Deteccin de qurum reguladores de la virulencia de la expresin gnica en Vibrio cholerae

1. 2. 3. 4. 5. 6. Jun Zhu * , Melissa B. Miller , Russell E. Vance * , Michelle Dziejman *, Bonnie L. Bassler , y John J. Mekalanos * +Afiliaciones de los autores 1. * Departamento de Microbiologa y Gentica Molecular, Escuela Mdica de Harvard, 200 Longwood Avenue, Boston, MA 02115, y Departamento de Biologa Molecular, Universidad de Princeton, Princeton, NJ 08544-1014
1. Escrito por John J. Mekalanos

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Abstracto
La produccin de factores de virulencia como la toxina del clera y el pilus coregulated toxinas en el ser humano patgeno Vibrio cholerae est fuertemente influenciada por las condiciones ambientales. La seal bien caracterizados toxR cascada de transduccin es el responsable de la deteccin y la integracin de la informacin ambiental y el control del reguln de virulencia. Mostramos aqu que, adems de los componentes conocidos del circuito toxR de sealizacin, deteccin de qurum reguladores estn implicados en la regulacin de la V.cholerae virulencia. Nos centramos en el Luxo reguladores y HapR porque homlogos de estos qurum de control de dos protenas de deteccin en la estrecha relacin luminosa marina bacteria Vibrio harveyi . El uso de un modelo de ratn lactante, se encontr que un luxo mutante se presentan graves carencias en la colonizacin del intestino delgado. Arreglos de genes se utiliza para la transcripcin de perfil en el V. cholerae tipo salvaje y el luxo mutante. Estos estudios revelaron que el reguln toxR se reprime en el luxo mutante, y que este efecto es mediado por otro regulador negativo, HapR. Se demuestra que Luxo reprime hapR expresin temprana en el crecimiento de log-fase, y la expresin constitutiva de hapR bloques toxR-regulon expresin. Adems, Luxo y HapR regulan una variedad de otros procesos celulares, incluyendo la motilidad, la produccin de la proteasa, y la formacin de biofilm. En conjunto, estos datos sugieren un papel para la deteccin de qurum en la modulacin de la expresin de los bloques de genes de virulencia de manera recproca en vivo . Los Gram-negative bacteria Vibrio cholerae por lo general habita en ambientes acuticos naturales, pero es mejor conocido como el agente causante del clera, una diarrea severa ( 1 ). Dos factores son fundamentales para V. choleraevirulencia del clera enterotoxina (CT) y un factor de colonizacin intestinal conocida como pilus toxinas coregulated (TCP). Mal caracterizado las seales ambientales influyen en la expresin de la TC y TCP en vivo ( 2 ). Dos protenas sensoriales, toxR y TCPP, probablemente juegan un papel en la deteccin de las seales del medio ambiente, a continuacin, iniciar una cascada de transduccin de seales que promueve la expresin de ToxT, que a su vez, activa directamente la transcripcin de genes implicados en la expresin de TCP y TC ( 3 ). Trabajos recientes han demostrado que muchas especies de bacterias controlar su poblacin de clulas densidades a travs del intercambio de molculas de sealizacin qumica (llamada autoinductores) que se acumulan extracelular y alteraciones en el comportamiento de disparo a alta densidad de poblacin. Este fenmeno es conocido como quorum sensing ( 4 , 5 ). La deteccin de qurum controla los procesos que incluyen la bioluminiscencia, la virulencia, la formacin de biopelculas, y la esporulacin en diferentes especies bacterianas. En general, la deteccin de qurum regula los procesos que son efectivos slo cuando una poblacin de bacterias acta de forma coordinada, pero no cuando las bacterias actan como individuos. Bacterias Gram-negativas suelen utilizar acil-homoserina lactonas como autoinductores ( 5 , 6 ), mientras que las bacterias Gram positivas suelen utilizar oligopptidos modificados como las seales de comunicacin ( 5 - 7 ). Un vnculo entre la deteccin de qurum y la virulencia se ha establecido slo para unos pocos patgenos bacterianos, especialmentePseudomonas aeruginosa ( 8 ) y Staphylococcus aureus ( 9 ). La bacteria marina Vibrio harveyi utiliza un complicado sistema de deteccin de qurum para regular la bioluminiscencia y otros fenotipos ( 10 ) . V. harveyiproduce dos autoinductores, un autoinductor homoserina lactona (AI-1) y un segundo de deteccin de qurum autoinductor (AI-2) que se ha descubierto recientemente que un dister de borato ( 11 , 12 ). Deteccin y respuesta a la IA-1 y AI-2 se produce en paralelo a travs de dos circuitos de dos componentes de transduccin de seales ( 10 , 13 , 14 ), y un regulador de respuesta compartida llamada Luxo integra la informacin de estos dos circuitos ( 15 ). Luxo regula negativamente la expresin de la luminiscencia, probablemente por la activacin de un supuesto represor aguas abajo de la luciferasa opern ( luxCDABE ) ( 16 ).Adems, un regulador positivo llamado LuxR es necesaria para la transcripcin de los genes que codifican la luciferasa ( 17 , 18 ). LuxR es un homlogo de cierre de la V. cholerae proteasa HapR protena reguladora ( 19 ). El anlisis de los completado V. cholerae genoma ( 20 ) revela que, aunque V.cholerae carece de los genes necesarios para la produccin de luz ( luxCDABE ), que posee los genes necesarios para la produccin y la respuesta a la deteccin de qurum seal de AI-2 ( luxS, PQ, OU ). En consonancia con este hallazgo, los trabajos anteriores demostraron que V. cholerae produce AI-2 ( 21 , 22 ). Sin embargo, el V. cholerae objetivo (s) controlados por esta supuesta deteccin de qurum circuito, en su caso, sigue siendo desconocido. Aqu mostramos que elV. harveyi -como la deteccin de qurum reguladores estn involucrados en el control de V. cholerae virulencia de la expresin gnica. Sorprendentemente, a diferencia de otras especies bacterianas en las que la deteccin de qurum activa la expresin de genes de virulencia en altas densidades de clulas, en V. cholerae, la deteccin de qurum parece reprimir toxR regulados los genes de virulencia. Seccin anteriorSeccin siguiente

Materiales y Mtodos
Cepas bacterianas, plsmidos, y condiciones de cultivo.

V. cholerae El Tor cepa C6706 ( 23 ) fue utilizado como la tensin de los padres en este estudio. El mtodo utilizado para la construccin de la hapR y luxo mutantes de delecin fue el de Skorupski y Taylor ( 24 ). El p hapR plsmido fue construido por la clonacin de hapR ORF en pBBR1MCS4 ( 25 ) aguas abajo de la constituyente p lac promotor.Un isopropil - D tiogalactsido (IPTG)-inducible hapR- expresando plsmido (pJZ146) fue construido por la subclonacin hapR gen en pMalc2x (New England Biolabs). pMal-c2x contiene la p tac promotor y el lacI Q gen. CromosmicasTCPP-lacZ y hapRlacZ fusiones reportero transcripcional fueron construidas por la amplificacin de PCR de los 5 'del ADN de TCPP y hapR , respectivamente, y la clonacin de estos fragmentos en pVIK112 ( 26 ). Los plsmidos resultantes fueron integrados en el cromosoma en el TCPP y hapR loci, respectivamente, por recombinacin homloga. Cuando la TC y la produccin de TCP se requiere, V.cholerae cepas fueron cultivadas en medio de la IRA como se describe ( 27 ). En todos los dems experimentos, V. cholerae cepas fueron propagadas por el LB a 37 C. Los experimentos de microarrays. La produccin de microarrays que contienen manchas de larga duracin ORFs derivados de V. cholerae N16961 cepa ha sido descrito ( 28 ). Se aisl el ARN de las clulas cultivadas en un medio AKI mediante el uso de reactivo Trizol (Gibco / BRL), se extrae con fenol caliente (pH 5.2, 65 C), y se purifica mediante un kit RNeasy (Qiagen, Chatsworth, CA). CDNA marcado con fluorescencia fue preparado por la incorporacin directa de fluorescentes anlogos de nucletidos (Cy3 y Cy5dCTP dCTP) durante la primera cadena de reaccin al azar preparado transcripcin inversa. El ADNc diferencialmente etiquetados se combinaron y se aplic posteriormente a la superficie de la matriz en las condiciones que favorecen la hibridacin ( 28 ).Diapositivas de microarrays fueron escaneados mediante el uso de un aparato ScanArray 5000 (GSI Lumonics, Watertown, MA). Por cada punto ORF especficos, la intensidad de fluorescencia resultante de cada una de las etiquetas se midi y compar con el sistema de software GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments, Foster City, CA). La deteccin de TC, TCP y de la proteasa Hemaglutinina (HA). GM1 inmunoenzimtico ensayos de TC ( 29 ) se llevaron a cabo despus de la incubacin de V. cholerae cepas durante 5 horas a 37 C, con aireacin en el medio de la IRA. Celulares extractos preparados a partir de cultivos utilizados para los ensayos de TC fueron sometidos a SDS / PAGE, transferidos a membranas de nitrocelulosa, probaron con anticuerpos antiTCPA ( 30 ), y se visualizan mediante el sistema de deteccin de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia).HA proteasa azocaseina ensayos se realizaron como se describe ( 31 ).Zimogramas se llevaron a cabo mediante la incorporacin de 0,2% (final) de gelatina en un 7% SDS / PAGE geles. Tampn de la muestra fue introducido en sobrenadantes de cultivo que posteriormente se aplicaron a los geles sin hervir.Despus de la electroforesis, los geles se lavaron durante 30 minutos en el 2,5% y 1% de Triton X-100, seguido de tres lavados en tampn de la proteasa (0,1 M Tris, pH 8/0.5 mM CaCl 2 ). En gel de actividad de la proteasa se dej transcurrir durante la noche en el buffer de la proteasa a 37 C, despus de que los geles se tieron con azul de Coomassie. Ensayos de biofilm. Cultivos de una noche de V. cholerae fueron inoculadas en una dilucin de 1:100 en caldo LB y se incubaron en tubos de borosilicato de 18 horas a 22 C. Posteriormente, los tubos se lavaron con agua destilada luego se llena con colorante cristal violeta. Despus de 5 minutos, los tubos se enjuagan.El violeta biofilm asociado cristal se resuspendi con DMSO, y el OD 570 de la suspensin resultante se midi. La colonizacin del ratn lactante de ensayo. El ensayo de colonizacin del ratn lactante ha sido descrito ( 32 ). En pocas palabras, V. cholerae cepas mutantes (Lac + ) se mezclaron con la cepa de tipo salvaje (Lac - ), y aproximadamente 10 5 clulas fueron inoculadas en 5 - 6 das de edad, CD-1 en ratones lactantes. Despus de un perodo de 20 h de la colonizacin, homogeneizados intestinal han sido recogidos, y la proporcin de bacterias mutantes / de tipo salvaje se determin en placas de agar LB que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil - D -galactsido. Seccin anteriorSeccin siguiente

Resultados
Luxo es requerida para V. cholerae de colonizar ratones. La V. harveyi luxCDABE opern se utiliz como blanco heterloga en V. cholerae para la prueba de deteccin de qurum regulacin. Este estudio revel que de tipo salvaje V.cholerae expresa luminiscencia en un dependiente de la densidad celular manera, una luxo mutante muestra luminiscencia constitutiva mxima, y una hapRmutante produce ninguna luz (MBM y BLB, trabajo no publicado). Estos luxpatrones de expresin se corresponden exactamente con los de la anloga V.harveyi cepas, lo que confirma que el V. harveyi -como la deteccin de qurum circuito est en funcionamiento en V. cholerae , y tambin que el V. cholerae Luxo y protenas HapR son homlogos funcionales de la V. harveyi Luxo y LuxR protenas, por lo menos con respecto a la regulacin de la luciferasa. Sin embargo, V. cholerae no posee un opern de la luciferasa, por lo que no est claro cul es la deteccin de qurum endgeno objetivos de control se encuentran en esta bacteria. El nico papel que anteriormente se caracteriza por HapR en la regulacin de la expresin de la proteasa de HA ( 19 ). En un esfuerzo por determinar los objetivos de la deteccin de qurum en V.cholerae , hemos probado si las mutaciones en luxo y / o hapR afectan V.cholerae patognesis. Para ello se realiz un en vivo ensayo de colonizacin mediante el modelo de ratn lactante. CD-1 lactante de seis das de edad, los ratones fueron infectados con mezclas 1:1 de la noche-culta de tipo salvaje yluxo mutantes y de tipo salvaje y hapR mutantes. Los ratones fueron asesinados despus de 20 h, y el intestino delgado se analiz para determinar la relacin de tipo salvaje a las bacterias mutantes. De tipo salvaje bacterias podan distinguirse de las cepas mutantes en virtud de una lacZ de eliminacin que no afecta a la virulencia. La Tabla 1 presenta los

resultados. El hapR mutante coloniza ratones lactantes de la misma medida de tipo salvaje V. cholerae (ndice de competitividad 1). En contraste, el luxo mutante es profundamente defectuoso en la colonizacin, como no hay un solo luxo bacteria mutante se recuper en el intestino delgado de cualquiera de los 12 ratones usados en el experimento. Por lo tanto, el ndice de competitividad para el luxo mutante es <10 -4 .

Tabla 1 Infantil ensayos de colonizacin del ratn Luxo regula la expresin de genes de virulencia.

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Para investigar el mecanismo por el que se regula Luxo V. cholerae patogenicidad, se realiz todo el genoma de los experimentos de microarrays de ADN y compararon los perfiles de la transcripcin de tipo salvaje y luxo mutantes. En este experimento se utiliz in vitro las condiciones (medio AKI), que se sabe que inducen la expresin de factores de virulencia. Los resultados se presentan en la fig. 1 y la Tabla 2 . Fig. 1muestra que, en relacin con la cepa de tipo salvaje, muchos genes se activan y muchos son reprimidos en el luxo mutante. Sin embargo, el aumento de expresin de todos los genes en el reguln toxR virulencia se da en la cepa de tipo salvaje en comparacin con el luxo mutante. Las diferencias en el nivel de expresin de todos los genes regulados por Luxo se dan en la Tabla 2 . Una vez ms, estos datos muestran claramente que todo el reguln toxR se reprime en elluxo mutante. Por ejemplo, los genes en la isla de TCP son reprimidos de 2,7 a 41,7 veces en el luxo mutante. Del mismo modo, el ctxA y ctxB genes que se transcriben en un opern y codificar las dos subunidades de la TC, tambin estn fuertemente inhibida (40 veces) en el luxo mutante.

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Figura 1 Perfiles de expresin gnica de tipo salvaje C6706 y el luxo V. cholerae mutantes.Genes con mayor expresin en la cepa de tipo salvaje en comparacin con el luxomutantes se muestran en rojo.Genes que se expresan en niveles ms altos en el luxomutantes en comparacin con la cepa de tipo salvaje se muestran en verde. Negro puntos representan los genes que muestran menos de tres veces la variacin entre las dos cepas. * Indican los genes conocidos por ser esencial para la virulencia.

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Tabla 2 La expresin gnica diferencial en el luxo mutante en medio AKI Para verificar los datos de microarrays, se analiz la produccin de dos factores determinantes de virulencia, la TC y la TCPA, despus de un crecimiento en el medio de la IRA en las mismas condiciones que se utiliz en el experimento de microarrays. Nuestros resultados muestran que el luxo mutante no produce ningn detectable TCPA (Fig. 2 superior ) o una tomografa computarizada (Fig. 2Bajo ). Estos datos son consistentes con el experimento de microarrays y explicar por qu el luxo mutante no puede colonizar ratones.

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Figura 2 CT y TCPA de produccin de tipo salvaje y mutante C6706 V. choleraecepas. Las muestras se prepararon despus de 5 h de incubacin en el medio de la IRA con la aireacin a 37 C. (superior ) pellets celulares de las cepas indicadas fueron objeto de Western blot y probaron con anticuerpos anti-TCPA. ( Bajo ) El correspondiente libre de clulas lquido de cultivo se ensayaron en GM1 ligado a enzimas inmuno ensayos de TC. Luxo acta a nivel de TCPP expresin. Dos cascadas de transduccin de seales en paralelo de forma coordinada regulan la virulencia en V. cholerae ( 33 ).El toxRToxS y los circuitos de sealizacin TCPP-TcpH detectar y responder a los estmulos ambientales, y los dos circuitos de ejercer su control regulador sobre la virulencia que influyen en la expresin de toxT . ToxT, a su vez, activa la transcripcin de una variedad de genes necesarios para la virulencia ( 34 ). Para estudiar el mecanismo de la represin del reguln de virulencia en el luxomutante, que expresa constitutivamente toxR, TCPP y ToxT ( 33 ) en el luxomutante y probaron si la sobreexpresin de cualquiera de estos genes podra eludir el luxo de defectos y restaurar el mutante CT de produccin. Fig. 3 Amuestra que la expresin constitutiva de toxR no afecta a la produccin de CT en el luxo mutante. Sin embargo, la TC se produce cuando uno de TCPP o toxT se expresa constitutivamente en el luxo mutante. Este resultado indica que el efecto de Luxo en el reguln de virulencia est mediada por la baja regulacin de TCPP.De acuerdo con esta hiptesis, los datos de microarrays en la Tabla 2 muestran que la expresin 16,6 veces menor de TCPP se produce en el luxo mutante que en la cepa de tipo salvaje.

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Figura 3 Luxo reprime TCPPexpresin. ( A ) toxR , TCPP ytoxT fueron clonados en el vector de expresin pBAD24 (33 ), y los plsmidos se introdujeron en el V. cholerae luxo mutante. Posteriormente, las cepas fueron cultivadas bajo condiciones AKI induce en presencia de 0,01% arabinosa.La produccin de CT se cuantific despus de 5 h de incubacin a 37 C con aireacin. Los datos se presentan como el porcentaje de la produccin de CT del cojinete de tipo salvaje los mismos plsmidos. ( B) TCPP-lacZ expresin se ensay en el tipo salvaje, el luxo mutante, y la cepa de tipo salvaje que expresan constitutivamente un clonado hapRgen (denominado p hapR ). galactosidasa -ensayos de actividad ( 39 ) se llevaron a cabo despus de un crecimiento con aireacin durante 5 horas a 37 C en el medio de la IRA. En una prueba independiente para verificar que Luxo activa TCPP expresin, hemos introducido TCPP-lacZ fusiones reportero de la transcripcin en los cromosomas de las de tipo salvaje y luxo mutante nulo. La actividad -galactosidasa de la TCPP-lacZ fusin se midi en cada cepa, y se encontr que de 40 veces menos de la expresin del periodista se produce en el luxo mutante que en el tipo salvaje (Fig. 3 B ). Este resultado muestra que la transcripcin de TCPPrequiere la presencia de una protena funcional Luxo. Luxo acta a travs de HapR de control TCPP expresin. El experimento de microarrays revela que uno de los genes regulados por Luxo es el V. harveyi LuxRhomlogo hapR . En concreto, hapR expresin aumenta 6,9 veces en el luxomutante, lo que sugiere que Luxo es un represor de hapR expresin (Tabla 2 ). Por lo tanto, se pregunt si podra afectar Luxo TCPP expresin indirecta, actuando a travs de HapR. La hiptesis de que Luxo regula negativamente hapR expresin, y HapR a su vez, reprime TCPP expresin. Para probar esta idea, un plsmido que contiene una expresa constitutivamente hapR gen se introdujo en la de tipo salvaje V. cholerae . La cepa recombinante resultante no produce TCP y TC, en las condiciones estndar de induccin (Fig. 2 ), lo que indica que HapR est involucrado en la represin de la regulon toxR. De acuerdo con este resultado, la figura. 3 B muestra que en una cepa de tipo salvaje, la expresin constitutiva dehapR resultados en la represin son casi completa de la TCPP-lacZ fusin

reportero. Anlisis tambin demuestra que los microarrays de expresin constitutiva de hapR produce un perfil de la transcripcin de la V. cholerae genes de virulencia muy similar a la de la luxo mutantes (datos no mostrados). En conjunto, estos datos sugieren que HapR actos posteriores de Luxo para reprimirTCPP expresin, y esta accin en ltima instancia resulta en la represin del reguln de virulencia toxR. Para confirmar nuestras predicciones sobre las funciones de Luxo y HapR en la regulacin de genes de virulencia, se realiz una prueba de epistasis para demostrar que efectivamente HapR actos posteriores de Luxo. Hemos construido un luxo , hapR produccin doble mutante nulo y probado TC y TCP, as como la capacidad de la doble mutante para colonizar ratones. El doble mutante produce de tipo salvaje niveles de TC y TCP (Fig. 2 ), y este mutante tiene, como mucho, slo un defecto de la colonizacin menor (Tabla 1 ). Estos datos muestran quehapR es episttico de luxo y Luxo que no est obligado a activar directamente laTCPP promotor. Por el contrario, los controles de Luxo TCPP expresin indirecta por reprimir la expresin de hap R, que a su vez reprime TCPP expresin. No sabemos si HapR acta directa o indirectamente para reprimir TCPP transcripcin.En general, HapR y sus homlogos en otros Vibrio especies (LuxR, SmcR y Opar) actan como activadores de la transcripcin ( 17 , 18 , 36 , 37 ). Como se mencion anteriormente, HapR activa la expresin de luxCDABE en V. cholerae .Muchos son tambin activadores de los represores, sin embargo, y HapR puede poseer ambas actividades. Por otra parte, HapR podra activar un represor aguas abajo de TCPP expresin. Luxo Reglamento de hapR expresin. Nuestros datos sugieren que HapR juega un papel importante en la regulacin de deteccin de qurum de la V.cholerae factores de virulencia. Para investigar cmo HapR funciones en la regulacin del proceso de virulencia, que supervis la expresin de una hapR-lacZ fusin transcripcional en el tipo salvaje y el luxo mutante V. cholerae cepas en funcin de la densidad de las clulas. Fig. 4 Una muestra que hapR se expresa en las densidades de clulas de baja en el luxo mutante nulo, pero no a bajas densidades de clulas de tipo salvaje V. cholerae . Sin embargo, en el momento en las cepas de llegar a finales de log-fase, la expresin de hapR es idntica en los de tipo salvaje y el luxo mutante. Interpretamos este resultado implica que la expresin inicial, pero no de fines de hapR en el luxo mutante es crtico para la inhibicin de la produccin de factor de virulencia.

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Figura 4 Luxo regulacin dehapR expresin y regulacin de la produccin HapR CT. ( A ) de tipo salvaje y luxo mutantes llevando una cromosmicashapR-lacZ fusin periodista fueron cultivadas en medio AKI a 37 C. Las muestras fueron retiradas en la especificada de SAO, y -galactosidasa actividad fue ensayada. , de tipo salvaje (wt); , luxomutante. ( B ) de tipo salvaje V.cholerae que contiene el vector pMal-c2x o llevar pJZ146 (pMal-c2x contiene hapR bajo el control de IPTG) se cultivaron como se describe en el medio de la IRA, y IPTG (50 mM concentracin final) se aadi a los intervalos de tiempo indicados. Todas las muestras se analizaron para la produccin de CT despus de un total de 10 horas a 37 C. Los datos se presentan como el porcentaje de la produccin de CT en el V. cholerae cepa llevar pJZ146 en comparacin con la cepa de llevar slo el vector pMal-c2x. Un modelo en el que hace un tiempo, pero no es una expresin tarda de hapRreprime la expresin de genes de virulencia predice que la induccin de hapR a veces fuera de plazo no debera influir en la produccin de factores de virulencia.Para probar esta idea, hemos introducido un plsmido que contiene un IPTG-inducible hapR la construccin de genes en la naturaleza y tipo V. choleraeC6706. Se aadi IPTG a diferentes puntos de tiempo durante el crecimiento y la produccin de CT fue ensayada despus de 10 h de incubacin. Fig. 4 B muestra el nivel de produccin de TC en HapR clulas que expresan en comparacin con la producida por una cepa que contiene un control de vectores. Fig. 4 B muestra que el efecto inhibitorio sobre la produccin HapR TC se observa slo cuando hapR se induce en los puntos de los primeros tiempos, a pesar de que el anlisis de SDS / PAGE demostr que la protena HapR total realizada por 10 horas fue similar con independencia de que se aadi IPTG a 0 h u 8 h (datos no mostrados). Estos datos indican que, al menos in vitro , HapR acta en una etapa temprana de crecimiento para reprimir la produccin de factor de virulencia. No queda claro cmo HapR regula la expresin de genes de virulencia in vivo . Las protenas Luxo y HapR de control de mltiples procesos en V.cholerae .

Hemos investigado si Luxo y HapR puede controlar mltiples procesos celulares, adems de la patognesis. Como se ha mencionado, HapR se requiere para la produccin de la proteasa de HA ( 19 ). La proteasa HA es codificada por el hapa gen, y es una proteasa extracelular importante que puede servir como un "detachase" durante la colonizacin ( 38 ). Zimograma anlisis (Fig. 5 A ) de 17 h de clulas libres de fluidos de cultivo pas de la V. cholerae hapR y hapa mutantes demuestra que, como era de esperar, estos mutantes no producen proteasas HA. El anlisis cuantitativo de las actividades de la proteasa del hapR mutante demuestra que es muy similar a la de la hapa mutante (Fig. 5 ).Por el contrario, las preparaciones idnticas a partir de la luxo mutante result en un zimograma y el perfil de actividad de la proteasa similar a la del tipo salvaje (Fig. 5 ). Curiosamente, nuestros anlisis demuestran que los niveles ms altos de la proteasa estn presentes en clulas libres de los lquidos de cultivo gastado preparado a partir de un luxo - hapa doble mutante que de la hapa nico mutante (Fig. 5 B ). Este resultado indica que Luxo regula negativamente proteasas secretadas que no sea el de la proteasa HA. Adems, el curso temporal de la produccin de la proteasa (Fig. 5 B ) muestra que la actividad de la proteasa se produce a principios de luxo mutante que en la de tipo salvaje. Sugerimos que esta regulacin se ejerce a travs de Luxo HapR, lo cual es consistente con nuestro hallazgo de que Luxo reprime hapR nica expresin de baja densidad celular.

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Figura 5 HA produccin de la proteasa en V. cholerae de tipo salvaje y cepas mutantes. ( A ) Zimograma anlisis de fluidos de cultivo celular libre de preparados a partir de la designada V. cholerae padres y isognicas cepas mutantes despus de 17 h de incubacin a 37 C se muestran. En las calles preparadas a partir de las muestras que contienen una alta actividad de la proteasa HA [tipo salvaje (wt) yluxo ], los resultados de la proteasa HA en la limpieza completa de la gelatina, porque la proteasa HA est activa durante la ejecucin de la electroforesis. ( B ) un curso de tiempo de la produccin de la proteasa HA se muestra para las mismas cepas analizadas en una . Cultivos de una noche se diluyeron 1:100 en LB y se incubaron a 37 C. Las muestras fueron tomadas en intervalos de 2 horas para la determinacin de la actividad azocaseina. Una unidad azocaseina se define como la cantidad de enzima que produce un aumento de 0,01 unidades de DO por h. Los datos de microarrays presentan en la Tabla 2 muestran que la expresin de varios genes implicados en la quimiotaxis y la movilidad estn alterados en elluxo mutante. Se examin la motilidad del luxo mutante en una placa de enjambre y se encontr que este mutante es menos mviles que los de tipo salvaje y hapRcepas mutantes (Fig. 6 A ). Tambin hemos probado si Luxo y HapR estn involucrados en la formacin del biofilm. Las fotografas y las cuantificaciones de cristal violeta de biofilms producidos por la de tipo salvaje, luxo , y hapRmutantes se muestran en la figura. 6 B . En comparacin con los de tipo salvaje V.cholerae , el luxo mutante es deficiente en su capacidad de formar una biopelcula, mientras que el hapR mutante es mayor en su capacidad de formar biofilm.

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Figura 6 Luxo y control de mltiples procesos en HapR V.cholerae . ( A ) Diferentes V.cholerae cepas fueron inoculadas en agar motilidad (LB agar que contiene 0,3%) y se incuba a 37 C durante 4 horas, despus de lo cual se tom la fotografa. ( B ) Una comparacin de biofilms producidos por tipo silvestre V. cholerae y el luxo y hapR mutantes. (superior ) La fotografa muestra la tincin de cristal violeta en los tubos de borosilicato que contiene las diferentes cepas. Los datos normalizados se presentan para estos ensayos ( Bajo ). El OD 570valores son una medida de la tincin de cristal violeta, que es proporcional al nivel de formacin del biofilm. El peso se refiere a la designacin de la cepa de tipo salvaje. Seccin anteriorSeccin siguiente

Discusin

Las bacterias de forma coordinada de control de la expresin gentica para adaptarse y sobrevivir en condiciones ambientales fluctuantes. Por ejemplo, el patgeno humano V. cholerae posee un reguln de virulencia de ms de 20 genes implicados en la colonizacin, la produccin de toxinas, y la supervivencia de bacterias en el husped ( 33 , 34 ). El reguln de virulencia est bajo el control de una cascada de reguladores transcripcionales que incluye toxR, TCPP y ToxT.Estos reguladores son hiptesis para responder a estmulos externos como la temperatura, el pH y osmolaridad. En este estudio, que demuestran un papel central para la deteccin de qurum protenas Luxo y HapR en la regulacin de la expresin de genes de virulencia en V. cholerae . Los datos aqu presentados sugieren que Luxo regula negativamente la expresin de HapR, que a su vez, reprime la expresin del regulador de genes de virulencia esenciales, TCPP. An no est claro cmo las seales de qurum y otras seales ambientales se integran para regular la virulencia in vivo . Uno de los modelos especulativos (Fig.7 ) propone que en la colonizacin inicial (de baja densidad celular de las bacterias) de una serie de V. cholerae Luxo reprime hapR y permite la expresin de TCPP. Esto, a su vez, se traduce en la expresin de los factores de virulencia en el reguln toxR. Estos factores de virulencia permiten V. cholerae para colonizar el intestino delgado, se multiplican y producen la toxina del clera. Cuando una alta densidad celular se alcanza, autoinductor se acumula, y ya no se reprime Luxo hapR expresin. Posterior produccin de HapR supuestamente reprime TCPPy expresin toxR reguln. En cambio, en alta densidad celular, HapR activa la expresin de hapa , que codifica la proteasa HA. Expresin de la proteasa podran promover destacamento de V. cholerae clulas, y por lo tanto facilitar el establecimiento de una nueva infeccin focos en otros lugares dentro del tracto gastrointestinal, o, alternativamente, promover la salida de la V. cholerae desde el host. La represin de los TCP, un tipo IV pilus propuesta para mediar en las bacterias-bacterias adhesin, tambin podra promover la separacin de V.cholerae en el epitelio. Cabe sealar que, a pesar de que han demostrado un papel inequvoco de Luxo y HapR en la expresin de genes de virulencia, los estudios realizados no han demostrado que los genes de virulencia son sensibles a autoinductores que se acumulan en alta densidad celular.

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Figura 7 Un modelo para la deteccin de qurum regulacin de la V. cholerae virulencia. Las flechas continuas indican efectos positivos mientras slidas barras de T denotan los efectos negativos. En baja densidad celular, Luxo est activa y reprime la expresin dehapR . HapR es un regulador negativo de la TCPP la transcripcin, por lo que bajo esta condicin, la protena de sealizacin TCPP est presente y que, junto con TcpH y ToxRS, activa la expresin de factores de virulencia TCP y TC. En cambio, en alta densidad celular, Luxo est inactivo como consecuencia de la acumulacin de autoinductor seal. La inactivacin de los resultados de Luxo en hapR expresin de alta densidad celular.HapR reprime TCPP y el reguln toxR y activa la expresin de la proteasa Hap. Curiosamente, varios toxignico V. cholerae cepas (por ejemplo, El Tor cepa N16961 y la tensin clsica O395) posee un marco natural de desplazamiento de la mutacin en el hapR gen (datos no mostrados). Estas cepas expresan niveles bajos de HA de la proteasa, y una mutacin en luxo no da lugar a un defecto de produccin CT (datos no presentados y ref. 39 ). Este fenotipo es similar a lo que mostramos aqu para el luxo - hapR doble mutante. Es importante sealar que la regulacin negativa de la hapR homlogo LuxR de Luxo en V. harveyi no se ha observado. Por lo tanto, esta variacin en el circuito de regulacin podra ser nico para V. cholerae . Los autores especulan que la eliminacin de HapR, ya sea por mutacin o por la represin Luxo, puede ser un paso evolutivo que mejora laV. cholerae adaptacin al husped humano. Presumiblemente, la prdida o baja regulacin de HapR es una ventaja para la supervivencia y / o la colonizacin del husped por la prolongacin de la expresin TCP y TC, incluso a alta densidad celular. Tambin es probable que la prdida de HapR en la baja produccin de la proteasa HA, que a su vez podra limitar desprendimiento de las bacterias en el epitelio intestinal. Por lo tanto, carece de HapR vibriones puede permanecer unidos al epitelio por ms tiempo. Esto podra prolongar la colonizacin y la duracin de la eliminacin de los vibriones en las heces de los enfermos de clera. Adems, como hemos demostrado, hapR mutantes forman biofilms ms grueso, y esto puede ayudar a su persistencia en el husped. Los estudios futuros deben abordar cmo la deteccin de qurum autoinductores y otras seales se coordinan para regular la amplia gama de asociados a la virulencia de los fenotipos V. cholerae . Seccin anteriorSeccin siguiente

Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Daniele Provenzano para obtener ayuda con las infecciones del ratn lactante, Emmy Balon de microarrays, los Dres. Daniele Provenzano, James Bina, Pukatzki Stefan, y Boucher Acantilado til para los debates, y Ron Taylor para la revisin del manuscrito. REV es apoyado por una beca del Fondo de Damon Runyon Cancer Research. MBM es apoyado por una beca honorfica Jacobus. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant AI18045 (a JJM) y la National Science Foundation MCB-0094447 y la Oficina de Investigacin Naval de subvencin N00014-99-10767 (a BLB). Seccin anteriorSeccin siguiente

Notas al pie

A quin solicitudes de reimpresin deben ser tratados. E-mail:john_mekalanos@hms.harvard.edu .

Abreviaturas
CT , enterotoxina del clera ; TCP , toxinas coregulated pilus ; IPTG , isopropil - D -tiogalactsido ; HA , hemaglutinina Aceptado 21 de diciembre 2001. Copyright 2002, La Academia Nacional de Ciencias

Los pequeos ARN Acompaante Hfq y mltiples pequeos RNAs de control de deteccin de qurum en Vibrio harveyi y Vibrio cholerae
Derrick H Lenz 1 , 1
3

, Kenny C Mok 1 ,

, Brendan N Lilley 1 ,

, Rahul V Kulkarni 2 , Wingreen Ned S 1 ,

, Bonnie Bassler L

, 1,

Departamento de Biologa Molecular, Universidad de Princeton, Princeton, NJ 08544 EE.UU. Laboratorios NEC America, Inc., de 4 vas de la Independencia, Princeton, NJ 08540 EE.UU.

Recibido el 24 marzo de 2004; revisado el 18 mayo de 2004; aceptado 18a de mayo 2004. Publicado: 8 de julio de 2004. Disponible en Internet el 9 julio de 2004.

Abstracto
Deteccin de qurum bacterias se comunican con las molculas de seal extracelular llamada autoinductores. Este proceso permite que toda la comunidad de sincronizacin de la expresin gnica. Una pantalla de los componentes adicionales del Vibrio harveyi y Vibrio cholerae circuitos de deteccin de qurum revel la Hfq protena. Media Hfq las interacciones entre los ARN pequeos, reguladores (sRNAs) y especficos de ARN mensajero (ARNm) objetivos. Estas interacciones suelen alterar la estabilidad de las transcripciones de destino. Se demuestra que media Hfq la desestabilizacin del ARNm que codifica la deteccin de qurum maestro reguladores LuxR ( V. harveyi ) y HapR ( V. cholerae ), lo que implica un sRNA en el circuito. Utilizando un enfoque de la bioinformtica para identificar sRNAs putativo, hemos identificado cuatro sRNAs candidato en V. cholerae . La eliminacin simultnea de los cuatro sRNAs es necesario para estabilizar hapR ARNm. Proponemos que Hfq, junto con estos sRNAs, crea un interruptor ultrasensible de regulacin que controla la transicin crtica en la alta densidad celular, el modo de deteccin de qurum.

Esquema del artculo

o o o o o o o o

Introduccin Resultados

Una pantalla gentica para la V. harveyi de deteccin de qurum represor revela Hfq Hfq se requiere para la deteccin de qurum represin Hfq se requiere para la Regulacin de la expresin de genes de virulencia en V. cholerae Predicciones para la participacin de Hfq en Quorum Sensing Hfq afecta la estabilidad de LuxR / hapR ARNm Luxo-P Reglamento de hapR Es posttranscriptional y requiere Hfq Identificacin de sRNAs que participan en la deteccin de qurum uso de la bioinformtica Luxo-P- 54 controla la expresin de los loci sRNA

o o o o o o o o o

Cuatro sRNAs estn involucrados en la deteccin de qurum represin en V. cholerae Discusin Los procedimientos experimentales

Cepas bacterianas y medios de comunicacin Las manipulaciones de ADN Los ensayos de bioluminiscencia galactosidasa -Ensayos Western blot y anticuerpos Preparacin Blot del Norte Pantalla gentica para identificar hfq Agradecimientos

Los nmeros de la adhesin Referencias

Introduccin
La deteccin de qurum es un proceso de clula a clula de comunicacin que utilizan las bacterias para evaluar su densidad de poblacin a fin de coordinar la expresin del gen de la comunidad (Miller y Bassler, 2001) . La deteccin de qurum requiere la produccin, secrecin, y la deteccin de molculas de sealizacin extracelular denominada autoinductores. Diversos comportamientos estn controlados por la deteccin de qurum, pero, por lo general, estas conductas son las que sera ineficaz si slo un pequeo grupo de clulas que lleva a cabo. A menudo, las bacterias producen y detectar autoinductores mltiples, algunas de las cuales se utilizan para la comunicacin intraespecfica, mientras que otros promueven la comunicacin entre especies [Federle y Bassler 2003] , [Fuqua et al. 2001] y [Javier y Bassler 2003] .

