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Reis, Sonia Rolim Manual bsico de bioterismo / Sonia Rolim Reis, Antonia Maria Ramos Franco. --- Manaus : [s.n.], 2012. 47 p. : il. color. Elaborao Projeto Fronteiras: Alto Rio Negro; apoio FINEP, Financiadora de Estudos e Projetos. Inclui sugesto de referncias para leitura. ISBN: 1. Biotrios Medida de segurana. 2. Experncia com animais Medida de segurana. 4. Animais de laboratrio. 5. Biossegurana. 6. Biotica. I. Franco, Antonia Maria Ramos. II. Ttulo. CDD 19. ed. 636.0885

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Sonia Rolim Reis Antonia Maria Ramos Franco

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Agradecimentos
Homenagem

Deus! Aos nossos pais e esposos e aos nossos filhos, pela pacincia e dedicao, com muito amor e carinho.

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Sumrio
Introduo...........................................................................................................9 1. As barreiras sanitrias....................................................................................10 2. Espcies mais utilizadas em pesquisas........................................................10 3. Classificao dos animais quanto ao status sanitrio................................11 4. Fatores ambientais em um biotrio............................................................12 4.1. Temperatura...............................................................................................12 4.2. Umidade......................................................................................................12 4.3. Ventilao e renovao do ar...................................................................13 4.4. Luz e fotoperodo......................................................................................14 4.5. Rudo............................................................................................................14 4.6. Caixas e gaiolas...........................................................................................14 4.7. Cama das gaiolas........................................................................................15 4.8. Alimentao e gua...................................................................................16 4.9. Manejo e comportamento........................................................................16 4.10. Higiene e limpeza.....................................................................................17 5. Normas de segurana...................................................................................18 6. Eutanasia........................................................................................................19 Captulo I Das normas gerais......................................................................20 Captulo II Dos procedimentos..................................................................20 Captulo III Dos mtodos recomendados.................................................20 Anexo I..............................................................................................................22 Bibliografia.........................................................................................................25 Prtica de disseco de flebotomneos..........................................................29 Coleta de material para demonstrao direta do parasito...........................33 Prtica de colorao de lmina para diagnstico de leishmaniose............34 Colorao giemsa..............................................................................................36 Isolamento de parasitas em meio de cultura NNN agar sangue...............37 Sugesto de referncias....................................................................................39

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Introduo
Este manual descreve de modo sucinto os aspectos importantes na utilizao de animais de laboratrio. Aborda os parmetros fsicos, qumicos e biolgicos preconizados em biotrio de Experimentao Animal, bem como, as principais normas de biossegurana que devem ser empregadas. O livro proporciona o conhecimento das tcnicas e das necessidades bsicas no manejo de animais de laboratrio, enfocando, principalmente, a questo da tica, do bem-estar animal. Dessa forma, o manual, resultado da observao das necessidades principalmente quanto a boas prticas no manejo com animais de experimentao, oferece uma contribuio de grande relevncia, apresentando ao leitor os diversos aspectos do bioterismo no momento em que se verifica uma profunda mudana nos padres das pesquisas realizadas no Brasil. Literatura essencial para profissionais da rea, incluindo os de nvel tcnico e os ps-graduandos que fazem uso de animais de experimentao no desenvolvimento de suas pesquisas. O manejo adequado de animais de laboratrio implica na interao de diversos fatores sejam estes fsicos, qumicos, biolgicos e da responsabilidade e profissionalismo do bioterista. Biotrios so as instalaes capazes de produzir e manter espcies animais destinadas a servir como reagentes biolgicos em diversos tipos de ensaios controlados, para atender as necessidades dos programas de pesquisa, ensino, produo e controle de qualidade nas reas biomdicas, farmacolgicas e biotecnolgicas segundo a finalidade de cada Instituio. necessrio que os biotrios sejam construdos amparados em rgidos critrios de biossegurana e em tambm quanto sua organizao funcional, espacial, permitindo assim a criao ou a experimentao animal, dentro dos padres preconizados de higiene, assepsia e segurana, necessrios obteno ou a utilizao de diferentes espcies animais.

1. As Barreiras Sanitrias
As barreiras sanitrias so imprescindveis nos biotrios de Criao e Manuteno/Experimentao. So definidas como mecanismos fsicos, qumicos e biolgicos que dificultam ou minimizam os efeitos da interao entre agentes biolgicos de risco com o homem e o animal e que so necessrias de acordo com o grau de risco do agente envolvido. So exemplos de barreiras sanitrias: materiais utilizados na construo dos Biotrios (isolantes trmicos, impermeabilizantes), equipamentos para a filtrao de ar, autoclaves, higiene pessoal da equipe de funcionrios do setor e dos usurios de animais, presso diferencial entre ambientes, compostos qumicos utilizados em desinfeco e esterilizao, etc. O ambiente do biotrio requer cuidados rigorosos, pois os animais vivem em ambientes artificiais, recebem dieta padronizada e, na maioria dos experimentos, as doenas so artificialmente induzidas. Estes animais dependem totalmente do tcnico responsvel pelo biotrio para suprir suas necessidades nutricionais e pelo seu bem estar. Deve-se tambm obter apenas animais com padro sanitrio definido, adotando-se barreiras sanitrias eficientes no biotrio, para diminuir as chances de contaminao, pois isto poderia ocasionar doena ou morte destes animais propiciando falhas nos resultados das pesquisas. necessrio o monitoramento cuidadoso da sade dos animais e dos tcnicos a fim de se evitar doenas que podem ser transmitidas do homem para os animais e vice-versa. Quanto mais eficientes so as barreiras sanitrias dos biotrios, sejam estes de Criao ou Manuteno/Experimentao, menores as chances de contaminao dos animais e do homem.

