Laboratorio N 5 Metabolismo de carbohidratos Fermentacin en levaduras (Inhibicin de la gliclisis)

INTRODUCCIN Todos los seres vivos requieren un continuo aporte de nutrientes para suplir sus necesidades de materia y energa. El principal nutriente de la clula es la glucosa, la que es catabolizada para producir ATP, la forma ms importante de energa utilizable en la clula. El metabolismo de la glucosa ocurre a travs de una serie de reacciones: Gliclisis: Ciclo de Krebs: Cadena respiratoria: Glucosa Acetil-CoA NADH + H+ FADH2 + O2 Piruvato + ATP CO2 + NADH + FADH2 + ATP + H+ ATP + H2O

En ausencia o deficiencia de oxgeno, ocurre respiracin celular anaerbica o fermentacin, en que el piruvato (producto de la gliclisis) se transforma en etanol (levaduras) o acido lctico (msculo). En presencia de oxgeno suficiente ocurre respiracin celular aerbica, en que el piruvato se incorpora a la mitocondria y se transforma en Acetil CoA, el cual a travs del ciclo de Krebs origina CO 2 y coenzimas reducidas. Estas coenzimas reducidas se incorporan a la cadena respiratoria mitocondrial, donde son reoxidados por O2, produciendo ATP y H2O. Esta va aerbica es la principal va de produccin de ATP. Algunas clulas como los glbulos rojos y las bacterias anaerbicas estrictas tienen en la fermentacin la nica va de produccin de ATP, en tanto que otras clulas como las levaduras, que son anaerobios facultativos, en ausencia de O 2 realizan fermentacin y en presencia de l, realizan fermentacin y respiracin celular. OBJETIVOS 1. Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin celular anaerbica (fermentacin) en levaduras. 2. Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la respiracin celular. 3. Aplicar los conceptos de sustrato, oxido-reduccin, modificacin de pH e inhibidores en la interpretacin de sus resultados.

ACTIVIDADES Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomyces cerevisiae). La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin: C6H12O6 2CO2 + 2 C2H5OH (etanol)

El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO2. Fermentacin de glucosa y sacarosa por clulas de levadura. 1. Complete la siguiente batera de tubos: al finalizar mezcle por inversin para homogenizar el contenido de cada tubo.
Tubo rtulo Suspensin de levadura 10% Solucin de glucosa 10% Solucin de sacarosa 10% Agua destilada (43C)
Volumen de gas despus de 0 minutos. Volumen de gas despus de 10 minutos. Volumen de gas despus de 20 minutos.

1
8 ml 8 ml Resultados

2
8 ml 8 ml -

3
8 ml 8 ml

2. Aspire solucin desde el tubo N1 con una pipeta graduada de 5ml hasta casi llenarla. Selle el extremo inferior de la pipeta con papel parafilm (Ver figura 1). Llene completamente la pipeta graduada de 5ml con la mezcla N1 por el extremo superior de sta utilizando una pipeta Pasteur (No deben quedar burbujas). 3. Coloque sobre el extremo sin sellar de la pipeta graduada el tubo 1 invertido. Invierta todo el sistema cuidadosamente manteniendo juntos el tubo de ensayo y la pipeta. 4. Repita el procedimiento con los tubos 2 y 3. 5. El gas producido se acumular en el extremo cerrado de la pipeta graduada. Registre el nivel del gas en las pipetas cada cierto tiempo por alrededor de 20 min. Anote sus resultados en la tabla.

Experimento II: Produccin de CO2 por fermentacin e inhibicin con NaF. Bajo condiciones anaerbicas, las levaduras degradan azcares, desprendiendo gas. La evidencia de que est ocurriendo la fermentacin en un cultivo de levaduras puede ser lograda haciendo burbujear el gas en una solucin indicadora.

1. Complete la siguiente batera de tubos: al finalizar mezcle por inversin para homogenizar el contenido de cada tubo. Tubo rtulo
Suspensin de levadura 10% Solucin de glucosa 10% Solucin NaF 0,5M Agua destilada (43C) Resultados
Color inicial del indicador Color final del indicador (20min)

1
3 ml 2 ml --1 ml

2
3 ml 2 ml 1 ml ---

2. Tomar dos tubos de ensayo y colocar en cada uno 6 ml de Azul de Bromotimol. 3. Hacer burbujear el tubo N1 (levadura, glucosa y agua) hacia el que contiene el indicador de azul de bromotimol a travs de un tubo o manguera en U. Para ello, colocar el extremo del tubo en U, que tiene el tapn, en el tubo de ensayo N1 y sumergir el extremo opuesto en el tubo de ensayo que contiene el indicador (Ver figura 1). 4. Repetir el procedimiento con el tubo N2. 5. Colocar los tubos en bao termoregulado a 43C por 30 minutos. Colocar un tubo conteniendo slo 6 ml de indicador azul de bromotimol. Si el CO2 producido en la fermentacin alcohlica pasa a la solucin indicadora, ste provocar que el indicador vire de color, en el rango de pH 6 - pH 7,6. 6. Anote el color inicial del bromotimol y el color final del indicador de en la tabla.

Figura 1

Soluciones y materiales: 1. Solucin de levadura. 2. Solucin de glucosa 10%. 3. Solucin de sacarosa 10% 4. Solucin de NaF 0,5 M. 5. Azul de bromotimol (Diluido 1/3). 6. Papel Parafilm. 7. Bao termoregulado a 43 C. 8. Gradilla con tubos de ensayo. 9. Pipetas graduadas de 2 ml. 10. Pipetas Pasteur con bulbo. 11. Tubo en U 12. Peras de gomas y bombas para pipetas. 13. Cinta para rotular. 14. Agua destilada.