La bacteria marina Vibrio harveyi produce y detecta dos autoinductores, AI-1 y AI-2, y estas seales de control de la expresin de mltiples genes, incluidos los de la bioluminiscencia (luciferasa) [Bassler et al. 1993] , [Bassler et al. 1994a] , [Cao y Meighen 1989] y [Chen et al. 2002b] , la produccin de siderforos (Lilley y Bassler, 2000) , morfologa de la colonia, la produccin de metaloproteasas (Mok et al., 2003) y secrecin de tipo III (Henke y Bassler, 2004) .

En V. harveyi , AI-1 y AI-2 son producidas por el LuxM sintasas y LuxS, respectivamente [Bassler et al. 1993] y [Surette et al. 1999] . LuxN detecta AI-1, y LuxPQ detecta AI-2(Figura 1) [Bassler et al. 1993] , [Bassler et al. 1994a] , [Chen et al. 2002b] y [Freeman et al. 2000] . LuxN y LuxQ estn unidas a la membrana de dos componentes hbridos quinasa sensor de protenas. LuxP, que se une el AI-2 en el periplasma, se requiere con LuxQ para la respuesta a la AI-2 [Bassler et al. 1994a] y [Chen et al.2002b] . La informacin sensorial de ambos sistemas converge en la protena phosphorelay LuxU y LuxU transmite la seal al regulador de respuesta Luxo [Bassler et al. 1994b] , [Freeman y Bassler 1999] y [Freeman y Bassler 2000] . A transcripcional LuxR activador llamado tambin es necesaria para la expresin de lux y otros genes controlados por la deteccin de qurum [Henke y Bassler 2004] , [Martin et al. 1989] , [Miyamoto et al. 1994] y [Showalter et al. 1990] .

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Figura 1.

Los modelos de la V. harveyi y V. cholerae circuitos de deteccin de qurum

(A) Dos sistemas de deteccin de qurum funcionar en paralelo para regular la expresin gnica en V. harveyi . Pentgonos y tringulos representan AI-1 y AI-2, respectivamente.

(B) Tres sistemas de deteccin de qurum-funcionar en paralelo para regular la expresin gnica en V. cholerae . Las funciones que componen el tercer circuito (denominado Sistema 3) quedan an por identificar. Los diamantes y tringulos representan CAI-1 y AI-2, respectivamente. En ambos circuitos, los flujos de fosfato en la direccin indicada por las flechas de baja densidad celular y en la direccin opuesta a alta densidad celular.

El patgeno humano Vibrio cholerae posee deteccin de qurum sistemas anlogos a los descritos anteriormente para la V. harveyi (Miller et al., 2002) . La V. choleraeautoinductores CAI-1 y AI-2 son sintetizados por CqsA y LuxS y detectado por CqsS y LuxPQ, respectivamente (fig. 1B) . V. cholerae tiene un sistema adicional (Sistema 3), que an no se ha identificado (Miller et al., 2002) . La informacin sensorial de los tres sistemas converge en Luxo. La V. cholerae homlogo LuxR se llama HapR(Jobling y Holmes, 1997) . La deteccin de qurum controla la virulencia y la formacin de biopelculas en V. cholerae [Hammer y Bassler 2003] , [KOVIKOV y Skorupski 2002] , [Miller et al. 2002] , [Vance et al. 2003] , [Zhu y Mekalanos 2003] y [Zhu et al. 2002] .

La V. harveyi y V. cholerae deteccin de qurum circuitos funcionan de manera similar (Miller et al., 2002) . En baja densidad celular, es decir, en ausencia de autoinductores, los sensores actan como quinasas y fosfato a travs de la transferencia de LuxU de Luxo. Luxo-fosfato (luxo-P) se activa y regula negativamente lux . En alta densidad celular, es decir, cuando el autoinductores estn presentes, los sensores actan como fosfatasas. Flujo de fosfato a travs del circuito se invierte, dando lugar a la defosforilacin e inactivacin de Luxo [Freeman y Bassler 1999] , [Freeman y Bassler 2000] y [Freeman et al. 2000] . Bajo esta condicin, los reguladores de la transcripcin LuxR en V. harveyi y HapR en V. cholerae obligar a la lux de transcripcin promotor y activar (Figura 1) .

Luxo-P-mediada por la represin de lux es indirecta (Lilley, y Bassler, 2000) . Luxo es homlogo a los miembros de la familia NtrC de reguladores de la respuesta, que pueden actuar como activadores transcripcionales o represores. Los que son activadores requieren la alternativa sigma factor 54 para la funcin, mientras que los que los represores no [Benson et al. 1994] , [North et al. 1996] , [Reitzer y Magasanik 1985] , [Wingrove y Gober 1994] y [Wu y Newton 1997] . Luxo es un miembro de la clase activador de homlogos NtrC. Hemos sugerido que, a baja densidad celular, luxo-P activa la expresin de un represor que controla los genes diana posterior. Se demuestra que mltiples y redundantes pequeos ARNs reguladores (sRNAs), junto con la protena Hfq sRNA vinculante, cumplir con este papel represor. En concreto, en baja densidad celular, los complejos de Hfq sRNA represor desestabilizar la V. LuxR harveyi y V. cholerae hapR ARNm (Figura 1) .

Resultados
Una pantalla gentica para la V. harveyi de deteccin de qurum represor revela Hfq
Para identificar el represor supuesto de que los actos posteriores de Luxo, hemos utilizado un alelo previamente caracterizadas Luxo, luxo D47E (Freeman y Bassler, 1999) . La mutacin D47E altera el sitio de fosforilacin, y "bloquea" la protena D47E Luxo en un estado imitando luxo-P. Luxo-P se activa la transcripcin del represor putativo de lux en baja densidad celular. De acuerdo con el modelo, V. harveyi luxo D47E cepas son de color oscuro, debido presumiblemente a la expresin constitutiva de la Lux represor. Nos mutagenizadas una V. harveyi luxo D47E cepa con el transposn mini-Mu lacZ y seleccionados para las colonias que haban adquirido un fenotipo brillante, indicando que haban obtenido una mutacin sin pasar por la oscuridad Luxo fenotipo D47E.

De las 40.000 mutantes de insercin de transposones generados, 85 eran brillantes. La mayora de estos (82) contenan inserciones de transposones en cualquiera deluxo o rpoN , el gen que codifica 54 . Tres mutantes brillante no albergaba mutaciones en cualquiera de estos genes. A V. harveyi genmica csmido de la biblioteca se introdujo en uno de estos mutantes (BNL211) y se seleccionan para la restauracin del fenotipo oscuro. Todos los csmidos confiere un fenotipo oscuro contiene regiones con reas de ADN, lo que sugiere que un locus nico era el responsable. Un csmido, pBNL2014, haba mutado con Tn 5lacZ para identificar la regin responsable de lux represin. La regin identificada fue clonado y secuenciado y se encontr que contienen el gen hfq (Figura 2A) . La V. harveyi hfq gen muestra una alta homologa con hfq genes de otras especies de Vibrio, incluyendo Vibrio parahaemolyticus , V. cholerae y Vibrio vulnificus , con 100%, 95% y el 94% de identidad, respectivamente (NCBI Blast: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ).

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Figura 2.

Hfq se requiere para la deteccin de qurum represin en V. harveyi y V. cholerae

(A) El hfq lugar en V. harveyi . MIAA y hflC no se secuenciado en su totalidad (regiones sin secuencia se indican con sombreado de color claro). (B) los ensayos de bioluminiscencia para V. harveyi cepas son: BB120 (WT, plazas), JAF78 ( luxo :: cm , diamantes), JAF548 ( luxoD47E, tringulos), BNL258 ( hfq :: Tn 5lacZ , crculos), y BNL211 ( luxo D47E, hfq :: Mini-Mu lacZ , tringulos cerrados). Unidades relativas de luz para la V. harveyi se definen como recuentos min
-1 r

ml

-1

x 10 / ml ufc

-1

. (C) los ensayos de bioluminiscencia

para V. cholerae cepas son: MM227 (WT, plazas), MM349 ( luxo , diamantes), BH48 ( luxo D47E, tringulos), DL2078 ( hfq , crculos), y DL2378 ( luxo D47E, hfq , tringulos cerrados). Unidades relativas de luz para la V. cholerae se definen como recuentos min -1 ml -1 / OD 600
nm

. En (B) y (C), las lneas punteadas representan el lmite de deteccin para la luz. (D) V. cholerae cepas analizadas para la produccin de

TCPA por Western blot son: C6706str2 (WT), MM307 ( luxo ), BH38 ( luxo D47E), MM194 ( hapR ), DL2066 ( hfq ), DL2146 ( luxo D47E, hfq ), y DL2607 (hapR , hfq ).

Hfq se requiere para la deteccin de qurum represin

Para verificar que Hfq tiene un papel en la deteccin de qurum regulacin en V. harveyi , hfq mutaciones nulas fueron introducidos en los cromosomas de la V. harveyide tipo salvaje y luxo cepas D47E. Los fenotipos de los Lux solo hfq y doble luxo D47E, hfq mutantes fueron examinados y comparados con los de la de tipo salvaje, luxo, y luxo D47E V. harveyi cepas (Figura 2B) . De tipo salvaje V. harveyi muestra tpica de deteccin de qurum conducta (plazas): es muy brillante inmediatamente despus de dilucin en medio fresco, pero, a principios del ensayo, la luminiscencia disminuye vertiginosamente (~ 1000 veces) debido a la dilucin de la autoinductores a nivel inferior al requerido para la activacin de lux . No obstante, como las clulas crecen, producen endgenamente autoinductores se acumulan para el nivel requerido para la deteccin. La produccin de luz comienza y aumenta de 1.000 veces, hasta alcanzar el nivel de pre-dilucin. El luxo tensin nula (diamantes) es constitutivamente brillante, ya que, en ausencia de Luxo, no lux represor se produce. Por el contrario, el luxo cepa D47E (tringulos) es oscuro. El hfq mutante (crculos) tiene un fenotipo indistinguible de la luxo mutante, lo que demuestra que Hfq es necesaria para la represin de lux expresin en las densidades celulares de baja. Elluxo D47E, hfq doble mutante (tringulos cerrados) es tambin constitutivamente brillante, mostrando que la represin de lux por Hfq se produce aguas abajo de Luxo.

Se confirm que Hfq tiene el papel idntico en V. cholerae que tiene en V. harveyi quorum sensing mediante la medicin de la densidad dependiente de la produccin de luz de la V. cholerae cepas con V. harveyi lux . Los fenotipos de Lux de la de tipo salvaje (cuadrados) luxo (diamantes) luxo D47E (tringulos), hfq (los crculos), y luxoD47E, hfq (tringulos cerrados) individuales y dobles V. cholerae mutantes imitan la correspondiente V. harveyi fenotipos mutantes (Figura 2C) .

Hfq se requiere para la Regulacin de la expresin de genes de virulencia en V. cholerae

En V. cholerae , la deteccin de qurum promueve la expresin de genes de virulencia en la baja densidad celular (fig. 1B) . Para demostrar que la actividad de deteccin de qurum de Hfq no se limita a los no nativos lux objetivo en V. cholerae , que mide la TCPA (la subunidad principal de la pilus toxinas coregulated) de produccin mediante Western blot (Figura 2) (Taylor, 1991) . TCPA est presente en la cepa de tipo salvaje, ya que, a baja densidad celular, la deteccin de qurum inicia la cascada que conduce a la produccin de TCPA, lo que permite su deteccin en alta densidad celular (Zhu et al., 2002) . No TCPA se observa en el luxo la tensin, porque luxo-P se requiere en la densidad celular baja para iniciar la produccin de la TCPA observada en el tipo salvaje. Por el contrario, los altos niveles de TCPA se observan en elluxo cepa D47E. Del mismo modo, el hapR mutante que tambin se bloquea en modo de baja densidad de las clulas produce altos niveles de TCPA. Es importante destacar que, bajo TCPA se detecta en el hfq mutante, lo que demuestra que Hfq es de hecho necesaria para la expresin de la virulencia de los factores. La produccin de TCPA en el doble luxo D47E, hfq y hapR , hfq mutantes demuestra que Hfq actos posteriores de Luxo y aguas arriba de HapR en la cascada de deteccin de qurum reglamentario.

Predicciones para la participacin de Hfq en Quorum Sensing

En Escherichia coli y otras bacterias, Hfq une una gran variedad de pequeos ARNs reguladores (sRNAs) y promueve la interaccin entre el sRNAs y su objetivo mRNAs[Masse et al. 2003b] y [Valentin-Hansen et al. 2004] . Estos complejos Hfq sRNA alterar la estabilidad / traduccin del ARNm diana. Nuestro hallazgo de que Hfq es necesaria para la deteccin de qurum en la

represin V. harveyi y V. cholerae nos llev a dos predicciones: en primer lugar, la deteccin de qurum se produce la represin posttranscriptionally, y, en segundo lugar, debe haber uno o ms sRNAs involucrados. El hallazgo de que luxo-P y transcripcin de hfq(datos no mostrados) nos llev a predecir que, a baja densidad celular, la luxo-P-
54 54

no controlan la

complejo activar la transcripcin del

gen de la (s) que codifica la Srna (s). El resto de los experimentos que aqu se presenta prueba de estas predicciones.

Hfq afecta la estabilidad de LuxR / hapR ARNm

LuxR y HapR parecen ser los reguladores maestros de sus respectivos deteccin de qurum regulons [Henke y Bassler 2004] y [Zhu et al. 2002] . Sabiendo esto sugiere dos mtodos por los cuales Hfq pudo reprimir quorum sensing controlada por la expresin de genes. En primer lugar, Hfq podra actuar directamente sobre el ARNm que codifica cada uno de los genes diana conocida de la regulons de deteccin de qurum. En segundo lugar, Hfq podra actuar en la codificacin de LuxR mRNAs en V.harveyi y HapR en V. cholerae . Estamos motivado esta ltima posibilidad es ms probable, ya que, en este escenario, Hfq necesidad de actuar slo en un nico ARNm de cada especie.

Northern blots fueron utilizados para determinar el efecto de hfq mutaciones en LuxR y hapR la estabilidad del ARNm en V. harveyi y V. cholerae . La rifampicina se aade a los cultivos de terminar la transcripcin, despus de que el LuxR y hapR transcripciones fueron monitoreados en el tiempo. El anlisis se realiz en el luxocepas D47E para evaluar el destino de la LuxR y hapR transcripciones de baja densidad celular. Figura 3A muestra que, bajo estas condiciones, tanto en el LuxR y hapRtranscripciones desaparecen inmediatamente despus de la terminacin de la transcripcin (paneles etiquetados luxo D47E) . Sin embargo, en el luxo D47E, hfqdobles mutantes, las transcripciones muestran una duracin considerablemente mayor ( Figura 3A , paneles etiquetados luxo D47E, hfq ). El control muestra que la mutacin de hfq no tiene ningn efecto sobre la estabilidad de rpsL ARNm ( Figura 3A , cuatro paneles inferiores). Western blots muestran que la mayor estabilidad de laLuxR y hapR ARNm en el hfq mutantes conduce a mayores niveles de la LuxR y protenas HapR (Figura 3B) . Estos resultados demuestran que, a baja densidad celular, Hfq desestabiliza el LuxR y hapR mRNA en V. harveyi y V. cholerae , respectivamente, lo que conduce a la reduccin de LuxR y protenas HapR en las clulas.

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Figura 3.

Hfq regula la expresin de LuxR y hapR posttranscriptionally

No en estado estacionario Northern blots fueron utilizados para analizar LuxR / hapR estabilidad transcripcin en lo siguiente: (A) V. harveyiJAF548 ( luxo D47E) y BNL211 ( luxo D47E, hfq :: Mini-Mu lacZ ) y (B) V. cholerae BH38 ( luxo D47E) y DL2146 ( luxo D47E, hfq ). (C) Western blot en lisados de V. harveyi BB120 (WT), JAF548 ( luxo D47E), BNL258 ( hfq :: Tn 5lacZ ), BNL211 ( luxo D47E, hfq :: Mini-Mu lacZ ), y (D) V. cholerae C6706str2 (WT), BH38 ( luxo D47E), DL2066 ( hfq ), DL2146 ( luxo D47E, hfq ) mide LuxR y protenas HapR, respectivamente.

Luxo-P Reglamento de hapR Es posttranscriptional y requiere Hfq

Anlisis previos han sugerido que la luxo-P controla la transcripcin de hapR en V. cholerae (Zhu et al., 2002) . Nuestra incapacidad para detectar hapR ARNm en las manchas del Norte en el momento cero no nos permite distinguir entre la regulacin transcripcional y postranscripcional de hapR . Hemos construido cromosmicashapR-lacZ fusiones transcripcionales, la traduccin, y el promotor y se mide su actividad en el V. cholerae de tipo salvaje, luxo D47E, hfq y luxo D47E, hfq cepas. Las fusiones de transcripcin y traduccin son reprimidos en el luxo cepa D47E, y la represin requiere Hfq ( Figuras 4A y 4B , respectivamente). Por el contrario, Luxo D47E no reprimir a los hapRlacZ fusin de promotor en el que lacZ se fusiona con el sitio previsto de iniciacin de la transcripcin (una pgina) (Figura 4C) . Estos resultados sugieren que la luxo-P regulacin de hapR es posttranscriptional y muestran que la regin entre la prediccin de un sitio y la hapR regin de codificacin se requiere para Hfq control.

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Figura 4.

Luxo-P y Hfq Regular hapR posttranscriptionally -galactosidasa actividad de (A) hapR-lacZ de transcripcin en V. cholerae DL2106 (WT, lacZ ), DL2099 ( luxo D47E, lacZ ), DL2523 (hfq , lacZ ), y DL2441 ( luxo D47E, hfq , lacZ ). (B) hapR-lacZ traduccin en V. cholerae DL2543 (WT, lacZ ), DL2542 ( luxo D47E, lacZ ), DL2531 ( hfq , lacZ ), y DL2533 ( luxo D47E, hfq , lacZ ). (C) hapR-lacZ promotor de la actividad en V. cholerae DL2748 (WT, lacZ ), DL2771 ( luxo D47E, lacZ ), DL2703 ( hfq , lacZ ), y DL2698 ( luxo D47E, hfq , lacZ ).

Identificacin de sRNAs que participan en la deteccin de qurum uso de la bioinformtica

Nuestros resultados apuntan hacia una luxo- 54 -regulado sRNA en la deteccin de qurum de transduccin de seales, circuitos de V. harveyi y V. cholerae . Dado que estos genes pequeos son muy difciles de identificar por los mtodos tradicionales de gentica, se desarroll un mtodo para explorar la V. cholerae genoma para el candidato sRNA loci. No se pudieron realizar este anlisis en V. harveyi , debido a que su genoma no ha sido secuenciado. Se utilizaron los siguientes parmetros en nuestro anlisis: (1) expresin de la sRNA se activa por la luxo-P- 54 complejo, por lo tanto de la regin aguas arriba del lugar que contiene una
54

sitio de unin, (2) ms sRNAs

identificado la fecha se han Rho-independiente terminadores, y asumimos que este es el caso de la sRNAs putativo en nuestro anlisis [Argaman et al.2001] , [Chen et al. 2002a] y [Wassarman et al. 2001] , (3) la mayora de los sRNAs se encuentran en las regiones intergnicas, por lo que restringe la bsqueda a las regiones entre los genes anotados [Argaman et al. 2001] y [Wassarman et al. 2001] , y (4) la sRNA deben ser conservadas en V. cholerae , V. parahaemolyticus y V.vulnificus . Las secuencias de genoma completo de estos vibriones demostrar que poseen homlogos de LuxR / hapR , luxo , luxU y hfq , lo que sugiere que tienen una conserva de deteccin de qurum mecanismo de regulacin [Chen et al. 2003] , [Heidelberg et al. 2000] y [Makino et al. 2003] . Utilizando PATSER, se exploraron la V. cholerae genoma en busca de posibles 54 sitios de unin con una matriz de peso construido a partir de un conjunto compilado de ~ 180 54 sitios de unin de varias especies bacterianas [Barrios et al. 1999] , [Dombrecht et al. 2002] , [Hertz y Stormo 1999] y [van Helden 2003] . Se consideraron todos los accesos por encima de un punto de corte elegido para incluir a todos los sitios de unin aguas arriba de los genes en V. cholerae que se sabe que son regulados por 54 . En un procedimiento paralelo, las regiones aguas arriba de la conocida V. cholerae 54 genes regulados fueron extrados, y se utiliz el programa de Consenso para buscar un motivo de 16 pb en estas secuencias (Hertz y Stormo, 1999) . El motivo as obtenida corresponde perfectamente a la conocida 54 sitios de unin en V. cholerae , con la secuencia consenso 5'-TGGCAC-N 5 -TTGCA/T-3. El conjunto alineado de sitios de unin se utiliz para construir una matriz de pesos para 54 sitios especficos para V. cholerae . Debido a que las matrices de peso obtenido por estos dos procedimientos son bastante similares, el resultado final no depende de la matriz de peso que se utiliza para escanear el genoma. Nuestro anlisis de la V. cholerae identificado varios predijo 54 sitios de unin en las regiones intergnicas. Hemos examinado esas regiones para la conservacin a travs de los genomas vibrio especficos y por la presencia de Rho-independiente terminadores. Estas restricciones limitaron la bsqueda a cuatro regiones intergnicas. Las secuencias y la alineacin de estas cuatro regiones se muestran en la Figura 5 , junto con las regiones correspondientes de V. parahaemolyticus y V.vulnificus . Estos cuatro lugares son altamente homlogas entre s. Todos contienen la firma 54 sitio de unin y un terminador, lo que sugiere que estos elementos son loci independiente transcrito. Llamamos a estos loci QRR 1, QRR 2, QRR 3 y QRR 4 (para q uorum r REGLAMENTARIO r na 1-4). Curiosamente, uno de los loci sRNA,QRR 1, se encuentra inmediatamente aguas arriba de luxo . En V. parahaemolyticus y V. vulnificus , un locus putativo sRNA quinto se identific que cumple con todos nuestros criterios de bsqueda (denominado QRR 5).

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Figura 5.

El anlisis bioinformtico de la sRNAs QRR en V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. harveyi

(A) la alineacin de secuencias mltiples de la QRR genes que codifican las sRNAs identificados en V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. harveyi . Anotaciones de los genes que flanquean cada sRNA se dan en los soportes. La numeracin de los sRNAs se basa en orthology de genes de acompaamiento. Nucletidos en negro indican una alineacin perfecta. La supuesta
54

sitio de unin se marca como

-12 y -24, predijo el inicio de la transcripcin se etiqueta como una, y el terminador es sealado por la lnea de ms de la secuencia. (B) ms bajo de energa secundaria-estructurales predicciones para el sRNAs QRR identificados en V. cholerae . La tipografa en negrita indica las regiones conservadas en todos los sRNAs en V. cholerae , V. parahaemolyticus y V. vulnificus . (C) Alineacin del complemento de la hapR UTR con un parte de la sRNAs QRR identificados en V. cholerae . (D) La adaptacin de la dotacin de la LuxRUTR con una porcin de sRNA Qrr1 identificados en V. harveyi . En (C) y (D), el sitio de inicio de la traduccin (Inicio), el sitio de unin a ribosomas (RBS), y el sitio de inicio de la transcripcin (+1) se indican. (A), (C) y (D) fueron producidos usando CLUSTALW (Thompson et al., 1994) y ESPript (Gouet et al., 1999) .

Utilizando el programa RNAfold, encontramos las estructuras predichas secundaria del candidato sRNAs (Figura 5) (Hofacker, 2003) . Las estructuras previstas de Qrr2 y Qrr3 son muy similares, como es la estructura de Qrr4 si los tres pares de nucletidos que une los dos bucles centro se funden (y tenga en cuenta estos tres pares de nucletidos que no se conservan todas las especies). Por lo tanto, slo la estructura prevista de Qrr1 es obviamente diferente. Qrr2 Qrr3 y mostrar una pgina similar a la propuesta del sitio Hfq vinculante, que es un 8-12 nucletidos ricos en AU regin adyacente a la madre de los bucles (Moll et al., 2003) . La composicin de los bucles es variable entre las especies, pero los tallos son altamente conservados, el apoyo a las predicciones de plegado. Muchos pequeos RNAs reguladores actan por apareamiento de bases complementarias a las regiones en la regin 5 'no traducida del ARNm. Utilizando el LALIGN programa, que busca el mejor alineamiento local de las secuencias de entrada, que se suman el complemento de la hapR sin traducir regin aguas arriba de los cuatro V. cholerae sRNAs y la LuxR regin aguas arriba con V. harveyi Qrr1 ( Figuras 5C y 5D , respectivamente). Curiosamente, la regin se identifican como potencialmente implicados en el apareamiento de bases complementarias es absolutamente conservado entre los cuatro candidatos sRNA, con una diferencia de una sola base de V. harveyi QRR 1 (Figura 5) . El altamente conservadas se superpone regin hapR y LuxR supuestos sitios de unin al ribosoma (AAGGAUAU para hapR y AAGGAAAA de LuxR ). Finalmente, el anlisis de las regiones aguas arriba de hapR y LuxR y su orthologs en todos los vibrios secuencia indica que esta regin putativa de la interaccin con el sRNAs es muy conservado.

Proponemos que los cuatro loci putativo sRNA en V. cholerae , y posiblemente cinco, en V. parahaemolyticus , V. vulnificus y V. harveyi (vase la discusin), se rigen por luxo-P junto con 54 . El anlisis de las regiones aguas arriba de los loci candidato sRNA muestra una regin altamente conservada aguas arriba de la 54 sitio. Este sitio ha dada simetra, y la secuencia de consenso es TTGCAW 3 TGCAA (donde W corresponde a A / T). Nuestra hiptesis es que esta regin podra ser importante para Luxo-P vinculante.

Luxo-P- 54 controla la expresin de los loci sRNA

Para determinar si algunos de los lugares candidatos sRNA es un objetivo de luxo-P- 54 regulacin en V. cholerae anlisis Northern blot se utiliz para cuantificar los niveles de transcripcin. El ADN que codifica la sRNAs putativo fue amplificado por PCR y se utiliza para la sonda idntica Northern blots que contienen ARN aislado de baja densidad de cultivos de clulas de tipo salvaje, luxo , luxo D47E, y rpoN V. cholerae cepas. Figura 6 ( hapR + panel) muestra que, sorprendentemente, slo Qrr4 es, obviamente, regulada por la luxo-P- 54 . Una cantidad muy pequea de esta sRNA se detecta en clulas de tipo salvaje, mientras que los altos niveles estn presentes en el luxo cepa D47E. Es importante destacar que Qrr4 es indetectable tanto en el luxo y rpoN mutantes, en consonancia con el requisito de que tanto luxo-P y 54 para activar la expresin de la codificacin en lugar Qrr4 baja densidad celular. No se detectaron los otros tres V. cholerae sRNAs en este anlisis.

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Figura 6.

Regulacin de la expresin de la sRNAs por Quorum Sensing ARN aislado de (A) V. cholerae C6706str2 (WT), MM307 ( luxo ), BH38 ( luxo D47E), BH76 ( rpoN ) fue investigado por sRNAs Qrr1, Qrr2, Qrr3 y Qrr4, y V. cholerae rpsL se muestra como el control de carga. (B) de ARN aislado de V. harveyi BB120 (WT), BB721 ( luxo :: Tn 5lacZ ), JAF548 ( luxo D47E), y BNL240 ( rpoN :: cm ) se probaron para sRNA Qrr1 con una sonda contra V. harveyi QRR 1 y para sRNA Qrr4 con una sonda contra V. cholerae QRR 4. V. harveyi rpsL se muestra como el control de carga. (C) sola vez RLU punto V. cholerae cepas DL3212 ( luxo ) y DL3213 ( luxo D47E) que contiene la QRR 1 - lux fusin transcripcional en trans.
r

Recientemente, se ha demostrado en E. coli que, al unirse a su objetivo de ARNm, la RyhB sRNA se degrada con el objetivo de RNaseE (Masse et al., 2003a) . En ausencia de los objetivos de ARNm, una mayor estabilidad de RyhB se observa (ver Discusin). Nos preguntamos si la sRNAs QRR se estn degradando a lo largo de la hapR ARNm diana. Para probar esto, hemos eliminado hapR en la de tipo salvaje, luxo , luxo D47E, y rpoN V. cholerae cepas, preparado de RNA, realizar transferencias de Northern, y probaron que para los cuatro sRNAs ( Figura 6 , hapR - panel). En ausencia de hapR ARNm, un aumento en el nivel de Qrr4 se observa en el tipo salvaje y luxo cepas de D47E. Tambin detectar pequeas cantidades de Qrr2 y Qrr3 en el luxo cepa D47E, demostrando que son efectivamente regulada por luxo-P, y que sus niveles aumentan en la ausencia de hapR ARNm. Sin embargo, no hemos podido detectar la Qrr1 sRNA.

Sabemos por nuestra secuencia que QRR 1 reside aguas arriba de luxo en V. harveyi , sin embargo, no hemos podido detectar este sRNA por Northern blot (Figura 6) .Debido a que el genoma de V. harveyi no ha sido secuenciado, no sabemos si los genes correspondientes a QRR 2, QRR 3, QRR 4, y / o QRR 5 de V. parahaemolyticusy V. vulnificus estn presentes. Hemos detectado correctamente Qrr4 de V. harveyi probando el ARN total con la sonda de ADN a partir de la V. cholerae QRR 4 producto de PCR, que muestran que tal sRNA existe en V. harveyi , y su expresin es inducida por Luxo D47E (Figura 6) .

La incapacidad para detectar V. cholerae y V. harveyi Qrr1 podra ser una consecuencia de la expresin extremadamente bajos de QRR 1 o la inestabilidad de la QRR un expediente, junto con la falta de sensibilidad del procedimiento de transferencia de Northern. Por otra parte, la expresin de QRR 1 no podra ser controlado por luxo-P, sin embargo, esto parece poco probable, basado en el anlisis de la bioinformtica. Para descartar esta posibilidad esta ltima, se construy una QRR un reportero de la transcripcin de fusin de la regin aguas arriba de la V. cholerae QRR 1 al luxCDABE (luciferasa) opern y probaron si esta construccin se rige por luxo-P. Se midi la expresin de la QRR 1 - lux de fusin en el luxo nula y luxo D47E V. cholerae cepas. La presencia de Luxo D47E provoca un aumento de 220 veces en la expresin de la QRR un promotor, la verificacin de que, efectivamente, QRR 1 est regulada por la luxo-P (Figura 6) . Llegamos a la conclusin de que la transcripcin de las cuatroQRR genes est regulada por la luxo-P.

Cuatro sRNAs estn involucrados en la deteccin de qurum represin en V. cholerae

Para conocer las funciones individuales de los cuatro sRNAs en la deteccin de qurum, solo, doble, triple, cudruple y la QRR supresiones sRNA se construyeron en V.cholerae . Posteriormente, se midi la densidad dependiente de la produccin de luz y encontr que slo la eliminacin simultnea de los cuatro sRNAs afectados expresin bioluminiscencia (Figura 7) . Los resultados se muestran slo para cada mutante triple y el mutante cudruple. SRNA mutantes individuales y dobles eliminacin se comport de manera similar a los mutantes triples. Sorprendentemente, los resultados muestran que si alguno de los cuatro sRNAs est presente, V.cholerae expresa dependiente de la densidad de bioluminiscencia similar a la de tipo salvaje. Sin embargo, la supresin de los cuatro genes sRNA juntos los resultados de forma constitutiva lux fenotipo idntico al luxo mutante nulo. Por lo tanto, los cuatro sRNAs participar en la deteccin de qurum la represin, aunque cualquiera es suficiente.

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Figura 7.

La eliminacin simultnea de los cuatro sRNAs se requiere para afectar la deteccin de qurum en V. cholerae (A) los ensayos de bioluminiscencia se realizaron en V. cholerae : MM227 (WT, plazas abiertas), MM349 ( luxo , diamantes abierto), DL2998 ( QRR 2, QRR 3, QRR 4, cuadrados cerrados), DL2996 ( QRR 1, QRR 3, QRR 4 , diamantes cerrado), DL2955 ( QRR 1, QRR 2, QRR 4, tringulos cerrados), DL2997 ( QRR 1, QRR 2, QRR 3, crculos cerrados), DL2956 ( QRR 1, QRR 2 , QRR 3 de QRR 4, crculos blancos). (B) sola vez RLU punto V. cholerae cepas MM227 (WT) MM349 ( luxo ), BH48 ( luxo D47E) DL2956 ( QRR 1, QRR 2, QRR 3, QRR 4) y DL3024 ( luxo D47E, QRR 1, QRR 2, QRR 3, QRR 4). Las transferencias Western probaron para HapR y TCPA de V. cholerae cepas C6706str2 (WT), MM307 ( luxo ), BH38 ( luxo D47E), DL2953 ( QRR 1, QRR 2, QRR 3 de QRR 4), y DL3020 ( luxo D47E, QRR 1, QRR 2, QRR 3, QRR 4).

Debido a la supresin de la sRNAs elimina la deteccin de qurum la represin en V. cholerae , se deduce que la sobreexpresin de la sRNAs debe dar lugar a la represin constitutiva. Pusimos a prueba esta por sobreexpresin de V. cholerae QRR 1 en varios V. cholerae y V. harveyi cepas y examinar sus repercusiones en la produccin de luz. En comparacin con el control del vector solo, cuando V. cholerae QRR 1 se sobreexpresa en V. cholerae , la produccin de luz se reduce al 21% en los de tipo silvestre, un 10% en el luxo tensin nula, y el 1% en el cudruple mutante sRNA (Tabla 1) . La sobreexpresin de la V. cholerae QRR 1 en V. harveyi reduce la produccin de luz a 12% en el% de tipo salvaje y las 3 de la luxo tensin nula. As, el V. cholerae sRNA Qrr1 funciones tanto en V. cholerae y V. harveyi para reprimir a la deteccin de qurum. Tenemos la sospecha de que los mismos resultados se obtienen con cualquiera de los otros tres sRNAs identificados en este trabajo.

Tabla 1. Sobreexpresin de V. cholerae QRR 1 en V. cholerae y V. harveyi

Tensin

Luz por ciento restante en comparacin con vector solo

V. cholerae en peso 21 V. cholerae lux O 10

V. cholerae 4 sRNA - 1 V. harveyi peso V. harveyi luxo 12 3

Estos experimentos son representativos de varias pruebas que no fueron significativamente diferentes. Todos los datos aqu presentados sugieren que varios sRNAs acto aguas abajo de luxo-P para desestabilizar LuxR / hapR ARNm y regular de deteccin de qurum la expresin de genes dependientes en V. harveyi y V. cholerae . Como una verificacin final de este modelo, se realiz una prueba de epistasis en V. cholerae . Se midi la produccin de luz y los niveles de HapR y TCPA de protenas en el V. cholerae cepa de tipo salvaje, el luxo mutante nulo, el luxo D47E mutante, el cudruple mutante sRNA la eliminacin, y el luxo D47E mutante que contiene la eliminacin del cudruple QRR genes (Figura 7) . La luz mxima que se produce y el nivel correspondiente de protenas de alta HapR se observa en la alta densidad celular de tipo salvaje y luxo cepas. La luz y los niveles de protena son HapR reducido drsticamente en elluxo cepa D47E. Sin embargo, la supresin de los cuatro sRNAs solos o en luxo fondo D47E restaura la produccin de luz mxima y la mxima produccin de protenas HapR, mostrando que los cuatro sRNAs son necesarios para la posterior represin y el acto de Luxo. Debido a lux y tcpA se regulan de una manera opuesta por la deteccin de qurum, los niveles de TCPA se espera que varen

recprocamente con los de lux concentracin de expresin y HapR en los mutantes de deteccin de qurum. Figura 7B muestra este es el caso y, sobre todo, que los cuatro sRNAs se episttico de luxo-P en la regulacin de tcpA .

Discusin
Tanto V. harveyi y V. cholerae uso quorum sensing para regular la expresin gnica en respuesta a cambios en la densidad celular. Muchos de los componentes regulatorios que componen estos sistemas de comunicacin vibrio se han identificado y caracterizado sus funciones [Federle y Bassler 2003] y [Javier y Bassler 2003] .Los anlisis genticos han demostrado que uno de esos componentes, Luxo, es fosforilada en baja densidad celular, y, de esta manera, interacta con el factor sigma alternativo
54 54

para activar un supuesto represor aguas

abajo (Lilley y Bassler, 2000) . Aqu mostramos que, en V. cholerae , el represor es el Hfq chapern sRNA y sRNAs cuatro. Luxo-P, junto con , activa la expresin de los loci que codifican los cuatro sRNAs, y la represin se produce a travs Hfq sRNA mediada por la desestabilizacin de la hapR transcripcin de ARNm (Figura 1) . Sorprendentemente, mientras que cuatro sRNAs estn involucrados, cualquiera es suficiente para la completa deteccin de qurum represin. En V. harveyi , muy probablemente cinco sRNAs trabajo en conjunto con Hfq para desestabilizar al LuxR ARNm (vase ms abajo).

Las molculas pequeas, sin traducir ARN tienen un papel en la expresin de genes de control en las bacterias (Masse et al., 2003b) y los eucariotas (Carrington y Ambros, 2003) . En eucariotas, la regulacin asombrosamente complejo est a cargo de microRNAs (miRNAs). Por ejemplo, en Caenorhabditis elegans y la Drosophila melanogaster , algunas regiones no traducidas de los ARNm de contener varios sitios a los que miRNAs puede unirse. En otros casos, un miRNA puede controlar la expresin de otro miRNA. Finalmente, en el D. melanogaster , los miRNAs distintas puede afectar a un solo proceso (por ejemplo apoptosis), sino que cada miRNA acta en una funcin diferente en la va (Carrington y Ambros, 2003) . En las bacterias, sRNAs regular una variedad de procesos celulares, incluyendo el almacenamiento de carbono y la utilizacin (Romeo, 1998) , la respuesta a la limitacin de hierro [Masse et al. , 2003a] y Masse [y Gottesman 2002] , la respuesta al estrs oxidativo (Zhang et al., 1998) y la transicin a la fase estacionaria (Repoila et al., 2003) . sRNAs regular la expresin gnica en una variedad de niveles, incluyendo pero no limitado a la estabilidad del mRNA y la traduccin (Masse et al., 2003b) . Regulacin se produce a travs de interacciones protena-ARN y ARN-ARN apareamiento de bases. SRNAs bacteriana suelen ser del orden de 100 nucletidos de longitud, y pueden actuar de manera positiva o negativamente en sus objetivos, dependiendo de la ubicacin dentro del mensaje de la interaccin ARN-ARN (Masse et al., 2003b) . Por ejemplo, el OxyS sRNA se une a la rpoS ARNm e impide su traduccin [Zhang et al. 1998] y [Zhang et al. 2002] . En contraste, el DsrA sRNAs y RPRa mejorar la traduccin de rpoS ARNm mediante la unin a una regin lder aguas arriba y la eliminacin de la formacin de una estructura secundaria particular en el mensaje de que inhibe la traduccin [Majdalani et al. 1998] y [Majdalani et al. 2002] .RyhB se une en el ARNm especifica la succinato deshidrogenasa ( sdhCDAB ) opern y facilita la degradacin de la transcripcin [Masse et al. 2003a] y Masse [Gottesman y 2002] . En muchos casos conocidos, la protena chaperona sRNA Hfq es necesario para mejorar la interaccin entre sRNAs y su objetivo ARNm [Moller et al. 2002] y [Zhang et al. 2002] . Adems, muchos sRNAs recientemente identificados que no tienen ninguna funcin conocida regulacin se puede unir a Hfq directamente, lo que sugiere que Hfq es una chaperona de ARN para un gran nmero de sRNAs [Wassarman et al. 2001] y [Zhang et al. 2003] . Hfq ha sido durante mucho tiempo se sabe que un regulador global de la expresin gnica, y ahora se cree que esta propiedad de Hfq se deriva de su interaccin con numerosos sRNAs reguladoras.