2. Espcies mais utilizadas em pesquisa

As espcies mais utilizadas em pesquisas so:

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o o o o o o o o

Ces (Canis familiaris); Camundongos (Mus musculus domesticus); Cobaia ou porquinho-da-ndia (Cavia porcellus); Coelho (Oryctolagus cunicullus); Hamster chins (Cricetelus griseus); Hamster srio (Mesocricetus auratus); Macaco Rhesus (Macaca mulatta); e Rato (Rattus norvegicus).

3. Classificao dos Animais quanto ao Status Sanitrio

O manejo na criao e manuteno de animais de laboratrio pode ser atravs de tcnicas que resultaro em animais livres de qualquer forma de vida associada (vrus, bactrias, fungos, protozorios, helmintos, etc). De acordo com o status sanitrio que apresentam os animais de laboratrio estes podem ser classificados como: - Gnotobiticos Possuem uma microbiota associada conhecida. - Germ Free Animais totalmente isentos de germes. - Specific Patogen Free (SPF) Animais isentos de Agentes Patognicos Especficos. - Animais Convencionais Animais que possuem microbiota indefinida. Fatores como temperatura, umidade, ventilao e qualidade do ar, luz e rudo devem ser controlados o mximo possvel (Fig. 1).

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Figura 1. Sala de manuteno de animais de experimentao, mantidos em ambientes com climatizao controlada. Fonte: Marcel Frajblat, 2003

4. Fatores ambientais em um biotrio

4.1. Temperatura A temperatura ideal para quase todas as espcies de animais em biotrios de 21 C (3). Para evitar situaes de estresse trmico que levariam a queda da resposta imune dos animais e conseqentemente alteraes nos dados dos experimentos esses animais devem ser mantidos constantemente em sua zona de conforto trmico, o que implica no controle rigoroso da temperatura. 4.2. Umidade Umidade relativa do ar recomendada para a maioria dos animais de laboratrio de 55%( 15). A maioria dos animais de laboratrio apresenta sudorao insignificante e usa a taquipnia como mecanismo de adaptao frente ao calor. Assim, o excesso de umidade interfere na dissipao de calor destes animais.

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4.3. Ventilao e renovao do ar Os animais esto constantemente perdendo calor e umidade e eliminando CO2, alm de outros produtos resultantes de reaes metablicas. Os biotrios devem ter um mecanismo de renovao de ar, a fim de evitar o acmulo de substncias txicas nas salas. O uso de exaustores e condicionadores de ar , portanto, indispensvel. Em relao ao ambiente de trabalho, alguns odores animais so agressivos para seres humanos. Grande parte destes odores produzida pela decomposio bacteriana dos excrementos, porm no se devem usar produtos que os mascare, pois, podem ser extremamente nocivos aos animais. Esses odores devem ser controlados por procedimentos rotineiros de limpeza e ventilao adequados. As pessoas que trabalham nestes ambientes obrigatoriamente devem usar mscaras. O mais comum e mais srio dos contaminantes ambientais dos biotrios o amonaco (NH3), que se forma pela ao das bactrias (urease positiva) sobre os excrementos. A concentrao do amonaco influenciada por muitos fatores, como: ventilao, umidade relativa, nmero de animais por gaiola, alimentao, etc. Atualmente existem sistemas de estantes que comportam certo nmero de animais e gaiolas em um ambiente ventilado e climatizado (Fig.2).

Estantes ventiladas

Figura 2. Tipo de estante ventilada e climatizada. Fonte: Marcel Frajblat,2003

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4.4. Luz e fotoperodo A intensidade luminosa e o foto perodo influenciam o metabolismo e o ciclo estral dos animais, alterando suas respostas biolgicas. O fotoperodo consiste na quantidade de luz que estes animais recebero durante o dia (10h, 12h, etc.).Recomenda-se o isolamento total do biotrio em relao luz natural, permitindo o controle da intensidade luminosa e do fotoperodo. Deve-se preferir o uso de luzes fluorescentes brancas, em virtude de menor emisso de calor. A intensidade luminosa no deve ultrapassar a 300 Lux, na sala, a um metro do cho, e, o interior das gaiolas, no deve exceder a 60 Lux. Outras variveis devem ser consideradas, como a luminosidade dentro das gaiolas, uma vez que, como estas esto dispostas em prateleiras, gaiolas das prateleiras superiores tendem a receber mais luz do que as situadas nas prateleiras inferiores.

4.5. Rudo O rudo um fator de grande influncia sobre o bem estar dos animais de biotrio, principalmente considerando-se que os ouvidos dos roedores possuem a capacidade de escutar freqncias mais altas (ultrassons), inaudveis pelos ouvidos humanos. Frente a sinais de estresse dos animais, deve-se verificar se h alguma fonte de rudo (por exemplo, um equipamento que possa estar emitindo ultrassons) que esteja perturbando os animais, mas que no seja perceptvel pelo tratador.Notar tambm que rudos contnuos so menos estressantes do que um rudo repentino. Alguns autores recomendam o uso de msica para minimizar o estresse por rudo. recomendado rudo com at cerca de 45 Db (decibis).

