Laboratorio N 7 Separacin Electrofortico de fragmentos de ADN en Geles de Agarosa

(Aplicacin: Determinacin del nmero de pares de bases de un ADN de inters)

INTRODUCCIN

La electroforesis en geles de agarosa es usada para separar fragmentos de DNA en base a su tamao molecular. Esta tcnica se basa en el desplazamiento de una molcula que posee una carga neta a travs de un campo elctrico aplicado. Las separaciones electroforticas normalmente se realizan sobre geles de agarosa (extrada de algas marinas) y bsicamente es un polmero capaz de formar una malla tridimensional. El gel de agarosa provee el soporte semislido y presenta poros por los cuales el lquido y las molculas a separar pueden migrar. Las molculas ms grandes migran ms lentamente que las molculas ms pequeas, debido a una mayor fuerza de friccin y a una migracin menos eficiente a travs de los poros del gel. La muestra de ADN, a ser sometida en una electroforesis, se mezcla con tampn de carga y se aplica en el gel. El tampn de carga contiene tambien sacarosa que aumenta su densidad y lo lleva al fondo del pocillo al momento de aplicar la muestra en el gel. Adems, contiene un indicador del frente de corrida que permite monitorear el avance de la electroforesis. De la concentracin de agarosa va a depender el tamao del poro formado en la preparacin de un gel. A concentraciones de agarosa ms bajas los geles resultan con poros de mayor tamao, lo que permite la separacin de fragmentos de DNA de mayor tamao. Por otra parte, a concentraciones de agarosa ms altas los geles presentan poros de menor tamao, lo que permite la separacin ms eficiente de molculas en tamao no tan distintas. La siguiente tabla sirve para evaluar el rango de eficiencia de separacin de las molculas del DNA con respecto al tamao de ellas y al porcentaje de agarosa. % Agarosa 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0 Rango eficiente de separacin de DNA (pb) 5000 60000 1000 - 20000 800 10000 500 7000 400 6000 200 3000 100 - 2000

Esquema de fraccionamiento de DNA en un gel de agarosa:

Estndar de DNA de peso Molecular. DNA cortado. plasmidial

Gel de agarosa

Pocillo Fragmentos de DNA.

Para visualizar el ADN en el gel de agarosa es necesario teirlo. El Bromuro de Etidio es una molcula pequea que se intercala entre las bases nitrogenadas del ADN. El bromuro de etidio emite luz al ser iluminado con una lmpara ultra violeta (UV). Esto permite la visualizacin de los fragmentos de ADN en el gel por medio de un aparato conocido como trans-iluminador. Una importe aplicacin para los geles de agarosa es determinar el nmero de pares de bases de un fragmento de ADN desconocido a partir de un estndar con muestras de ADN de tamaos de fragmentos de ADN conocidos. Con este propsito se realiza una electroforesis en geles de agarosa donde ambas muestras son corridas en paralelo. Finalizada la electroforesis se hace una curva de calibracin en la cual se grafica (en el eje Y) el logaritmo de pares de bases (log pb) versus (en el eje X) la distancia de migracin del fragmento de DNA en centmetros. Obtener del grfico el nmero de pares de bases (pb) del fragmento de ADN de inters.

OBJETIVOS 1. Conocer mtodos de separacin de cidos nucleicos. 2. Comprender las propiedades fisicoqumicas de los cidos nucleicos que permiten su separacin e identificacin.

PARTE EXPERIMENTAL PROCEDIMIENTO: 1) 2) Corrida electrofortica virtual de fragmentos de ADN en geles de agarosa. Se le entregara un diagrama de corrida electrofortica. Medir la distancia de migracin de cada uno de los fragmentos de ADN del estndar al punto de origen y calcular el logaritmo del valor obtenido. Llenar la siguiente tabla con los datos. NOTA: Los tamaos de los fragmentos de DNA estndar sern entregados en el laboratorio. Distancia recorrida
Estandar 1 Estandar 2 Estandar 3 Estandar 4 Estandar 5 Estandar 6 Estandar 7 Estandar 8
Muestra de Inters 1 Muestra de Inters 2 Muestra de Inters 3

Pares de bases (pb)

Log pb

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Hacer una curva de calibracin para determinar el tamao del fragmento de DNA de inters. Para ello, graficar en el eje X, la distancia de migracin en el gel de agarosa de cada uno de los fragmento de DNA del estndar (en centmetros) versus (en el eje Y) el logaritmo del nmero de pares de bases (pb) de cada uno de los fragmentos de DNA del estndar (log pb). Determinar el tamao de los fragmentos DNA de inters. En el informe adjuntar una tabla con los datos experimentales obtenidos junto a la curva de calibracin realizada para determinar el tamao del fragmento de ADN.

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MATERIALES DNA plasmidial; estndar DNA. Agarosa Solucin TAE 1x: 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA Tampn de carga 6x: 30 % sacarosa; 0,25 % xylene cyanol; 0,25 % azul de bromo fenol. Solucin de bromuro de etidio (EtBr): 10 mg/ml (CANCERIGENO! Utilizar guantes de seguridad) Estndar de tamao molecular: Solucin que contiene fragmentos de ADN de diferentes tamaos que sirven para compararlos con una muestra problema que contiene fragmentos de ADN de tamaos desconocidos una vez realizada una electroforesis.