Nuestro anlisis predijo cuatro altamente homloga sRNAs como socios potenciales para Hfq en la deteccin de qurum en la regulacin V. cholerae , Figura 5 , Figura 6 y Figura 7 . Mientras que la verificacin experimental es necesario, la bioinformtica sugiere cinco sRNAs estn involucrados en el anlogo V. parahaemolyticus y V.vulnificus de deteccin de qurum circuitos (Figura 5) . Desde V. harveyi est ms estrechamente relacionada con V. parahaemolyticus que a V. cholerae (Rowe-Magnus et al., 2001) sospechamos que cinco sRNAs tienden a asociarse con Hfq en V. harveyi de deteccin de qurum regulacin.

Curiosamente, el gen que codifica sRNA Qrr1 est situado inmediatamente aguas arriba de la luxOU opern en todos los vibrios analizados (Figura 5) . Conservacin del orden de genes entre especies es generalmente indicativo de las funciones que actan en el mismo proceso (Dandekar et al., 1998) . Se postula que la QRR 1 -luxOU lugar representa una unidad evolutiva antigua. Este sRNA es notablemente diferente de los otros tres en que se prev que se pliegan en una estructura tallo-bucle con un lazo que es mucho menor que la predicha por los otros tres sRNAs (Figura 5) . Esto es en parte explicada por el hecho de que Qrr1 falta varios tramos de nucletidos que se conservan en Qrr2, Qrr3 y Qrr4 (ver Figura 5 ). El anlisis filogentico preliminar indica que los cuatro sRNAs son paralogs, es decir, que se derivan de la duplicacin de un nico gen sRNA en un organismo ancestral (presumiblemente el sRNA vinculados a luxOU ) seguidos por otros en la familia de los vibriones.Este escenario evolutivo deja abierta la pregunta de por qu sRNAs mltiples se utilizan para controlar la deteccin de qurum en estos organismos.

Redundancia amplia que existe entre los cuatro sRNAs: la inactivacin simultnea de los cuatro es necesario eliminar Hfq mediada por la represin de deteccin de qurum (Figura 7) , y, en consonancia con esto, la sobreexpresin de un solo sRNA es suficiente para la represin (Tabla 1) . En principio, un nico sRNA activado por luxo-P pudo realizar la transicin entre los estados de baja densidad y alta de la clula. Una posibilidad es que la presencia de varios sRNAs es importante para afinar la transicin. Si es as, la presencia de cuatro sRNAs puede permitir nuevos aportes reglamentarios (por ejemplo, metablicas) para influir en cuando se produce la transicin. De hecho, hemos

identificado motivos conservados, de conformidad con regulacin del factor sitios de unin, en las regiones aguas arriba de la QRR 2 yQRR genes 3, adems de la supuesta luxo-P sitios de unin situado aguas arriba de los cuatro sRNAs (RVK, datos no publicados ).
+

No podemos detectar sRNAs Qrr1, Qrr2 o Qrr3 en el luxo cepa D47E por anlisis de Northern ( Figura 6 , hapR panel). Sin embargo, su inactivacin es necesaria para eliminar Hfq dirigida deteccin de qurum la represin (Figura 7) , por lo que debe estar presente, y que definitivamente actuar bajo condiciones experimentales.Recientemente, se inform que Hfq, junto con el RyhB sRNA, facilita la degradacin de la sodB mRNA en E. coli (Masse et al., 2003a) . El RyhB sRNA cuando se combina con su objetivo ARNm se degrada rpidamente por RNaseE. SRNAs Otros tambin demostraron ser estabilizado en la ausencia de sus mRNAs especficos, lo que sugiere que este mecanismo de regulacin se puede generalizar (Masse et al., 2003a) . Hemos encontrado que los niveles de sRNA Qrr2, Qrr3 y Qrr4 aumento en elluxo cepa D47E, en ausencia de hapR ARNm (Figura 6) . Este hallazgo sugiere que, en primer lugar, al igual que QRR 4, QRR 2 y QRR tres son controlados por luxo-P y, en segundo lugar, que al igual que en E. coli , la presencia del ARNm diana reduce la estabilidad de estos tres sRNAs. Si los mensajes especificando otros genes quehapR son tambin objetivos de la regulacin de este conjunto de sRNAs, podra ser necesario para eliminar estos mRNAs de observar una mayor estabilidad y / o abundancia de sRNA Qrr1 y una mayor estabilidad mayor y / o abundancia de sRNAs Qrr2 y Qrr3 . Un reportero de la fusin transcripcional de la QRR un promotor demuestra que tambin es controlada por luxo-P (Figura 6) . Tenemos la sospecha de que no se puede detectar este sRNA por Northern blot, porque la tcnica no tiene la sensibilidad necesaria para detectar ARN con una presencia muy escasa. En un intento adicional para estudiar Qrr1, la hiptesis de que la ausencia de la sRNAs Qrr2-4 podra conducir a una mayor expresin de los restantes QRR gen, QRR 1. Sin embargo, ningn cambio en la transcripcin de QRR 1 - lux ocurrido en el triple mutante, lo que sugiere que la presencia o ausencia de QRR 2.4 no afecta a la expresin de QRR 1 (datos no mostrados).

Por qu Luxo regular hapR / LuxR a travs de sRNAs y no directamente? Una razn puede ser que la sRNAs permitir que un simple "inversin" de control reglamentario, de modo que el activador de Luxo puede reprimir hapR / LuxR . Sin embargo, esta inversin tambin podra lograrse de otras maneras, por ejemplo, al cambiar el patrn de regulacin de hapR / LuxR con respecto a sus genes diana. Una de las motivaciones ms fundamentales para el control a travs de sRNAs puede lograr un ultrasensible (switchlike) la respuesta al nivel de luxoP. Como base de sincronizacin de un sRNA con su mensaje de destino es conocido por promover la degradacin tanto de la sRNA y el mensaje, esta "destruccin mutua" proporciona un mecanismo elegante para ultrasensitivity. En concreto, como se muestra en la Figura 8 , si la tasa de sntesis de un sRNA en particular excede la velocidad de sntesis de su mensaje de destino, aunque sea levemente, la sRNA se pueden acumular en la clula, y los niveles de destino del mensaje puede ser reducida a muy niveles bajos. Por el contrario, si la tasa de sntesis de un mensaje de destino en particular supera a la de su sRNA regulacin, entonces el mensaje se puede acumular (Figura 8) . El mecanismo descrito ultrasensible aqu tambin se aplica en el caso de sRNAs mltiples que interactan con uno o ms objetivos de mRNA (Paulsson y Ehrenberg, 2001) . El uso de sRNAs para lograr una respuesta ultrasensibles pueden ser particularmente aptos para procesos tales como la deteccin de qurum en el que se indica una respuesta de todo o nada. Del mismo modo, este requisito de todo o nada-podra explicar por qu sRNAs de control de la entrada en fase estacionaria. Un tipo diferente de sRNA interruptor se destac por Masse et al. (2003a)para el sistema de RyhB. En este caso, el RyhB sRNA se demostr que mediar un cambio rpido, reversible en el tiempo en respuesta a un gran cambio en la entrada (por ejemplo, la adicin de hierro a la media). En el circuito de deteccin de qurum, por el contrario, el cambio se produce en respuesta a un pequeo cambio en la entrada (por ejemplo, los niveles de luxo-P), que est fuertemente amplificada en una transicin entre dos estados discretos (por ejemplo, la densidad de clulas de alta y baja). Qu tan rpido produce este cambio en el tiempo depender de la velocidad de cambio de luxo-P los niveles, as como en el ritmo de acumulacin y / o la degradacin de LuxR / hapR ARNm y LuxR / protena HapR. Curiosamente, una respuesta ultrasensibles de luxo-P a travs de la velocidad de produccin de sRNA premia precisamente en el control de la tasa de transcripcin de la sRNAs, de acuerdo con nuestra hiptesis de que la presencia de varios sRNAs representa un mecanismo para ajustar la transicin entre alta y baja Estados densidad celular.

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Figura 8.

La destruccin mutua de sRNA ARNm y de destino produce una respuesta ultrasensibles a la velocidad de sntesis de Srna.

Si la tasa de sRNA sntesis, k x , cae por debajo de la tasa de sntesis de ARNm objetivo, k y , a la piscina en estado estacionario de mensaje de destino se eleva abruptamente. En el circuito de deteccin de qurum, esto implica que un aumento en ultrasensible hapR / LuxR los niveles de ARNm se produce con la disminucin de los niveles de luxo-P a medida que aumenta la densidad celular. Las curvas se generan a partir de la ecuacin 7 de Elf et al. (2003) , que describe la produccin de dos especies qumicas (el sRNA y el ARNm) que se someten a la destruccin mutua con una velocidad de segundo orden constante k
md

(v = max / K x K y ) y tambin se someten intrnseca, de primer orden la

2 7

degradacin en una tasa . En las curvas se muestra, hemos establecido el parmetro de un ajuste k md k y / para ser igual a 5 10 , que est en el rgimen en el que la degradacin de las especies de las minoras se debe principalmente a los procesos de mutua destruccin. Las concentraciones se dan en unidades de k y / .

La decisin de hacer la transicin de por s solo de participar en una actividad de grupo es crtico para las bacterias. En vibrios, sofisticados dispositivos reguladores se encuentran en diferentes posiciones en la deteccin de qurum de transduccin de seales de rel para asegurarse de que esta decisin se produce en el conjunto adecuado de las circunstancias y con alta fidelidad. Anteriormente, hemos demostrado que un detector de coincidencia regula la entrada en modo de alta densidad de las clulas: la presencia simultnea de mltiples autoinductores tiene la obligacin de invertir el sentido de phosphoflow a travs del sistema y as iniciar la transicin crtica de la individualista de la vida del grupo (Mok et al., 2003) . El esquema de coincidencia de deteccin de probables proteger el circuito de deteccin de qurum de las molculas en el ambiente que se parecen a los autoinductores bona fide. En el presente trabajo, demostramos que un interruptor ultrasensible participacin de varios sRNAs existe para hacer el paso de compromiso en la deteccin de qurum modo definitivo. Se argumenta que esta transicin no se clasifica, sino ms bien un interruptor de encendido / apagado, el cual desactiva las conductas que son tiles cuando se lleva a cabo solo y se convierte en los comportamientos que son productivos cuando se realiza como una comunidad.

Los procedimientos experimentales

Cepas bacterianas y medios de comunicacin
V. harveyi cepas se derivan de BB120 (Bassler et al., 1997) y se cultivaron a 30 C con aireacin en Luria-marinos (LM), la infusin de corazn (HI), o un bioensayo autoinductor (AB) de caldo [Bassler et al . 1994b] y [Freeman y Bassler 1999] . V. cholerae cepas son derivados de la cepa El Tor C6706str2 (Thelin y Taylor, 1996) y se cultivaron a 30 C con aireacin en Luria-Bertani (LB) o caldo de SOC (Sambrook et al., 1989) . Para los estudios de la toxina coregulated pilus (TCP), V. cholerae fue aumentado a 37 C en medio AKI AKI en condiciones (Iwanaga et al., 1986) . E. coli S17-1pir (de Lorenzo y Timmis, 1994) y JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) fueron utilizadas para propagar los plsmidos a 37 C en LB. Los antibiticos se utilizaron los siguientes: ampicilina (amp), 100g/ml, tetraciclina (Tet), 10g/ml, kanamicina (kan), 100g/ml, cloranfenicol (cm), 10g/ml y gentamicina (Gent), 100 microgramos / ml. Estreptomicina (estreptococo) se utiliz en 1 mg / ml y polymyxcin B (pb) a 50 unidades / ml.

Las manipulaciones de ADN

Todas las manipulaciones de ADN se realizaron segn Sambrook et al. (1989) . Polimerasa PFU turbo (Stratgene) fue utilizado para las reacciones de PCR utilizado en la clonacin, mientras que la Taq polimerasa (Roche) se utiliza para todas las otras reacciones de PCR. dNTP, endonucleasas de restriccin y la ligasa de T4 se obtuvieron de New England Biolabs. Kits de purificacin de ADN fueron obtenidas de QIAGEN. Primer secuencias estn disponibles bajo peticin. V. harveyisupresiones se construyeron utilizando el mtodo de Datsenko y Wanner (2000) . Construcciones fueron colocados en la V. harveyi cromosoma mediante la sustitucin de alelos (Bassler et al., 1993) . En el marco eliminaciones fueron construidas por el mtodo de Skorupski y Taylor (1996) . hapR-lacZ fusiones reportero se construyeron mediante el mtodo de Kalogeraki y Winans (1997) . QRR 1 de V. cholerae se sobreexpresa a partir del plsmido pKK177-3RI (regalo de G. Storz). Por V. harveyi , un cassette de resistencia a kan tambin se incorpor en pKK177-3RI. El QRR 1 - lux plsmido de fusin transcripcional fue construido por la ligadura de un Pac fragmento I de pCS26- Pac (Bjarnason et al, 2003.) en una ingeniera Pac sitio que en pBBR1MCS (Kovach et al, 1994). . El vector fue digerido con Bam HI, que elimin un fragmento de aproximadamente 2 kb de ADN, y un fragmento amplificado por PCR que contiene la regin promotora de la V. cholerae QRR 1 fue clonado en el Bam HI sitio.

Los ensayos de bioluminiscencia

V. harveyi culturas se cultivaron en caldo de AB durante 14 horas a 30 C, con aireacin. Los cultivos se diluyeron 1:5000 antes de los ensayos de bioluminiscencia, que se llevaron a cabo como se describe (Bassler et al., 1993) . Unidades relativas de luz para la V. harveyi se definen como recuentos min -1 ml -1 x 10 3 / ml ufc -1 . V.cholerae ensayos de bioluminiscencia se llevaron a cabo despus de un crecimiento h 10 a 30 C en el SOC contiene tet para mantener la realizacin pBB1 plsmido V.harveyi luxCDABE . OD 600 nm para cada cultivo se midi, y los cultivos se diluyeron de manera que cada cultura se encontraba en la misma densidad celular (~ dilucin 1:1000). Luz y OD 600 fueron medidos cada 45 minutos como se ha descrito (Miller et al., 2002) . Unidades relativas de luz para la V. cholerae se definen como recuentos min -1 ml -1 / OD 600 nm .

galactosidasa -Ensayos
galactosidasa -ensayos se realizaron por triplicado, como en Slauch y Silhavy (1991) . galactosidasa -unidades se definen como [V max ] [factor de dilucin] / OD 600 nm.

Western blot y anticuerpos Preparacin

Western blot se realiz como se describi (Henke y Bassler, 2004) , las membranas fueron expuestas a anticuerpos anti-TCPA, y deteccin de quimioluminiscencia (Amersham) se utiliz (Sun et al., 1991) . Para analizar HapR y LuxR los niveles de protena, HapR y LuxR fueron purificados (Chen et al. 2002b) , y anticuerpos policlonales fueron generados (Henke y Bassler, 2004) . Antisuero policlonal fueron adsorbidos en tanto E. coli pGEX-4T-1 lisados y ya sea una V. cholerae hapRmutante lisado o V. harveyi LuxR mutante lisado antes de su uso.

Blot del Norte

Cultivos utilizados para la preparacin de ARN fueron cultivadas a OD 600nm de 0,5. La rifampicina se aadi a 100 g / ml, y cada cultura se incubaron con la aireacin a 30 C. Se tomaron alcuotas en los momentos adecuados, y se extrajo el ARN con Trizol (Invitrogen) y cloroformo. ARN se precipit con isopropanol, se lava con etanol 75% y se resuspendi en agua DEPC. Northern blots se realizaron como se describe (Martin et al. 1989) . En estado estacionario Northern blots se realizaron el anterior, excepto que no se aadi rifampicina.

Pantalla gentica para identificar hfq

V. harveyi cepa JAF548 ( luxo D47E kan r ) fue mutagenizada con mini-Mu lacZ (cm r ) como se describe (Martin et al., 1989) . Colonias brillantes fueron aislados, e inserciones en luxo y rpoN se identificaron por PCR y la complementacin. Tn 5lacZ mutagnesis de hfq en csmido pBNL2014 se llev a cabo como se describi previamente (Showalter et al., 1990) . Inserciones de transposones fueron asignadas mediante el anlisis de restriccin y secuenciacin. Csmido pBNL2031, que contiene una Tn 5lacZ insercin en hfq , fue utilizado en el procedimiento de sustitucin allica para generar BNL258 ( hfq :: Tn 5lacZ ).

Vibrio cholerae O1 El Tor: La identificacin de un grupo de genes necesarios para el tipo de colonias rugosas, la produccin de exopolisacridos, resistencia al cloro, y la formacin de biofilm
1. 2. Fitnat H. Yildiz y Gary K. Schoolnik * +Afiliaciones de los autores 1. Departamento de Medicina, Divisin de Enfermedades Infecciosas y Medicina Geogrfica, y el Departamento de Microbiologa e Inmunologa de la Universidad de Stanford Escuela de Medicina, Beckman Center, Sala 239, Stanford, CA 94305
1. Comunicada por Emil C. Gotschlich, la Universidad Rockefeller, Nueva York, NY (recibido para revisin 05 de noviembre 1998)

La seccin siguiente

Abstracto
La variante de la colonia rugosa de Vibrio cholerae O1, biotipo El Tor, se muestra para producir un exopolisacrido, EPS ETR , que confiere resistencia al cloro y la capacidad de formacin de biofilm. EPS ETR de produccin requiere de un locus cromosmico, vps , que contiene secuencias homlogas a genes de la biosntesis de carbohidratos de otras especies bacterianas. Las mutaciones en este lugar el rendimiento de cloro sensibles, las variantes de colonia lisa que se biofilm deficiente. Las propiedades de formacin de biofilm de EPS ETR puede permitir la supervivencia de V. cholerae O1 en los hbitats acuticos del medio ambiente entre los brotes de enfermedades humanas. La epidemiologa del clera en la regin de Bengala de la India y Bangladesh se caracteriza por brotes peridicos de temporada seguida por intervalos de tiempo durante el cual la enfermedad se presenta espordicamente o nunca ( 1 ). Falta de identificacin con regularidad portadores crnicos de Vibrio cholerae O1 o reservorios de animales infectados, su capacidad de colonizar el intestino de los coppodos ( 2 ), y la deteccin del organismo adjunto al fitoplancton ( 3 - 5 ) y en muestras de agua durante todo el ao ( 6 ) ha llevado a la idea de que V. choleraeO1 reside en hbitats acuticos naturales en los intervalos entre perodos de epidemia ( 7 ). Posibilidades sugeridas por otros investigadores son su persistencia en una opcin viable, pero el estado no cultivable, en el agua ( 8 , 9 ) y su asociacin como comensales o simbiontes de otros miembros de la flora acutica ( 7 ). Estos microambientes tienen en comn la supervivencia del organismo en virtud de las limitaciones fisiolgicas que probablemente difieren marcadamente de las condiciones dentro del tracto gastrointestinal humano. Una caracterstica comn de la mayora de los reservorios ambientales es la baja disponibilidad de nutrientes, en comparacin con el medio intestinal. Adems, los hbitats del medio ambiente estn sujetas a cambios estacionales determinado de la microflora y las fluctuaciones fsico. Aqu nos informe lo siguiente: la variante rugosa colonial de V. cholerae O1, biotipo El Tor produce un polisacrido extracelular nico, designado EPS ETR , que confiere resistencia al cloro y promueve la formacin de biofilm. Anlisis de la composicin y la vinculacin de este material se lo ensea a no tener relacin con descrita anteriormente V.cholerae hidratos de carbono, y los experimentos de mutacin condujo a la identificacin de un grupo

cromosmica de los genes que se requiere para la produccin de este compuesto y rugosa asociada a fenotipos. En vista de las propiedades funcionales que le confiere, proponemos un papel de EPS ETR en la supervivencia del organismo en el medio ambiente los hbitats acuticos. Seccin anteriorSeccin siguiente

MATERIALES Y MTODOS
Las cepas bacterianas. Escherichia coli cepas DH5a y S17-1 ( 10 ) fueron utilizados para la manipulacin de ADN estndar y el apareamiento, respectivamente. La V. cholerae cepas utilizadas fueron las variantes lisas y rugosas de 92A1552 (de tipo salvaje, El Tor, Inaba, y el Rif r ) y los mutantes de las cepas que figuran en la Tabla 2 . Microscopa. Escaneado y microscopa electrnica de transmisin, la tincin de rojo de rutenio, y la microscopa electrnica de inmunomarcaje se realizaron como se describe ( 11 ). El aislamiento de EPS. Colonias lisas o rugosas se cultivaron durante 24 horas a 30 C en la superficie de las membranas de celofn estril de dilisis colocado en la superficie de las placas de agar LB. El csped del crecimiento bacteriano confluente se recogi y se suspendi en el 0,9% de NaCl. EPS ETR luego fue separado de la superficie de la bacteria y purificado de acuerdo con los mtodos publicados ( 12 - 14 ). Glicosil composicin y anlisis de ligamiento se realiz en la Universidad de Georgia Complejo del Centro de Investigacin de Carbohidratos ( 15 ). Mutagnesis. Transposn mutagnesis de la V. cholerae O1 El Tor, la tensin 92A1552, se llev a cabo por la conjugacin con el donante E. coli S-17-l pir, que contiene un conjunto de 40.000 firmas etiquetados pUT mini-Tn5-Km2 (16 ). El exconjugants fueron seleccionados por la chapa de la suspensin en placas de LB suplementado con 100 mg / ml de rifampicina y 150 mg / ml de kanamicina. Las manipulaciones de ADN y anlisis. Plsmido de ADN y preparacin de ADN cromosmico, la ligadura de ADN, la transformacin bacteriana, la electroforesis en gel de agarosa, Southern blot, y la construccin de la biblioteca de csmidos se realizaron mediante mtodos estndar ( 17 ). Gene clonacin y secuenciacin de ADN. ADN cromosmico fue digerido por separado con Eco RI, Sal I, KPN I y Pst I, y los fragmentos se resolvieron en un gel de agarosa, se transfiri a membranas Hybond N, y se hibrida con el gen de resistencia a la kanamicina pUT mini-Tn5 Km2. Las enzimas de restriccin que produjo fragmentos de hibridacin entre 3 y 8 kb fueron utilizadas para digerir ADN cromosmico, y los fragmentos resultantes fueron clonados en BluescriptKS.Los plsmidos se analizaron por digestin con enzimas de restriccin, y una regin de 300 pb fue secuenciado de la regin que flanquean el sitio de insercin del transposn. La secuencia fue analizada por el HUECO del programa del paquete de programas GCG y EXPLOSIN del Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica en un mnimo de 50 aa secuencia. Matar a cloro, Biofilm, y ensayos de EPS. Para el anlisis de la supervivencia de cloro, 5.1 x 10 7 bacterias se incubaron con NaOCl 3 ppm de 0 min y 5 min a 30 C. Bacterias que sobreviven se enumeran en los dos puntos de tiempo por el conteo de placas viable de bacterias que haban sido vortex con cuentas de vidrio de 3 mm para formar una suspensin de clulas individuales. Formacin de biopelculas se analiz como se describe ( 18 ). La produccin de EPS se detect mediante el uso de un ensayo en fase slida de sobrenadantes de cultivo y un antisuero especfico de EPS. Seccin anteriorSeccin siguiente

RESULTADOS Y DISCUSIN
La variante rugosa de la colonia V. cholerae 01 El Tor. V. choleare O1 Inaba, biotipo El Tor, la cepa 1552, aislada en 1992 de un paciente con clera que haba viajado recientemente en Amrica Latina, se cultiv a 30 C con aireacin durante 20 das en condiciones de limitacin de carbono en el medio mnimo M9 suplementado con 0,02% de glucosa. Revestimiento de la partida (carbn repleto) y final (de carbono muerto de hambre) los cultivos en agar LB mostr que un cambio notable en la morfologa colonial se haba producido: 1% de las colonias cultivadas a partir de la cultura de hambre estaban arrugadas y opaco (Fig. 1 A ) en comparacin con las colonias suave y translcida de la cultura unstarved. En caldo de cultivo esttico, estas colonias tambin se observ arrugado para formar unas pelculas flotante que contiene las bacterias muy juntos (Fig. 1 Recuadro B ). Por el contrario, la variante suave colonial creci por debajo de la superficie del caldo como una suspensin de clulas individuales.

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Figura 1 La variante rugosa colonial de V. cholerae O1 El Tor produce un glicoclix extracelular. ( A ) morfologa de las colonias de las variantes lisa y rugosa en agar LB a 30 C durante 72 horas. ( B ) la formacin de pelcula por la variante rugosa crecido en caldo LB durante 72 horas. El tipo de colonia rugosa forma una membrana flotando en la interfase aire-caldo en el que cubre la superficie de vidrio del tubo de cultivo. Microscopa electrnica de barrido de la pelcula muestra que se compone de bacterias muy juntos ( recuadro ). La variante suave crece principalmente por debajo de la superficie. ( C ) rutenio roja manchada de secciones delgadas de colonias lisas y rugosas. Micrografas electrnicas muestran una matriz manchado entre rugosa tipo de bacterias. ( D ) inmuno microscopa electrnica de fina de seccin colonias lisas y rugosas. Una EPS ETR antisuero especfico localizado entre el polisacrido antgeno rugoso tipo de bacterias. [Barras = 5 micras ( B ) y 1 micras ( C y D ).] Una revisin de la literatura ms antigua revel que el tipo de colonia arrugada era, de hecho, la variante rugosa descrito por Balteanu en 1926 y Blanca en 1938 (19 ). Ms recientemente, el arroz y otros . ( 20 ) variantes rugosas aislados durante la reciente epidemia de clera en Amrica Latina y puso de manifiesto que la rugosidad se asocia con aumento de la supervivencia en el agua clorada, en comparacin con la forma suave de las colonias, y Morris y sus colegas ( 21 ) mostraron que la variante rugosa podra causar una tpica enfermedad del clera diarrea cuando se administra oralmente a los voluntarios, una observacin que indica que la forma rugosa, no es ms que una curiosidad de laboratorio. Un reciente estudio de la variante rugosa por Wai et al. ( 11 ) demostr que poda producir una capa de superficie de la cpsula-como y agarrar mejor al cristal de la variante suave ( 11 ). Para saber si in vitro el cambio entre los tipos de colonias lisas y rugosas se produce durante el cultivo en caldo nutritivo, colonias aisladas de la variante lisa o rugosa fueron inoculados en frascos separados de caldo de LB y se incubaron durante 5 das a 30 C con aireacin. A las 24 horas y 120 horas diluciones seriadas de los cultivos se agitaron con cuentas de vidrio de 3 mm para producir una sola clula suspensiones y inoculadas en agar LB, y el nmero de colonias rugosas y lisas fueron contados. Por 24 horas de incubacin, el 0,05% de las bacterias de tipo liso se haba convertido al morfotipo rugosa y el da 5, la proporcin de bacterias de tipo rugoso haba aumentado a 6,0%. El cambio de la rugosa para el morfotipo suave tambin se observ: el da 5 de 10.2% de bacterias de tipo rugoso haba convertido a la forma suave de colonias. Por lo tanto el cambio bidireccional entre los dos tipos de colonias se produce y favorecera consecuencia de la variante ms adaptada a un ambiente particular. Rugosidad se asocia con la produccin de EPS. Para apreciar mejor la naturaleza de las adherencias interbacterial entre bacterias de tipo rugoso, que creci cada tipo de colonia separada en las membranas de celofn estril colocada en la superficie de agar LB y luego se examina la pelcula resultante de bacterias por tincin de cortes ultrafinos con rutenio rojo seguido por microscopa electrnica de transmisin . Este mtodo, que preferentemente las manchas de polisacridos cidos ( 22 ), revel una abundante, el rutenio rojo-positivo de la matriz entre las bacterias de tipo rugoso (Fig. 1 C ), sin este material se hizo evidente en las pelculas compuestas de la variante colonial lisa (Fig. 1 C ). Por el contrario, la recientemente descrita cpsula-como capa rugosa de una variante del biotipo El Tor por Wai y sus colegas ( 11 ) se encontr que estar estrechamente relacionada con la superficie bacteriana. El rojo de rutenio-positivo material fue aislado y sometido a la composicin de glicosil y anlisis de ligamiento ( 15 ) para determinar si era idntica a la anteriormente caracterizada V. cholerae polisacridos. Se encontr que contienen cantidades casi iguales de glucosa y galactosa, con pequeas cantidades de N -acetilglucosamina y manosa (Tabla 1 ). Este resultado lo distingue claramente la composicin del material de tipo cpsula, aislados por Wai et al. (11) a partir de una variante rugosa de una V. cholerae El Tor cepa, que inform carecan de glucosa y contenidos 6-desoxi- D -galactosa, de V. cholerae O1 lipopolisacrido, que contiene grandes cantidades de perosamine y quinovosamine ( 23 - 25 ), y del polisacrido capsular de la V. cholerae O139, que al parecer evolucion de un antepasado El Tor ( 26 , 27 ) y contiene 3,6-dideoxyxylohexose ( 28 ). El anlisis de ligamiento detectado cantidades casi iguales de 4 vinculados galactosa y glucosa 4-vinculada (tabla 1 ) y por lo tanto, estos pueden contener la columna vertebral (s) del sacrido. Ramificacin se indica por la presencia de 3,4 - y 4,6-vinculados galactosa y glucosa y 2,4-galactosa vinculada (tabla 1 ).Posteriormente se trabajar revelar la estructura

completa y si contiene acetato, piruvato, o succinato comn sustituyentes de exopolisacridos bacterianos que aumentar la hidrofobicidad del compuesto y, cuando cetal-linked, que imparten una carga negativa ( 29 , 30 ).

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Tabla 1 Glicosil composicin y anlisis de ligamiento de EPS Para determinar si este material fue localizado en el compartimiento de interbacterial mismo que el rojo de rutenio-positivo material mostrado en la figura. 1 C , un antisuero para las bacterias de tipo rugoso, se obtuvo en un conejo, absorbe sin problemas de tipo bacterias y se utiliza para realizar inmuno- microscopa electrnica de fina de seccin colonias lisas y rugosas. Las partculas de oro localizada entre adyacentes tipo rugoso-bacteria, pero no se unen entre o dentro de bacterias de tipo liso (Fig. 1 D ). Como resultado de estos hallazgos se propone la designacin EPS ETR , para denominar a los polisacridos extracelulares producidos por la variante rugosa del biotipo El Tor. EPS ETR Media la supervivencia de cloro y la formacin del biofilm. El cloro ha sido el principal medio de prevencin de enfermedades infecciosas transmitidas por el agua, incluido el clera, desde la primera dcada de este siglo ( 31 ). Para saber si EPS ETR puede ser responsable de la resistencia al cloro relativa de la variante rugosa por otros ( 20 ), se realiz un experimento de supervivencia de la variante suave de hipoclorito de sodio (NaOCl) que contienen diferentes concentraciones de BPA ETR . Para los experimentos se describe a continuacin, se utilizaron concentraciones de NaOCl que son 10 - a 20 veces superiores a las concentraciones de cloro libre por lo general obtenido en el suministro de agua municipal. NaOCl (3 ppm) se incub con 2,0 10 7 unidades formadoras de colonias de bacterias de tipo suave, y las bacterias sobrevivientes fueron enumerados por el conteo de placas. No hay sobrevivientes de bacterias de tipo liso se detectaron despus de un perodo de exposicin de 5 minutos (Fig. 2 A ). Por el contrario, en las mismas condiciones experimentales, 6 x 10 4 bacterias de tipo rugoso, segn lo determinado por el conteo de placas de bacterias dispersas, sobrevivieron a la exposicin NaOCl, lo que confirma la observacin de Rice et al. ( 20 ) que la variante suave de cloro es sensible, mientras que la variante rugosa es relativamente resistentes a cloro. Sin embargo, lisa tipo de bacterias podra convertirse en un estado de resistencia al cloro en relacin con la adicin de EPSETR : la presencia de 125 mg / ml, 250 mg / ml, y 500 mg / ml de EPS ETR result en 0%, 0,03 % y el 25% de supervivencia, respectivamente, de buen tipo bacterias expuestas a NaOCl 3 ppm durante 5 min. Este efecto protector podra aumentar drsticamente de la preincubacin de NaOCl con EPS ETR antes de la adicin de estos reactivos a una suspensin de bacterias de tipo suave. Bajo esta condicin experimental, la concentracin mnima de EPS ETR (125 ug / ml) confiere una proteccin completa (Fig. 2 B ) en contra de NaOCl 3 ppm. En conjunto, estos experimentos sugieren que la EPS ETR es directamente responsable de la resistencia al cloro de la variante rugosa. Esta posibilidad ha sido probado an por determinar si la EPS ETR puede consumir de otra manera o inactivar el cloro, una propiedad se indica anteriormente para el cido algnico que contienen lodo producido por las variantes mucoides de Pseudomonas aeruginosa ( 32 ). NaOCl (6 ppm) se incub durante 1 minuto con diferentes concentraciones de BPA ETR , la concentracin resultante de cloro libre despus se midi por el mtodo de siringaldazina ( 33 ). En ausencia de EPS ETR ningn cambio en la concentracin de cloro se observ. Por el contrario, en presencia de EPS ETR , un consumo dependiente de la dosis de cloro libre se ha detectado (Fig. 2 C ), en la mayor concentracin ensayada de EPS ETR (200 ug / ml), el 80% de la concentracin inicial de libre cloro se consume en el perodo de reaccin de 1 min.

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Figura 2 EPS ETR mediada por la supervivencia en el cloro y la formacin de biofilm por las variantes colonial rugosa y lisa.( A ) liso tipo bacterias se incubaron durante 5 min con 3 ppm de cloro (hipoclorito sdico) y las concentraciones indicadas de EPS purificado ETR. Las bacterias sobrevivientes fueron enumerados por el conteo de placas viable, y su nmero en comparacin con el nmero de bacterias sobreviven sin problemas que no haban sido incubadas con NaOCl, denotado por

C, este nmero se define como 100% de supervivencia. Aumentar la supervivencia de la variante suave de cloro fue conferido por EPS ETR concentraciones de 250 y 500 mg / ml. Rugosas y las bacterias lisas, se incubaron con NaOCl 3 ppm en ausencia de factores exgenos EPS ETR , denotado por R y 0, respectivamente, no revelaron diferencias entre la resistencia intrnseca de las dos variantes coloniales de la actividad bactericida del cloro. ( B ) La preincubacin de NaOCl (3 ppm) con las concentraciones indicadas de EPS ETR durante 5 minutos antes de la adicin de bacterias de tipo suave incremento del efecto protector de los polisacridos. C denota la supervivencia de las bacterias de tipo suave, en ausencia de NaOCl y EPS ETR . ( C ) El consumo de cloro libre por purificada EPS ETR . NaOCl (6 ppm) y las concentraciones indicadas de EPS ETR se incubaron en PBS durante 1 min a 22 C, y la concentracin de cloro libre despus se determin por el mtodo de siringaldazina. EPS ETR causado rpida, dependiente de la concentracin del consumo de cloro. ( D ) El anlisis cuantitativo de la formacin de biofilm por las variantes lisas y rugosas. Las bacterias de cada tipo de colonia (1-5 x 10 6 unidades formadoras de colonias) se incubaron en un lugar distinto de un plato de microtitulacin de poli (cloruro de vinilo) para los perodos indicados, los pozos se vacan y se lavan, y las bacterias adheridas se tieron con una solucin al 1% de cristal violeta. El colorante se solubiliza por la adicin de etanol al 95%, y la absorbancia se determin a 560 nm. Formacin de biopelculas progresiva por la variante rugosa est indicado por un aumento de un 560 durante el perodo experimental. La propensin de la variante colonial rugosa para recubrir las paredes laterales de vidrio de un tubo de cultivo, evidente en la figura. 1 B , nos llev a estudiar formalmente el biofilm que forman el comportamiento. Cada variante colonial se cultiv en un lugar distinto de nueve placas de microtitulacin de poli (cloruro de vinilo), y el biofilm se cuantific en el momento 0 y una vez cada hora a partir de entonces. Tipo rugoso-bacteria mostr un aumento en funcin del tiempo de la colonizacin de la superficie (Fig. 2 D ). Por el contrario, la variante colonial suave adherido mal durante el perodo de observacin de 8 horas. Para saber si las aparentes diferencias en la capacidad de formar biofilm entre las dos variantes colonial podra haber sido causado por las diferencias en sus tasas de crecimiento, que se cultivaron durante 8 horas en el mismo medio, y sus concentraciones se determinaron por nefelometra cada hora despus de ser dispersados como una sola clula suspensiones. No se observaron diferencias en la tasa de crecimiento se han detectado (datos no mostrados). Para obtener ms informacin acerca de la arquitectura tridimensional de las bacterias adheridas, se realiz la microscopa de barrido lser confocal (SCLM) el uso de bacterias lisas y rugosas que lleva un lugar plsmidos codifican constituitively que expresa la protena verde fluorescente ( 34 ). Bacterias lisas y rugosas se incubaron por separado en las cmaras que contienen cubres de borosilicato. Despus de 1, 2, 4, 6 y 24 horas, los pozos se vaciaron y examinados por SCLM. Secciones pticas del sustrato a la superficie del biofilm se obtuvieron. Serie horizontal ( xy ) secciones se proyectaron utilizando un algoritmo de mxima intensidad y, cuando se ve a bajo aumento, mostr que la variante rugosa formas islas discretas e irregulares de la superficie adherente-agregados de bacterias dentro de 1 hora de incubacin. En comparacin, suave de tipo bacterias adheridas al sustrato como clulas individuales (Fig. 3 A y B ). Por 6 horas, aproximadamente el 4% del sustrato se compone de la totalidad de las bacterias asociadas, entre los agregados, las bacterias individuales se vieron adherirse a la superficie de vidrio (Fig. 3 B ). La reconstruccin de estas imgenes a lo largo del xz eje dado un perfil sagital de la biopelcula y demostr que los agregados mencionados forman picos y crestas que un promedio de 30,3 m de altura por el punto de tiempo de 6 horas (Fig. 3 C ). Pocos cambios en la altura de los agregados adherente ocurri con el envejecimiento de la biopelcula en este sistema esttico. Por el contrario, lisa tipo de bacterias forman un biofilm bajo perfil, con un promedio 11,7 m de altura (Fig. 3 C ).