4.6. Caixas e gaiolas Existem vrios modelos de dimenses variadas e de gaiolas e caixas (Tab. 1) que so utilizadas para a manuteno de animais em biotrios, sendo mais indicadas as de policarbonato ou polipropileno, por serem

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autoclavveis (Fig. 3). As gaiolas devem ser periodicamente higienizadas e autoclavadas.

Figura 3. Gaiola para camundongos Fonte:www insightltda.com.br

Tabela 1. Nmero de animais por caixa, para as principais espcies de laboratrio.

espcie cob aias co elhos ratos e hamsters camundongos peso(gr) largura 250-300 4000 150-200 20 20-35 45 20-35 20-30 dimenses (cm) profundidade 30-50 60 30-50 30-45 altura 20-20 40 20-20 12-12 1-4 1 3-10 10-20 n de animai s

Fonte: LUCA et al, 1996.

4.7. Cama das gaiolas Os materiais que podem ser utilizados so: vermiculita e a palha de arroz, contudo, o mais adequado a maravalha (serragem grossa) de Pinus.A serragem esterilizada por autoclavagem a mais indicada, e deve ser trocada regularmente. Seu descarte deve ocorrer em sacos plsticos fechados, com o status de lixo contaminado, recolhido por servio especial de coleta.

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a) Filete de maravalha de 2 cm ( ratos )

b) Filete de maravalha de 3 cm (camundongos)

Figura 4. Gaiolas com dois tipos de cama diferentes. Fonte: Marcel Frajblat, 2003

4.8. Alimentao e gua A dieta deve atender os requisitos nutricionais de cada espcie, tanto quantitativa quanto qualitativamente. Geralmente as raes comerciais de animais de laboratrio so apresentadas em pellets, pois a maioria dos animais necessita estar roendo diariamente para desgastar os dentes. Ratos e camundongos se alimentam da mesma rao. Dietas so normalmente superestimadas (Protena: 140-227 g/kg). Ter cuidado na estocagem da rao para no haver contaminao por fungos, bactria, insetos etc. Ela deve estar armazenada em local limpo, seco e ventilado. A gua oferecida em bebedouros ou atravs de sistema automtico usando vlvulas. Os bebedouros devem ser lavados e autoclavados. A gua filtrada e tratada, podendo ser esterilizada com a adio de 01 mL/ litro de cido clordrico.

4.9. Manejo e comportamento necessrio submeter os animais climatizao padronizada para que eles se habituem ao ambiente que sero criados e mantenham sua ho-

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meostase. Os tcnicos que trabalham em biotrio devem estar treinados para que se habituem a observar os animais e anotarem qualquer alterao comportamental.Os animais de laboratrio conhecem o seu tratador pelo odor e se estressam menos quando manipulados por tratadores com quem j tenham tido contato anterior. No recomendado trocar o pesquisador/ tcnico durante o experimento, pois isto pode alterar o metabolismo devido ao estresse dos animais. Tambm comprovado que pessoas estranhas na sala de experimentao podem resultar em um aumento de temperatura corprea do animal por estresse. Esse cuidado de especial importncia quando um experimento est sendo realizado.

4.10. Higiene e limpeza A eficincia de qualquer procedimento de limpeza depende do zelo do executor. A higiene pessoal constitui uma importante barreira contra infeces. O hbito de lavar as mos antes e aps manipular qualquer animal, reduz o risco de disseminar doenas, bem como o de auto-infeco. obrigatrio o uso de luvas para qualquer procedimento nos biotrios (criao e experimentao). Ao manipular agentes patognicos, em biotrios experimentais, utilizar luva dupla. Uniforme completo (Jaleco de mangas compridas e longo, cala exclusiva para uso no biotrio, mscara, gorro, pantufas, etc). Aventais, jalecos ou uniformes so vestimentas de proteo usada nas reas de animais, devendo ser retiradas antes de sair do ambiente. As roupas de laboratrio usadas em reas de risco devem ser autoclavadas antes de serem lavadas. O material descartado (proveniente de necrpsia, carcaas de animais infectados, etc) deve ser identificado e autoclavado. Se possvel incinerado. Equipamentos e superfcies de trabalho devem ser descontaminadas com desinfetante apropriado, em uma rotina bsica, aps o trmino do trabalho com materiais infecciosos e especialmente aps derrame, gotejamento ou outra forma de contaminao com material infeccioso. importante conhecer as caractersticas das substncias

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empregadas na higienizao para que seja eficaz e segura. Ler com ateno o modo de utilizao de cada desinfetante. Utilizar a dose recomendada pelo fabricante.

