCl 0,03M Tampn Fosfato PH 5,0 Tampn Fosfato PH 6,0 Tampn Fosfato PH 8,0 Tampn Fosfato PH 9,0 Almidn Color despus de 15min 2. 3. pH 5,0 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml pH 6,0 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml pH 8,0 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml pH 9,0 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml

Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo agregue una gota de lugol, vuelva a mezclar y observe. Anote sus resultados.

Reactivos y Materiales. 1. Preparacin enzimtica 2. Tampn fosfato 0.1M; pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0 y pH 9.0. 3. Solucin de Cloruro de sodio 0.03M. 4. Solucin de almidn 1% p/v.

5. Solucin de lugol. 6. Solucin Enzimtica. 7. Bao termoregulado. 8. Gradillas. 9. Tubos de ensayo. 10. Pipetas parciales de 5 y 10 ml. 11. Varillas de agitacin. 12. Agua destilada.