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Figura 3 Reconstrucciones tridimensionales de los biofilms formados por las variantes colonial liso y rugoso. Bacterias de tipo liso y rugoso que lleva un plsmido constituitively que expresan la protena verde fluorescente se incubaron en cmaras que contienen el fondo de borosilicato cubre objetos.Los pozos se vaciaron en el 1, 2, 4, 6 y 24 horas, se lavan, y se examinaron con un microscopio lser confocal de barrido (Multiprobe 2010, Molecular Dynamics) con 488 - y 510-nm de excitacin y de emisin de longitudes de onda, respectivamente. ( A y B ) Horizontal ( xy ) las imgenes proyectadas en la ampliacin de bajo y alto, respectivamente, de los biofilms formados por los dos tipos de colonias despus de un perodo de incubacin de 6 horas. Islas de agregados de bacterias adheridas tipificar el biofilm de tipo rugoso. ( C ) la

reconstruccin de la imagen llev a un sagital ( xz ) vista de las biopelculas mismo y revel grandes diferencias entre sus alturas. La intensidad relativa de las imgenes pseudo-color se muestra en la esquina inferior derecha y se correlaciona con la densidad celular. [50 M Bares ( A ) y M 10 ( B y C)] 18. La identificacin de un grupo de genes necesarios para fenotipos de la Variante colonia rugosa. Las caractersticas hasta ahora asociados con el fenotipo rugoso - una morfologa colonial distintiva, la produccin de EPS ETR , resistencia al cloro, y la formacin de biofilm - podra ser casualidad o relacionados coregulated o determinado por genes (s) en un solo lugar. Para abordar esta cuestin, la variante colonial rugosa fue sometido a mutagnesis de transposones, y el resultado transconjugantes fueron seleccionadas por bajo consumo de energa de microscopa para identificar mutantes que se haban sometido a una transicin rugosa a lisa en la morfologa colonial. De 150.000 transconjugantes seleccionados, se analizaron 29 que fueron fenotpicamente uniforme. A diferencia de la variante suave de tipo salvaje, ninguno de estos mutantes volvi al fenotipo rugoso. Los sitios de insercin de transposones fueron clonados en el rescate marcador, y las regiones que flanquean fueron secuenciados. Seis de las secuencias se encontraron en ms de un clon, lo que indica que la insercin del transposn haba llegado a la saturacin. Las secuencias de protena deducida a partir del 20 de estas etiquetas de secuencias fueron homlogas a 11 EPS y funcionalmente diferentes protenas capsulares la biosntesis de otras especies. Se incluyeron las protenas con las siguientes funciones: precursor de la sntesis de nucletidos de azcar; glicosil transferasas y las polimerasas, la secrecin de EPS y EPS de modificacin por la adicin de grupos noncarbohydrate ( 35 - 43 ) (Tabla 2 ). Una etiqueta de secuencia adicional corresponda a los homlogos de genes tirosina fosfatasa en los grupos de genes EPS de Ralstonia solanacearum y Erwinia amylovora ( 38 ) (Tabla 2 ). De los 29 mutantes, slo cuatro no homlogo de identificacin y no formaban parte de la V.cholerae O1 serotipo O139 lipopolisacridos o grupos de genes cpsula ( 44 , 45).

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Tabla 2 Anlisis de secuencias de transposones etiquetados genes revela homologas con motivos de la biosntesis de polisacridos Para determinar si estas secuencias estn vinculados fsicamente en el V. choleraeO1 cromosoma, una biblioteca de csmidos se prepar a partir de la variante suave y la superposicin de csmidos que contienen secuencias de EPS que fueron identificados por la biblioteca utilizando como sondas las etiquetas de secuencias de los mutantes 8, 21, 35 y 74 (Tabla 2 ). Restriccin y anlisis del Sur (Fig. 4 A y B ) mostr que los 29 secuencias asignadas a csmido-3, que abarca 30,7 kb en el V. cholerae cromosoma. Veinte de los mutantes transposn, en representacin de cada uno de los 14 grupos de homologa listados en la Tabla 2, fueron analizadas por EPS ETR de produccin utilizando el antisuero se ha descrito anteriormente y en la fig. 1 D . Todas las EPS fueron ETR antgeno-negativos (Fig. 4 C ). Sin embargo, el morfotipo rugosa y EPS ETR de produccin fueron restauradas en cada uno de complementacin con el csmido-3 (Fig. 4 C ).Seis de los mutantes (nn. 21, 35, 39, 50, 59 y 69, Tabla 2 y fig. 4 ), la acogida o el vector de clonacin o csmido-3, tambin se pusieron a prueba la sensibilidad de cloro y la capacidad de formacin de biofilm. Todos los mutantes analizados fueron asesinados por completo cuando se incuban con NaOCl 3 ppm durante 5 min a 30 C, mientras que cada uno de los mutantes complementados por csmido-3 tenan niveles rugosa tipo de resistencia al cloro. Del mismo modo, estos mutantes fueron incapaces de formar biofilms de tipo rugoso, pero se recuperaron capacidad de formacin de biofilm cuando se complementa con el csmido-3 (datos no mostrados). Csmido-3 lo cual implica un grupo de genes necesarios para la EPS ETR de produccin, que designamos vps ( Vibrio sntesis de polisacridos). Estos resultados tambin proporcionan pruebas convincentes de que vps y su producto, EPS ETR , se requieren para cada uno de los rasgos asociados a rugosa descrito anteriormente.

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Figura 4

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La identificacin de secuencias de la V. cholerae O1, El Tor cromosoma que se requieren para EPS ETR de produccin. ( A ) Mapa fsico del csmido-3 derivados de mapeo de restriccin y el sur de anlisis de ADN de insercin. E indica Eco sitios de restriccin RI. ( B ) Ubicacin de fragmentos de ADN marcados en csmido-3. Csmido-3 fue digerido con Eco RI, los fragmentos de restriccin fueron separados por electroforesis de agarosa al 0,8% en gel, transfirieron a membranas, y se hibridan con las etiquetas de secuencias radiomarcada de cada uno de los mutantes indicados (identificado por el nmero encima de cada autorradiografa y que corresponden a los nmeros designacin en la Tabla 2 ). Los tamaos de los fragmentos de hibridacin se indican. ( C) EPS ETR de produccin por los mutantes albergar tanto el vector de clonacin solo o complementado con csmido-3, segn lo determinado por ELISA sobre una membrana de nitrocelulosa con un EPS ETR antisuero especfico. Sobrenadantes de las lisas (S) y rugosa (R) contienen variantes EPS crudo ETR fueron incluidos como controles positivos y negativos, respectivamente. Purificada EPS ETR fue utilizado como control positivo adicional. Csmido-3 complementado EPS ETRde produccin por cada uno de los mutantes. El uso de las etiquetas de secuencias como sondas para estudiar el biotipo clsico de V. cholerae O1 revel que tambin contiene el vps grupo de genes (datos no mostrados). Sin embargo, no fuimos capaces de inducir a las cepas clsicas en nuestra coleccin de adoptar el fenotipo rugoso. EPS ETR de produccin por el biotipo clsico pueden requerir diferentes condiciones de induccin. Por otra parte, el biotipo clsico podra carecer de crtica genes reguladores o accesorio o su vps grupo de genes puede ser incompleta. Si es as, esto podra explicar la capacidad que indica superior del biotipo El Tor de persistir en reservorios ambientales ( 46 , 47 ). La fase acutica de la V. cholerae O1 ciclo de vida parece abarcar varias etapas, las transiciones entre estas etapas es probable controlado por las caractersticas fsico-qumicas del hbitat, que, a su vez, el clima determinado. Etapa especfica de la adaptacin a las cambiantes condiciones ambientales que representan la capacidad de este organismo de persistir en hbitats acuticos como un miembro ms o menos permanente de la flora autctona ( 2 , 7 , 48 ). Con respecto a la etapa de biofilm, un modelo de dos compartimentos se ha sugerido ( 18 , 49 , 50), con oscilaciones entre los que nadan libremente, las bacterias individuales y la poblacin bacteriana en la superficie adjunta comunidades. Mayor complejidad se introduce por etapas adicionales consistentes en zooplancton, fitoplancton, y la viable, pero no cultivable, el estado ( 7 , 8 ). Nuestras conclusiones de que la variante rugosa colonial de V. cholerae O1, biotipo El Tor expresa una EPS nos ha llevado a centrarse en la etapa del ciclo de biofilm del organismo vida del medio ambiente. Dentro del biofilm, las bacterias pueden tener acceso a los nutrientes atrapados y adsorbidos, participar en transacciones favorables metablicas con otros miembros de la biopelcula (que en la naturaleza pueden contener especies heterlogas), y estar protegidos de los depredadores de pastoreo ( 51 , 52 ). La observacin de que EPS ETR confiere resistencia al cloro predice que tambin puede proporcionar proteccin contra los oxidantes naturales del medio ambiente y, de hecho, la variante rugosa se ha demostrado que es relativamente resistente a H 2 O 2 ( 11 ). La emigracin de la biopelcula podra generar nuevas comunidades en otras partes, un proceso que puede requerir la digestin de la matriz localizada interbacterial. Adems de contribuir a la liberacin de organismos biofilm, la fase de liberacin del proceso podra proporcionar una fuente utilizable de carbono. Visto de esta manera, la etapa de biofilm en s es una de varias etapas, el fenotipo multifuncional. Nuestros estudios fueron realizados con superficies sintticas y los medios de comunicacin. Ahora ser importante saber si V. cholerae O1 El Tor pueden ser identificados dentro de los biofilms en ambientes infectados de forma natural y la correlacin de la etapa de formacin de biofilm con el cambio climtico y la epidemiologa del clera. Seccin anteriorSeccin siguiente

Reconocimientos
Damos las gracias a R. Fernndez para la realizacin de la microscopa electrnica, SL para la realizacin de Palmieri microscopa lser confocal, Valdivia R. y S. Falkow para proporcionar la protena verde fluorescente plsmido, D. Holden para proporcionar la firma de etiquetado mutagnesis piscina, y Bieber D. , D. Kaiser y B. Stocker para la lectura crtica del manuscrito. El anlisis de carbohidratos se llev a cabo por el Centro de Investigacin de Carbohidratos Complejos de la Universidad de Georgia. Este trabajo fue financiado por el subsidio RO1-AI43422 de los Institutos Nacionales de Salud.

A Vibrio cholerae isla de patogenicidad asociados a las cepas epidmicas y pandmicas

1. 2. 3. 4. 5. 6. David KR Karaolis * , Judith A. Johnson , Camella C. Bailey * , Edgar C. Boedeker * , James B. Kaper * , y Peter R. Reeves +Afiliaciones de los autores 1. * Centro de Desarrollo de Vacunas y Departamento de Patologa, Universidad de Maryland Escuela de Medicina de Baltimore, MD 21201; Departamento de Asuntos de Veteranos, Maryland Health Care System, Baltimore, MD 21201, y Departamento de Microbiologa (Go8), Universidad de Sydney, Nueva Gales del Sur 2006, Australia
1. Comunicada por Harley W. Luna, Iowa State University, Ames, IA (recibido para revisin 02 de octubre 1997)

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Abstracto
La especie bacteriana Vibrio cholerae incluye cepas inocuas acuticos, as como las cepas capaces de causar epidemias y pandemias de clera. Mientras investiga la relacin entre los patgenos y cepas no patgenas, se identific una isla de patogenicidad cromosmica (PAI) que est presente en la epidemia y las cepas pandmicas, pero ausentes de las cepas no patgenas. Inicialmente, dos toxR genes regulados ( alda y tagA ) fueron estudiados y se encontr que se asocia con la epidemia y las cepas pandmicas, pero ausente en las cepas no toxignicas. La regin que contiene alda y tagA consta de 13 kb de ADN no identificados previamente y es parte de un programa de actuacin que contiene un regulador de genes de

virulencia (ToxT) y un grupo de genes que codifican un factor esencial la colonizacin y el receptor de la toxina del clera fagos (coregulated toxinas pilus; TCP). El PAI es de 39,5 kb de tamao, tiene una baja% G + C (35%), contiene genes putativos de la integrasa y la transposasa, est flanqueada por att sitios, y se inserta cerca de un gen 10Sa ARN ( ssrA ), lo que sugiere que puede ser de origen bacterifago . Nos pareci que este PAI en dos clnicas no-O1/no-O139 clera cepas de la toxina-positivos, lo que sugiere que puede ser trasladado dentro V.cholerae . La secuencia dentro de este PAI incluye una ORF con homologa con un gen asociado con el grupo de genes de tipo IV pilus de enteropatgenas de Escherichia coli , una transposasa de Vibrio anguillarum , y varios ORFs sin homologa conocida. A medida que el PAI incluye el receptor CTX, puede representar el factor inicial gentica necesaria para la aparicin de la epidemia y pandemia de clera. Proponemos llamar a esta isla VPI ( V. cholerae isla de patogenicidad).

virulencia

colonizacin

CTX receptor

En la ltima dcada, la epidemia de clera que amenaza la vida las enfermedades diarreicas ha llegado a una distribucin ms amplia que en cualquier otro momento en el siglo 20. El clera es causado por la bacteria Vibrio cholerae , que se pueden clasificar en ms de 140 serogrupos ( 1 ). Antes de 1992, se crea que slo V. cholerae del serogrupo O1 fueron los responsables de pandemia de clera y que las cepas de los serogrupos O1 que no eran virulentas o slo caus enfermedad espordica. Sin embargo, en 1992, una cepa O139 serogrupo surgido y enfermedades causadas por la epidemia ( 2 ). Los factores necesarios para la epidemia y la capacidad de la pandemia no se comprenden totalmente, y no ha habido grandes brotes de clera causada por cepas toxignicas no-O1/no-O139 que no se han traducido en importantes epidemia o pandemia de enfermedad ( 3 ,4 ). Epidemia y las cepas pandmicas de V. cholerae segregan la toxina del clera (CT), la toxina responsable de la diarrea secretora que es caracterstico de la enfermedad. CT es codificada por el ctxAB genes que se llevan en un bacterifago filamentoso designado CTX ( 5 ). El receptor bacteriano de este fago es el pilus toxinas coregulated (TCP), un factor esencial en los modelos de colonizacin humana y animal ( 6 , 7 ). Expresin de la TC y TCP se coregulated por el sistema de regulacin toxR que consiste en la toxR protenas, ToxS y ToxT ( 8 , 9 ).Recientemente, se ha demostrado que los genes TCPP y tcpH dentro del grupo TCP tambin regulan los factores de virulencia ( 10 ). El grupo de genes que codifican TCP, un factor de colonizacin de accesorios (ACF), y los genes de virulencia ToxT regulador se encuentran cerca unos de otros ( 11 ). Recientemente Kovach et al. ( 12 ) han encontrado que al lado del grupo de genes TCP es un gen de la integrasa ( int ) y un att sitio que marca el extremo derecho de un lugar nico en las cepas patgenas. Anteriormente, se obtuvo evidencia que sugiere que las cepas pandmicas 6 y 7 y del Golfo de EE.UU. costa V. cholerae O1 aisladas se pueden derivar de las cepas no toxignicas y que la transferencia horizontal se da en V. cholerae , dando lugar a la aparicin de nuevas cepas patgenas ( 13 , 14 ). Para extender estos resultados y entender mejor la estructura gentica de la poblacin de V. choleraey los factores que contribuyen a la epidemia y la capacidad de la pandemia, que inicialmente se estudi la variacin de prevalencia y la secuencia de dos genes bajo el control de toxR ( alda y tagA ). alda codifica un citoplasma CoA-independiente de la aldehdo deshidrogenasa (EC 1.2.1.3 ) ( 15 ) , mientras que el lado opuesto y se transcribe tagA codifica una lipoprotena ( 16 ). Como ningn papel evidente en la virulencia se encontr con un modelo de ratn ( 15 , 16 ), estos genes se cree que codifican funciones metablicas en lugar de virulencia, lo que resulta adecuado relojes moleculares y se estudi inicialmente en ese contexto. Nos informan de que alda y tagA son parte de una isla de patogenicidad 39,5 kb (PAI) que incluye el grupo TCP-ACF y est asociada con las cepas epidmicas y pandmicas de V. cholerae . Proponemos llamar a este lugar VPI (por V. choleraeisla de patogenicidad). Seccin anteriorSeccin siguiente

MATERIALES Y MTODOS
Las cepas bacterianas. Un total de 59 de tipo salvaje V. cholerae aisladas que comprende 29 cepas del serogrupo O1, 10 del serogrupo O139, serogrupos 20 de no-O1/no-O139, y un mimicus Vibrio aislado se utiliz en este estudio. La mayora de estas cepas se han descrito ( 13 ). V. cholerae N16961 es un CT-positivo pandemia sptimo O1 El Tor cepa aislada en Bangladesh en 1975 ( 47 ).Las cepas fueron analizadas para la presencia de ctx genes de ADN a un hybrization ctxAB sonda. Escherichia coli HB101 y DH5a fueron utilizados como anfitriones para el mantenimiento de clones de csmidos y plsmidos, respectivamente. Csmido vector pHC79 ( 17 ) se utiliz para la construccin de la N16961 biblioteca genmica, mientras que pBluescript + (Stratagene) se utiliz para la subclonacin ADN csmido. Las tcnicas de ADN recombinante. ADN genmico, csmido, y el plsmido se prepararon mediante el uso de los mtodos estndar ( 18 ). Una biblioteca de csmidos fue construido con ADN cromosmico aislado de N16961 parcialmente digerido con Sau 3AI para dar fragmentos de 30 kb. Los fragmentos fueron ligados en Bam HI-digerido pHC79, empaquetado in vitro con el lambda Gigapak embalaje del kit (Stratagene), y se usa para infectar E. coli HB101. Transformantes se seleccionaron en Luria-Bertani (LB) de agar que contiene ampicilina (200 mg / ml), y cada colonia se inocularon en pocillos separados de una placa de microtitulacin que

contienen caldo de LB y el 5% dimetilsulfxido. Microplacas se incubaron durante la noche a 37 C y una rplica chapada en filtros de nylon (Qiagen, Chatsworth, CA) para la hibridacin y posterior identificacin de clones de csmidos que contienen Alda. pDK8, un clon csmido de N16961 , fue seleccionado para el trabajo futuro. Subclones fueron creados por la digestin del ADN del csmido con Hin DIII y ligar en Hin DIII-digerido pBluescript +. La ligadura se electroporated en DH5a y seleccionados en agar LB con ampicilina (200 mg / ml). Los productos PCR de clones de csmidos pDK8 y la sptima cepa pandmicaN16961 se utilizaron como sondas para determinar si las secuencias correspondientes estaban presentes en preparaciones de ADN genmico de variasV. cholerae cepas. Los fragmentos se marcaron con [- 32 P] dCTP mediante el uso de la pgina Preparado para sistema de reparto (Pharmacia). Hibridaciones Southern blot se realizaron utilizando los mtodos estndar ( 18 ). PCR se llev a cabo esencialmente como se describe por Saiki et al. ( 19 ), con primers que figuran en la Tabla 1 . Localizacin de los cebadores se muestra esquemticamente en la fig. 1 . Extendido PCR con la Perkin-Elmer kit XL PCR y los tiempos de extensin de 12 minutos fue utilizado para amplificar la tagA -tagD regin en pDK8.

Tabla 1 Cebadores utilizados

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Figura 1 El VPI. Flechas por encima de los genes muestran PCR primers utilizados y se identifican por el nmero de la serie de Manuales KAR, mientras que las flechas dentro de los genes muestran la direccin de la transcripcin. , sondas utilizadas; , comn cromosmicas del ADN que flanquean; en cada extremo de VPI denota att sitios, y en el extremo izquierdo de la VPI indica la transposasa defectuoso. Los botones + y - indican la presencia y ausencia, respectivamente, de la regin en la epidemia y las cepas y cepas pandmicas no toxignicas. La secuenciacin del ADN de doble cadena a partir de csmidos, plsmidos, y los productos de PCR se llev a cabo con la Taq kit Dye Terminator secuenciacin (Perkin-Elmer) por el laboratorio de biopolmeros en la Universidad de Maryland utilizando un secuenciador automtico de ADN 373A (Applied Biosystems) .Cebadores universales que corresponden a los promotores T7 y T3 se utiliza cuando es necesario. Cebadores para PCR y secuenciacin fueron sintetizados con un sintetizador de ADN Applied Biosystems. Contigs secuencia se alinearon conSEQUENCHER versin de software 3.0 (Genecodes, Ann Arbor, MI). Base de datos de las comparaciones se realizaron con la herramienta bsica de bsqueda local de alineacin ( EXPLOSIN ) programa ( 20 ). Anlisis de la computadora se realiz mediante el uso de la Genetics Computer Group (Madison, WI) paquete (GCG), versin 8.0 ( 21 ). Nmeros de secuencia de nucletidos de adhesin. Las secuencias de nucletidos se describe en este documento han sido depositados en la base de datos GenBank (no la adhesin. AF034434 ). Seccin anteriorSeccin siguiente

RESULTADOS
Asociacin de alda y tagA con Epidemias y Pandemias V. cholerae . La prevalencia y la variacin de alda y tagA en V. cholerae se estudi en un gran nmero de cepas (patgenas y no patgenas), que fueron temporalmente (aos 1931-1994) y extendido geogrficamente. Anlisis de PCR con cebadores KAR3/KAR7 y KAR8/KAR9, y los resultados de la hibridacin con fragmentos obtenidos mediante el uso de estos cebos, mostr que alda y tagA se asociaron con CT-positivo epidemia y las cepas pandmicas. alda se encuentra en las cepas 24/29 de la O1 incluyendo aislamientos del serogrupo 6 y 7 de la pandemia, los aislamientos de la costa del Golfo de EE.UU., y las cepas aisladas durante dos brotes pandmicos pre-sptima (1937 Sulawesi, Indonesia y Egipto, 1954).Secuencia homloga a alda y tagA no se detect en 17 toxignicas ambientales O1, 3 clnicas O1 incluyendo un CT-1961 positivo cepa indonesia con ribotipos idnticas a las cepas pandmicas sptimo ( 13 ), o en dos clnicas CT-negativos cepas. alda estuvo presente en 6 serogrupo O139 CT-positivo, pero no en las cepas O139 CT-4 cepas negativas, y se identific en 2 cepas no-O1/noO139.Curiosamente, estos dos ltimos fueron aislados de la TC-positivo, y las dos cepas fueron asociados con brotes explosivos de diarrea en Checoslovaquia en 1965 (cepa ATCC25872) y el Sudn en 1968 (la cepa S-21). Ni alda o tagA se detectaron en el V. mimicus examinado de manera aislada. Estos resultados muestran que alda y tagA estn asociados con epidemias y pandemias V. cholerae. El examen de la alda gen de 24 aislamientos mostraron sus secuencias eran idnticas. Anlisis de los primeros 1.686 nt de tagA mostraron cerca de identidad entre los aislamientos, excepto que los dos no-O1/no-O139 CT-positivo cepas diferentes

de todas las otras cepas en la posicin 786 (nucletidos C T), que no alter el amino cido. Adems, en 1021 la posicin de las cepas pandmicas sexto fueron nicos en que tena una T dando un codn de serina, mientras que una pandemia sptimo, O139 Bengala, Golfo de EE.UU. costa, la cepa 1937 de El Tor de Sulawesi, y los dos CT-positivos no O1- / no-O139 cepas tenan una dando un un codn de treonina. Asociacin de alda y tagA con el grupo de TCP. La asociacin de alda ytagA con la epidemia y las cepas pandmicas nos llev a analizar en detalle la asociacin entre estos genes y tcp genes que estn asociados con patgenos V.cholerae ( 22 ). En primer lugar, determinar si la tcpA gen, que codifica la subunidad pilin de la TCP, estuvo presente en el alda - y tagA positivo cepas.Anlisis de PCR de la tcpA gen con primers especficos para KAR24/KAR25 sptima pandemia (biotipo El Tor) y las cepas especficas para una pandemia sexto (biotipo Clsico) cepas KAR24/KAR82 mostr que la presencia de tcpAcorrelacin del 100% con la presencia de alda y tagA . Este hallazgo nos llev a investigar si el grupo TCP se encuentra cerca de alda y tagA . Una biblioteca de csmidos N16961 se hibrid con sondas de alda , tagA y tcpA y ocho clones fueron identificados que figuran Alda, Taga, y tcpA secuencias en el mismo fragmento. Anlisis de PCR de uno de estos clones de csmidos (pDK8) y la cepa de tipo salvaje N16961 con cebadores KAR24/KAR25 identificado una espera 606-bp fragmento, y posterior hibridacin con este fragmento confirm que el grupo estaba cerca de TCP alda y tagA . Anlisis de PCR con cebadores KAR90/KAR91 [ubicado en el extremo 5 'de tagA y el extremo 5 'de tagD (junto aIRPC )] en el csmido pDK8, la cepa pandmica sptimo N16961 , y el sexto cepa pandmica 395 revel que tagA se 9 kb desde el extremo izquierdo del grupo TCP. Identificacin de la VPI y secuenciacin de ADN. Hibridaciones Southern de ADN cromosmico de un grupo de V. cholerae cepas con el 9 kb tagA - tagDfragmento de PCR obtenidos a partir de N16961 revel que esta regin se asoci con la epidemia y las cepas pandmicas y ausente de las cepas no toxignicas del medio ambiente. Debido a los resultados anteriores mostraron que alda y tagAtambin slo se encuentran en la epidemia y pandemia de V. cholerae , especul que el ADN circundante y el grupo TCP formaba parte de un lugar que se haba informado anteriormente que contiene un gen de la integrasa putativo ( int ) y uno al lado att sitio ( 12 ). Anlisis de PCR de N16961 con cebadores KAR22/KAR23 produjo una espera de 1,2 kb fragmento correspondiente a la int gen, mientras que la PCR del ADN junto con KAR85/KAR86 producido un fragmento de 0,6 kb. El uso de los 1,2 kb y 0,6 kb fragmentos como sondas mostraron que int se asocia con la epidemia y las cepas pandmicas y ausentes de las cepas no patgenas, mientras que el 0,6 kb adyacente se encuentra en todas las cepas. Esto confirma los resultados de Kovach et al. ( 12 ) que muestra que int se encuentra en el extremo distal de una regin nica de ADN que incluye el grupo de genes TCP. Aguas abajo de ADN de alda sido analizada para identificar el extremo izquierdo del lugar y por lo tanto totalmente definir el alcance de la nica regin en la epidemia y las cepas pandmicas. Cebadores KAR92 (extremo 3 'de alda ) y KAR93 (en el vector de clonacin pHC79) produjo un fragmento de PCR de 12 kb de pDK8. El anlisis de hibridacin mostraron que el fragmento contena ADN comn a ambas epidemias y las cepas pandmicas, y que las secuencias en este fragmento tambin se encontraron en las cepas ambientales. Estos resultados mostraron que el cruce a la izquierda de este lugar nico, que parece ser un PAI fue aguas abajo de alda . Proponemos llamar a esta isla de patogenicidad VPI. Para caracterizar el VPI, pDK8 fue digerido con Hin DIII, y los fragmentos resultantes se ligaron en pBluescript +. Secuencia de ADN de varios clones se determin inicialmente mediante el uso de secuencias de acompaamiento vector como sitios de imprimacin universal vinculante seguido de una estrategia de caminar con adelante y atrs diseado a partir de los extremos de cada serie de secuenciacin. Cebadores aguas abajo de alda fueron diseados y utilizados en la PCR con V. cholerae cepas para identificar el extremo izquierdo de la VPI.Cebadores KAR96/KAR97 gener un fragmento de la esperada de 0,8 kb de tamao que era especfico para cepas epidmicas y pandmicas, mientras que el fragmento adyacentes producida por primers KAR94/KAR95 dio un solo fragmento de 1,4 kb que fue comn a todas las cepas probadas. Hibridacin con estos fragmentos confirm que haba identificado la regin que contiene el extremo izquierdo de la VPI y que no haba 13 kb entre el cruce a la izquierda ytagD . Anlisis de secuencias de ADN nuevo. La VPI se muestra en la figura. 1 . La secuencia de ADN de los 13 kb entre el cruce a la izquierda y tagD y varios kilobases que flanquean el extremo izquierdo de la VPI se compar con la base de datos GenBank utilizando la EXPLOSIN algoritmo ( 20 ). Dentro de la VPI cerca del cruce a la izquierda, un ORF (ORF1) se identific con una homologa significativa (58% de identidad ms de 109 aa) a la bfpM gen de enteropatgena E. coli (EPEC) (sin GenBank. U27184 ) ( 23 ). En EPEC este gen se encuentra en un plsmido y se asocia con un grupo de genes que codifican el tipo IV paquete que forman pilus (BFP), que se cree que participan en la fijacin inicial de las cepas de EPEC a las clulas husped eucariticas ( 23 , 24 ). Despus de cuatro carreras independientes de secuenciacin en esta regin (dos en cada sentido) se encontr que ORF1 (325 codones que codifican una protena potencial de 38,2 kDa) es considerablemente mayor que la publicada EPEC bfpM gen (109 codones) (GenBank adhesin no. L07028 ) ( 23 ). Que el correspondiente E. coli abajo secuencia de bfpM no est en la base de datos, no podemos especular sobre si estos investigadores han encontrado slo una parte de la E. coli del gen. ORF1 tambin mostr una homologa significativa con transposases varias encontrado en otras especies bacterianas como la TNPA gen de nicotinovorans Arthrobacter(31% de identidad ms de 324 aa) (GenBank no. X97015 ), lo que sugiere que ORF1 es una transposasa. Es muy posible que el bfpM en las funciones de EPEC como una transposasa y est involucrado en la transferencia de la agrupacin de genes BFP. Aguas abajo junto a ORF1 y de alda es una regin que muestra homologa con una transposasa (ISV-3L) se encuentra en Vibrio anguillarum (88% de identidad) (GenBank no. L40498 ) ( 25 ) y la transposasa de Tn903 en E. coli (48% de identidad) (sin GenBank. I77546 ) ( 26 ). Este transposasa parece ser funcional, ya que es un codn de parada y una delecin de 30 aa en la regin central en comparacin con la transposasa en V. anguillarum . Anlisis del ADN en el extremo 3 'de tagA revel una discrepancia entre la secuencia publicada generados a partir de la cepa pandmica sexto 395 ( 16 ) y la de la cepa pandmica sptimo N16961 utilizados en este estudio. Secuenciacin de mltiples carreras de ambas cadenas de ADN de los tagA gen en pDK8 (un clon csmido de la cepa pandmica sptimo N16961 ) y la confirmacin de la tagAsecuencia de pDK29 (un clon csmido de la cepa pandmica sexto 395) mostr que entre los nucletidos 1685 y 1692 (nmeros en la secuencia publicada) haba siete residuos de T, en contraste con los seis reportados para la publicacin 395tagA gen. Esto altera nucletido adicional el marco de lectura y aumenta considerablemente el tamao

de la protena codificada en un gen putativo grandes de 1.002 a bis (peso molecular predicho de 114,6 kDa) en lugar de 568 bis (64 kDa) se ha informado de la prediccin tagA protena de 395. El ADN entretagA y tagD contiene tres ORFs (incluido otro gran ORF) sin homologa evidente para cualquier secuencia en la base de datos. Entre ellos ORF2, ORF3 y ORF4, que codifican las protenas potencial de 379 aa (43,9 kDa), 1111 bis (126,4 kDa) y 285-332 aa (32,8-37,6 kDa, dependiendo de que el codn de inicio se utiliza), respectivamente. ORF4 contiene un motivo asociado con metaloproteasas ( 27 ).El tagA gen, ORF2, ORF3, ORF4, y tagD se transcriben en la misma direccin sin transcripcin evidente Terminator, lo que sugiere que son un opern. tagD se encuentra junto al IRPC , el primer gen del grupo TCP ( 28 ). No hemos encontrado una homologa de bases de datos convincentes en el 2 kb adyacente a la unin a la izquierda de la VPI que era comn a todas las cepas. Anlisis de secuencias de unin izquierda y derecha. Hemos examinado el sitio de insercin de la VPI en la epidemia de varias cepas de la pandemia y descubri que era idntico en todas las cepas de VPI-positivos (Fig. 2 ). El sitio de insercin de la unin a la izquierda de la VPI era investigado por primera vez mediante el uso de cebos KAR94/KAR97. Estos cebadores de PCR gener una espera de 3 kb fragmento en todas las cepas de VPI-dieron positivo (pandemia sexta, sptima pandemia, del Golfo de EE.UU., O139, las dos cepas no-O1/noO139, y una cepa de 1937 Sulawesi). El sitio de insercin de la unin el derecho fue estudiado mediante el uso de cebos KAR87 (fuera de la unin en el mismossrA genes) y KAR23 (dentro de int ). Estos cebadores generado un esperado de 1.6 kb fragmento en todas las cepas anteriores. No hay fragmentos fueron producidos en cualquiera de las ocho cepas toxignicas prueba. Estos resultados muestran que el VPI se inserta en el mismo sitio cromosmicas en todas las cepas de VPI-dieron positivo. Para determinar si la secuencia real en el sitio de insercin fue idntico en todas las cepas, la secuencia de las uniones izquierdo y derecho contenido en los productos PCR de KAR94/KAR97 y KAR23/KAR87 obtenidos a partir de las cepas VPI-positivo. Secuenciacin confirman que la secuencia en el cruce a la izquierda y la derecha es idntico entre todas las cepas de VPI-positivos (Fig. 3 A ).

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Figura 2 PCR anlisis de los cruces a la izquierda y derecha de la VPI. ( A ) fragmentos de tamao similar que contiene el cruce a la izquierda para todas las cepas con los primers KAR94/KAR97. ( B ) similares que contienen fragmentos de tamao adecuado para la unin de todas las cepas con KAR23/KAR87. Carriles: 1, la cepa pandmica sexto 395, 2 , 7 cepa pandmica N16961 , 3, O139 Bengala cepa AI1837, 4, EE.UU. costa del Golfo de cepa E506, 5, 1937 Sulawesi cepa 66-2, 6, no-O1/no-O139 CT positivo ATCC25872 cepa de Checoslovaquia, 7, no-O1/no-O139 CT-positivos cepa S-21 en Sudn, centro de carril, 1-kb marcador.