5. Normas de biossegurana
Todos os bioteristas ou estudantes/pesquisadores que trabalham com animais infectados ou no devem ter treinamentos especficos e serem informados sobre todos os riscos a que esto sujeitos, bem como as maneiras de se proteger e evit-los. Fumar, comer ou beber no permitido dentro dos biotrios ou em qualquer outra rea em que existam microorganismos patognicos. Gabinetes de fluxo laminar, contenes fsicas e/ou equipamentos de proteo individual (respiradouros, mscaras faciais) devem ser usados sempre que procedimentos com alto potencial de formao de aerossis so realizados. Qualquer ferimento na pele do tcnico, ou estudante, ou pessoal de apoio, deve ser devidamente protegido antes de se iniciar a manipulao de animais e agentes patognicos. Se agentes altamente infecciosos ou nocivos so usados, o animal deve ser isolado em unidade de fluxo laminar ou mesmo em isoladores, nos quais o ar que entra e sai convenientemente filtrado, atravs de filtros absolutos. Necrpsias de animais infectados com organismos altamente contagiosos devem ser feitas em gabinetes ventilados, que permitam a filtragem do ar. Avaliao sorolgica peridica do pessoal, considerando o agente de risco. O acesso para estudantes, pesquisadores, visitantes dever ser limitado ao horrio em que os bioteristas estiverem presentes. Os biotrios devem ter um programa de segurana que inclui equi-

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pamentos de combate a incndio, instrues para o uso correto de equipamentos e treinamento de primeiros socorros. Tabela 2. Nveis de Biossegurana recomendados no uso de animais infectados.
Nvel de biossegurana 1. Baixo risco individual e comunitrio. 2. Moderado risco individual e comunitrio podendo causar patologias ao homem ou ao animal. Prticas e tcnicas Manejo padro para colnias conven cionais Uso obrigatrio d e jaleco e luvas, descontaminao dos dejetos infectados e das gaiolas dos animais antes da higienizao, acesso limitado e sinalizao p ara alerta de riscos. Prticas do nvel 2, mais: uniforme especial e acesso controlado Prtica do nvel 3, mais: tro ca de roupa de rua por uniforme especial em vestirio, du cha n a sada, descontaminao de todos os dejetos antes de sua retirada do infectrio. Barreira p arcial (guich de desinfeco), uso de EPIs (mscara, culos protetor, etc.) para a manipulao de agentes ou animais infectados que p roduzem aerossis. Equipamentos de segurana Instalaes Bsicas

Bsicas

3. Risco individual elevado, risco comunitrio baixo 4. Elevado risco individual e comunitrio

Os do nvel 2, porm, devem ser usados para todos os tipos de manipulaes com Alta seguran a animais infectados. Barreiras mximas, isto , classe III de seguran a biolgica ou barreira p arcial em Seguran a combinao com: Proteo total do mxima co rpo com uma pea nica dotada de ventilao e presso positiva, gaiolas dotadas de filtros, estantes com fluxo laminar, etc

imprescindvel a notificao IMEDIATA de possveis acidentes que venham ocorrer nos biotrios.

6.Eutansia
Define-se como eutansia a morte serena, sem dor ou sofrimento. Aps a realizao dos experimentos os animais envolvidos devem ser submetidos eutansia, no entanto, eles no optaram por morrer e no tem conscincia que vo morrer. A eutansia um procedimento emocional e tico que deve ser executado por um mdico veterinrio segundo resoluo do Conselho Federal de Medicina Veterinria n 714, de 20 de junho de 2002. Os pontos mais importantes da resoluo esto descritos abaixo:

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CAPTULO I DAS NORMAS GERAIS Art. 2 A eutansia deve ser indicada quando o bem-estar do animal estiver ameaado, sendo um meio de eliminar a dor, o estresse ou o sofrimento dos animais, os quais no podem ser aliviados por meio de analgsicos, de sedativos ou de outros tratamentos, ou, ainda, quando o animal constituir ameaa sade pblica ou animal, ou for objeto de ensino ou pesquisa. Pargrafo nico. obrigatria a participao do Mdico Veterinrio como responsvel pela eutansia em todas as pesquisas que envolvam animais.

CAPTULO II DOS PROCEDIMENTOS Art. 8 A escolha do mtodo depender da espcie animal envolvida, dos meios disponveis para a conteno dos animais, da habilidade tcnica do executor, do nmero de animais e, no caso de experimentao animal, do protocolo de estudo, devendo ainda o mtodo ser: I - compatvel com os fins desejados; II - seguro para quem o executa, causando o mnimo de estresse no operador, no observador e noanimal; III - realizado com o maior grau de confiabilidade possvel, comprovando-se sempre a morte do animal, com a declarao do bito pelo Mdico Veterinrio. Art. 10. Os procedimentos de eutansia so de exclusiva responsabilidade do mdico veterinrio. Art. 11. Nas situaes em que o objeto da eutansia for o ovo embrionado, a morte do embrio dever ser comprovada antes da manipulao ou eliminao do mesmo.

