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Laboratorio Nº 5

Metabolismo de carbohidratos Fermentación en levaduras (Inhibición de la glicólisis)

INTRODUCCIÓN

Todos los seres vivos requieren un continuo aporte de nutrientes para suplir sus necesidades de materia y energía. El principal nutriente de la célula es la glucosa, la que es catabolizada para producir ATP, la forma más importante de energía utilizable en la célula. El metabolismo de la glucosa ocurre a través de una serie de reacciones:

Glicólisis:

Glucosa

Glucosa

Piruvato + ATP

Ciclo de Krebs:

Acetil-CoA

Acetil-CoA

CO 2 + NADH + FADH 2 + ATP + H +

Cadena respiratoria:

NADH + H+ FADH 2 + O 2

ATP + H + Cadena respiratoria: NADH + H+ FADH 2 + O 2 ATP +

ATP + H 2 O

En ausencia o deficiencia de oxígeno, ocurre respiración celular anaeróbica o fermentación, en que el piruvato (producto de la glicólisis) se transforma en etanol (levaduras) o acido láctico (músculo).

En presencia de oxígeno suficiente ocurre respiración celular aeróbica, en que el piruvato se incorpora a la mitocondria y se transforma en Acetil CoA, el cual a través del ciclo de Krebs origina CO 2 y coenzimas reducidas. Estas coenzimas reducidas se incorporan a la cadena respiratoria mitocondrial, donde son reoxidados por O 2 , produciendo ATP y H 2 O.

Esta vía aeróbica es la principal vía de producción de ATP. Algunas células como los glóbulos rojos y las bacterias anaeróbicas estrictas tienen en la fermentación la única vía de producción de ATP, en tanto que otras células como las levaduras, que son anaerobios facultativos, en ausencia de O 2 realizan fermentación y en presencia de él, realizan fermentación y respiración celular.

OBJETIVOS

1. Observar experimentalmente los fenómenos de respiración celular anaeróbica (fermentación) en levaduras.

2. Comprobar el efecto de inhibidores de la glicólisis y de la respiración celular.

3. Aplicar los conceptos de sustrato, oxido-reducción, modificación de pH e inhibidores en la interpretación de sus resultados.

ACTIVIDADES

Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomyces cerevisiae).

La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción:

C 6 H 12 O 6

ocurre de acuerdo a la reacción: C 6 H 1 2 O 6 2CO 2 +

2CO 2 + 2

C 2 H 5 OH (etanol)

El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentación por la producción de CO 2 .

Fermentación de glucosa y sacarosa por células de levadura.

1. Complete la siguiente batería de tubos: al finalizar mezcle por inversión para homogenizar el contenido de cada tubo.

Tubo rótulo

 

1

 

2

 

3

Suspensión de levadura 10%

8

ml

8

ml

8

ml

Solución de glucosa 10%

8

ml

 

-

 

-

Solución de sacarosa 10%

 

-

8

ml

 

-

Agua destilada (43°C)

 

-

 

-

8

ml

 

Resultados

 

Volumen de gas después de 0 minutos.

     

Volumen de gas después de 10 minutos.

     

Volumen de gas después de 20 minutos.

     

2. Aspire solución desde el tubo N°1 con una pipeta graduada de 5ml hasta casi llenarla. Selle el extremo inferior de la pipeta con papel parafilm (Ver figura 1). Llene completamente la pipeta graduada de 5ml con la mezcla N°1 por el extremo superior de ésta utilizando una pipeta Pasteur (No deben quedar burbujas).

3. Coloque sobre el extremo sin sellar de la pipeta graduada el tubo 1 invertido. Invierta todo el sistema cuidadosamente manteniendo juntos el tubo de ensayo y la pipeta.

4. Repita el procedimiento con los tubos 2 y 3.

5. El gas producido se acumulará en el extremo cerrado de la pipeta graduada. Registre el nivel del gas en las pipetas cada cierto tiempo por alrededor de 20 min. Anote sus resultados en la tabla.

Experimento II: Producción de CO 2 por fermentación e inhibición con NaF.

Bajo condiciones anaeróbicas, las levaduras degradan azúcares, desprendiendo gas. La evidencia de que está ocurriendo la fermentación en un cultivo de levaduras puede ser lograda haciendo burbujear el gas en una solución indicadora.

1.

Complete la siguiente batería de tubos: al finalizar mezcle por inversión para homogenizar el contenido de cada tubo.

Tubo rótulo

 

1

 

2

Suspensión de levadura 10%

3

ml

3

ml

Solución de glucosa 10%

2

ml

2

ml

Solución NaF 0,5M

---

1

ml

Agua destilada (43°C)

1

ml

 

---

Resultados

 

Color inicial del indicador

   

Color final del indicador (20min)

   

2. Tomar dos tubos de ensayo y colocar en cada uno 6 ml de Azul de Bromotimol.

3. Hacer burbujear el tubo N°1 (levadura, glucosa y agua) hacia el que contiene el indicador de azul de bromotimol a través de un tubo o manguera en U. Para ello, colocar el extremo del tubo en U, que tiene el tapón, en el tubo de ensayo N°1 y sumergir el extremo opuesto en el tubo de ensayo que contiene el indicador (Ver figura 1).

4. Repetir el procedimiento con el tubo N°2.

5. Colocar los tubos en baño termoregulado a 43°C por 30 minutos. Colocar un tubo conteniendo sólo 6 ml de indicador azul de bromotimol. Si el CO 2 producido en la fermentación alcohólica pasa a la solución indicadora, éste provocará que el indicador vire de color, en el rango de pH 6 - pH 7,6.

6. Anote el color inicial del bromotimol y el color final del indicador de en la tabla.

Soluciones y materiales:

Soluciones y materiales: Figura 1 1. Solución de levadura. 2. Solución de glucosa 10%. 3. Solución

Figura 1

1. Solución de levadura.

2. Solución de glucosa 10%.

3. Solución de sacarosa 10%

4. Solución de NaF 0,5 M.

5. Azul de bromotimol (Diluido 1/3).

6. Papel Parafilm.

7. Baño termoregulado a 43° C.

8. Gradilla con tubos de ensayo.

9. Pipetas graduadas de 2 ml.

10. Pipetas Pasteur con bulbo.

11. Tubo en U

12. Peras de gomas y bombas para pipetas.

13. Cinta para rotular.

14. Agua destilada.