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Figura 3 Secuencia de las uniones a izquierda y derecha de la VPI y su lugar de insercin en el V. cholerae cromosoma. (A ) Las uniones de izquierda y derecha de VPI. ( B ) att sitio en el extremo 3 'de la ssrA gen en tres VPI-negativos cepas. El texto en negrita indica attsitios. Tenga en cuenta que la ausencia de la adenina en la attsitio en el cruce a la izquierda de VPIpositivo de las cepas ( A) tambin se encuentra en el VPI-TC negativa-positiva cepa E9120 ( B ).Diferencias en la secuencia que flanquean la att sitio en el DK63 cepa VPI-negativos son subrayados ( B ). A continuacin, compar el sitio de insercin putativo de las cepas de VPI-positivas y negativas-VPI. Mediante el uso de cebadores que flanquean KAR94/KAR87 las uniones a izquierda y derecha, ninguna de las cepas de VPI-positivo dado un producto de PCR. Este resultado era esperado debido a que estas cepas contienen 40 kb entre los cebadores que est ms all de las capacidades de PCR en las condiciones empleadas. Cepas que carecen de VPI era de esperar para obtener un producto de 1,7 kb cuando se amplifica con estos cebadores, sino de ocho VPI-negativos cepas analizadas, slo tres obtuvieron los esperados de 1,7 kb fragmento. Sin embargo, los ocho cepas parecen tener similares regiones de acompaamiento porque la ssrA gen (a la derecha de VPI) podra ser amplificado utilizando cebadores KAR85/KAR86 y la regin a la izquierda de la VPI puede ser amplificada mediante el uso de KAR94/KAR95. Este resultado sugiere que no hay variacin en la secuencia en la regin correspondiente al extremo 3 'del cebador KAR87 o hay otro fragmento de ADN de tamao considerable se inserta en este sitio en estas cepas. Para investigar estas posibilidades, la PCR se realiz con los primers KAR94 y KAR86, ambos con xito fragmentos amplificados a partir de las ocho cepas cuando se combina con otros cebadores (ver arriba). El primer par KAR94/KAR86 amplificacin de fragmentos de los que slo tres cepas que producen productos con KAR94/KAR87 (datos no mostrados).El anlisis de Southern blot con el producto de PCR de la cepa de KAR94/KAR87E92120 como una sonda revel claras diferencias entre los patrones de bandas de las cepas (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que otro fragmento se puede insertar en este sitio y aumentar la posibilidad de que la regin de la V.cholerae VPI cromosoma que contiene puede ser un "punto caliente" para la insercin de elementos de ADN. Las tres cepas de VPI-negativos que produjo la esperada de 1,7 kb producto de PCR con primers KAR94/KAR87 fueron analizados por la secuencia de todo el attsitio. La secuencia de los productos amplificados mostraron que las tres cepas posean un solo att sitio en el extremo 3 'de la ssrA gen. La alineacin de estas secuencias con las de los cruces de izquierda y derecha de VPI-positivo cepas mostraron pequeas diferencias dentro y adyacentes a sus att sitio (Fig. 3 B ). Elatt sitios de los cruces a izquierda y derecha de VPI-positivo cepas comparten 13 de 20 nt, de un solo nucletido tambin se elimina de la unin de la izquierda en comparacin con el cruce a la derecha (Fig. 3 A ). Dos de los tres VPI-negativos cepas contienen att secuencias idnticas a las que se encuentran en el cruce de derecho de VPI-positivo de las cepas (Fig. 3 B ). La tercera VPI-negativos cepa contiene un att sitio en el que se elimina una adenina, similar a la supresin se ve en el cruce a la izquierda de VPI-positivo cepas. Curiosamente, esta cepa VPI-negativo (E9120) es CT-positivo, mientras que los otros dos VPI-negativos cepas son CT-negativo. E9120 cepa fue aislada en Indonesia al comienzo de la pandemia del sptimo (1961) y tiene un ribotipos idntica a la de las tpicas cepas pandmicas sptimo. Estos resultados sugieren que la E9120 es un aislado de la pandemia del sptimo, que ha perdido los valores VPI o es un aislamiento en relacin con el ancestro de la cepa pandmica sptimo que an no ha adquirido VPI. Debido a VPI contiene el grupo TCP que se requiere para la adquisicin de CTX, lo ms probable es que esta cepa, una vez contenida VPI y luego lo perdi. Estos resultados indican que el sitio de insercin y la secuencia en los extremos izquierdo y derecho de la VPI es idntico en todas las cepas de VPI-positivos, aunque algunos variacin de la secuencia se encuentra en la secuencia adyacente a la att sitio en VPI-negativos cepas. La escisin de VPI parece ser especfica y que no interrumpir el ADN adyacentes, lo que sugiere que la insercin de VPI implica una duplicacin parcial de la att sitio con la prdida de la adenina y la escisin de VPI restaura el nico att sitio a excepcin de la adenina. Con la identificacin de att sitios que flanquean el locus de ADN nico y la nueva secuencia obtenida, se ha calculado (utilizando el conocido TCP / ACF secuencia de grupo de la cepa 395;. nn GenBank X64098 y U39068 ) que VPI en la sptima pandemia O1 El Tor cepa N16961 es de 39,5 kb de tamao. Adems, se determin que la VPI tiene% sorprendentemente bajo contenido G + C (35%) en comparacin con la media de la genmica% G + C de la V. cholerae (4749%). Seccin anteriorSeccin siguiente

DISCUSIN
Se presenta la identificacin, secuencia y anlisis de la V. cholerae isla de patogenicidad (VPI). Se demuestra que el VPI est claramente asociada a la epidemia y las cepas pandmicas de V. cholerae . VPI contiene el descrito anteriormente V. cholerae determinantes de virulencia ToxT, TCP, y el ACF.Adems, demostramos que alda y tagA , as como varios ORFs con homologas con secuencias que antes no sabe que se producen en V. cholerae , tambin se encuentran en el VPI. Nuestra conclusin inicial de que alda secuencias son idnticas entre pandemia sexto, sptimo pandemia, EE.UU. aislados de la Costa del Golfo, y el serogrupo O139 cepas de Bengala estaba en fuerte contraste con nuestros resultados con elasd gen ( 14 ), que difiere entre las cepas pandmicas 6 y 7. El asd gen se encuentra en todos los V. cholerae a diferencia de las cepas de alda gen, que se limita a la epidemia y las cepas pandmicas. El alda secuencia es idntica en las cepas, mientras que otros genes en el VPI como tcpA ( 29 ) y tagA (este estudio) varan, lo que sugiere alda puede ser un marcador til para la identificacin gentica cepas potencialmente epidmicas y pandmicas. Se demuestra que el VPI es de 39,5 kb de tamao e incluye 13 kb de ADN no identificados previamente. Nuestra hiptesis es que todos los genes en el VPI es probable que sean importantes en la enfermedad, ya sea con un papel directo en la patognesis del clera o una funcin indirecta en la transferencia y movilidad de la VPI, creando el potencial para el surgimiento de la nueva epidemia y pandemia las cepas. La VPI contiene los genes, como tcpA que codifica un factor importante y la colonizacin del receptor para el CTX; toxT , TCPP y tcpH que codifican los reguladores de genes de virulencia, genes que puedan ser necesarios para la transferencia e integracin de la VPI (ORF1 y int ), y el ADN de la funcin sin caracterizar, pero potencialmente importante. El hallazgo de dos protenas codificadas potencial muy grande en el VPI (1002 y 1111 bis de tamao) es interesante como ORF de esta magnitud no se han reportado previamente para la V. cholerae y no son comunes en general. La VPI est flanqueada por att sitios que supuestamente funcionan como sitios de unin especfica entre este elemento y el cromosoma del husped bacteriano. Parece que la posesin de la VPI ha permitido

que determinadas cepas de V. cholerae (que normalmente es una bacteria acutica de agua y de estuarios) que se adaptan al medio ambiente intestinal humano y de xito que colonizar. Adems, el VPI permite que estas cepas a convertirse en una infeccin toxignicas siguientes CTX. La capacidad de colonizar y los resultados de CT secretan en cantidades copiosas de V.cholerae clulas que se excretan en las enfermedades diarreicas y por lo tanto permitira la supervivencia continuada del organismo en la naturaleza y su ventaja selectiva sobre las cepas no patgenas. La identificacin de los posibles genes de la integrasa y transposasa en cada extremo de la VPI sugiere que estos genes pueden tener un papel en la transferencia e integracin de la VPI en la epidemia y las cepas pandmicas. Recientemente, se ha encontrado que los genes implicados en la virulencia, la presencia de patgenos que distinguen a partir de cepas patgenas de las especies, a menudo agrupados en PAI. Estos PAI a menudo cerca de insertar genes de ARNt en el cromosoma bacteriano ( 30 - 32 ). PAI se han encontrado en las bacterias patgenas como enteropatgena E. coli (EPEC) ( 33 ), enterohemorrgicaE. coli O157: H7 (ECEH) ( 33 ), uropatgena E. coli ( 31 , 34 , 35 ), Yersinia pestis (36 ), Salmonella typhimurium ( 37 , 38 ), y Dichelobacter nodosus ( 39 , 40 ). La V.cholerae PAI es de 39,5 kb de tamao y se asocia con la epidemia y las cepas pandmicas de la especie. El VPI es similar a otros PAIs en que ( i ) que contiene grupos de genes de virulencia conocida ( tcp y ACF ), incluyendo un regulador de genes de virulencia ( toxT ), ( ii ) que ha supuesto tanto una integrasa y el gen de la transposasa y flanqueado es por att sitios, ( iii ) tiene bajo% de G + C en relacin con el contenido genmico total, y ( iv ) que se inserta en un sitio adyacente a un gen tRNA-como ( ssrA ). Recientemente se ha demostrado que 10Sa ARN acta para proporcionar una "terminacin" para los mRNAs incompleta sin los codones de parada y es una funcin muy presentes en las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas ( 41 , 42 ). Curiosamente, ssrA es tambin el sitio de insercin del PAI de la D. nodosus ( 40 ). Se ha sugerido que los PAI podra ser transferido por fagos de transduccin ( 43 ), y teniendo en cuenta las conclusiones de este estudio, es muy probable que el VPI es de origen fago. Uno puede imaginar que los fagos seleccionar este tipo de sitios, ya que estn muy presentes y, probablemente, fuertemente conservadas en la secuencia. A medida que la VPI no contiene genes escisin obvio que es posible que el VPI era originalmente un fago funcional que fue adquirida por V. cholerae y luego modificado por lo que es defectuoso y no a los impuestos especiales. Esto proporcionara una ventaja selectiva a estas cepas por cepas no patgenas en el que permanentemente tiene la capacidad de colonizar el intestino humano, se convierten en toxignico a travs de la posterior adquisicin de CTX, y as mantener sus nmeros en la naturaleza. Deleciones de regiones de ADN que contienen los factores de virulencia corto se ha informado de algunos patgenos, tales como Haemophilus influenzae yStreptococcus pyogenes ( 44 ). Sin embargo, antes de este estudio los nicos informes de otras supresiones de toda PAIs cromosmica de las bacterias han sido por Y. pestis ( 36 ) y uropatgenos E. coli ( 31 ). La ausencia de la VPI de una cepa O1 CT-positivos aislados en 1961 en Indonesia con un ribotipos idnticas a las cepas pandmicas sptima representa el primer hallazgo de una cepa pandmica CT-positivo que al parecer ha perdido el VPI. Anlisis de la secuencia del lugar de la escisin en el VPI-TC negativa-positiva cepa sugiere que la escisin es especfica y no alterar el ADN adyacente a la att sitio, sin embargo, que al parecer mantiene la secuencia de la VPI izquierda att escisin siguiente sitio. Esta situacin difiere de la que se encuentra despus de la escisin de los PAI en uropatgena E. coli , donde los resultados escisin en la eliminacin de parte de la adyacente gen tRNA ( 31 ). Es de notar que el VPI se encuentra en dos no-O1/no-O139 CT-positivo cepas.Una de estas cepas causaron un brote explosivo de las enfermedades diarreicas en Checoslovaquia en 1965 ( 3 ), mientras que el otro caus un brote en el Sudn en 1968 ( 45 ). La cepa O139 Bengala, que recientemente ha surgido y ha causado grandes epidemias de clera, es en la actualidad el mejor ejemplo que muestra que una cepa de un serogrupo no O1 puede causar enfermedades epidmicas.Nuestro hallazgo de vista epidemiolgico no asociada IVF y CT-positivo no-O1/no-O139 las cepas aisladas de diferentes continentes, en diferentes aos pone de manifiesto la importancia de la transferencia horizontal de genes en los grupos de emergencia y creacin de organismos patgenos. Es muy posible que las epidemias pasadas y futuras de clera pudo haber sido y podra ser causada por cepas no-O1/no-O139 si adquieren VPI y CTX. El VPI es claramente un requisito para la epidemia y pandemia de clera, la aparicin de lo que parece ser un procedimiento de varios pasos. Antes de convertirse en una cepa toxignica a travs de la infeccin con el CTX, el receptor TCP codificados en el VPI es necesario. As, el IVF puede ser el factor gentico inicial y esenciales para la epidemia y las enfermedades pandmicas. Los resultados de este estudio identificar el VPI completa y demuestran la existencia de genes de virulencia potencial que anteriormente eran desconocidas en V.cholerae . A medida que la VPI es uno de los requisitos de la epidemia y la capacidad de la pandemia y que parece ser capaz de someterse a la transferencia horizontal, nuestro estudio proporciona informacin importante sobre el surgimiento y la patognesis de la epidemia y pandemia de clera. Seccin anteriorSeccin siguiente

Reconocimientos
Damos las gracias a Lisa Sadzewicz del Fondo para el ncleo de biopolmeros, de la Universidad de Maryland, por su excelente asistencia tcnica en el componente de secuencia de este estudio. Esta labor fue apoyada por subvenciones del Servicio de Salud Pblica (AI35729) y el Departamento de Asuntos de Veteranos (a JAJ), los Institutos Nacionales de Salud (AI19716 a JBK), y el Consejo de Investigacin Australiano (A1913857 a esta enfermedad). Seccin anteriorSeccin siguiente

Notas al pie

A quin solicitudes de reimpresin deben ser tratados. e-mail:karaolis@umaryland.edu . Los datos de deposicin: La secuencia presenta en este documento ha sido depositado en la base de datos GenBank (no adhesin. AF034434 ).

ABREVIATURAS
CT , la toxina del clera ; TCP , toxinas coregulated pilus ; ACF , accesorios factor de colonizacin ;

PAI , isla de patogenicidad ; VPI , V. cholerae isla de patogenicidad Recibido 02 de octubre 1997. Aceptado 12 de enero 1998. Copyright 1998, La Academia Nacional de Ciencias

Los sistemas paralelos de Quorum Sensing Converge para regular de virulencia en Vibrio cholerae
Melissa B. Miller 1 , Karen Skorupski 2 , Derrick H. Lenz 1 , Ronald K. Taylor 2 , Bonnie L. Bassler 1 , 1
,

Departamento de Biologa Molecular, Universidad de Princeton, Princeton, NJ 08544 EE.UU. Departamento de Microbiologa e Inmunologa, Facultad de Medicina de Dartmouth, Hanover, NH 03755 EE.UU.

Recibido el 15 de abril de 2002, revisado 3 de julio de 2002, disponible en lnea 13 agosto de 2002.

Abstracto
La bacteria marina Vibrio harveyi posee dos sistemas de deteccin de qurum (Sistema 1 y Sistema 2) que regulan la bioluminiscencia. Aunque el Vibrio choleraesecuencia del genoma revela que una V. harveyi -como sistema de dos existe, no predice la existencia de una V. harveyi -como un sistema o cualquier qurum obvio sensores controlados por los genes diana. En este informe, identificar y caracterizar los genes que codifican un adicional de V. cholerae autoinductor sintasa y su sensor afines. Anlisis de los dobles mutantes indica que una tercera parte an no identificada circuito sensorial existe en V. cholerae . Este aparato de deteccin de qurum es extraordinariamente compleja, ya que est compuesto de al menos tres canales paralelos de sealizacin. Nos muestran que en V. cholerae estos sistemas de comunicacin convergen en el control de la virulencia.

Esquema del artculo

o o o o o o o o o o o o o

Introduccin Resultados

La V. harveyi -como Sistema de Deteccin de qurum 2 en V. cholerae V. cholerae Posee mltiples circuitos Quorum Sensing Quorum Sensing integracin de la seal en V. cholerae Identificacin de un sistema de deteccin de qurum adicionales en V. cholerae Identificacin de la sintasa de CAI-1 El anlisis de un sensor en V. cholerae Anlisis de la CAI-1 Un mnimo de tres circuitos sensoriales existe en V. cholerae LuxU funciones tanto en V. cholerae Quorum Sensing System 1 y Sistema 2 Quorum Sensing Regula la virulencia en V. cholerae Discusin Los procedimientos experimentales

Cepas bacterianas y medios de comunicacin Las manipulaciones de ADN Dependiente de la densidad bioluminiscencia (Lux) Ensayos

o o o o

Transposn mutagnesis y Anlisis de Secuencia de ADN Los ensayos autoinductor Crossfeeding Los ensayos de virulencia El anlisis de autoinductor dependiente TCPP-lacZ expresin Agradecimientos Referencias

Introduccin
En un proceso llamado deteccin de qurum, las bacterias se comunican entre s utilizando molculas extracelulares de sealizacin qumica llamada autoinductores.Comunicacin celular permite a una poblacin de bacterias para coordinar la expresin de genes y por lo tanto, el comportamiento del grupo. Las funciones controladas por la deteccin de qurum son muy variadas y reflejan las necesidades de una determinada especie de bacterias que habitan en un lugar determinado. Por lo general, los tipos de procesos controlados por la deteccin de qurum son aquellos que son eficaces cuando un gran nmero de bacterias actan juntos y la accin de una bacteria individual es insignificante. Por ejemplo, la deteccin de qurum procesos controlados incluyen la bioluminiscencia, la expresin de factores de virulencia, el desarrollo del biofilm, y la conjugacin [Davies et al. 1998] , [de Kievit y Iglewski 2000] , [Engebrecht y Silverman 1987] , [Miller y Bassler 2001] , [Piper et al. 1993] y [Zhang et al. 1993] .

En general, los circuitos de deteccin de qurum en bacterias gram-negativas se componen de dos funciones de regulacin. En primer lugar, la seal autoinductor es una lactona acilada homoserina (HSL) cuya sntesis depende de la sintetasa de autoinductor Luxi tipo. En segundo lugar, una protena reguladora del tipo LuxR es responsable de la recepcin autoinductor y activacin de la expresin del gen diana (Miller y Bassler, 2001) . Esta nomenclatura se refiere a los componentes de regulacin de la Vibrio fischeri quorum sensing circuito, el primero de estos tipos de sistemas descubiertos (Engebrecht y Silverman, 1984) . En cambio, en bacterias gram-positivas, las seales extracelulares suelen modificarse oligopptidos, y deteccin de la seal se produce a travs de sistemas de dos componentes de transduccin sensorial [Kleerebezem et al. 1997] y [Lazazzera y Grossman 1998] .

En el medio marino bacteria Vibrio harveyi , dos circuitos de deteccin de qurum funcionan en conjunto para el control de los resultados previstos, que incluyen la bioluminiscencia (Lux) (Figura 1) . Sorprendentemente, a diferencia de otras bacterias gram-negativas qurum de deteccin, no hay componentes Luxi-LuxR son necesarios para la deteccin de qurum en V. harveyi . Los anlisis genticos y bioqumicos de la V. harveyi han demostrado que el sistema de deteccin de qurum 1 se compone de un autoinductor HSL llamado HAI-1 (harveyi autoinductor-1), que es el 4-hidroxi C4 HSL, y su protena sensor afines LuxN [Bassler et al. 1993] , [Cao y Meighen 1989] y [Freeman et al. 2000] . Sntesis de HAI-1 requiere la luxLM lugar (Bassler et al., 1993) . La segunda V. harveyi circuito se compone de un autoinductor indicado AI-2 y su aparato sensorial LuxPQ (Bassler et al., 1994a) . AI-2 es un dister borato furanosyl, y su sntesis depende de la enzima LuxS [Chen et al. 2002] ,[Schauder et al. 2001] y [Surette et al. 1999] . En el Sistema de 2 circuitos, el LuxP protena periplsmico es la protena de unin AI-2, y la hiptesis de que el complejo LuxP-AI-2 interacta con LuxQ para facilitar la retransmisin de la seal (Bassler et al., 1994a) . LuxN y LuxQ son hbridos de dos componentes, las protenas quinasa sensor. Informacin de ambos LuxN y LuxQ es traducida a un HPT compartido (histidina fosfotransferasa) protena llamada LuxU y, finalmente, los rels LuxU la seal al regulador de respuesta Luxo [Bassler et al. 1994b] , [Freeman y Bassler 1999a] y [Freeman y 1999b Bassler] . Luxo, junto con el factor sigma alternativo 54 , controla la expresin de la luciferasa estructurales opern luxCDABE (Lilley y Bassler, 2000) . Luxo es la accin indirecta, ya que nuestra evidencia sugiere que la luxo- 54complejos afecta luxCDABE mediante la activacin de la expresin de un represor que an no se ha identificado (denominado "X" en la Figura 1 ). Expresin de la luciferasa tambin requiere que el activador de la transcripcin de protenas LuxR (no similar a la V. fischeri LuxR) [Martin et al. 1989] y [Showalter et al. 1990] .

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Figura 1.

Modelo de la V. harveyi Quorum Sensing Circuito

Dos circuitos paralelos de deteccin de qurum regular la produccin de luz en V. harveyi . Los detalles del mecanismo de retransmisin de la seal se proporcionan en el texto. Pentgonos y tringulos representan HAI-1 y AI-2, respectivamente. La "P" en el crculo muestra que la transduccin de seales se produce por phosphorelay.

Nuestro anlisis gentico de la V. harveyi circuito sensorial sugiere que funciona de la siguiente manera (Figura 1) . En baja densidad celular, cuando las concentraciones de los autoinductores son bajos, y LuxN LuxQ son quinasas. En ausencia de ligando, que autophosphorylate conserva restos de histidina (H1) en sus respectivos mbitos sensor quinasa y, posteriormente, la transferencia de fosfato a residuos de aspartato conservado (D1) en sus dominios adyacentes respuesta del regulador. Fosfato de ambos LuxN LuxQ y se canaliza a los residuos de histidina conservada (H2) de LuxU y, finalmente, el residuo aspartato apropiado (D2) de Luxo. Le sugerimos que fosfo-Luxo une
54

activa la expresin de las aguas abajo del represor (X), que, a su vez, se cierra la produccin de luz. En cambio, en alta densidad celular en presencia de HAI-1 y AI-2, y LuxN LuxQ convertir de quinasas de fosfatasas. Fosfato fluye hacia atrs a travs del circuito de Luxo a LuxU a LuxN y LuxQ donde se hidroliza. Dephospho-Luxo est inactivo, por lo que no la expresin de la supuesta X Lux represor se produce. LuxR activa la transcripcin del opern de la luciferasa, y V. harveyi produce la luz.

Hemos sugerido que la V. harveyi utiliza HAI-1 y para dentro de una especie LuxN la comunicacin celular y la IA-2 y LuxPQ entre especies para la clula-clula de sealizacin. En consonancia con esta idea, hemos encontrado que la posesin de un luxS gentica y la produccin de AI-2 la actividad estn muy extendidas entre las bacterias, mientras que luxLM y HAI-1 son muy raros [Bassler et al. 1997] y [Surette et al. 1999] . Adems, nuestros resultados recientes indican que el precursor de AI-2 4,5-dihidroxi-2 ,3-pentanodiona, y, posiblemente, el AI-2 en s, son producidas por enzimas LuxS muchos, lo que sugiere que esta seal tiene un papel ms universal que la HAI- 1 y autoinductores otras especies que son muy especficos [Chen et al. 2002] , [Schauder y Bassler 2001] y [Schauder et al. 2001] .

A pesar de Vibrio cholerae est estrechamente relacionada con V. harveyi , estas especies a menudo viven en nichos muy diferentes. Ambas especies son las bacterias marinas, pero V. harveyi , que se sepa que un agente patgeno de langostinos tigre, no es patgeno para los seres humanos [Liu et al. 1996] y [Manefield et al. 2000] .En contraste, V. cholerae es un importante patgeno humano en el tercer mundo (Faruque et al., 1998) . Adems, V. harveyi es bioluminiscente, y, en general, patgenos, V. cholerae cepas no lo son. Sin embargo, algunos patgenos V. cholerae cepas poseen lux genes y son bioluminiscentes, o que contienen vestigios de luxgenes, pero, aparentemente, han perdido la capacidad para producir luz (Palmer y Colwell, 1991) .

En este informe se utiliza la V. harveyi luciferasa opern como reportero heterloga para examinar la deteccin de qurum en V. cholerae . Nuestros resultados muestran que al menos tres sistemas sensoriales redundantes operan en V. cholerae , y juntos controlan la virulencia. Este informe describe la identificacin y el anlisis de dos de las tres V. cholerae circuitos sensoriales.

Resultados
La V. harveyi -como Sistema de Deteccin de qurum 2 en V. cholerae
El genoma completo de la secuencia de V. cholerae El Tor N16961 muestra que contiene cada uno de los componentes de la deteccin de qurum reglamentario de V.harveyi Sistema de Sealizacin 2 ( luxS , luxP y luxQ ), as como todos los de la V. harveyi componentes compartidos tanto por el Sistema 1 y Sistema 2 ( luxU , Luxo, rpoN y hapR , que es homloga a LuxR de V. harveyi ) [Heidelberg et al. 2000] , [Jobling y Holmes 1997] , [Klose et al. 1998] y [Surette et al. 1999] . Hemos demostrado que V. cholerae produce AI-2, y esto depende de LuxS ( Bassler et al., 1997 , y datos no presentados). En trminos de un sistema de componentes, un gen anotado como " luxN "est presente en el V. cholerae genoma, sin embargo, la inspeccin de la secuencia traducida de esta protena muestra que el dominio sensorial N-terminal no es similar a la de dominio correspondiente de la V. harveyi LuxN protenas. No hay luxLM lugar en V. cholerae que puede codificar una sintasa HAI-1 ni componentes similares a V. fischeri Luxi y LuxR . Por ltimo, aunque parece que V. cholerae posee una completa V. harveyi -como el Sistema de Sealizacin 2, V.cholerae N16961 no posee un opern estructural luciferasa, por lo que no est claro cul podra ser el objetivo (s) de este circuito de deteccin de qurum.

Para comprobar si la supuesta V. cholerae quorum sensing Sistema 2 es funcional, se introdujo la V. harveyi luciferasa genes y la produccin utiliza la luz como una salida para medir heterlogos quorum sensing dependiente de la expresin gnica. En este informe, se utiliza V. cholerae El Tor C6706 en lugar de la secuencia V.cholerae El Tor cepa N16961 porque el HapR activador de la transcripcin est inactivo en V. cholerae debido a una mutacin del marco de lectura natural N16961.HapR est intacto en V. cholerae El Tor C6706 (Zhu et al., 2002) .

Tres V. cholerae cepas fueron examinados para el control de la deteccin de qurum de lux expresin: la de tipo salvaje, un luxo mutante nulo, y un hapR mutante nulo.Estas cepas fueron elegidos por el anlogo V. harveyi cepas de mostrar las diferencias ms dramticas en los fenotipos Lux. En concreto, de tipo salvaje V. harveyiexpresa luxCDABE de una manera dependiente de la densidad (Bassler et al., 1993) , el V. harveyi luxo mutante constitutivamente brillante porque Luxo es necesaria para la represin de lux en baja densidad celular [Bassler et al. 1994b] y [Freeman y Bassler 1999a] , y el V. harveyi LuxR mutante es oscura porque LuxR se requiere para la activacin

de lux transcripcin [Martin et al. 1989] y [Showalter et al. 1990] . Los fenotipos de la correspondiente V. cholerae cepas con luxCDABE se muestran enla Figura 2A .

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Figura 2.

Mltiples Qurum Sensing Systems Existen en V. cholerae

Los ensayos se realizaron Lux para las siguientes cepas. (A) MM227 (en peso, de diamantes), MM239 ( hapR , plazas), y MM349 ( luxo , tringulos). (B) MM227 (en peso, de diamantes), MM229 ( luxS , plazas), MM231 ( luxQ , las estrellas), y MM331 ( luxP , tringulos). (C) MM227 (en peso, de diamantes), MM583 ( luxU , crculos), y MM349 ( luxo , tringulos).

En este experimento, el V. cholerae cepas fueron cultivadas durante la noche a la fase estacionaria. Los cultivos se diluyeron 1:1000 en el inicio del experimento, y la produccin de luz por clula se midi durante el posterior crecimiento de las culturas diluida. Figura 2A muestra que de tipo salvaje V. cholerae produce la luz en una celda dependiente de la densidad patrn, un sello distintivo de un quorum sensing controlada por proceso (diamantes). En concreto, inmediatamente despus de la dilucin del tipo silvestre V. cholerae cultura, una dramtica disminucin en la emisin de luz por clula se produce. Sin embargo, despus de que un mayor crecimiento, la produccin de luz por clula aumenta bruscamente. En la expresin de qurum luminiscencia de deteccin controlado, una curva "U" en forma que se observa debido a la dilucin de la cultura reduce el nivel de autoinductor extracelular por debajo del umbral de concentracin necesario para la deteccin y estimulacin de lux expresin.Sin embargo, como las clulas crecen, autoinductor endgena producida se acumula en el medio, y cuando se alcanza la concentracin crtica requerida para la deteccin, lux es la expresin inducida. El patrn de lux expresin que observamos de tipo silvestre V. cholerae exactamente imita a la de tipo salvaje V. harveyi , lo que indica que, en V. cholerae , la deteccin de qurum es el control de lux . Ms evidencia de esta afirmacin, y la idea de que el V. cholerae qurum homlogos de deteccin reguladores actan de manera anloga a los de la V. harveyi , proviene de un anlisis de los fenotipos de Lux de la V. cholerae luxo y hapR mutantes.Exactamente como en V. harveyi , en V. cholerae el luxo mutante constitutivamente brillante (tringulos) y el hapR mutante est completamente oscuro (cuadrados). En conjunto, estos resultados demuestran que la V. cholerae quorum sensing circuito es realmente operativo, y, adems, que el V. harveyi luxCDABE opern se puede utilizar como un blanco artificial para estudiar la deteccin de qurum en V. cholerae .

V. cholerae Posee mltiples circuitos Quorum Sensing

Figura 2A muestra que la mayora de abajo V. harveyi -como quorum sensing componentes luxo y hapR funcin de V. cholerae . Para probar si la V. harveyi -como componentes luxS, luxP y luxQ tambin estn involucrados en la deteccin de qurum va de transduccin de seales, que elimina cada uno de estos genes en V.cholerae y se examin el efecto de lux expresin. Figura 2B muestra que la inactivacin de luxS , luxQ o luxP no suprime dependiente de la densidad lux expresin en V.cholerae (cuadrados, estrellas y tringulos, respectivamente). Anloga a la V. harveyi , hay diferencias notables en las amplitudes de los lux curvas de respuesta de los distintos mutantes, que se deriva de la proporcin relativa de la quinasa de actividad de la fosfatasa que queda cuando un solo circuito est en funcionamiento. Por lo tanto, las curvas se vuelven ms pronunciada Lux o menos profunda dependiendo de si ms quinasa fosfatasa o ms permanece en la cepa mutante en relacin con el tipo salvaje (Freeman y Bassler, 1999a) .

Para eliminar dependiente de la densidad lux expresin en V. harveyi , una mutacin inactivante Sistema de Sealizacin 2 (es decir, una mutacin en luxS o luxPQ ) combinado con una mutacin inactivante Sistema de Sealizacin 1 (es decir, una mutacin en luxLM o luxN ) o una sola mutacin que inactiva a uno de los componentes compartidos de sealizacin ( luxU , luxo , o LuxR ) se requiere [Bassler et al. 1994a] y [Freeman y Bassler, 1999a] . Los fenotipos de Lux se presentan enlas figuras 2A y 2B sugieren que este es tambin el caso

de V. cholerae , y que el Sistema 2 y al menos otro sistema debe funcionar en paralelo para regular la luciferasa. Adems, ambos sistemas deben transmitir la informacin a travs de Luxo y HapR porque, a diferencia de la mutacin de luxS , luxP o luxQ , la mutacin deluxo o hapR suprime completamente la densidad de deteccin de V. cholerae .

Quorum Sensing integracin de la seal en V. cholerae

Una marcada diferencia que existe entre el comportamiento de los distintos V. harveyi y V. cholerae quorum sensing mutantes, y que es el luxU fenotipo (Figura 2C) . EnV. harveyi , tanto los sistemas de sealizacin requiere el LuxU HPT protena de transferencia de informacin de Luxo (Figura 1) . Por lo tanto, la inactivacin de cualquiera de las luxo o luxU en V. harveyi resulta en una tensin constitutiva brillante (Freeman y Bassler, 1999b) . Sin embargo, la supresin de luxU en V. choleraeproduce una tensin que mantiene la densidad que dependen de expresin de lux ( Figura 2C , crculos). Sugerimos dos posibles interpretaciones de este fenotipo: (1) LuxU actos en uno solo de los dos V. cholerae quorum sensing circuitos, o (2) existen ms de dos sistemas, y LuxU actos en slo un subconjunto de la V. choleraesistemas sensoriales. Hay que distinguir entre estas posibilidades en un apartado posterior.

Identificacin de un sistema de deteccin de qurum adicionales en V. cholerae

Un candidato obvio para el sistema de un sensor es el V. cholerae protenas anotado como "LuxN" en la secuencia del genoma. Se encontr que un " luxN "supresin mutante retiene dependiente de la densidad lux expresin y tiene esencialmente un fenotipo de tipo salvaje. Esperbamos que este fenotipo, ya que, como hemos dicho, un sistema de doble sistema de 1-2 mutante debe ser necesaria para eliminar la deteccin de qurum en V. cholerae . Por lo tanto, se construy la V. cholerae " luxN " , luxQ doble mutante y se examina su lux fenotipo. En V. harveyi , un luxN, luxQ doble mutante es constitutivamente brillante porque no fosfato de flujos de los sensores de Luxo a causa lux represin ( Figura 1 ; Freeman y Bassler, 1999 ). Sin embargo, en V. cholerae , el doble " luxN ", luxQ mutante retiene dependiente de la densidad luxregulacin. Este resultado sugiere que, o bien " luxN "no est involucrado en la deteccin de qurum en V. cholerae , o que " luxN "est involucrado, pero el qurum arquitectura de deteccin de seales en V. cholerae es ms compleja que la de V. harveyi .

Pensamos que si podemos identificar y mutagenizar el sistema de un gen de la sintasa autoinductor, entonces se podra realizar una prueba convincente de si "LuxN" es necesaria para la regulacin de lux en respuesta al sistema de una autoinductor. De aqu en adelante, llamaremos a esta seal de CAI-1 para Cholerae autoinductor-1.Nos mutagenizadas una V. cholerae luxS (AI-2 - ) la tensin con Tn 5 (. RA Larsen et al, presentado) y se introduce un csmido lleva la V. harveyi luciferasa genes. El exconjugants mutantes fueron seleccionados por un oscuro (Lux - ) fenotipo. Predijo que un doble CAI-1 - , AI-2 - mutante sera oscuro, porque la ausencia de ambos autoinductores cerraba los dos sensores afines como quinasas y el resultado en lux represin. Se seleccionaron e identificaron 30.000 exconjugants 37 Lux - mutantes. Adems de predecir el fenotipo oscuro de la CAI-1 - , AI-2 - mutante, la insercin de un transposn en hapR tambin dara lugar a un Lux - fenotipo. Se realiz PCR en el 37 cepas oscuras, y ocho mutantes no di una hapR producto de PCR, lo que indica que haba adquirido un transposn insercin en hapR . Estos mutantes no fueron estudiados. Para determinar cul de los mutantes restantes eran defectuosos en la sntesis de CAI-1, se realiz un ensayo crossfeeding. Estamos motivados que CAI-1 - , AI-2 - mutantes llevar luxCDABE debe crossfed a un Lux + fenotipo cuando se siembran en las proximidades de la AI-2 - V. cholerae cepa madre, porque la cepa madre es capaz de suministrar la supuesta CAI-1. Se encontr que seis de los mutantes podran ser crossfed a un Lux + fenotipo, lo que indica que estas inserciones se encuentra en un gen (s) necesarios para la produccin de un autoinductor que no sea el AI-2. El anlisis de los restantes 23 mutantes oscuros mostraron que haban adquirido las mutaciones que afectaron las funciones metablicas necesarias para la produccin de luz como ribe y la usura , los genes que son esenciales para la biosntesis de riboflavina, que es un cofactor necesario en la reaccin de la luciferasa.

Identificacin de la sintasa de CAI-1

Las ubicaciones de los seis Tn 5 inserciones que elimin CAI-1 de produccin asignadas a un mismo gen (denominado VCA0523 en el V. cholerae base de datos del genoma). Nuestros hallazgos indican que codifica una sintasa VCA0523 autoinductor, que el nombre de CqsA Cholerae qurum autoinductor de deteccin.

Para verificar que cqsA codifica una sintasa autoinductor, hemos realizado experimentos autoinductor crossfeeding. Estamos preparados libres de clulas lquido de cultivo de tipo salvaje V. cholerae (CAI-1 + , AI-2 + ), de la luxS mutante (CAI-1 + , AI-2 - ), y de la cqsA mutante (probablemente CAI-1 - , AI-2 + ). Pusimos a prueba las respuestas de la cqsA , luxS (sensor 1 + , CAI-1 - , Sensor 2 + , AI-2 - ) y el cqsA , luxQ (sensor 1 + , CAI-1 - , Sensor 2 - , AI-2 + ) mutantes de estas preparaciones.El conjunto de la izquierda de las barras en la Figura 3 muestra que la adicin de tipo salvaje lquido de cultivo libres de clulas (CAI-1 + , AI-2 + ) estimula la produccin de luz en el cqsA , luxS (sensor 1 + , CAI-1 - , Sensor 2 + , AI-2 - ) destinatario 10896 veces. Una induccin 1.235 veces se observa cuando el luxS mutante (CAI-1 + , AI-2 - ) la preparacin, se aade. Este resultado muestra que, en ausencia de AI-2, una sustancia estimulante adicional est presente para que V. cholerae responde.Por el contrario, libre de clulas lquidos preparados a partir de la cqsA mutante (CAI-1 - , AI-2 + ) slo contienen actividad estimulante ligero (11 veces). Por lo tanto, adems de la exigencia de luxS para producir AI-2,

el cqsA gen es necesario para la produccin de la autoinductor adicionales CAI-1. Adems, la respuesta de V.cholerae de CAI-1 es ms fuerte que a AI-2.

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Figura 3.

cqsA (VCA0523) es el gen de CAI-1 Synthase Libre de clulas lquido de cultivo fueron preparados a partir de V. cholerae C6706str2 (peso, barras de color negro), KSK1052 ( luxS ; barras grises), y MM893 ( cqsA ; barras blancas). Los preparativos se han aadido en el 30% (v / v) de las cepas receptoras MM914 ( cqsA, luxS ) y MM920 ( cqsA , luxQ ). La produccin de luz se midi despus de 2,5 horas de crecimiento.

El conjunto de las barras de la derecha en la Figura 3 demuestra que LuxQ no es necesaria para la respuesta a la autoinductor CAI-1. En concreto, cuando el cqsA , luxQ (sensor 1 + , CAI-1 - , Sensor 2 - , AI-2 + ) la tensin es el destinatario, que tiene una respuesta similar a los lquidos preparados, tanto del (de tipo salvaje CAI- 1 + , AI-2 + ) y el luxS (CAI-1 + , AI-2 - ) de las cepas (estimulacin 3024 veces y 2198 veces, respectivamente). Por lo tanto, un sensor que es distinta de LuxQ debe existir enV. cholerae que reconoce CAI-1. Por ltimo, la barra de la derecha en la Figura 3 muestra que el cqsA , luxQ (sensor 1 + , CAI-1 - , Sensor 2 - , AI-2 + ) mutante no responde a los fluidos de la cqsA (CAI-1 - , AI-2 + ), cepa, que muestra que LuxQ se requiere para la V. cholerae respuesta a AI-2.

El anlisis de un sensor en V. cholerae

Una de las razones para identificar la sintasa CAI-1 fue para darnos un medio para comprobar si el V. cholerae "LuxN" protena tiene un papel en la deteccin de qurum.Sorprendentemente, cuando estudiamos la insercin de transposn a la cqsA (VCA0523) genes, se encontr que cqsA est al lado, pero transcrita en la direccin opuesta de la V. cholerae " luxN "homlogo. La proximidad de " luxN "a cqsA indic que era probable que "LuxN" est involucrado en V. cholerae quorum sensing.

Para examinar si "LuxN" es el CAI-1 sensor, se realiz un anlisis de epistasis, el razonamiento de que si "LuxN" es el sensor de CAI-1, entonces tiene que funcionar abajo de la sintasa CqsA. Hemos ensayado los fenotipos de la Lux cqsA y " luxN "nico mutantes y el cqsA , " luxN "doble mutante. Figura 4 muestra que la supresin decqsA lugar a un fenotipo oscuro en V. cholerae (crculos). Este fenotipo es idntica a la luxLM (HAI-1 - ) fenotipo de la V. harveyi . Ya hemos informado de que, en V.harveyi , Sistema 1 es dominante sobre el Sistema 2, y por lo tanto la eliminacin de HAI-1 resulta en un fenotipo oscuro debido a que su LuxN sensor afines se bloquea en una quinasa, y por lo tanto lux es reprimido (Freeman et al., 2000) . Al parecer, este es tambin el caso de V. cholerae . Sin embargo, la mutacin de " luxN "es episttico a la mutacin de cqsA en V. cholerae porque el doble " luxN ", cqsA V. cholerae mutantes se restaura a un brillante y densodependientes fenotipo idntico al fenotipo de la nica " luxN " V. cholerae mutantes (plazas abiertas y cerradas, respectivamente). Los resultados en la Figura 4 demuestran que, en V. cholerae , la "LuxN" protena es necesaria para la deteccin y la respuesta a la autoinductor CqsA dependiente de CAI-1.