CAPTULO III DOS MTODOS RECOMENDADOS Art. 12. Os agentes e mtodos de eutansia, recomendados e aceitos sob

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restrio encontram-se listados, por espcie, no anexo I. 1 Mtodos recomendados so aqueles que produzem consistentemente uma morte humanitria, quando usados como mtodos nicos de eutansia. 2 Mtodos aceitos sob restrio so aqueles que, por sua natureza tcnica ou por possurem um maior potencial de erro por parte do executor ou por apresentarem problemas de segurana, podem no produzir consistentemente uma morte humanitria, ou ainda por se constiturem em mtodos no bem documentados na literatura cientfica. Tais mtodos devem ser empregados somente diante da total impossibilidade do uso dos mtodos recomendados constantes do anexo I desta Resoluo. Art. 13. Outros mtodos de eutansia no contemplados no ANEXO I podero ser permitidos, desde que realizados sob autorizao do CRMV ou CFMV. Art. 14. So considerados mtodos inaceitveis: I - Embolia Gasosa; II - Traumatismo Craniano; III - Incinerao in vivo; IV - Hidrato de Cloral (para pequenos animais); V - Clorofrmio; VI - Gs Ciandrico e Cianuretos; VII - Descompresso; VIII - Afogamento; IX - Exsanguinao (sem sedao prvia); X - Imerso em Formol; XI - Bloqueadores Neuromusculares (uso isolado de nicotina, sulfato de magnsio, cloreto de potssio e todos os curarizantes); XII - Estricnina. Pargrafo nico. A utilizao dos mtodos deste artigo constitui-se em infrao tica.

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Art. 15. Esta Resoluo entra em vigor na data de sua publicao, revogadas as disposies em contrrio. Anexo I:
Espcie Aceitos sob Restrio Recomendados Barbitricos, anestsicos inalveis (em algumas espcies), Dixido de Pistola de ar comprimido, Carbono (CO), Monxido de Carbono (CO), metano sulfonato de pistola, atordoamento e decapitao, decapitao tricana (TMS, MS222), e seco da medula hidrocloreto de benzocana, dupla espinhal. seco da medula espinhal.

Anfbios

Animais selvagens de vida livre

Barbitricos intra-venoso (IV) ou intra-peritonais (IP), anestsicos inalveis, cloreto de potssio com anestesia geral prvia.

CO, CO, Nitrognio (N ), argnio, pistola de ar comprimido, pistola, armadilhas (testadas cientificamente)

Animais de zoolgicos

Barbitricos, anestsicos inalveis, CO, CO, cloreto de potssio com anestesia geral prvia.

N, argnio, pistola de ar comprimido, pistola.

Aves

Barbitricos, anestsicos inalveis, N, argnio, deslocamento CO, CO, pistola. cervical, decapitao. Barbitricos, anestsicos inalveis, CO, CO, cloreto de potssio com anestesia geral prvia. N, argnio, pistola de ar comprimido, eletrocusso com sedao prvia. Hidrato cloral, (IV, aps sedao), pistola, eletrocusso com sedao prvia.

Ces

Cavalos
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Barbitricos, cloreto de potssio com anestesia geral prvia, pistola de ar comprimido.

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Cavalos

Barbitricos, cloreto de potssio com anestesia geral prvia, pistola de ar comprimido.

Hidrato cloral, (IV, aps sedao), pistola, eletrocusso com sedao prvia.

Coelhos

Barbitricos, anestsicos inalveis, N , argnio, deslocamento CO, CO, cloreto de potssio com cervical (<1kg), anestesia geral prvia. decapitao, pistola de ar comprimido. Barbitricos, anestsicos inalveis, CO, CO, cloreto de potssio com anestesia geral prvia.

Gatos

N, argnio.

Mamferos marinhos

Barbitricos, hidrocloreto de etorfina.

Pistola (cetceos <4m de comprimento)

Peixes

Barbitricos, anestsicos inalveis, CO, tricana metano sulfonato (TMS, MS222), hidrocloreto de benzocana, 2-fenoxietanol.

Decapitao e seco da medula espinhal, atordoamento e decapitao ou seco da medula espinhal. Anestsicos inalveis, CO, CO, N, argnio.

Primatas nohumanos

Barbitricos

Rpteis

Barbitricos, anestsicos inalveis (em algumas espcies), CO (em algumas espcies).

Pistola de ar comprimido, pistola, decapitao e seco da medula espinhal, atordoamento e decapitao Metoxiflurano, N , argnio, deslocamento cervical (ratos <200g), decapitao.

Roedores e Barbitricos, anestsicos inalveis, outros pequenos CO, cloreto de potssio com mamferos anestesia geral prvia.

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Roedores e outros pequenos mamferos

Barbitricos, anestsicos inalveis, CO, cloreto de potssio com anestesia geral prvia.

Metoxiflurano, N , argnio, deslocamento cervical (ratos <200g), decapitao. Hidrato cloral (IV, aps sedao), pistola, eletrocusso, com sedao prvia.

Ruminantes

Barbitricos,CO, cloreto de potssio com anestesia geral prvia, pistola de ar comprimido.

Sunos

Barbitricos, CO,CO, cloreto de potssio com anestesia geral prvia, pistola de ar comprimido.

Anestsicos inalveis, CO, hidrato cloral, (IV aps sedao), pistola, eletrocusso com sedao prvia, pancada na cabea (< 3 semanas de idade).

Vises, raposas, e outros mamferos criados para extrao do plo.

Barbitricos, anestsicos inalveis, CO (vises requerem altas concentraes para eutansia sem agentes suplementares), CO, cloreto de potssio, com anestesia geral prvia.

N, argnio, eletrocusso, com sedao prvia seguida de deslocamento cervical.