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Figura 4.

"LuxN" es el sensor para la cqsA autoinductor dependiente de CAI-1 en V. cholerae Los ensayos se realizaron en Lux MM227 (en peso, de diamantes), MM843 ( " luxN ", cerr cuadrados), MM924 ( cqsA , crculos), y MM964 ( " luxN ", cqsA , plazas abiertas).

V. harveyi HAI-1 no estimula la produccin de luz en V. cholerae que contiene el lux opern, mostrando que la autoinductor producido por LuxLM en V. harveyi es distinta de la producida por CqsA en V. cholerae (datos no mostrados). Por lo tanto, "LuxN" de V. cholerae no reconoce el mismo ligando como LuxN de V. harveyi . Llamamos a que el sensor anotado como "LuxN" en el V. cholerae genoma CqsS para Cholerae sensor de deteccin de qurum.

Anlisis de la CAI-1
CqsA podra catalizar una reaccin enzimtica similar a la de Luxi, como las enzimas para formar un autoinductor HSL. Decimos esto porque, segn lo predicho por la conservacin del dominio, cqsA probable que codifica una actividad aminotransferasa y Luxi tipo enzimas tambin catalizan las reacciones de transferencia de aminocidos. En concreto, Luxi homlogos par el grupo acilo de protenas especficas de acil acil portador a la mitad amino de la metionina en la SAM [Hanzelka y Greenberg 1996] , [Ms et al. 1996] , [Parsek et al. 1999] y [Val y Cronan 1998] . LuxLM, Ains, y HDTS, aunque no relacionados en orden a las enzimas del tipo de Luxi, tambin sintasas HSL autoinductor y se ha propuesto para catalizar reacciones idnticas a las enzimas Luxi tipo [Cao y Meighen 1989] , [Gilson et al. 1995] , [Hanzelka et al. 1999] y [Laue et al. 2000] .

Hemos tratado de purificar el CAI-1 a partir de fluidos de cultivo libre de clulas preparadas a partir de nuestra luxS mutante V. cholerae cepa utilizando procedimientos convencionales de extraccin empleado para el aislamiento de HSL autoinductores [Schaefer et al. 2000] , [Schaefer et al. 2001] y [Shaw et al. 1997] . Los extractos se ensay la actividad con HSL cepas biosensor que reconocer una variedad de HSLS [McClean et al. 1997] y [Ravn et al. 2001] . No se detect actividad en nuestra preparacin, lo que sugiere que si CAI-1 es un HSL, no tiene una estructura convencional. Para investigar los requisitos para la CAI-1 de produccin, hemos clonado el V. cholerae cqsA gen en una coli luxS E. y encontr que la recombinacin produce abundantes CAI-1. Este resultado indica que si la maquinaria, adems de CqsA es necesario para la biosntesis de CAI-1, que se conserva entre V. cholerae y E. coli .En trabajos anteriores, hemos demostrado que el AI-2 requiere la biosntesis de SAM SAM mediante la adicin de luxS + E. coli lisados y el control AI-2 de produccin(Schauder et al., 2001) . Del mismo modo, hemos probado si la CAI-1 de produccin en E. coli depende de la SAM. No se observ actividad de CAI-1, lo que sugiere que la biosntesis de CAI-1 requiere algn otro sustrato o como complemento a la SAM. A pesar de que todava no han determinado la estructura de la CAI-1, nuestros resultados indican que, de forma similar a lo que hemos encontrado para la LuxS dependiente de AI-2, la estructura y la biosntesis de la autoinductor CqsA dependientes no son similares a los previamente identificados molculas de sealizacin .

Un mnimo de tres circuitos sensoriales existe en V. cholerae

Hemos construido mutantes individuales y dobles en los dos V. cholerae quorum sensing circuitos con el fin de estudiar la transmisin de seales a travs de esta red.Sorprendentemente, a diferencia de V. harveyi , en V. cholerae combinaciones del Sistema 1 y Sistema 2 dobles mutantes no elimin la deteccin de la densidad. Figura 5 muestra que el V. cholerae cqsS , luxQ (sensor de 1 - , CAI-1 + , Sensor 2 - , AI2 + ) y el cqsS , luxS (sensor de 1 - , CAI-1 + , Sensor 2 + , AI-2 - ) dobles mutantes conservar la densidad dependiente de lux expresin (crculos y cuadrados vacos, respectivamente). Por el contrario, la correspondiente V. harveyi luxN , luxQ (sensor de 1 - , HAI-1 + , Sensor 2 , AI-2 + ) y el luxN , luxS (sensor de 1 - , HAI-1 + , Sensor 2 + , AI-2 - ) mutantes dobles tienen fenotipos constitutivamente brillantes y oscuros, respectivamente ( Freeman y Bassler, 1999 , y datos no presentados). Nuestros resultados muestran que CAI-1 y CqsS juntos y AI-2 y LuxPQ juntos cada regulan luciferasa en V. cholerae . El hallazgo de que la inactivacin conjunta de estos dos sistemas de deteccin de qurum no elimina dependiente de la densidad luxexpresin slo puede explicarse si V. cholerae tiene tres (o ms) estmulos sensoriales. Por lo tanto, a diferencia de V. harveyi en un sistema de doble uno, el Sistema 2 mutacin hace que la abolicin completa de sensores de densidad, en V. cholerae un triple mutante se requiere para este efecto.

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Figura 5.

V. cholerae posee al menos tres circuitos sensoriales

Ensayos de Lux se mostrarn para las siguientes V. cholerae cepas. (A) MM227 (en peso, de diamantes), MM843 ( cqsS , tringulos), MM825 ( cqsS , luxQ , crculos abiertos) y MM822 ( cqsS , luxS , plazas abiertas). (B) MM227 (en peso, de diamantes), MM583 ( luxU , plazas), MM920 ( cqsA , luxQ , plazas abiertas), y MBM08 ( cqsA , luxQ , luxU , diamantes abierto). (C) MM227 (en peso, de diamantes), MM583 ( luxU , plazas), MM879 ( cqsS , luxP , crculos abiertos) y MM933 ( cqsS , luxP , luxU , tringulos).

LuxU funciones tanto en V. cholerae Quorum Sensing System 1 y Sistema 2

Una diferencia importante entre la V. harveyi y V. cholerae circuitos parece estar en la funcin de LuxU. En V. harveyi , la inactivacin de los resultados LuxU en la abolicin completa de sensores de densidad, mientras que una V. cholerae luxU mutante expresa dependiente de la densidad de luminiscencia (Freeman y Bassler, 1999b) . Se utilizaron pruebas epistasis para examinar el papel de LuxU en cada uno de los V. cholerae sistemas de deteccin de qurum. Para comprobar si la sealizacin a travs del sensor CqsS requiere LuxU, que comenz con el cqsA , luxQ mutante. Este mutante es oscuro debido a la ausencia de LuxQ elimina la entrada del sistema 2, y la ausencia de CAI1 bloquea CqsS como una quinasa ( Figura 5B , plazas abiertas). Luxo es constitutivamente fosforilada, lo que resulta en la represin de lux expresin. Hemos construido el triple de cqsA , luxQ , luxU mutante y descubrieron que se muestra dependiente de la densidad de luminiscencia, que muestran que el sensor CqsS requiere LuxU a la informacin del canal de Luxo ( Figura 5B , diamantes abierto). Para probar si LuxQ tambin depende de LuxU para phosphorelay de Luxo, se construy una cqsS, luxP doble mutante. A pesar de este mutante ha de tipo salvaje LuxQ, no puede responder a AI-2 debido a la ausencia de LuxP. Sin embargo, a diferencia de la cqsS , luxS mutante, el cqsS , luxP mutante es oscuro debido a la ausencia de LuxP aumenta la actividad de la quinasa LuxQ a un nivel ms elevado que la ausencia de AI-2 ( Figura 5C , crculos abiertos). As, en el cqsS , luxPmutante, LuxQ permanece bloqueado en el modo de quinasa, lo que resulta en la fosforilacin de Luxo y, a su vez, la represin de lux y un fenotipo oscuro (ver Figura 1 ).Hemos encontrado que la triple cqsS , luxP , luxU mutante se restaura a depender de la densidad de luminiscencia ( Figura 5C , tringulos). Este fenotipo es idntica a la luxU fenotipo mutante nico y demuestra que la actividad LuxQ de Luxo requiere LuxU. Figura 5 muestra que las funciones LuxU tanto rel de seal Sistema 1 y Sistema 2. Sin embargo, debido a que el luxU mutante tiene un fenotipo dependiente de la densidad Lux, que no deben actuar de transduccin de seales del sistema 3. Nuestros resultados son consistentes con un mnimo de tres circuitos redundantes sensorial en V. cholerae . Si hay ms de tres sistemas de existir, sigue siendo posible que LuxU es un componente del "Sistema 3", pero no de "Sistema 4", etc

Quorum Sensing Regula la virulencia en V. cholerae

Usando V. harveyi luciferasa como reportero de qurum artificial de deteccin de V. cholerae nos ha permitido identificar algunos de los componentes de la red que controla la comunicacin celular. Otro objetivo nuestro es para determinar el qurum de deteccin endgeno controlado por los genes diana en V. cholerae .Anteriormente se demostr que, a baja densidad celular, Luxo indirectamente activa la V. cholerae reguln de virulencia por la represin de hapR , lo que resulta en la produccin de la virulencia del regulador TCPP (Zhu et al., 2002) .

Para determinar la influencia de los sistemas de deteccin de qurum 1 y 2 en la expresin de genes de virulencia en V. cholerae , se realizaron ensayos de colonizacin del ratn lactante con los mutantes se ha descrito anteriormente, y tambin analiz su capacidad para

producir el factor de colonizacin primaria de la toxina coregulated pilus (TCP) y la toxina del clera (CT) in vitro (Figura 6) . Como se ha demostrado anteriormente, el luxo mutante se reduce significativamente en su capacidad de colonizar ratones lactantes, y en consonancia con este hallazgo, que no produce ni TCP ni CT. Por el contrario, la inactivacin del V. harveyi -como sistema de dos componentes especficos de luxS , luxP y luxQ , del Sistema de componentes de una recientemente identificada cqsA y cqsS , o de luxU no de manera significativa la colonizacin intestinal de impacto o la produccin de TCP y TC (Figura 6) . Tambin hemos probado mutantes defectuosos en ambos sistemas de deteccin de qurum y se encontr que cada uno es de tipo salvaje de las actividades de la virulencia. Este resultado no es inesperado, ya que, en cada uno de los mutantes, por lo menos un sistema sensorial sigue siendo operativa, y al parecer esto es suficiente para la expresin de la virulencia. En condiciones ptimas, que llevara a cabo estos experimentos con mutantes que tiene los tres sensores inactiva. Nuestra prediccin es que esta cepa debe tener una colonizacin, TCP y TC fenotipo idntico al luxomutante, porque no hay fosfato fluye por el circuito, por lo que Luxo permanece en la alta densidad celular, estado inactivo.

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Figura 6.

El anlisis de virulencia en los mutantes de deteccin de qurum

(A) V. cholerae cepas se ensayaron para la toxina coregulated pilus (TCP) y la produccin de la toxina del clera (CT), y el ndice de competitividad se determin en los ensayos de colonizacin del ratn. De izquierda a derecha: C6706str2 (en peso), KSK1052 ( luxS ), MM304 ( luxP ), MBM18 ( luxQ ), MM893 ( cqsA ), MM819 ( cqsS ), MM310 ( luxU ), MM307 ( luxo ) , MM883 ( cqsA, luxS ), MM887 (cqsA , luxP ), MM869 ( cqsS , luxP ), y MM816 ( cqsS , luxQ ). ND denota no determinado. (B) El medio de cultivo solo o el 80% libre de clulas de fluido de tipo salvaje V. cholerae fue agregado a V. cholerae cqsA , luxS , lacZcepa MM938, y la produccin de TCP y TC se midieron. El TCPP-lacZ fusin se introdujo en la cepa MM938 MM977 para hacer presin, y -galactosidasa se ensay la siguiente adicin de las mismas preparaciones. (C) 80% libre de clulas lquido de cultivo de la de tipo salvaje (CAI-1 + , AI-2 + ) o el cqsA , luxS (CAI-1 - , AI-2 - ) la tensin se aade a la cqsA , luxS , lacZ (CAI-1 - , AI-2 - ) o el cqsA , luxS , hapR , lacZ (CAI-1 - , AI-2 - , HapR - ) mutantes que lleva el TCPPlacZ fusin (MM977 y MBM34, respectivamente).

Le sugerimos que los circuitos de deteccin de qurum que hemos definido en el presente trabajo de control de la actividad de Luxo en V. cholerae . Estamos an ms la hiptesis de que en la de tipo salvaje V. cholerae , a baja densidad celular, en ausencia de autoinductores, Luxo est activa, sino que reprime hapR , lo que resulta en la produccin de TCPP y por lo tanto la activacin de la expresin de genes de virulencia. Nuestro modelo predice que las altas concentraciones autoinductor debe causar la inactivacin de Luxo y la represin de la expresin de genes de patogenicidad. Para probar esta idea, hemos preparado libre de clulas fluido de cultivo de tipo salvaje V. cholerae y se aade esta preparacin en un 80% (v / v) a una V. cholerae cqsA , luxS (sensor 1 + , CAI-1 - , Sensor 2 + , AI-2 - ) mutantes y se mide la produccin de TCP y TC. Tambin hemos introducido una TCPP-lacZ fusin transcripcional en esta cepa y se mide su expresin en medio solo o el 80% de clulas libres de lquido de cultivo se aadi. Figura 6B muestra que no hay expresin de TCP o CT se produce, y TCPP-lacZ expresin se reduce aproximadamente 10 veces en la presencia de un 80% de tipo salvaje libre de clulas lquido de cultivo.

Para verificar que el autoinductores en lquido de cultivo libre de clulas son responsables de la represin de virulencia, que mide la represin de TCPP-lacZ expresin causada por el lquido 80% de los cultivos libres de clulas de tipo salvaje y de la cqsA , luxS (CAI -1 - , AI-2 - ) tensin. Hemos probado estas preparaciones en una cqsA , luxS (CAI-1 - , AI-2 - ) la tensin que lleva el TCPP-lacZ . fusin para evitar la interferencia de la produccin endgena de CAI-1 y AI-2 por el receptor Figura 6Cmuestra que la preparacin de la CAI-1 - , AI-2 - mutante contiene una actividad significativamente menor represin (33 gal -unidades) que tiene la preparacin de la cepa de tipo salvaje (7,7 gal units).

En nuestro modelo, CAI-1 y AI-2 inhiben la produccin de factor de virulencia de canalizar la informacin a travs del circuito sensorial que hemos identificado. Para probar esta hiptesis, se realiz el experimento anterior, excepto que hemos aadido las dos preparaciones de clulas libres de caldo de cultivo para un cqsA , luxS , hapR (CAI-1 , 2-AI , HapR ) cepa receptora. En V. cholerae , el hapR mutacin es episttico a la cqsA (CAI-1 ) y el luxS (AI-2 ) debido a que las mutaciones cqsA , luxS , hapR (CAI-1 , 2-AI , HapR cepa) no se puede crossfed a un Lux fenotipo mediante la adicin de lquido de cultivo libre de clulas (no mostrado). Si el acto CAI1 y AI-2 a travs del circuito que estamos investigando, entonces no hay represin de TCPP-lacZ debe ocurrir en el cqsA , luxS , hapR (CAI-1 , 2-AI , HapR ) triples mutante. Ni de tipo salvaje, ni CAI 1 , AI-2 fluidos de cultivo afectan TCPP-lacZ expresin cuando se aade a un destinatario que carecen de HapR (Figura 6) .En conjunto, estos resultados muestran que el CAI-1 y AI-2 contribuyen a la represin de la expresin factor de virulencia en concreto a travs del circuito de deteccin de qurum se describe aqu. Aunque los experimentos que aqu se presenta no se distingue entre la contribucin de la CAI-1 y que a partir de AI-2 a TCPP-lacZ la represin, se examinaron sus funciones especficas mediante la adicin de clulas libres de fluidos de cultivo de la cqsA (CAI-1 ) y luxS (AI-2 ) mutantes individuales a la CAI-1 , AI-2 (HapR ) que contiene la cepa TCPP-lacZ fusin. Cada autoinductor es capaz de inhibir parcialmente TCPP-lacZ expresin, pero en conjunto la autoinductores tener un efecto aditivo ms represivo, lo que sugiere que la V. cholerae autoinductores funcin sinrgica. Tambin hemos observado esto en V. harveyi lux Reglamento (KC Mok y BLB, datos no publicados).
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Discusin
En V. harveyi , expresin de la luciferasa est controlada conjuntamente por dos sistemas de deteccin de qurum. Uso de la V. harveyi lux opern como reportero de quorum sensing en V. cholerae , se encontr que en paralelo sistemas de dos componentes constituyen el quorum sensing cascada de sealizacin. Sin embargo, nuestro anlisis gentico sugiere que la V. cholerae quorum sensing circuito es ms complejo que el de V. harveyi en que al menos tres circuitos sensoriales funcionan para controlar la expresin gnica.

Un modelo que incluye los resultados se muestra en la Figura 7 . La V. harveyi -como el Sistema 2 constituye uno de los V. cholerae circuitos. Sistema 2 se compone de los autoinductor LuxS dependiente de AI-2 y su LuxPQ sensor afines. Los resultados presentados aqu (Figuras 2A y 2B) muestran que, en V. cholerae , la inactivacin de LuxS o LuxPQ no afecta significativamente la densidad que dependen de expresin de la luciferasa, mientras que la inactivacin de los organismos reguladores o aguas abajo Luxo HapR elimina la deteccin de la densidad. Estos resultados indican que la otra, el sistema sensorial redundantes deben estar presentes en V. cholerae y que transmiten informacin a travs de Luxo y HapR. Proponemos que la CqsA, CqsS funciones que hemos identificado conforman este sistema (sistema 1 en la figura 7 ). CqsA es una sintasa autoinductor y CqsS es el sensor de la seal de CqsA dependiente de la Figura 3 y Figura 4 . Adems, nuestro anlisis muestra que la epistasis LuxU es compartida por ambos sistemas de deteccin de qurum.

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Figura 7.

Un modelo para la deteccin de qurum en V. cholerae

Al menos tres circuitos de la funcin sensorial en paralelo en V. cholerae . Un sistema se compone de los autoinductor CqsA-dependiente (CAI-1) y su CqsS sensor. Sistema 2 se compone de los autoinductor LuxS-dependiente (AI-2) y su LuxPQ sensor. La informacin de ambos sistemas se canaliza a travs de Luxo LuxU. Nuestros datos muestran que un tercer circuito sensorial ("Sistema 3") debe actuar de forma paralela a los sistemas 1 y 2. Luxo y HapR recibir la informacin de los tres sistemas, ya que su inactivacin suprime completamente dependiente de la densidad lux expresin. Le sugerimos que Luxo indirectamente reprime hapR expresin mediante la activacin del represor (X). Esta suposicin se basa en la analoga de la V. harveyi sistema y el hecho de que Luxo es un 54 -dependientes activador. Un objetivo endgeno de los tres sistemas sensoriales es el reguln virulencia sobre la base de la virulencia del ratn vivo y ensayos de TC y TCP proporcionados en este informe y anlisis similares (Zhu et al., 2002) . Otros objetivos tambin podra ser regulada por estos sistemas redundantes sensorial en V. cholerae .

Curiosamente, los fenotipos de algunos de los V. cholerae mutantes de deteccin de qurum no se corresponden con los de la V. harveyi . En concreto, a diferencia deV. harveyi , en V. cholerae , un doble mutante inactiva, tanto en el Sistema 1 y Sistema 2 mantiene dependiente de la densidad lux expresin (Figura 5) . Este resultado sugiere que al menos uno de los circuitos ms sensorial debe estar presente en V. cholerae . En la figura 7 que hemos denominado el "Sistema 3." El sistema de supuestos tres de sus canales de informacin sensorial, ya la eliminacin de Luxo Luxo suprime completamente dependiente de la densidad lux expresin en V.cholerae (Figura 2A) . Nuestros resultados sugieren que LuxU no est involucrado en los rels del sistema de seal de 3 de Luxo (Fig. 2C) .

Sugerimos que anlogos a V. harveyi , en V. cholerae CAI-1 y un sistema dentro de las especies se utilizan para la comunicacin celular, y el AI-2 y el sistema 2 se utilizan para interespecies la comunicacin celular. No sabemos cul es el papel del Sistema putativo tres obras de teatro. Pistas para su composicin se puede inferir de los datos que presentamos aqu, lo que sugiere que el sistema de tres entradas sensoriales no es una seal extracelular. En concreto, la figura 6C muestra que el mismo nivel de represin de TCPP - lacZ expresin se produce cuando clulas libres de fluidos de cultivo de la cqsA , luxS doble mutante se aaden a cualquiera de los HapR o el HapR
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cepa. Sabemos que Luxo y HapR son necesarios para la transduccin de seales del sistema 3. Por lo tanto, si un sistema de 3-dependiente de la seal estaba presente en el cqsA , luxS doble fluidos de cultivo mutante, podemos predecir que TCPP-lacZ expresin se reprime en mayor medida en el HapR cepa que en el HapR cepa. Teniendo en cuenta que esto no ocurre, la hiptesis de que el Sistema 3 de entrada es una seal que se produce endgenamente intracelular. Si es as, esto significara que una entrada no deteccin de qurum se alimenta en el circuito identificado aqu.
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En un esfuerzo por definir el objetivo endgeno (s) bajo el control de deteccin de qurum en V. cholerae , se analiz la virulencia. En un informe anterior mediante el anlisis de microarrays, que mostr que la expresin de genes de virulencia se reduce significativamente en V. cholerae luxo mutante (Zhu et al., 2002) . Adems, se encontr que en comparacin con el tipo silvestre, un luxo mutante se presentan graves carencias en su capacidad para colonizar ratones lactantes, mientras que unhapR mutante coloniza los ratones tan eficientemente como el de tipo salvaje. Utilizando hapR-lacZ fusiones transcripcionales, hemos demostrado que Luxo ejerce su efecto sobre la expresin de genes de virulencia indirectamente por la represin de hapR transcripcin en baja densidad celular. HapR, a su vez, regula la cascada de la virulencia de la represin de la transcripcin de la TCPP regulador de virulencia global. Consistente con esto, hemos demostrado que el luxo , hapR doble mutante muestra de tipo salvaje virulencia, lo que demuestra que el efecto de Luxo en la expresin de genes de virulencia es HapR dependientes. Llegamos a la conclusin de que, a baja densidad celular, Luxo inactiva el represor HapR, lo que conduce a la expresin de factores de virulencia (Zhu et al., 2002) . Este trabajo mostr que Luxo primeros actos en la expresin de genes de virulencia. Sin embargo, muchos reguladores de expresin de genes de virulencia en V. cholerae ya ha sido bien caracterizado (DeRita et al., 1991) , y nuestros resultados sugieren que los reguladores deben actuar patogenicidad despus de la accin Luxo. En ese momento, que no entenda cmo la informacin fue transmitida a Luxo. Aqu demostramos que la informacin se canaliza a travs de los tres sistemas sensoriales en la figura 7 .Nuestro examen de la patogenicidad del Sistema de individuales y dobles 1 y Sistema 2 mutantes muestra que estas mutaciones son de tipo salvaje por su capacidad para colonizar ratones, as como la produccin de TC y TCP (Figura 6) . Este resultado se espera debido a que sugieren que un triple mutante que es defectuoso para la sealizacin a travs de los tres sistemas deben estar obligados a suprimir la virulencia.

Nuestra hiptesis es que la informacin de sealizacin extracelular es traducida a travs de Luxo y HapR para controlar la virulencia. Se demuestra que las clulas lquidos sin actuar para reprimir la cultura TCPP expresin y la TC y la produccin de TCP (Figura 6) . Adems, se observa que CAI-1 y AI-2 son responsables de gran parte de esta actividad represiva, y que ejercen su efecto a travs de una va HapR dependiente (Figura 6) . Estos resultados sugieren que autoinductores, a travs de los componentes de deteccin de qurum se muestra en la Figura 7 , reprimir la expresin de factores de virulencia en V. cholerae .

En cada experimento en el que se aade libre de clulas lquido de cultivo de V. cholerae , el nivel de TCPP-lacZ expresin es menor que cuando el medio de cultivo estril solo se agrega (comparar los datos de las Figuras 6B y 6C ). Por lo tanto, una actividad inhibitoria adicional est presente en fluidos estacionarios fase de cultivo de V. cholerae que afecta TCPP-lacZ expresin por un mecanismo independiente de HapR. No sabemos si esta actividad es una verdadera seal extracelular o un subproducto metablico de artefactos que se acumula en los fluidos de la fase estacionaria.

Por lo menos tres sistemas sensoriales paralelas existen en V. cholerae y convergen para regular su virulencia. Sugerimos que la redundancia extensa construida en el control de deteccin de qurum de la virulencia proporciona V. cholerae un sistema robusto para el mantenimiento de la patogenicidad. Adems, la redundancia de qurum sistemas de deteccin se combinan con un sistema redundante aparato sensorial del medio ambiente. El ToxRS, sistemas TcpPH integrar las aportaciones como la temperatura, el pH, la fase de crecimiento, y la osmolaridad para controlar la patogenicidad [Gardel y Mekalanos 1994] y [Skorupski y Taylor 1997] . Sugerimos que esta red multicanal de alta complejidad sensorial ha evolucionado porque el cambio entre una no patgena y un estilo de vida patgenos es fundamental para la supervivencia de V. cholerae en los nichos muy diferentes que habita.

Los procedimientos experimentales

Cepas bacterianas y medios de comunicacin

Todos V. cholerae cepas son derivados de El Tor C6706str2, un resistente a la estreptomicina aislar de C6706 (Thelin y Taylor, 1996) . V. cholerae culturas se cultivaron a 30 C con aireacin en Luria-Bertani (LB) caldo de pollo o caldo de SOC (Sambrook et al., 1989) . En los ensayos de virulencia in vitro, V. cholerae fue aumentado a 37 C en medio de la IRA (Iwanaga et al., 1986) . Escherichia coli S17-1pir (De Lorenzo y Timmis, 1994) , DH5a (Sambrook et al., 1989) , y BW27067 (Metcalf et al. , 1996)fueron utilizados como anfitriones de los plsmidos y se cultivaron a 37 C en LB con aireacin o en agar LB. Los antibiticos se utilizan en las siguientes concentraciones: ampicilina, 100 mg / ml, tetraciclina, 5 mg / ml, kanamicina, 50 mg / ml, polimixina B, 50 unidades / ml y estreptomicina, 1 mg / ml.

Las manipulaciones de ADN

Todos los mtodos de ADN se realizaron de acuerdo a Sambrook et al. (1989) . V. cholerae eliminaciones fueron construidas por el mtodo de Skorupski y Taylor (1996). De alta fidelidad, las reacciones de PCR se realizaron con Takara Ex Taq Polimerasa (Panvera) o PfuTurbo ADN polimerasa (Stratagene). Taq polimerasa (Roche) fue utilizado para la eliminacin clones de deteccin por PCR. El dNTPs, endonucleasas de restriccin, y la ADN ligasa de T4 se compraron de New England Biolabs. Kits de purificacin de ADN fueron adquiridos de Qiagen. La instalacin de la Universidad de Princeton SynSeq cabo todas las reacciones de secuenciacin. Primer secuencias estn disponibles bajo peticin.

Dependiente de la densidad bioluminiscencia (Lux) Ensayos

V. cholerae Lux ensayos se realizaron en el SOC con la seleccin de antibiticos para el mantenimiento de csmido pBB1, que lleva la V. harveyi luxCDABE opern. Las culturas se desarrollaron durante 10 horas a 30 C con aireacin. El OD 600 de cada cultura se midi, y los cultivos se diluyeron de manera que cada cultura tena la densidad de clulas idnticas (diluciones fueron de aproximadamente 1:1000). Culturas diluida fueron cultivadas a 30 C con aireacin, y la produccin de luz se midi cada 30 minutos utilizando el modo de quimioluminiscencia de un contador de centelleo Wallac modelo 1409. En cada momento, las alcuotas de los cultivos se diluyeron y se sembraron en agar LB. La densidad celular fue supervisado por contar unidades formadoras de colonias (ufc) al da siguiente. Unidades relativas de luz se define como cuenta min -1 ml -1 x 10 3 / ml ufc -1 .

Transposn mutagnesis y Anlisis de Secuencia de ADN

Tn 5 mutagnesis de V. cholerae KSK1052 ( luxS ) se realiz mediante el vector suicida pRL27c (RA Larsen et al., presentado). Los mutantes se agruparon y se pBB1 se introdujo por conjugacin. Exconjugant colonias fueron transferidas a placas de 96 pozos (Costar 3603, Corning) que contiene LB selectiva. Las placas se agita durante 5 horas a 30 C, y la produccin de luz se midi en un Wallac modelo 1450 MicroBeta Adems contador de centelleo. Mutantes oscuros y tenues fueron recolectados, y los transposones y de acompaamiento V. cholerae ADN fueron clonados (RA Larsen et al., presentado). Anlisis de la secuencia se realiz con Sequencher 4.1 (Gene Codes), el TIGR V. cholerae base de datos ( http://www.tigr.org ), y NCBI BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ).

Los ensayos autoinductor Crossfeeding

Oscuro candidato V. cholerae mutantes llevar pBB1 fueron parcheados en las proximidades de tipo salvaje y luxS V. cholerae cepas donantes en LB agar selectivo.Despus de un crecimiento durante la noche, los candidatos fueron seleccionados para la produccin de luz mayor. En los experimentos de crossfeeding cuantitativa, a principios de la fase estacionaria clulas libres de lquido de cultivo se prepararon en idnticas OD 600 de tipo salvaje (CAI-1 + , AI-2 + ), MM883 (CAI-1 - , AI-2 - ), KSK1052 ( CAI-1 + , AI-2 - ), y MM893 (CAI-1 - , AI-2 + ). Estas preparaciones se analizaron para la estimulacin de Lux MM914 ( cqsA , luxS ) y MM920 ( cqsA , luxQ ). Cultivos de una noche de los beneficiarios se diluyeron 1:10 en caldo LB con la seleccin, y el 30% (v / v) los lquidos de los donantes la cultura se han aadido. La produccin de luz se midi en un Wallac modelo 1450 MicroBeta Adems contador de centelleo lquido. Los datos se presentan como la induccin de veces ms que el nivel de fondo de luz que se produce cuando MM883 (CAI-1 - , AI-2 - ) libre de clulas fluido de cultivo se aadi.

Los ensayos de virulencia

Para los ensayos de colonizacin del ratn, las cepas fueron cultivadas durante la noche en LB (pH 6,5) a 30 C (Taylor et al., 1987) . Los mutantes se mezclan por igual con el lacZ padres KSK262 y por va oral a ratones alimentados infantil (3 - 5 das de edad ratones CD-1, Charles River). Total de unidades formadoras de colonias se obtuvieron a partir de los intestinos pequeos de cuatro a seis ratones despus de 24 horas en placas homogeneizados intestinal de la estreptomicina, la X-gal. El ndice de competitividad se define como la diferencia entre la entrada y salida de los ratios relativos a los mutantes de tipo salvaje. GM1 ELISA ensayos de TC se llevaron a cabo en los fluidos de las culturas AKI crecido a 37 C durante 7,5 horas (Gardel y Mekalanos, 1994) . Extractos para anlisis de inmunoblot fueron preparados a partir de grnulos de las clulas de las culturas AKI crecido y se cuantificaron utilizando el procedimiento de BCA (Pierce). Las protenas fueron separadas en PAGE al 12,5%, y el TCP se visualizan despus de la transferencia a nitrocelulosa y sondear con anticuerpos anti-TCPA (Sun et al., 1991) utilizando el sistema de deteccin ECL (Amersham).

El anlisis de autoinductor dependiente TCPP-lacZ expresin

El TCPP-lacZ reportero fue integrado en el cromosoma de la cqsA , luxS , lacZ (MM938) y el cqsA , luxS , lacZ , hapR (MBM27) V. cholerae cepas [Kalogeraki Winans y 1997] y [Zhu et al. 2002] , dando lugar a tensiones y MM977 MBM34, respectivamente. Libre de clulas lquido de cultivo fueron preparados a partir de principios de cultivos en fase estacionaria crecido de un modo idntico OD 600 . Las cepas de los donantes son de tipo salvaje, C6706str2 (CAI-1 , AI-2 ), MM883, cqsA , luxS, (CAI-1 , AI-2 ); KSK1052, luxS (CAI-1 , AI-2 ) y MM893, cqsA (CAI-1 , AI-2 ). El TCPP-lacZ reportero cepas fueron cultivadas durante la noche en LB a 30 C en presencia de fluidos de cultivo libre de clulas. Posteriormente, las cepas se diluye en 1:10.000 5 x medio AKI clulas que contienen lquidos sin cultura. Tras un crecimiento de 7,5 horas a 37 C, -galactosidasa ensayos se realizaron por triplicado (Slauch y Silhavy, 1991) . galactosidasa -unidades se definen como V max 0.2 / [OD 550 de las clulas Volumen (ml)].
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de Princeton Jacobus Honor (HCH), beca predoctoral del HHMI (DHL), NIH AI39654 (RKT), NIH AI41558 (KS) y la Oficina de Investigacin Naval de subvencin N00014-99-1 hasta 0767 y NSF subvencin MCB-0094447 (BLB). Damos las gracias a T. Silhavy y los miembros del laboratorio de Bassler para discusiones profundas muchos. Damos las gracias a J. Zhu para proporcionar cepas y asesoramiento.

Resumen
Mltiples de deteccin de qurum funcin de los circuitos en paralelo para controlar la virulencia y la formacin de biopelculas de Vibrio cholerae . En contraste con otros patgenos bacterianos que inducen la produccin de factor de virulencia y / o formacin de biopelculas en alta densidad celular en presencia de la deteccin de qurum autoinductores, V. cholerae reprime estas conductas en alta densidad celular. Consistente con esto, mostramos aqu que V. cholerae cepas "bloqueada" en el Estado regulador imitando baja densidad celular se han mejorado para la produccin de biofilm, mientras que los mutantes "bloqueada" en el Estado regulador imitando alta densidad celular son incapaces de producir las biopelculas. La cascada de deteccin de qurum que hemos identificado en V. choleraeregula la transcripcin de genes implicados en la produccin de exopolisacridos (EPS), y las variantes que producen EPS y biofilms surgir en forma de alta frecuencia de no-EPS, no las cepas productoras de biofilm. Nuestros datos muestran que la mutacin espontnea del regulador transcripcional hapR es responsable de este efecto. Varias cepas toxignicas de V. cholerae poseen una mutacin del marco de lectura de forma natural en hapR . Por lo tanto, los entornos distintos ocupado por este patgeno acuticos, presumiblemente incluyen nichos en los que la comunicacin celular es crucial, as como aquellos en los que la prdida de deteccin de qurum a travs de hapR mutacin confiere una ventaja selectiva. Los biofilms bacterianos podra representar un complejo hbitat donde la diferenciacin que esto ocurre.

Introduccin
Regulacin de los genes de bacterias en respuesta a la densidad de las clulas de la poblacin, llamado deteccin de qurum, se lleva a cabo a travs de la deteccin de la produccin, la secrecin y la posterior de las molculas de seal extracelular llamada autoinductores. La expresin del gen objetivo se ve alterada cuando una concentracin autoinductor crtico es alcanzado, lo que facilita los cambios de comportamiento que se relacionan con las fluctuaciones en la densidad de poblacin de clulas ( Miller y Bassler, 2001). Deteccin de qurum circuitos de control de una variedad de funciones fisiolgicas incluyendo la motilidad, la conjugacin, la competencia, la esporulacin, la virulencia y la formacin de biopelculas. Adems, un cierto sentido bacterias y responder a las seales autoinductor mltiples, y en los hbitats naturales, esto podra permitir a diferenciar entre las especies dentro de un consorcio.Presumiblemente, las bacterias coordinar los comportamientos del grupo para llevar a cabo actividades que sera imposible que una bacteria de modo individual para llevar a cabo. El modelo de bacteria marina Vibrio harveyi produce y responde a una acilada homoserina lactona (HSL) seal (HAI-1), que es sintetizada por LuxLM, y, adems, un segundo, borato novela furanosyl dister autoinductor (AI-2), que es sintetizados por LuxS (Schauder et al ,

2001. ; Chen et al ., 2002 ). Se ha propuesto que la HAI-1 es una seal para la comunicacin intraespecfica, mientras que el AI-2 se utiliza como una seal para la comunicacin entre especies ( Bassler et al ., 1997 ). Esta teora ha sido reforzada por la identificacin de luxS y AI-2 en ms de 40 especies de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, y la IA-2-dependen de la regulacin de genes en muchos de esos organismos ( Surette y Bassler, 1998 ; Surette et al , 1999. , Xavier y Bassler, 2003 ). Los estudios de V. harveyi muestran que HAI-1 y AI-2 son detectados por los afines de dos componentes quinasas sensor hbrido, LuxN y LuxQ, respectivamente, y cada uno contiene una histidina quinasa y un dominio regulador de respuesta. Sealizacin se produce por una cascada phosphorelay. Adems, AI-2 requiere la deteccin de la protena LuxP, que muestra similitud con la Escherichia coli, la protena de unin periplsmico ribosa. Es la hiptesis de que el AI-2 interacta con LuxP y luego este complejo interacta con LuxQ de transduccin de la seal. LuxN y LuxP / Q canal de informacin a la protena fosfotransferasa LuxU, que transfiere la seal a la Luxo respuesta de dos componentes del regulador. En baja densidad celular, cuando la concentracin es baja autoinductor, LuxN y LuxQ son quinasas y fosfato de transporte a Luxo. Fosfo-Luxo est activo, y que participa con el factor sigma alternativo 54 para activar la transcripcin de un supuesto represor que impide la expresin de la luciferasa opern luxCDABE . En alta densidad celular, cuando el autoinductores han alcanzado una concentracin crtica, el flujo de fosfato se invierte. Dephospho-Luxo est inactivo. El represor no se expresa, y la transcripcin LuxR activador activa la expresin de luciferasa ( Freeman et al , 2000. ; Miller y Bassler, 2001 ). El ciclo de vida de Vibrio cholerae , como V. harveyi , incluye una fase de vida libre y una gran cantidad asociada a la fase. Sin embargo, a diferencia de V. harveyi , que slo infecta a los anfitriones del mar ( Manefield et al ., 2000 ), V. cholerae se adhiere al intestino humano tras la ingestin de alimentos o agua contaminados, y las causas de la grave epidemia de diarrea enfermedad del clera. Mientras que la toxina coregulados pilus (tcp) mediada por la colonizacin y la expresin de la toxina del clera son los principales responsables del xito de la V. cholerae en vivo , el apego a la superficie de la flora y fauna acutica que parece ser crucial para la supervivencia de V.cholerae durante los perodos interepidmicos en el medio ambiente (ver comentarios Islam et al , 1993. , Cotter y DiRita, 2000 ). Recientemente, un sistema de deteccin de qurum se identific en V. cholerae y demostrado que regulan numerosas incluyendo fenotipos de virulencia ( Miller et al , 2002. , Zhu et al ., 2002 ). El examen de los completado V. cholerae secuencia del genoma mostr que una V. harveyi -como AI-2 de deteccin de qurum circuito estaba presente. El anlisis gentico fue utilizado para demostrar que, adems de este sistema de IA-2, V. cholerae posee otros dos circuitos sensoriales paralelo. Informacin de los tres sistemas se canaliza a la protena de Luxo dos componentes respuesta regulador para controlar la expresin de genes ( Fig. 1. ). Figura 1. Modelo de la V. cholerae qurum circuito de deteccin. Tres circuitos sensoriales convergen para controlar la formacin de biofilm, virulencia, HA / de la proteasa y un reportero heterloga Lux. Los detalles del mecanismo de transduccin de seales se proporcionan en el texto.Cuadrados y tringulos representan CAI-1 y AI-2, respectivamente. La 'X' muestra la protena represora putativo.

Nuestro modelo ( Fig. 1. ) para la deteccin de qurum en V. cholerae predice que, un sistema se compone de un autoinductor (CAI-1) cuya sntesis depende de CqsA, y su sensor CqsS afines. Sistema 2 se compone de los autoinductor LuxS-dependiente (AI-2) y su sensor afines LuxP / Q. Componentes de la supuesta "Sistema 3" son desconocidas. En baja densidad celular cuando las concentraciones son bajas

autoinductor, el fosfato es transferido desde los sensores y CqsS LuxP / Q a la protena integrador LuxU.LuxU transfiere el fosfato de Luxo. Fosfo-Luxo en asociacin con 54 se activa un supuesto represor (X) que reprime la expresin dehapR ( el V. harveyi LuxR homlogo). Como se muestra en la figura. 1 , HapR activa algunos genes especficos y reprime a los dems.En baja densidad celular (es decir, cuando hapR expresin es reprimida), la formacin del biofilm se produce y V. cholerae expresaApha dependiente de genes de virulencia. Por otra parte, no de la proteasa de la hemaglutinina (HA / proteasa) se produce a baja densidad celular porque HapR se requiere para la activacin de la HA / gen de la proteasa hap . Anloga a la V. harveyi circuito, en V.cholerae , en alta densidad celular del flujo de fosfato se invierte, lo que resulta en la defosforilacin e inactivacin de Luxo. Expresin de HapR ocurre, y HapR reprime la expresin de genes la formacin de biofilm por un mecanismo desconocido y la expresin de la virulencia se detiene mediante la unin a la Apha promotor y la represin de Apha transcripcin ( KOVIKOV y Skorupski, 2002 ; Milleret al ., 2002 ; Zhu et al ., 2002 ). HapR tambin activa la transcripcin de la HAP gen que resulta en HA / proteasa de produccin ( Jobling y Holmes, 1997 ). Los estudios apoyan nuestra afirmacin de que la deteccin de qurum se requiere para la expresin de genes implicados en la formacin de biofilm en baja densidad celular. En concreto, hemos demostrado que una hapR mutante que es "bloqueada" en la caracterstica del Estado regulador de baja densidad celular tiene un fenotipo biofilm mejorado, mientras que un luxo mutante que es "bloqueada" en la caracterstica del Estado regulador de alta densidad celular es deterioro de la formacin de biofilm ( Zhu et al ., 2002 ).Sin embargo, los genes biofilm objetivo controlada por los reguladores de deteccin de qurum no fueron identificados en este estudio inicial. Estudios de mutagnesis con V. cholerae han demostrado que la formacin de biofilm adecuado requiere pilus-y el movimiento mediado por flagelos, as como la biosntesis y la expresin de exopolisacridos (EPS) (para una revisin ver Davey y O'Toole, 2000 ). En consecuencia, la inactivacin de dos V. cholerae operones biosntesis de EPS, VPSA-K o Q-vpsL , o un regulador desvinculado de estos operones, vpsR , impide la expresin EPS, reduce la adhesin de superficie y se detiene el desarrollo de biofilms maduros ( Yildiz y Schoolnik, 1999 ; Yildiz et al ., 2001 ) . Aqu nos muestran que la deteccin de qurum controla la formacin de adultos V. cholerae biofilm por las comunidades que dirigen la expresin de los genes de la biosntesis de EPS. En concreto, se demuestra: (i) que la deteccin de qurum controles de maduracin del biofilm, (ii) que la expresin de la VPSA-K y Q-vpsL operones EPS se induce en el biofilm, una mayor hapR mutante, y downregulated en el biofilm con deficiencias luxo mutantes, en comparacin con la cepa de tipo salvaje, y (iii) que la cascada de deteccin de qurum controla la transcripcin de lacZ fusiones a la vps operones en un vpsR manera independiente. Toxignicas varios biofilm con dominio V. cholerae cepas poseen un cambio de marco natural en hapR ( Zhu et al ., 2002 ), y nos muestran que en los ensayos de biofilm extendida que aislar variantes que se han acumulado hapR mutaciones. Nuestra prediccin es que durante su ciclo de vida, V. cholerae se encuentra con una amplia gama de hbitats, que incluyen a favor de los nichos de deteccin de qurum la expresin de genes controlados, as como nichos en los que la eliminacin de la deteccin de qurum a travs de la mutacin de hapRproporciona una ventaja selectiva.

Resultados
La deteccin de qurum controla la formacin de biopelculas en V. cholerae
Varios circuitos de deteccin de qurum-regulan diversas funciones en V. cholerae , incluyendo la virulencia, la actividad de la proteasa y la formacin de biopelculas, las cuales son modulados por la actividad del regulador de respuesta Luxo y HapR ADN-protena de unin (KOVIKOV y Skorupski, 2002 ; Miller et al , 2002. , Zhu et al ., 2002 ). Debido a que activos de fosfato Luxo indirectamente reprime hapRa baja densidad celular, e inactivos dephospho-Luxo permite hapR expresin de alta densidad celular, el luxo y hapR mutantes reguladores muestran patrones opuestos de expresin de los genes diana de deteccin de qurum-regulado. Estos

fenotipos extremos fueron tiles porque nos ha permitido caracterizar la baja y alta densidad celular fenotipos biofilm de V. cholerae . En comparacin con la de tipo salvaje cepa El Tor C6706str2 (Biofilm + ), el luxo mutante que es "bloqueada" en el Estado regulador imitando alta densidad celular es incapaz de formar una biopelcula (biofilm - ) despus de una incubacin de 24 h en caldo Luria (LB) ( Zhu et al ., 2002 ). El luxo fenotipo es similar a la de un vpsR mutante (Biofilm - ), que no puede producir exopolisacridos (EPS) ( Yildiz et al ., 2001 .) Figura 2 muestra que las dos cepas no muestran el adjunto de las bacterias a los lados de tubos de ensayo en la interfase aire-caldo ( fig. 2A ), ambos conceden poco a la superficie de vidrio cubreobjetos ( fig. 2B ), y ambos son incapaces de formar microcolonias visible o agregados multicelulares que se elevan a ms de 5 M sobre la superficie de cubreobjetos ( Fig.. 2C y datos no presentados). Figura 2. Vibrio cholerae qurum mutantes de deteccin han alterado fenotipos formacin de biopelculas. A. formacin de biopelculas por V.cholerae de tipo salvaje y cepas mutantes se incubaron en tubos de ensayo durante 24 h. B. Fase de contraste micrografas de la unin de V. choleraede tipo salvaje y cepas mutantes de cubreobjetos de vidrio despus de 24 h de incubacin. C. micrografas deconvolucin de fluorescencia de la unin de las buenas prcticas agrarias-que expresa V. cholerae luxo y hapRmutantes de cubreobjetos de vidrio despus de 24 h de incubacin. Barra de escala = 5 M.

En contraste con el luxo mutante que es "bloqueada" en el Estado regulador imitando alta densidad celular, un hapR mutante que es "bloqueada" en la caracterstica del Estado regulador de baja densidad celular forma una biopelcula ms pronunciada (Biofilm + + ) que es la cepa de tipo salvaje (Biofilm + ) ( Fig.. 2A ). En concreto, en la interfase aire-caldo, el hapR mutante muestra una pelcula flotante mejorada, que se adhiere a la pared del tubo de ensayo de vidrio y es caracterstico de V. cholerae El Tor biofilms ( Yildiz y Schoolnik, 1999 ). Al igual que la cepa de tipo salvaje, el hapR mutante se adhiere a la superficie del vidrio como colonias individuales y en conjuntos que aparecen como una fase brillante "aster" por microscopa de contraste de fase ( fig. 2B ) y que, como pilares de biofilm en forma de hongo superar los 20 M de altura por microscopa de fluorescencia ( Fig.. 2C ). Con base en nuestros hallazgos previos en V.harveyi , predijo que V. cholerae podra ser "encerrado" en un estado imitando a baja densidad celular mediante la introduccin de la constitutivamente activa luxo alelo luxo D47E ( Freeman y Bassler, 1999 ). Para probar esta idea, se construy la V. cholerae luxo D47E mutante y se caracteriza su deteccin de qurum fenotipos. Como era de esperar, el V. cholerae luxo D47E mutante, como el hapRcepa, no produce luz cuando el V. harveyi luxCDABE periodista se introduce (datos no mostrados, Miller et al ., 2002 ). Adems, el V.cholerae luxo D47E mutante forma una biopelcula ms robusta (Biofilm + + ) que el tipo silvestre de una pelcula marcada ( Fig.. 2A ), y se adhiere al vidrio en los conjuntos que aparecen como pilares de biofilm en forma de hongo por microscopa de fluorescencia ( Fig.. 2B y datos no mostrados).

Nos preguntamos si el Biofilm + + prueba de fenotipo tubo se observ para el hapR y luxo D47E mutantes en comparacin con la cepa de tipo salvaje ( Fig.. 2A ) se debe a una densa biofilms con canales de agua menos, o posiblemente un resultado de ms alto biofilms que contiene un mayor nmero de bacterias. No se observaron diferencias significativas entre los de tipo salvaje, hapR y luxo D47E biofilms mutantes respecto al nmero o la altura de los pilares o extensin de los canales de agua a las 24 h (datos no mostrados).

La cuantificacin de V. cholerae biofilms

Para examinar el fenotipo del biofilm de cada uno de los mutantes de deteccin de qurum, se modific el criterio cuantitativo de 96 pozos de ensayo desarrollado por la placa de biofilm O'Toole et al . (1999 ) para permitir la cuantificacin de ambos las bacterias adheridas y la pelcula flotante. En concreto, se incubaron las clulas en placas de 96 pozos de filtros (Millipore, 11 micras de tamao de poro) y luego quitar las bacterias sin ataduras y medio por aspiracin al vaco a travs del filtro y mantiene las bacterias biofilm adherido a la placa de microtitulacin y se asocia con la pelcula en la superior de los filtros. Es importante sealar que ninguna de las mutaciones que estamos examinando confiere un defecto de crecimiento o una ventaja de crecimiento en medio lquido. Figura 3Amuestra que en comparacin con la cepa de tipo salvaje, el luxo mutante que es "bloqueada" en un estado de baja imitando densidad de las clulas, es defectuoso para la formacin de biofilm (Biofilm - ) similar a la vpsR (EPS - ) mutante, que nos sirve de control negativo. En contraste, el hapR y luxo D47E mutantes que son "encerrados" en el modo de alta densidad celular, la forma mejor biopelculas (biofilms + + ) de tipo salvaje. A luxU mutante formularios reglamentarios biofilms tan mal como el luxo cepa (Biofilm - ).Se observaron diferencias cuantitativas en los fenotipos biofilm entre la cepa de tipo salvaje y mutantes de deteccin de qurum a las 24 h en nuestro ensayo ( figuras 2 y 3A ). Estamos motivado que las diferencias precisas en la cintica de formacin del biofilm de los mutantes de deteccin de qurum se puede medir en un experimento que sigue el curso temporal de la produccin de biofilm. Figura 3Bmuestra que la formacin de biofilm de tipo salvaje V. cholerae es detectable inici aproximadamente a las 12 h en la incubacin, y alcanza un nivel mximo de ~ 24 h (cuadrados de color negro). En contraste, el hapR y luxo D47E mutantes que son "encerrados" en el caracterstico modo de regulacin de baja densidad celular forman el biofilm mximo medible por nuestro ensayo 12.06 h antes que de tipo salvaje (crculos en blanco y negro, respectivamente). Estos resultados apoyan la hiptesis de que, a baja densidad celular, fosfato Luxo la expresin de genes dependientes promueve V. cholerae formacin de biopelculas. Como era de esperar, el vpsR (EPS - ) mutante es defectuoso para la formacin de biofilm en todo el experimento (cuadrados blancos). Finalmente, la figura. 3B muestra tambin que el luxo y luxU cepas, como la vpsR cepa control negativo, son incapaces de formar biofilms en las primeras 24 h de incubacin. Sorprendentemente, sin embargo, tanto el luxo y luxU mutantes biofilm se forma por 36 h (tringulos en blanco y negro, respectivamente). Figura 3. formacin de biopelculas por V. cholerae deteccin de qurum mutantes. A. Vibrio cholerae de deteccin de qurum reglamentario mutantes se analizaron para la formacin de biofilm a las 24 h. B. La cintica de la formacin de biopelculas en los mutantes se analizaron en intervalos de 6 h en un perodo de perodo de 36 h de incubacin. Se muestran los valores medios SE para los pozos de cuatro ejemplares.

Variantes rugosas surgir durante el ensayo de biofilm

Es intrigante que el luxo y luxU mutantes forman biofilms despus de una incubacin prolongada ( Fig. 3B. ) porque ambos son mutantes biofilm - en nuestro estndar, 24 h del ensayo ( figuras 2 y 3A ). Nos preguntamos si de incubacin de la luxo y luxUmutantes ya sea: (i) se activa una va adicional sensorial que permite la formacin de biofilm de manera Luxo / LuxU independiente, o (ii) favorece la acumulacin de mutaciones en los genes que promueven el biofilm formacin. Para examinar estas dos posibilidades, que explota la observacin de que la produccin de EPS abundante por varios V. choleraevariantes espontneas se acopla a la adquisicin de la capacidad de formar biofilms ( Yildiz et al ., 2001 ). Una mayor produccin de EPS tambin confiere una morfologa de las colonias rugosas a V. cholerae , y el fenotipo que puede distinguirse fcilmente de la morfologa de las colonias sin problemas de tipo salvaje V. cholerae en medio slido ( Yildiz y Schoolnik de 1999 , Ali et al , 2000. , 2002 ). Para probar si el luxU y / o luxo mutantes acumulan mutaciones mejorar la formacin del biofilm en el plazo ampliado por supuesto, las clulas de tipo salvaje, luxo y luxU cepas mutantes fueron cosechadas a partir de 96 placas de biofilm de ensayo a los 24 y 36 h y chapada en medio LB. Despus de un crecimiento, las colonias resultantes fueron seleccionados para la adquisicin del fenotipo rugoso. Como controles, vpsR (liso, Biofilm - ) y hapR (rugosa, Biofilm + + ) de las cepas fueron recolectadas tambin y se colocaron en la misma forma. Como era de esperar, despus de la cosecha de los ensayos de biofilm a las 24 y 36 h, las colonias de la vpsRmutantes eran suaves, mientras que las colonias de la hapR mutantes eran rugosas (datos no mostrados). De tipo salvaje, luxo y luxU clulas recolectadas a partir del ensayo biofilm a las 24 horas todos se convirtieron en colonias lisas (datos no mostrados). Sin embargo, fruto de tipo salvaje, luxo , y luxU clulas recolectadas a partir de la prueba despus de 36 h biofilm dio una mezcla de colonias lisas y rugosas. En concreto, de tipo salvaje colonias se haban convertido de suave a rugosa con una frecuencia de menos del 1% (<0,88% 0,003), y el luxo y luxU colonias haban obtenido una morfologa rugosa con una frecuencia ligeramente superior (2,28% 0,003% y 3,00 0,009, respectivamente). En conjunto, estos resultados muestran que la capacidad de los de tipo salvaje V.cholerae para formar biopelculas de 24 h no se debe a la acumulacin de variantes rugosas EPS-en exceso, ya que este cambio morfolgico slo se produce en los ltimos tiempos. Sin embargo, los biofilms formados por luxo y luxU mutantes despus de una incubacin prolongada (es decir, 36 h) puede ser debido a la acumulacin de una mutacin (s). Se consideraron los dos no exclusiva posibilidades de cmo podra formar biofilms en la luxU y luxo extendido incubaciones como consecuencia de la aparicin de EPS-rugosa sobreproduccin de variantes. En primer lugar, la EPS-rugosa sobreproduccin de las variantes podra crecer ms rpido que las cepas parentales, y por lo tanto podra hacerse cargo de la cultura y forma de la biopelcula.En segundo lugar, la EPS abundante producida por las variantes rugosas pueden atrapar las clulas de los padres en la matriz del biofilm. Para investigar estas ideas, se prepararon las mezclas de rugosa (Biofilm + + ) y suave (Biofilm - ) de las cepas y se determin el porcentaje de clulas rugosas que se requieren en la mezcla inicial para la formacin de un biofilm. Tambin se determin el porcentaje de clulas presentes lisas y rugosas despus de la incubacin para determinar si las variantes rugosas tienen una ventaja de crecimiento en condiciones estticas. Mezclas que contienen diversas proporciones de la lisa (Biofilm - ) vpsR mutante y la rugosa (Biofilm + + ) hapR mutantes se prepararon, cada mezcla se dividi por la mitad y al mismo tiempo las alcuotas se incubaron en placas de 96 pozos de filtro para la cuantificacin de biofilm y en estndar de 96 pocillos para la siembra y el recuento posterior. Se utiliz el vpsR mutante como la lisa (Biofilm - ) y la cepa hapR mutante como el rugoso (Biofilm + + ) la tensin debido a que estos mutantes no cambian su morfologa de colonia. Adems, el vpsR cepa fue LacZ - y el hapR cepa fue lacZ + , colonias tan suave es blanca, mientras que las colonias rugosas azul apareci en placas con X-Gal. Para asegurarse de que las mezclas que figuran las proporciones correctas a partir de las cepas, hemos plateado y cont el

nmero de clulas de cada cepa en las mezclas iniciales. El recuento en las mezclas de acuerdo con las relaciones de predecir (como se especifica en la fig. 4A ) a menos de 3%. Sorprendentemente, las mezclas que contienen un principio tan slo 0,01 clulas rugosas% (es decir, 0,01% hapR : 99,99% vpsR clulas) produce importantes biofilms, y biofilms mxima se produce cuando el 0,1% (es decir, 0,1% hapR : 99,9% vpsR clulas) fueron co-incubadas ( fig. 4A ). Nuestra cuantificacin de las clulas por ciento rugosas en las mezclas despus de la incubacin demostrado que la rugosa hapR variante tiene una ventaja de crecimiento a lo largo de la suave vpsR mutante. En concreto, durante la incubacin de 24 h, la proporcin de rugosa: clulas lisas aument en ms de 100 veces de la relacin inicial ( . Fig. 4A ). Figura 4 tambin muestra que la presencia de clulas rugosas menos del 10% al final de el experimento da como resultado la formacin de biofilm casi mxima. Figura 4. Un pequeo porcentaje de las variantes rugosas es suficiente para formar una biopelcula. A. Muestra la media SE de cuatro ejemplares de los pozos de las mezclas de V. cholerae (Biofilm + + ) hapR y (Biofilm - ) vpsR lacZ mutantes mezclan en el indicado vol: vol ratios (t = 0 h) y se incubaron durante 24 h. Unidades formadoras de colonias (UFC) se calcularon para verificar la inicial (t = 0 h) y final (t = 24 h) relaciones. B. muestra una micrografa de fluorescencia de una seccin interna horizontal de una pelcula ~ 50 micras de espesor. La muestra fue recolectada despus de 24 h esttica co-incubacin de V. cholerae hapR (Biofilm + + ) y GFP-expresando vpsR (Biofilm - ) cepas mezcladas en una relacin inicial de 0,01% hapR : 99,99% vpsR / pMMB GRN-. La pelcula (rojo) se visualiza mediante contraste de fase, y el vpsR clulas (verde) se visualizan por microscopa de fluorescencia. Barra de escala = 10 micras.

Especulamos que la EPS abundante producida por una rugosa (Biofilm + + ) hapR mutante podra servir como una matriz para atrapar fsicamente suave (Biofilm - ) vpsR clulas en la biopelcula durante un experimento de mezcla. Para probar esta idea, hemos preparado las mezclas que contienen diversas proporciones de la vpsR y hapR mutantes que el anterior, excepto que marc el vpsR mutante mediante la introduccin de un plsmido (pMMB-GRN) que codifica la protena verde fluorescente (GFP). Despus de la incubacin, las mezclas y los controles fueron examinados por el contraste de fases y microscopa de fluorescencia. El suave vpsR / pMMB-GRN tensin s mismo no forma una pelcula de biopelculas, y el hapR cepa solo forma una pelcula resistente biofilm que no es fluorescente, ya que carece de la GFP-expresando plsmido ( Fig. 2. y datos no mostrados). Por el contrario, la pelcula biofilm producido por la mezcla del 0,01% hapR : 99,99% vpsR / clulas pMMB-GRN contena cepas. Se observ ( Fig. 4B. ), que la pelcula fue compuesta de biofilm predominantemente no fluorescentes (es decir, hapR , Biofilm + + ) las clulas salpicado de fluorescentes (es decir, vpsR / pMMB GRN, Biofilm - ). clulas Figura 4B muestra una seccin horizontal representante, sin embargo, el examen microscpico de las muchas secciones similares horizontal a travs del biofilm mostraron que las clulas fluorescentes se distribuyeron a lo largo de la pelcula entera. En conjunto, los resultados presentados en la figura. 4A y B muestran que slo un pequeo nmero de rugosa (Biofilm + + ) las clulas se requieren en un cultivo inicial de lisa (Biofilm - ) las clulas para la formacin de biofilm, porque las clulas rugosas crecer mucho ms rpido en estas condiciones y tambin la trampa no rugosas en las clulas la matriz del biofilm.Llegamos a la conclusin de que luxo y luxU (Biofilm - ) biofilms forma cepas despus de 36 h ( . Fig. 3B ), ya que rugosa (Biofilm + +) variantes surgen durante el ensayo, las variantes de crecer ms rpido que las cepas parentales y, adems, la trampa sin problemas clulas de sus padres en un biofilm.

Anlisis de los mutantes supresores rugosa

Numerosos estudios documentan la observacin de que lisa V. cholerae clulas incubadas bajo condiciones de estrs convertir en rugosa variantes que producen abundante EPS ( Morris et al , 1996. ; Wai et al , 1998. ; Yildiz y Schoolnik de 1999 , Ali et al ., 2002 ).Nuestros experimentos han demostrado que se encuentra aguas abajo de HapR LuxU y Luxo en el V. cholerae deteccin de qurum en cascada ( Miller et al ., 2002 ), y, adems, que la mutacin de hapR causa una rugosa (Biofilm + + ) fenotipo. De acuerdo con estos hallazgos, un doble hapR luxo mutante tiene una rugosa (Biofilm + + ) fenotipo idntico al nico hapR mutante ( Fig. 1. , datos no presentados y Miller et al , 2002. , Zhu et al ., 2002 ). Por lo tanto, hapR es un gen candidato que, si inactivado por una mutacin durante la prolongada luxU y luxo ensayos de biofilm, podran explicar tanto la adquisicin de la biopelcula + + y los fenotipos rugosa. Para probar esta idea, hemos aislado tanto de las clulas lisas y rugosas variantes de las 36 h biofilm en funcin del tiempo de los ensayos de la luxo cepa. Estas clulas fueron purificados, cultivados en medio lquido, y posteriormente de nuevo a prueba para la formacin de biofilm en el estndar de 24 h de ensayo. Figura 5 se muestran los resultados de un representante suave aislar y tres variantes rugosas representativos obtenidos de esta manera. Como era de esperar, como el luxo padre, el luxo aislado que conserva la morfologa suave durante el ensayo (denominado suave) se mantuvo Biofilm - , mientras que cada una de las luxo aislados que haba obtenido el fenotipo rugoso se haba convertido tambin Biofilm + + (denotado rugosa 1, 2 y 3). Como controles se analizaron los fenotipos de la de tipo salvaje, luxo y hapR cepas, y estos se muestran en la figura. 5A-C . Figura 5. variantes rugosas adquieren mutaciones en hapR . Tras una incubacin de 36 h de la luxo mutantes biofilm en un tiempo-por supuesto ensayo, tres rugosa y una colonia lisa se purifica y se compara con V.cholerae tipo salvaje, luxo y hapR de (A) la formacin del biofilm (B) bioluminiscencia, y (C) la actividad de la proteasa. A. La media de formacin de biopelculas SE de cuatro ejemplares de los pozos de V. cholerae tipo salvaje y cepas mutantes se incubaron durante 24 h. B. La media SE bioluminiscencia para dos cultivos de V. cholerae tipo salvaje y cepas mutantes que lleva el V. harveyi luxCDABE pBB1 plsmido reportero se incubaron durante 9 h. C. La media de actividad de la proteasa SE de dos cultivos de V. cholerae tipo salvaje y cepas mutantes se incubaron durante 12 h.

Los investigadores razonaron que, si la inactivacin de hapR fue el responsable del cambio de un suave (Biofilm - ) a una rugosa (Biofilm + + ) fenotipo de las variantes rugosas, a continuacin, las variantes rugosas que tienen el fenotipo de deteccin de qurum de un hapR mutante. Para probar esta prediccin, se introdujo la V. harveyi luciferasa opern ( luxCDABE ) en la de tipo salvaje, luxo y hapR cepas, as como las clulas lisas y rugosas variantes a prueba en el experimento de biofilm se muestra en la figura. 5A . A

continuacin, utiliza la produccin de luz, como un reportero de la deteccin de qurum ( la fig. 1 y Miller et al ., 2002 ). Utilizando Lux, hemos demostrado que de tipo salvaje V. cholerae muestra la expresin dependiente de la densidad de la luminiscencia, el luxomutante que es "bloqueada" en el modo de regulacin se asemeja alta densidad celular es constitutivamente brillante, y el hapRmutante que es "bloqueada" en la caracterstica del Estado regulador de baja densidad celular es oscuro ( Miller et al ., 2002 ).Consistente con esto, se muestra en la figura. 5B que, en alta densidad celular, de tipo salvaje y luxo V. cholerae que contieneluxCDABE son brillantes y producen entre 10 5 y 10 6 unidades relativas de luz (RLU), y el hapR cepa no produce luz (<10 RLU). Figura 5B muestra tambin que, al igual que su padre, el buen luxo aislarse de la prueba de biofilm extendido (denominado suave en la fig. 5B ) es brillante (10 5 RLU). Sin embargo, las tres cepas que adquiri el Biofilm + + y fenotipos rugosa son incapaces de producir la luz tras la introduccin de luxCDABE , y han adquirido un fenotipo de deteccin de qurum idntica a la de la hapR mutante. Estas variantes se denominan rugosa 1, 2 y 3 en la figura. 5B . Como prueba adicional, para un funcionamiento hapR / deteccin de qurum en el circuito de luxo rugosa (Biofilm + + ) cosechado variantes de la prueba de 36 h biofilm, se analizaron para HA / actividad de la proteasa. La HAP gen codifica la HA / de la proteasa, y su expresin es HapR-dependiente ( Fig. 1 y Jobling y Holmes, 1997 ). En la figura. 5C , nuestros controles indican que en comparacin con la cepa de tipo salvaje, el hapR mutante es incapaz de producir HA / proteasa actividad, mientras que el luxo mutante se ha incrementado HA / actividad de la proteasa que es una consecuencia de la constitutiva hapR expresin ( Zhu et al ., 2002 ). El buen aislamiento del ensayo biofilm (denominado suave) posee alta HA / proteasa actividad equivalente a la de sus padres luxo cepa. Sin embargo, dos de los tres rugosa, Biofilm + + variantes (rugosa 1 y 2) aislado de la luxo ensayo de biofilm, como el hapR cepa, no producen ningn tipo de actividad de la proteasa. La tercera variante (rugosa 3) produce alrededor de la mitad de la actividad de la proteasa del luxo padres. Se amplific, clon y secuenci el hapR gen y la regin de regulacin aguas arriba de los cuatro aislamientos examinados en estos experimentos. En el buen aislamiento, el hapR genes y el ADN vecinos tenan la secuencia de tipo silvestre. Sin embargo, cada variante rugosa haba adquirido una mutacin en hapR . En concreto, la rugosa una variante contena una insercin de 2 pb despus del codn especifica de aminocidos de 34 aos, que se traduce en un polipptido truncado HapR que se prev que sea 69 aminocidos de longitud (de tipo salvaje HapR es de 203 aminocidos). La rugosa 2 y 3 variantes haba adquirido las mutaciones puntuales que resulta en la R18C cambios y R12Q respectivamente. Curiosamente, el HapR hlice-giro-hlice (HTH) regin de unin al ADN se prev que comience en el aminocido 19, sobre la base de homologa con la regin de ADN HTH vinculante de TetR D , que fue co-cristalizado con tetraciclina ( Kisker et al ., 1995 , Jobling y Holmes, 1997 ). Por lo tanto, podemos predecir que la rugosa dos alteracin en el aminocido 18 confiere un fenotipo nulo HapR. Tenemos la sospecha de que la rugosa tres mutacin produce una protena con actividad residual HapR que podran explicar el bajo nivel de la proteasa se muestra en la figura. 5C .

La deteccin de qurum controla la expresin de genes EPS en V. cholerae

Vibrio cholerae hapR y luxo D47E mutantes que estn "bloqueados" en el modo de regulacin que imitan baja densidad celular parecen rugosas en medio slido y se han mejorado para la formacin de biofilm en comparacin con la cepa de tipo salvaje ( figuras 2 y 3 , y los datos no mostrados) . Debido a que una morfologa de las colonias rugosas en V. cholerae se asocia con la produccin de EPS abundante ( Yildiz y Schoolnik, 1999 ) nos preguntamos si EPS de reglamentacin y / o biosinttico genes son controlados por la deteccin de qurum en V. cholerae . Para probar esta posibilidad, se construy y se midi la expresin de lacZ fusiones transcripcionales a dos genes de la biosntesis de EPS no vinculadas operones: vpsB (VC0918 en el TIGR V. cholerae base de datos;http://www.tigr.org ), el segundo gen de la un grupo de 11 genes, y vpsL (VC0934), el primer gen de un grupo de seis genes ( Yildiz y Schoolnik de 1999 , Ali et al ., 2000 ). Tambin analizaron un lacZ de fusin a la vpsR gen, que controla la expresin tanto de la vpsB yvpsL operones ( Yildiz et al ., 2001 ). Por ltimo, como

control, se analiz la actividad de hap-lacZ , ya que, como se ha mencionado, su transcripcin es HapR (es decir, la deteccin de qurum) dependiente ( Jobling y Holmes, 1997 ). Pensamos que si la deteccin de qurum activa la produccin de EPS, a continuacin, vps transcripcin debe ser inducida a baja densidad celular, cuando fosfo-Luxo es actualmente. Figura 6 muestra que en la cepa de tipo salvaje, vpsB-lacZ y vpsL lacZ- se expresan en baja densidad de las clulas, mientras que estos genes no se expresan en el luxo mutante que es "bloqueada" en el modo de alta densidad celular. Debido a fosfo-Luxo reprime hapR expresin en baja densidad celular, hap expresin no debera ocurrir en esta condicin. De acuerdo con nuestra hiptesis y con los resultados anteriores ( Jobling y Holmes, 1997 ; Miller et al ., 2002 ), a baja densidad celular, la cepa de tipo salvaje no expresa el hap-lacZ fusin. En contraste, el luxo mutante que es incapaz de reprimir hapR , expresa hap-lacZ . Bajo esta condicin, el vpsR-lacZ fusin se expresa tanto en el tipo salvaje y el luxo mutante. Figura 6. La deteccin de qurum controla la transcripcin de la V. cholerae vps genes. galactosidasa -se muestran las actividades de haplacZ, vpsB lacZ- , vpsL lacZ- , y vpsR-lacZ fusiones en A y BA Las actividades de las fusiones en el tipo salvaje (barras de color negro) y luxo mutantes (barras blancas) mostrado un crecimiento siguiente a baja densidad celular (3-4 h).B. Las actividades de las fusiones en el tipo salvaje (barras de color negro) y hapR mutante (barras blancas) se muestran despus de un crecimiento de alta densidad celular (1214 h). C. galactosidasa -las actividades de unvpsB-lacZ de fusin en el tipo salvaje y el hapR V. cholerae cepas albergar un control de vectores (barras de color negro) o el vector de expresin constitutiva hapR (barras blancas). Los valores medios SE se presentan a las culturas por triplicado.

Nos predijo adems que si la deteccin de qurum est involucrado en vps regulacin, HapR debe reprimir vps la transcripcin de genes en alta densidad celular cuando Luxo es desfosforilado e inactivos. Para probar esta idea, en alta densidad celular, se compar lalacZ reportero salidas del tipo salvaje y el hapR cepa que es "bloqueada" en el modo de baja densidad celular. Figura 6B muestra que, tras un crecimiento durante la noche, la de tipo salvaje la tensin es reprimidos de 10 veces para vpsB-lacZ y 15 veces para vpsL-lacZexpresin en comparacin con el hapR mutante. 6B figura tambin muestra que HapR se requiere para la activacin de la HAP-lacZfusin a alta densidad celular. Una vez ms, como en el experimento de la figura. 6A , slo se observa una pequea diferencia en vpsR-lacZ expresin en las diferentes cepas. Para comprobar que estos efectos se deben a hapR , que expresa constitutivamente hapR en el tipo salvaje y el hapR cepas y se mide su efecto sobre un blanco activado ( hap-lacZ ) y uno de los objetivos de represin ( vpsB-lacZ ).De acuerdo con los resultados

anteriores y con estudios previos ( Jobling y Holmes, 1997 ), la expresin constitutiva de hapR tanto de tipo salvaje y hapR V. cholerae resultados en la represin de vpsB-lacZ expresin ( Fig.. 6C ) y la activacin de hap -lacZ expresin (datos no mostrados). En conjunto, los resultados mostrados en la figura. 6 indica que el V. cholerae deteccin de qurum circuito regula hap , vpsB y vpsLexpresin a travs de fosfo-Luxo y HapR. Sin embargo, al parecer vpsR no est bajo el control de deteccin de qurum. Le sugerimos que, a baja densidad celular, fosfato Luxo reprime hapR expresin. La ausencia de resultados HapR en la expresin de la vpsB y vpsLoperones y, a su vez, la formacin del biofilm. Sin embargo, bajo esta condicin, el HA / de la proteasa no se produce porque hap no se expresa. En alta densidad celular, la inactivacin de los resultados de Luxo en la produccin de HapR. HapR activa la transcripcin deHAP por lo que la HA / proteasa se hace. Sin embargo, HapR reprime la expresin de la vpsB y vpsL operones, lo que evita la formacin de biofilm. Actualmente, no sabemos si HapR mediada por la represin de la vps loci es directa o indirecta. Nos encontramos con que ninguno de Luxo HapR ni afecta a la transcripcin de la vpsR gen ( Fig. 6 A y B. ), y este resultado es consistente con las observaciones anteriores, que suave, Biofilm - cepas rugosas y espontnea, Biofilm + + variantes no muestran diferencias en vpsR transcripcin ( Yildizet al ., 2001 ). Por lo tanto, la deteccin de qurum controles vpsB - y vpsL dependiente de la V. cholerae EPS biosntesis de una fosfo-Luxo y HapR dependiente VpsR independiente del mecanismo. Sigue siendo posible que la deteccin de qurum regula otros V.cholerae genes implicados en la produccin de EPS o reglamento que quedan an por identificar.