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Bibliografia:
Animais de Laboratrio Criao e Experimentao- Antenor Andrade et al, 2002 Ed Fiocruz Biossegurana em Experimentao animal Um enfoque microbiolgico Jonas Borges da Silva. 1998. CECAL - Centro de Criao de Animais de Laboratrio da Fundao Oswaldo Cruz - http://www.fiocruz.br/cecal/Bioterismo.htm CEDEME - Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia da Universidade Federal de So Paulo - http://www. unifesp.br/mapageral.htm Manual para experimentao animal Tnia Arajo Jorge e Solange Lisboa de Castro 2000 Ed.Fiocruz. Procedimento Operacional N 340000.014 /CECAL/FIOCRUZ Biossegurana em Biotrio. Revista do Conselho Federal de Medicina Veterinria. Braslia, DF. Ed. CFMV, 2003. WWW.http://bioclima.info/pbioterio.php acesso realizado em 12/06/2010.

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Armadilha luminosa do tipo CDC

Paralelamente sero realizadas capturas manuais (capturador de Castro ou aspiradores eltricos de 6 Volts) onde sero realizadas buscas ativas dos vetores nas paredes externa e interna dos domiclios com o auxilio de uma lanterna, essas coletas sero realizadas tambm mensalmente em cada rea de risco, com inicio s 18h e encerradas s 22h, totalizando 4 h / homem/ parede externa ou interna.

Identificao dos vetores coletados A identificao do material ser realizada da seguinte forma: Pelos municpios ou regies que possurem ncleo de entomologia, equipado e com funcionrios devidamente treinados pelos ncleos de referncia. As amostras coletadas sero enviadas para os laboratrios referencias, durante o primeiro ano de trabalho em cada municpio. A partir do segundo ano, credenciar cada municpio para identificar 50 % das amostras coletadas. Pelos ncleos de referncia, quando o municpio ou regio no possuir equipe capacitada para identificao.

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Metodologia Os flebtomos coletados podem ser sacrificados atravs de diversos meios: lcool 70 % , gelo seco, clorofrmio ou cianureto (morteiros) ou aquecendo em luz solar direta . Os exemplares sacrificados com morteiros e luz solar devero ser armazenados entre capas de papel de seda em pequenos recipientes com tampa. Diversos mtodos de montagens de flebtomos esto disponveis em diversas referncias relacionadas ao assunto (Forattini, 1974; Ryan e cols. , 1986; Young e col. 1994) . Descrevemos aqui o mtodo de montagem em Berlese.

Mtodo de Berlese (Hoyer modificado): 1-3 h em Potassa 10 % (KOH) 2- 20 minutos em cido actico 10 % 3 3 sries de 20 minutos em gua destilada 4 - 24 h em Lactofenol 5 - Montagem em Berlese (Lmina e lamnula)

Formulaes: Lactofenol - Fenol cristalizado(100 mg), cido ltico (100 ml), Glicerina (100 ml) e gua destilada (100 ml).

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 Berlese - Goma arbica (08g) , hidrato de cloral (74g) , xarope de glicose (5 ml) e gua destilada (10 ml), acido actico (3ml) . Todos estes ingredientes so misturados e aquecidos sem deixar a soluo ferver . Manter o Berlese em frasco mbar.

Metodologia de Dissecao:

Introduzir o tubo contendo fmeas de flebtomos vivas no congelador, por um perodo de 10 minutos, para imobilizao dos exemplares.A seguir, colocar um exemplar sobre uma lmina de microscopia, ao lado de uma gota de salina estril, e o conjunto visualizado em lupa estereoscpica. Com o auxlio de um estilete de ponta recurvada (ngulo de 90), fixar a cabea do inseto contra a lmina e com outro estilete pressionar levemente o penltimo segmento do abdmen, retesando em direo ao centro da gota de salina, de modo a extrair o estomago anterior e posterior, intestino e tbulos de Malpighi. O conjunto arrumado sobre a lmina, de modo que, do pr-ventriculo ampola retal sejam claramente visveis. Por ltimo, cobrir o conjunto com lamnula e examinar sob microscopia comum (aumento de 400 vezes). Tambm pode ser realizado da seguinte forma: Para examinar Lutzomyia suspeitos de estar com Leishmania, pode-

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mos ter mais dois procedimentos: a. dissecao: o inseto vivo deve ser imobilizado em salina ou no frio (colocando-o por alguns minutos no congelador) logo antes do exame; coloc-lo em uma Imina com salina, sob uma lupa e, com o auxlio de estilete, decapitar o inseto, puxando pelo pescoo as glndulas salivares e o contedo intestinal; ao microscpio (40x) pode - se ver as promastgotas movimentando-se; com o material pode-se fazer um esfregao, fixar pelo lcool metlico e corar pelo Giemsa; b.triturao: imobilizar os insetos como citado antes e colocar alguns (trs a cinco) no buraquinho de placa de ELISA contendo um pouco de salina; com um basto de vidro, triturar o material, que poder ser examinado em microscpio a fresco, fixado e corado pelo Giemsa ou inoculado em focinho ou cavidade peritoneal de hamster.

PRTICA DE DISSECO DE FLEBOTOMNEOS

1. FINALIDADE
Preparo de Lminas de abdomem e intestino de fmea de flabotomneos para identificao da espcie de inseto e procura de promastigotas de Leishmania.

2. AMOSTRA
As amostras usadas sero coletadas em base de rvore com armadilha de luz do tipo CDC modificada para aspirao.

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3. MATERIAIS NECESSRIOS
Lmina de vidro. Lamnulas. Salina Estiletes. Recipiente pequeno com gua e detergente Estereoscpio

4. PROCEDIMENTO TCNICO
1. Coloca-se os insetos coletados dentro do recipiente com detergente para a retirada do excesso de cerdas; 2. Transfere-se o inseto individualmente para o centro da lmina contendo uma gota de salina; 3. Observa-se o material em estereoscpio e com o estilete retira-se o final do abdmen da fmea ou do macho e transfere-se para outra lmina colocando-se uma gota de xilol para clarificar o material para a observao do aparelho genital; 4. Do restante do abdmen com muito cuidado retira-se o intestino utilizando-se o estilete e transfere-se o material para outra lmina contendo uma gota de salina; 5. Coloca-se uma lamnula sobre o material e observa-se em microscpio de luz em aumento de 100X e 400X para a pesquisa de flagelados.

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Ciclo biolgico de um flebtomo. A) ovo; b) larva de primeiro instar; c) larva de quarto instar; d)pupa.

Aspectos morfolgicos de Lutzomyia longipalpis: a) cabea do macho; b) cabea da fmea; c) asa; d) armadura cibarial e faringe da fmea; e) espermateca da fmea; f) genitlia do macho

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Doena Clnica

Espcies de Leishmania

Posio Geogrfica Velho Mundo

Complexo L. tropica L. tropica L. aethiopica L. major Complexo L. mexicana L. mexicana L. pifanoi L. amazonensis L. garnhami Leishmaniose cutnea L. venezuelensis Complexo L. braziliensis* L. peruviana L. guyanensis L. panamensis L. lainsoni L. colombiensis L. infantum L.chagasi Complexo L. braziliensis* L. braziliensis L. guyanensis L. panamensis L. mexicana L. tropica L. major Complexo L. donovani L. donovani L. infantum L. chagasi L. tropica L.amazonensis

Novo Mundo

Velho Mundo

Novo Mundo Novo Mundo Novo Mundo Novo Mundo Velho Mundo

Leishmaniose

Leishmaniose visceral

Velho Mundo Velho Mundo Novo Mundo Velho Mundo Novo Mundo

Os membros do complexo L. braziliensis so considerados como um subgnero, Viannia, separado de todas as outras Leishmania, que pertencem ao subgnero Leishmania. Os organismos do complexo L. braziliensis desenvolvem-se no intestino posterior do flebotomneo (peripilria). Os do sub-gnero Leishmania desenvolvem-se na regio anterior do flebotomneo (suprapilria).
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COLETA DE MATERIAL PARA DEMONSTRAO DIRETA DO PARASITO:

Visando obter uma amostra vivel para um diagnstico confivel, alguns cuidados so necessrios: o primeiro deles o preparo do local de onde ser coletado o material (lceras recentes so mais ricas em parasitos). Deve ser feita uma limpeza vigorosa do local da leso com gua e sabo, retirando-se resduos de medicamentos ou outras substncias, seguida de antissepsia com lcool a 70%. Quando necessrio, pode-se fazer um pequeno boto anestsico com lidocana 1 ou 2%.

PROCEDIMENTO TCNICO

O esfregao realizado por escarificao da borda interna da lcera ou da superfcie de leso fechada, utilizando-se lminas de bisturi estreis ou estilete. A puno aspirativa pode ser realizada aps injeo de 3mL de soluo salina estril na borda da leso ou linfonodo, utilizando-se uma seringa de 5mL e agulha 25x8. Aps a exciso cirrgica, a tcnica de aposio em lmina (tambm denominada imprint ou touch preparation) pode ser realizada por meio da delicada compresso de fragmento de tecido, obtido por bipsia, sobre uma lmina de vidro. Uma boa execuo da tcnica requer que o fragmento seja previamente banhado em soluo salina estril e o excesso de sangue e lquidos absorvidos em gaze ou papel de filtro. O material obtido por qualquer das tcnicas deve ser distendido em lminas de microscopia previamente limpas, desengorduradas e secas. Se possvel, empregar lminas de borda fosca para melhor identificao do material.

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Aps a confeco do esfregao, as lminas sero coradas com derivados do Romanowsky: Giemsa, Leishman ou corantes rpidos (este ltimo ainda visto com algumas restries por alguns cientistas) e Escarificao da borda de leso cutnea, localizada no membro superior, com lmina de bisturi e confeco do esfregao em lmina de vidro.

PRTICA DE COLORAAO DE LMINA PARA O DIAGNTICO DE LEISHMANIOSE

PANTICO RPIDO LB

1. FINALIDADE
Colorao de material de leso para a visualizao de amastigotas

2. INTRODUO
O Pantico Rpido LB baseia-se no princpio de colorao hematolgica estabelecida por Romanowsky, atuando em 15 segundos.

3. AMOSTRA
A amostra usada consiste em lminas com extenses de material retirado da borda das leses. O material submetida a ao de um fixador e duas solues corantes, por meio de imerses de 5 segundos em cada, e ao final da ltima

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imerso encontra-se pronta para leitura.

4. REAGENTES
- Pantico rpido n 1: compe-se por uma soluo de triarilmetano a 0,1%. 0,1% 0,1% - Pantico rpido n 2: compe-se por uma soluo de xantenos a - Pantico rpido n 3: compe-se por uma soluo de tiazinas a

5. PROCEDIMENTO TCNICO
a) Preparar as extenses sangneas e deixar secar em temperatura ambiente; b) Preencher 3 recipientes com as solues nmero 1, 2 e 3 respectivamente; c) Submergir as lminas na soluo nmero 1 mantendo-se um movimento contnuo de cima para baixo ou para os lados durante 5 segundos (5 imerses de 1 segundo cada) e deixar escorrer bem; d) Submergir as lminas na soluo nmero 2 mantendo-se um movimento contnuo de cima para baixo ou para os lados durante 5 segundos (5 imerses de 1 segundo cada) e deixar escorrer; e) Submergir as lminas na soluo nmero 3 mantendo-se um movimento contnuo de cima para baixo ou para os lados durante 5 segundos (5 imerses de 1 segundo cada) e deixar escorrer bem; f) Lavar com gua deionizada recente (de preferncia tamponada a pH 7,0), secar ao ar na posio vertical e com o final da extenso voltado para cima.

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COLORAO GIEMSA

1. FINALIDADE
Colorao de material de leso para a visualizao de amastigotas

2. PRINCPIO
Os corantes para esfregaos sanguneos, tambm chamados de pancrmicos, so uma mistura de corantes de caractersticas neutras, dependentes do pH da soluo corante, que em condies apropriadas coram os componentes nucleares e citoplasmticos dos leuccitos, com predominncia de tons vermelhos (quando cidos) e azulados diversos (quando bsicos).

3. AMOSTRA
A amostra usada consiste em lminas com extenses de material retirado da borda das leses.

4. REAGENTES
Corante Giemsa, em p Glicerol Metanol (tamponado pH 6,8) q.s.p. 8g 500mL 1000mL

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5. MATERIAIS NECESSRIOS
Suporte para colorao. Cronmetro. Lminas. gua tamponada. Metanol.

5. PROCEDIMENTO TCNICO
a) Fixar o esfregao, cobrindo-o com 15 a 20 gotas de metanol por 5 minutos. b) Escorrer o lcool metlico e, sem lavar ou deixar secar. c) Cobrir a lmina com soluo de uso de Giemsa diludo (2 gotas de soluo me para 1mL de gua tamponada). d) Proceder colorao por 10 minutos. e) Lavar a lmina em gua corrente e deix-la secar em posio vertical.

ISOLAMENTO DE PARASITAS EM MEIO DE CULTURA NNN AGAR SANGUE

1. FINALIDADE
Isolar parasitas de insetos em meio especfico para estudo e diagnstico

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2. AMOSTRA
dos A amostra usada ser retirada de fmeas de flebotomneos infecta-

3. MATERIAIS NECESSRIOS
Meio de cultura NNN Agar sangue Estilete estril .

4. PROCEDIMENTO TCNICO
a) Aps a leitura da lmina positiva o intestino retirado com um estilete e transferido para tubo de ensaio com meio NNN. b) O tubo ento fechado e colocado em estufa de BOD a temperatura de 24 oC.

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SUGESTO DE REFERNCIAS
Ryan KJ; Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed.). McGraw Hill. pp.74954. ISBN0838585299. Myler P; Fasel N (editors). (2008). Leishmania: After The Genome. Caister Academic Press. ISBN978-1-904455-28-8. Momen H, Cupolillo E (2000). Speculations on the origin and evolution of the genus Leishmania. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 95 (4): 5838. doi:10.1590/S0074-02762000000400023. PMID10904419. Noyes HA, Morrison DA, Chance ML, Ellis JT (2000). Evidence for a neotropical origin of Leishmania. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 95 (4): 5758. doi:10.1590/S0074-02762000000400021. PMID10904417. Kerr SF (2000). Palaearctic origin of Leishmania. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 95 (1): 7580. doi:10.1590/S0074-02762000000100011. PMID10656708. Leishmania mexicana / Leishmania major Laskay T. et al.. (2003). Neutrophil granulocytes Trojan horses for Leishmania major and other intracellular microbes?. Trends in Microbiology 11 (5): 2104. doi:10.1016/S0966-842X(03)00075-1. PMID12781523. www.pdhealth.mil/downloads/Leish_brfng.ppt http://en.wikipedia.org/wiki/Leishmania acesso em 9/07/2010 http://pt.wikipedia.org/wiki/Leishmaniose Akopyants, N. et al. Science 324, 265268 (2009). Panton, L. J., Tesh, R. B., Nadeau, K. C. & Beverley, S. M. J. Protozool. 38, 224228 (1991) Miles, M. A., Yeo, M. & Mauricio, I. L. Science 324, 187189 (2009) Akopyants NA et al. Demonstrao de troca de material gentico durante o desenvolvimento cclico de Leishmania em flebotomneos . Ci

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Apoio Financeiro:

Universal proc. No. 2108354408954041

Laboratrio de Leishmaniose e Doena de Chagas/INPA Secretaria de Sade do Estado do Amazonas (SUSAM) Fundao Nacional de Sade Escola Agrotcnica de So Gabriel da Cachoeira Exrcito Brasileiro

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