Discusin
Masivos brotes estacionales de clera son una consecuencia directa del xito de la V. cholerae en la adaptacin a dos hbitats distintos: el medio ambiente marino y el intestino humano. El apego a ambas superficies abiticos y biticos en el ocano y en el husped humano es fundamental para el perfil epidemiolgico de este patgeno. Vibrio cholerae El Tor posee al menos tres circuitos de deteccin de qurum, que convergen para controlar la expresin de virulencia, la produccin de la proteasa y la formacin de biofilm en respuesta a la densidad de las clulas de la poblacin. En trabajos anteriores hemos demostrado que a baja densidad celular, activa fosfo-Luxo HapR reprime, y en ausencia de HapR, genes de virulencia se expresan ( Fig. 1 y. Miller et al , 2002. , Zhu et al ., 2002 ).Mostramos aqu que la deteccin de qurum similar regula la produccin de biofilms travs de la regulacin de los genes necesarios para la produccin de EPS, que ya ha demostrado que los necesarios para V. cholerae formacin de biopelculas ( Yildiz y Schoolnik, 1999 ). Anloga a la expresin de genes de virulencia, los estudios actuales muestran que a baja densidad celular, fosfato Luxo y la funcin para activar HapR vps genes necesarios para la formacin de biopelculas ( Figuras 1 y 6 ). En alta densidad celular, Luxo est inactiva y no reprimir HapR y HapR a su vez, reprime la expresin de virulencia a travs de la unin a la Apha promotor y la represin de la transcripcin ( KOVIKOV y Skorupski, 2002 ). Bajo esta condicin, el vps genes tambin son reprimidos y la formacin de biofilm no se produce. Queda por determinar si el efecto de HapR en vps la transcripcin de genes es directa o indirecta. A diferencia de los genes de virulencia y la biopelcula, el hap gen, que codifica la proteasa Hap no se expresa en baja densidad celular, y HapR activa su expresin en alta densidad celular ( Figuras 1 y 6 , y Jobling y Holmes, 1997 ). El aspecto ms sorprendente de este trabajo es que, en V. cholerae , la expresin de genes de virulencia y la formacin de biopelculas se producen en baja densidad celular, en ausencia de autoinductores y estos fenotipos son reprimidos en alta densidad celular cuando las molculas de seal se han acumulado. Para nuestro conocimiento, en todos los casos estudiados, la deteccin de qurum promueve la produccin de factores de patogenicidad y la formacin de biofilm en alta densidad celular. Sugerimos que la auto-limitacin de la naturaleza

de la infeccin del clera, a diferencia de las infecciones crnicas causadas por otros patgenos (sobre todo,Pseudomonas aeruginosa ), puede explicar el uso de contraste de quorum sensing para controlar la formacin de biofilm y la expresin de factores de virulencia. Vibrio cholerae penetra en el husped a travs de agua contaminada, las bacterias se adhieran al epitelio intestinal, y secretan toxinas y otros factores de virulencia que se traducen en diarrea severa. Como consecuencia de la diarrea, las bacterias son purgados del anfitrin y se devuelve al medio ambiente. Nuestros resultados sugieren que podra ser beneficioso para laV. cholerae que se biofilm / adhesin competente y para expresar productos de genes de virulencia en condiciones de baja densidad de las clulas-es decir, las condiciones de comienzo de la infeccin. Sin embargo, despus que las bacterias han llegado a alta densidad celular, con el fin de salir de la sede, podemos afirmar que V. cholerae vuelve incompetentes para tomar las biopelculas y, presumiblemente, se adhieren al intestino, las bacterias dejan de producir los factores de patogenicidad, y esto ayuda a la transicin de regreso a un estilo de vida adaptado al ambiente exterior. Curiosamente, en alta densidad celular, V. cholerae utiliza la deteccin de qurum para activar la expresin de la proteasa del Hap, que se ha propuesto ser un 'detachase' que promueve la liberacin del epitelio y el escape en el medio ambiente ( Finkelstein et al ., 1992 ). En contraste directo con nuestros resultados, la acumulacin de autoinductores por Pseudomonas aeruginosa en alta densidad celular promueve la maduracin del biofilm, y adjuntar los mutantes que no pueden sintetizar autoinductor pero no se diferencian en las biopelculas, con una arquitectura madura ( Davies et al ., 1998 ). Adems, en P. aeruginosa , la expresin de factor de virulencia en alta densidad celular requiere un qurum intacta circuito de deteccin. Pseudomonas aeruginosa es un patgeno oportunista humano, en particular de la Fibrosis Qustica (FQ) que sufren. Por lo general, los pacientes con FQ de manera permanente colonizado por P.aeruginosa , y, finalmente, sucumbir a la infeccin bacteriana. Por lo tanto, a diferencia de V. cholerae, que temporalmente ocupa el nicho humano, P. aeruginosa sigue siendo en este nicho especializado de forma indefinida. Nosotros sugerimos que el control de deteccin de qurum de la formacin de biofilm y la expresin de factor de virulencia es opuesta tiempo en V. cholerae y P. aeruginosa ya que los circuitos han sido adaptados especficamente a promover el tipo de enfermedad en particular para cada microbio. Vibrio cholerae El Tor C6706 es capaz de formar una biopelcula y es totalmente virulentas ( figuras 2 y 3 , y Zhu et al ., 2002 ), sin embargo, competente biofilm varios virulenta V. cholerae cepas incluyendo la cepa secuenciada El Tor N16961 poseen un marco de lectura natural en el hapR gen que elimina la entrada de deteccin de qurum ( Zhu et al ., 2002 ). Por lo tanto, un funcional sistema de deteccin de qurum no es un requisito absoluto para la virulencia o la formacin de biofilm. Sin embargo, la preservacin de un funcional hapR genes virulentos en C6706 El Tor sugiere un sistema intacto de deteccin de qurum se debi a que se requiere en algunos nichos. En nuestro ampliado biofilm en funcin del tiempo los experimentos se observ que el tipo salvaje, luxo , y luxUtensiones se acumulan las mutaciones que causan la formacin de biopelculas mayor, la sobreproduccin de EPS, y dar a las colonias un aspecto rugoso. Se analizaron varias variantes rugosas tales y se encontr que haban adquirido las mutaciones en hapR ( Fig. 5. ).Varios otros mutantes se han caracterizado que confieren un fenotipo similar en V. cholerae . Por ejemplo, CYTR, un represor de la absorcin y el metabolismo de los nuclesidos, tambin reprime la transcripcin de vpsL . Por lo tanto, la mutacin de CYTR promueve la produccin de EPS y le confiere una morfologa de las colonias rugosas a V. cholerae ( Haugo y Watnick, 2002 ). Numerosos estudios han documentado la acumulacin de mutaciones que confieren indefinido la morfologa rugosa a V. cholerae cultivadas bajo estrs prolongado de nutrientes ( Morris et al , 1996. ; Wai et al , 1998. ; Yildiz y Schoolnik de 1999 , Ali et al , 2002. ). En conjunto, estos resultados muestran que parece que hay una presin selectiva para la V. cholerae a aumentar la produccin de EPS y biofilms forma y esto puede ser manifestada por varios mecanismos, incluyendo: (i) la deteccin de qurum, a travs de la represin de hapR (ii) una mutacin espontnea de hapR o CYTR , o (iii) por mecanismos que pueden ser hapR / CYTR independiente. Por lo tanto, la formacin de biofilm en V. cholerae est controlado por una variedad de estmulos

sensoriales, slo unos pocos de los cuales se han caracterizado hasta la fecha. Es de suponer que la capacidad de transicin entre una gran cantidad asociada y una fase de vida libre es fundamental para la V. cholerae . Le sugerimos que V. cholerae ha desarrollado varios mecanismos para esta conversin, y esta redundancia probablemente reduzca su vulnerabilidad frente a las mutaciones y las influencias ambientales que afectan cualquier va nica. Los biofilms bacterianos son espacialmente heterogneas, lo que produce gradientes de nutrientes y sustancias qumicas que resultan en micronichos dentro de las comunidades microbianas ( Costerton et al , 1994. ; Stoodley et al ., 2002 ). Incluso dentro de los biofilms sola especie, la expresin gnica diferencial espacial y temporal se produce ( Whiteley et al ., 2001 ). En las biopelculas de especies mixtas, la heterogeneidad estructural apoya la co-existencia de mltiples organismos dentro de una comunidad que, aparentemente, beneficia a todos los habitantes ( Shapiro, 1998 ). Nuestros datos apoyan la hiptesis de que el medio ambiente biofilm pueden promover mutaciones, que producen un biofilm genotpicamente diferenciadas ( Shapiro, 1998 ). Por ejemplo, en respuesta al estrs, un subgrupo de individuos en una poblacin inicialmente homognea se puede acumular una mutacin (s) (es decir, en hapR ) que permite a ese subconjunto de producir EPS abundante, crecen ms rpido y ms robusto formar biopelculas. El grupo de Biofilm + +mutantes en la poblacin puede proporcionar una mayor adherencia al sustrato, las estructuras que promueven el flujo de nutrientes y eliminacin de residuos, y una funcin de barrera que protege y mejora la supervivencia de todos los miembros de la comunidad. Los restantes miembros de la biopelcula puede aportar beneficios diferentes a la comunidad tales como la comunicacin entre clulas. Por lo tanto, la capacidad de las bacterias a variar en la biopelcula ya sea mediante la alteracin de los patrones espaciales y temporales de la expresin gnica o mediante la fijacin de los nuevos patrones de expresin gnica a travs de mutaciones puede promover la especializacin de funciones y puede simular el desarrollo multicelular.

Los procedimientos experimentales

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
La V. el clera El Tor cepas utilizadas en este estudio son los derivados de C6706str2, un resistente a la estreptomicina aislar de C6706 ( Tabla 1 ) . Escherichia coli S17-1pir, y las cepas JM109 DH5a fueron utilizados para la clonacin. Todas las cepas se cultivaron en LB o el agar LB a 37 C, excepto cuando se indique. Vibrio cholerae caldos de cultivo fueron cultivadas bajo condiciones estticas durante los ensayos de biofilm y para el anlisis microscpico se describe a continuacin. Los cultivos fueron aireadas por la agitacin a ~ 200 rpm para la determinacin de unidades formadoras de colonias (UFC), y para los ensayos de bioluminiscencia, la proteasa y -galactosidasa. Donde se indique, los antibiticos se utilizan en las siguientes concentraciones (mg ml -1 ): ampicilina 100, 100 a la kanamicina, polimixina B 50, 1000 estreptomicina y tetraciclina 10. V cholerae cepas Caractersticas relevantes Referencia / fuente

C6706str2

El Tor tipo salvaje

Thelin y Taylor (1996 )

MM307

C6706str2 luxo

Miller et al . (2002), Zhu et al . (2002)

MM194

C6706str2 hapR

Miller et al . (2002), Zhu et al. (2002)

BH038

C6706str2 luxo D47E

Este estudio

MM310

C6706str2 luxU

Miller et al . (2002 )

V cholerae cepas

Caractersticas relevantes

Referencia / fuente

BH039

C6706str2 vpsR

Este estudio

BH063

MM307/pMMB-GRN

Este estudio

BH067

MM194/pMMB-GRN

Este estudio

BH125

BH039/pMMB-GRN

Este estudio

MM946

C6706str2 lacZ

MB Miller y Bassler BL, publ.

MM936

MM307 lacZ

MB Miller y Bassler BL, publ.

MBM20

MM194 lacZ

MB Miller y Bassler BL, publ.

BH121

BH039 lacZ

Este estudio

BH143

MM946:: pVIK112 vpsB-lacZ

Este estudio

BH146

MM936:: pVIK112 vpsB-lacZ

Este estudio

BH153

MBM20:: pVIK112 vpsB-lacZ

Este estudio

BH200

MM946:: pVIK112 vpsL-lacZ

Este estudio

BH359

MM936:: pVIK112 vpsL-lacZ

Este estudio

BH398

MBM20:: pVIK112 vpsL-lacZ

Este estudio

BH327

MM946:: pVIK112 hap-lacZ

Este estudio

BH335

MM936:: pVIK112 hap-lacZ

Este estudio

BH339

MBM20:: pVIK112 hap-lacZ

Este estudio

BH333

MM946:: pVIK112 vpsR-lacZ

Este estudio

BH237

MM936:: pVIK112 vpsR-lacZ

Este estudio

BH354

MBM20:: pVIK112 vpsR-lacZ

Este estudio

BH425

MM946:: pVIK112 vpsB-lacZ / pBBR1MCS4

Este estudio

BH437

MBM20:: pVIK112 vpsB-lacZ / pBBR1MCS4

Este estudio

BH427

MM946:: pVIK112 vpsB-lacZ / p hapR

Este estudio

BH439

MBM20:: pVIK112 vpsB-lacZ / p hapR

Este estudio

V cholerae cepas

Caractersticas relevantes

Referencia / fuente

BH433

MM946:: pVIK112 hap-lacZ / pBBR1MCS4

Este estudio

BH417

MBM20:: pVIK112 hap-lacZ / pBBR1MCS4

Este estudio

BH435

MM946:: pVIK112 hap-lacZ / p hapR

Este estudio

BH419

MBM20:: pVIK112 hap-lacZ / p hapR

Este estudio

BH265

"Rugosa 1 'MM307 hapR marco de cambio de mutantes

Este estudio

BH267

"Rugosa 2 'MM307 hapR R18C

Este estudio

BH268

"Rugosa 3 'MM307 hapR R12Q

Este estudio

BH275

"Suave" MM307

Este estudio

MM227

C6706str2/pBB1

Miller et al . (2002 )

MM349

MM307/pBB1

Miller et al . (2002 )

MM239

MM194/pBB1

Miller et al . (2002 )

BH285

BH265/pBB1

Este estudio

BH289

BH267/pBB1

Este estudio

BH291

BH268/pBB1

Este estudio

BH444

BH275/pBB1

Este estudio

Plsmidos

pMMB-GRN

IPTG-inducible protena verde fluorescente

Sturgill-Koszycki y Swanson (2000 )

pBB1

csmido llevar V. harveyi luxCDABE opern

Miller et al . (2002 )

pUC19

plsmido de expresin

Yanisch-Perron et al . (1985 )

pKAS32

plsmido suicida

Skorupski y Taylor (1996 )

pBH1

pUC19-luxo D47E

Este estudio

pBH3

pKAS32 luxo-D47E

Este estudio

pBH2

pKAS32-vpsR

Este estudio

pVIK112

promotor lacZ plsmido suicida

Kalogeraki y Winans (1997 )

V cholerae cepas

Caractersticas relevantes

Referencia / fuente

pGEM -T Easy

PCR vector de clonacin

Stratagene

pBH7

pGEM -T Easy-vpsL

Este estudio

pBH6

pGEM -T Easy-vpsR

Este estudio

pBH8

pVIK112-vpsL-lacZ

Este estudio

pBH9

pVIK112-vpsR-lacZ

Este estudio

pMM1294

pVIK112-vpsB-lacZ

Miller y Bassler, publ.

pMM1174

pVIK112-hap-lacZ

Miler y Bassler, publ.

pBBR1MCS4

p lac promotor vector de expresin

Kovach et al . (1995 )

p hapR

hapR bajo el control de p lac promotor

Zhu et al . (2002 )

Tabla 1. . Cepas y plsmidos utilizados en el estudio.

Construccin de V. cholerae mutantes

A V. cholerae cepa que contiene una delecin en el marco de la vpsR gen, que codifica un activador de la produccin de exopolisacridos se construy de la siguiente manera. La secuencia de ADN que codifica el codn de iniciacin y secuencia ascendente de la vpsR gen se amplific a partir de tipo salvaje V. cholerae por PCR utilizando los cebadores Vc-145 (5'-AAAATCTAGACACGTTGAT GTGGAGCCTTTC-3 ') y VC-146 (5'-AAAAAAAAGCGGC CGCGTGCTCATGAACCTATATTCCTT-3'), que introdujo Xba I y no me los sitios respectivamente. La secuencia de ADN, inmediatamente aguas abajo de vpsR fue amplificado utilizando los primers Vc-147 (5'AAAAAAAAGCGGCCGCGTTTTGCTGATTTACCT TGTAC-3 ') y VC-148 (5'-AAAGAATTCGCCATTTTCCG CAGCCTAATAAG-3'), que introdujono I y EcoRI I sitios, respectivamente. Ambos fragmentos fueron ligados en EcoRI I / Xba pKAS32 suicidio I-plsmido digerido para crear pBH2 plsmido. Este plsmido se utiliz para crear V. cholerae vpsR cepa BH029 por doble recombinacin homloga utilizando los mtodos descritos anteriormente ( Skorupski y Taylor, 1996 ). Para la construccin de la V. cholerae luxo D47E mutante, genmica ADN que codifica luxo y de las regiones que flanquean fue amplificado por PCR de tipo salvaje V. cholerae con los primers Vc-27 (5'-GCGAAGCTTATAAATCAGGCGCCACTG-3 ') y VC-28 (5'GCGAAGCCTTGATCGGCAGAAGCTGAG-3'). El producto re-sulting PCR fue digerido con Hin DIII, y luego clonado en Hin DIII-digerido pUC19. En segundo lugar, para generar el luxo alelo D47E y permitir la proyeccin de la mutacin siguiente intercambio de alelos, el codn Asp-47 GAT fue cambiado a GAG y un BFA sitio que se introdujo con el QuikChange Stratagene mutagnesis dirigida kit (Stratagene) con cebadores Vc -69 (5'-ATCTGGCAAACGTAACTCTAGCAG GATTAAGTCAGGC-3 ') y VC-70 (5'-GCCTGACTTAATCCT GCTAGAGTTACGTTTGCCAGAT-3'). El plsmido resultante (pBH1) fue digerido con Sac I / Bgl II y el luxo D47E fragmento se lig al Sac I /Bgl II digerido pKAS32 para crear pBH3 plsmido. Este plsmido se utiliz para crear la V. cholerae luxo D47E cepa BH038 por doble recombinacin homloga con el adicional BFAI sitio para la deteccin de la sustitucin de genes ( Skorupski y Taylor, 1996 ).

La construccin de los cromosomas fusiones de genes lacZ a los objetivos gen hapR regulados
Fusiones de la lacZ gen a las regiones promotoras de los HAP de genes y de tres vps genes se realiz mediante mtodos estndar (Kalogeraki y Winans, 1997 ). Secuencias de ADN fueron amplificados por PCR utilizando los cebadores de oligonucletidos siguientes: Vc57 (5'-GCGGAATTCTGTGAAGATTGCGTACTG CCC-3 ') y VC-58 (5'-GCGGGTACCTCAACCGCCAA CAACTGACC-3') para vpsB , Vc238 (5'-AAAGAATTCATCACG GCTGGTCTATGTGG -3 ') y VC-239 (5'-AAGGTACCAAAGT GAACGCAGCTTTGCT-3') para vpsL , Vc236 ( 5'-AAAGAAT TCTGGAAGCGAAAGAGTCTGGT-3 ') y VC-237 (5'-AAG GTACCTCCCACCACAACAAGAGAGCC-3') para vpsR , y VC9 ( 5'-GCGGAATTCCTCGTTTACCGAGATATGTCCG-3 ') y VC-10 (5'-GCGGGTACCGCAAGGAAGTTAGTCCAAG CG-3') para la HAP . El vpsB y happroductos de PCR fueron ligados directamente a pVIK112 para crear plsmidos pMM1294 y pMM1174 respectivamente. El vpsL y vpsRproductos de PCR se lig por primera vez en pGEM -T Easy (Stratagene) y la creacin de pBH7 pBH6 respectivamente. Posteriormente, el EcoRI de E / KPN que los fragmentos de restriccin que contienen los respectivos productos de PCR fueron ligados en pVIK112 para crear pBH8 y pBH9 respectivamente. La integracin de pVIK112 plsmido est diseado para permitir la expresin de la periodista de la regin promotora cromosmicas, y la longitud del ADN utilizado en cada construccin fue elegido para garantizar la recombinacin homloga. Cada plsmido se introdujo en el cromosoma de V. cholerae por los mtodos establecidos y la ubicacin de los integrantes fue verificada mediante amplificacin por PCR con un oligonucletido 5 'del lugar y la aplicacin de un primario con el plsmido pVIK112.

Imgenes del biofilm, contraste de fases y microscopa de fluorescencia deconvolucin

Las biopelculas se forman en los tubos de ensayo de vidrio de forma esttica incubando 5 ml de una dilucin de 1:100 de un cultivo de una noche en medio LB durante 24 horas a 37 C. Biofilms de V. cholerae cepas de tipo salvaje y mutante se formaron en cubreobjetos estriles en la parte inferior de los platos Petri estticamente incubando ~ 15 ml de una dilucin 1:100 de una cultura de la noche a 37 C en medio LB. Despus de 24 h de incubacin, cada cubreobjetos se lavaron dos veces con buffer de biofilm y preparaciones hmedas se visualizaron mediante un sistema integrado de DeltaVision (Applied Precision, Seattle, WA) que inclua una Nikon (Garden City, NY) Eclipse TW200 microscopio invertido con una de 100 x (apertura numrica, 1,4) objetivo. A los instrumentos de Princeton (Trenton, Nueva Jersey), enfriada, de carga acoplada cmara del dispositivo se utiliza para capturar las secciones horizontales. Para la microscopa de fluorescencia deconvolucin, las cepas llevado plsmido pMMB-GRN y se incubaron en medio LB suplementado con gentamicina y 200 mM IPTG. Horizontal ( xy ) se recogieron en las secciones 0.2 micras con intervalos de una longitud de onda de excitacin 488 nm, y luego deconvolved para generar aplanado z -secciones usando SoftWoRx vs 2,50.

Ensayos de biofilm
El mtodo de biofilm de microtitulacin estndar descrito por O'Toole et al . (1999 ) se ha modificado. Brevemente, cultivos de bacterias se incubaron durante la noche con agitacin se diluyeron hasta una DO 600 de ~ 0.1, y luego 200 alcuotas se incubaron en condiciones estticas en los pozos de cuatro ejemplares de un UV-esterilizados de 96 y placa de filtracin (Millipore) sellado con parafilm en la parte inferior . Despus de la incubacin las bacterias, la parafina se ha retirado y sin ataduras fueron eliminados por filtracin al vaco a travs de la membrana (11 micras de tamao de poro) en la base de cada bien. Biopelculas que quedaron atrapados en los pozos se lavaron dos veces con 2 mM CaCl 2 / de MgCl 2 buffer (buffer biofilm), teidas con un 0,01% de cristal violeta (CV), y luego se lavan dos veces con buffer de biofilm. Despus de sellar la base de cada bien, el 33% de cido actico se aadi a cada pocillo para solubilizar el CV durante 10 minutos. El contenido de cada pocillo se transfieren a una placa estndar de 96 pocillos para la determinacin de la absorbencia (OD550 ) en un Wallac Victor 2 modelo 1420 contra multilabel. Para biofilm en funcin del tiempo los experimentos, los cultivos se incubaron durante la

noche con agitacin se diluyeron en las placas de filtro en intervalos de 6 horas para un total de 36 horas y todos los pozos fueron procesadas para la formacin de biofilm de forma simultnea como se describi anteriormente.

Ensayos de bioluminiscencia
La bioluminiscencia se determin como se describi previamente ( Miller et al ., 2002 ). Duplicar los cultivos de V. cholerae cepas portadoras del pBB1 ( luxCDABE ) reportero csmido se cultivaron durante la noche para ~ 12 h en el SOC suplementado con tetraciclina. Cultivos de una noche se diluyeron 1:1000 y crecido con la aireacin de 9 horas a 37 C y, posteriormente, la produccin de luz se midi en un Wallac 1409 contador de centelleo lquido utilizando el modo de quimioluminiscencia. La densidad celular se determin por recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) al da siguiente. Las unidades relativas de luz (RLU) se definen como recuentos min -1 ml -1 * 10 3 / UFC ml -1 .

Los ensayos de la proteasa

Duplicar V. cholerae culturas se cultivaron durante la noche de ~ 12 horas con aireacin a 37 C, y entonces la actividad de la proteasa se determin por la reaccin azocaseina descrito anteriormente ( Denkin y Nelson, 1999 ) unidades de la proteasa actividad se definen como (OD 442 / OD 600 ) * 1000 .

galactosidasa -ensayos
Cultivos triplicados de cada lacZ cepa reportera fueron cultivadas con aireacin a 37 C durante aproximadamente 12 h en LB suplementado con kanamicina. Los cultivos se complementa tambin con la ampicilina para cepas con p hapR o pBBR1MCS4. Al comparar el tipo salvaje de la hapR cepa, los ensayos se realizaron con los cultivos de una noche saturada. Para los experimentos de comparacin de tipo salvaje a la luxo cepa, los cultivos durante la noche se diluyeron 1:100 en LB y crecido por aproximadamente 3-4 h -galactosidasa se determin como se describi previamente ( Slauch y Silhavy, 1991 ), y fueron las unidades de actividad define como [(V max * 5) / (UFC ml -1 )].

Agradecimientos
La Oficina de Investigacin Naval de la Subvencin Nmero N00014-03-1-0183 apoya este trabajo. Agradecemos a la Dra. Melissa Miller para muchas cepas y el laboratorio de Bassler de muchas discusiones tiles. Damos las gracias a Douglas Higgins para ayudar en la construccin de varias cepas y al Dr. Mark Rose, y el Dr. Peter Houston por su ayuda en los experimentos de microscopa.

Quorum sensing dependiente de biopelculas Mejorar la colonizacin en Vibrio cholerae

Jun Zhu , John J. Mekalanos
,

Del Departamento de Microbiologa y Gentica Molecular, Escuela Mdica de Harvard, 200 Longwood Avenue, Boston, MA 02115 EE.UU.

Recibido el 10 de junio de 2003, revisado el 29 de julio de 2003, aceptado el 18 de agosto de 2003. Publicado: 6 de octubre de 2003. Disponible en Internet el 16 de abril de 2004.

Abstracto
Vibrio cholerae es el agente causal de la enfermedad diarreica clera. Por un proceso de desarrollo no se entiende, V. cholerae formas complejas de superficie asociados, comunidades llamadas biofilms. Aqu nos muestran que la deteccin de qurum mutantes deficientes

de V. cholerae producen ms grueso que los biofilms formados por las bacterias de tipo salvaje. Anlisis de microarrays de biofilm bacterias asociadas muestra que la expresin del Vibrio sntesis de polisacridos ( VPS ) operones se ha mejorado en hapR mutantes. CqsA, uno de los dos sintasas autoinductor conocido en V. cholerae , acta a travs de HapR para reprimir vps la expresin gnica. Vibrio biofilms son ms resistentes a los cidos de las clulas planctnicas. Sin embargo, la deteccin de qurum con deficiencia de biofilms tienen una menor capacidad de colonizacin que los de tipo salvaje biofilms, lo que sugiere que la deteccin de qurum puede promover la salida celular del biofilm, una vez que los organismos han atravesado la barrera del cido gstrico del estmago. Estos resultados arrojan luz sobre las relaciones entre el desarrollo del biofilm, la deteccin de qurum, la infectividad y patognesis en V. cholerae .

Esquema del artculo

o o o o o o o o o o o o

Introduccin Resultados

Formacin de biopelculas en la deteccin de qurum Mutantes CAI-1 de sealizacin responsables de la formacin de biopelculas HapR Regulado Aumento en la formacin de biopelculas en hapR mutantes es debido a la sobreexpresin de vps Operones Funciones fisiolgicas de V. cholerae biopelculas Efecto de la formacin de biopelculas en la colonizacin Discusin Los procedimientos experimentales

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento Biofilm ensayo Los experimentos de microarrays CAI-1 Produccin de ensayo Oligonucletidos basados en S1 nucleasa Ensayo de proteccin Anlisis funcional de la V. cholerae biopelculas La colonizacin del ratn lactante de ensayo Datos complementarios Agradecimientos Referencias

Introduccin
Vibrio cholerae es el agente causante del clera, una enfermedad aguda deshidratacin diarreica que se presenta en forma epidmica y que tambin es endmica en muchas partes del mundo en desarrollo. Cada ao, el clera causa un estimado de 120.000 muertes en todo el mundo, adems de muchos otros casos no fatales(Faruque et al., 1998) . La capacidad de V. cholerae cepas que causan infecciones intestinales graves en los seres humanos requiere la expresin de la toxina del clera (CT) y un factor de colonizacin pilus llamada pilus coregulated toxina (TCP). Los genes implicados en la TC y la produccin de TCP son controlados directamente por la transcripcin ToxT activador, y la expresin de ToxT s est regulado por dos localizados membrana complejos, ToxRS y TcpPH, que se cree que responden a seales del medio ambiente. Un trabajo reciente ha identificado como un adicional de Apha activador de tcpPH expresin [KOVIKOV y Skorupski 2002] y [Skorupski y Taylor 1999] .

En vivo las seales ambientales que afectan a V. cholerae patogenia son desconocidas, aunque varias de las seales que afectan la expresin in vitro de genes de virulencia han sido identificados (Krukonis y DiRita, 2003) . Nosotros y otros han encontrado que la V. cholerae genes de virulencia tambin estn regulados por la deteccin de qurum [Miller et al. 2002] y [Zhu et al. 2002] , el fenmeno por el cual las bacterias controlar su densidad de poblacin de clulas a travs de la acumulacin extracelular de las molculas de sealizacin llamada autoinductores [Bassler 2002] , [Miller y Bassler 2001] y [Whitehead et al. 2001] . En V. cholerae , Luxo responde a por lo menos dos seales diferentes autoinductor, AI-2 y el CAI-1. AI-2 es producida por la protena LuxS (Miller et al., 2002) . Aunque la estructura qumica de CAI-1 no ha sido definido, el cqsA producto del gen ha sido identificado como la sintasa de CAI-1 (Miller et al., 2002) .

El HapR regulador de deteccin de qurum indirectamente disminuye tcpPH la transcripcin de la transcripcin de la represin de Apha (KOVIKOV y Skorupski, 2002) . Luxo ejerce su efecto sobre los genes de la TC y TCP por reprimir la expresin de HapR a baja densidad celular (Zhu et al., 2002) . Un alelo constitutivamente activa de luxo se ha demostrado que reprimir constitutiva de la transcripcin

de hapR (Vance et al., 2003) . HapR tambin activa la transcripcin de hapa , que codifica una secretadas hemaglutinina (HA) de la proteasa que es un factor de virulencia posible en V. cholerae [Finkelstein et al. 1992] , [Jobling y Holmes 1997] y [Mel et al.2000] .

Durante nuestros estudios anteriores, observamos que luxo y hapR mutaciones tambin se ve afectada la formacin de biopelculas [Vance et al. 2003] y [Zhu et al.2002] . Un biofilm es una superficie asociada a la comunidad microbiana que se incorpora en una produccin propia, una matriz polimrica extracelular. Estos compactos microbiana estructuras en tres dimensiones se encuentran en numerosos lugares de inters ambiental, tales como reservorios acuticos y las superficies del diente. La formacin del biofilm se reconoce como un proceso bacteriano de desarrollo que requiere una serie de pasos discretos y bien regulado (Stoodley et al., 2002) . Las biopelculas son clnicamente significativos, como bacterias asociadas a biofilms son menos susceptibles de acoger la respuesta inmune y los agentes antimicrobianos (Costerton et al., 1999) . Adems, las biopelculas se asocian a menudo con infecciones crnicas [Costerton et al. 1999] y [Singh et al. 2000] , sobre todo en Pseudomonas aeruginosa infecciones de los pacientes con fibrosis qustica y asociadas a catter biofilm de Staphylococcus epidermidis .

Varios estudios han sugerido que la biopelcula mediada por el apego a superficies abiticas pueden ser importantes para V. cholerae supervivencia en el medio ambiente [Watnick Kolter y 1999] y [Watnick et al. 2001] . Quorum sensing juega un papel en la formacin de biopelculas en diversos otros microorganismos (Schembri et al., 2002) . En este informe, que caracterizan el mecanismo por el cual la deteccin de qurum controla el desarrollo del biofilm en V. cholerae , y describir las funciones de formacin de biopelculas en V. cholerae virulencia.

Resultados
Formacin de biopelculas en la deteccin de qurum Mutantes
Hemos informado anteriormente de que la deteccin de qurum reguladores de Luxo y HapR afectar a la formacin de biopelculas en V. cholerae [Vance et al. 2003] y[Zhu et al. 2002] . En comparacin con la cepa de tipo salvaje, luxo mutantes no producen biofilms significativa despus de 24 horas, mientras que hapR mutantes formar biopelculas mucho ms gruesa (Figura 1) . Microscopa lser confocal mostraron que hapR biofilms son mucho ms gruesas y ms denso que el de tipo salvaje biofilms, que tienen canales de agua visible (fig. 1B) . Microscopa electrnica de barrido detectado material acumulado extracelular en hapR microcolonias, lo que sugiere que hapR biofilms sobreproduccin de la matriz extracelular que es presumiblemente compuesta por exopolisacridos (fig. 1C) .

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Figura 1.

La formacin de biopelculas en la deteccin de qurum mutantes de V. cholerae

(A) colorante cristal violeta y la cuantificacin de la formacin de biopelculas en los mutantes de QS. Las biopelculas se analizaron despus de una incubacin de 24 horas a 22 C.

(B) confocal de barrido lser de micrografas C6706 y hapR mutantes biofilm 24 horas. Micrografas panel superior representan secciones pticas en el xy el plano, y los paneles inferiores representan secciones pticas en el xz avin. La barra de escala representa 5 micras.

(C) biofilms de veinticuatro horas despus de la fijacin observada por SEM. La barra de escala representa 1 micra.

Para entender mejor como quorum sensing regula la formacin de biofilm, se examinaron los fenotipos mutantes biofilm de varios de deteccin de qurum (Figura 1) .Mutantes defectuosos en tanto luxo y hapR biofilms forma tan gruesos como los de hapR mutantes individuales, lo que indica que es HapR episttico de Luxo y es probable que acte aguas abajo de Luxo en esta va de transduccin de seales. Delecin del gen de la sintasa de AI-2 luxS no afecta a la formacin del biofilm, mientras que la supresin de la CAI-1 gen

sintetasa cqsA resultados en la formacin de biofilms ms grueso. Estos datos sugieren que el AI-2 seales son en gran parte prescindibles, mientras que CAI-1 de sealizacin es importante para regular la formacin del biofilm.

CAI-1 de sealizacin responsables de la formacin de biopelculas HapR Regulado

CAI-1, porque las seales a travs de Luxo (Miller et al., 2002) , la hiptesis de que los biofilms formados por una gruesa cqsA resultado mutante de los cambios enhapR expresin. Tanto, nuestro estudio hapR transcripcin de tipo salvaje y cqsA bacterias mutantes con una anomala cromosmica hapR-lacZ fusin (Zhu et al., 2002). Como se predijo, hapR expresin es significativamente ms baja en un cqsA mutante que en el tipo silvestre, tanto en el plancton y las clulas del biofilm asociado(Figura 2A) . Tambin analizaron CAI-1 de produccin en cultivos de plancton y en las biopelculas. CAI-1 se detecta fcilmente despus de las 9 horas en las clulas planctnicas, y despus de 12 horas en las clulas del biofilm (Figura 2B) . Cabe sealar que un biofilm tiene un volumen mucho menor en comparacin a una cultura del plancton que contienen el mismo nmero de clulas, sin embargo, las biopelculas y cultivos planctnicos contienen cantidades similares de CAI-1. Esto puede indicar que las biopelculas trampa CAI-1 de manera ms eficiente, o que las biopelculas producen ms CAI-1 en funcin de cada clula, o CAI-1 se degrada en el lquido de plancton.

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Figura 2.

CAI-1 Controles hapR expresin y la formacin del biofilm

(A) hapR patrones de expresin de peso (cuadrados) y cqsA mutantes (tringulos) en las clulas planctnicas (lneas continuas) y las clulas del biofilm (lneas discontinuas). C6706 y cqsA mutantes albergar cromosmicas hapR-lacZ fusin se cultivaron en tubos de 10 x 75 mm a 22 C durante varias horas, como se indica. Las clulas planctnicas y biofilm continuacin, se analizaron las actividades galactosidasa (Miller, 1972) .

(B) CAI-1 en la produccin de plancton y las clulas del biofilm. Sobrenadantes de las clulas planctnicas C6706 (diamantes) y las clulas del biofilm (cuadrados) en diferentes momentos se analizaron para la produccin de luz por el CAI-1 cepa reportero MM920 (Miller et al., 2002) . Los datos se presentan como la induccin de veces ms que el nivel de fondo de luz que se produce por la adicin de LB solo.

(C y D) hapR-lacZ expresin de 12 horas biofilms (C) o la formacin de biofilm a las 24 horas (D) se midi en presencia de 80% de las 24 horas medio libre de clulas pasado (SM) de tipo salvaje y cqsA mutantes . Las barras de error muestran la desviacin estndar calculada a partir de tres experimentos individuales.

Para confirmar que el CAI-1 es de hecho la seal que controla la formacin de biofilm, hemos aadido sobrenadantes pas de tipo salvaje o cqsA cepas mutantes, y se analiz la hapR expresin y la formacin de biopelculas. Sobrenadantes de tipo salvaje, pero no cqsA sobrenadantes, puede estimular hapR expresin (Figura 2C) . Del mismo modo, cqsA bacterias cultivadas en la presencia de tipo salvaje sobrenadantes formar biopelculas que son similares a los de tipo salvaje biofilms (Figura 2) .

Aumento en la formacin de biopelculas en hapR mutantes es debido a la sobreexpresin de vps Operones

Para identificar HapR regulados los genes que participan en la formacin de biofilm, se utiliz todo el genoma de anlisis de microarrays para comparar los perfiles de transcripcin de tipo salvaje y hapR biofilms. Los resultados se muestran en la Tabla 1 . Como era de esperar, los cambios de expresin se observaron hapa , que es activado directamente por HapR (Jobling y Holmes, 1997) . hapa codifica la proteasa secretada HA, una metaloproteasa de zinc que puede estar involucrado en el desprendimiento del epitelio del husped intestinal (Finkelstein et al. , 1992) . Sin embargo, Hapa no est involucrado en la formacin del biofilm (Vance et al., 2003) .Curiosamente, otro de metaloproteasas, PRTV (VCA0223; . Ogierman et al, 1997 ), tambin est regulada positivamente por HapR. Eliminacin de PRTV , sin embargo, no afecta a la formacin del biofilm en cualquiera de tipo salvaje o hapR bacterias (datos no mostrados). Un potencial de cinco

genes que codifican las protenas hipottica opern (VCA0880-VCA0884) se expresa fuertemente en el tipo salvaje, pero no en hapR mutantes. Supresin de uno de estos genes (VCA0880) no tuvo ningn efecto sobre la formacin de biofilm (datos no mostrados).

Tabla 1. expresin gnica diferencial en el hapR mutantes en las biopelculas

ORF

Identificacin Activacin veces (SD) una

Vibrio sntesis de polisacridos ( VPS ) Fosfotirosina protena fosfatasa UDP-N-acetil-2-epimerasa UDP-N-acetil-D-cido deshidrogenasa mannosaminuronic VC0916 VC0917 VC0918 2.9 (0.3) 2.4 (0.3) 2.4 (0.1)

Serina acetiltransferasa la protena relacionada VC0919 con La biosntesis de exopolisacridos protena E Polisacrido protena de exportacin Protena hipottica VC0920 VC0921 VC0922

5.9 (1.1)

4.6 (0.9) 3.0 (0.5) 3.3 (0.4) 4.2 (0.6)

Serina acetiltransferasa la protena relacionada VC0923 con CAPK protenas Polisacrido biosntesis de protenas Protena hipottica UDP-N-acetil-D-transferasa mannosamine Protena hipottica Hemolisina relacionada con la protena Hipottica protena conservada Protena hipottica VC0924 VC0925 VC0926 VC0927 VC0928 VC0930 VC0931 VC0932

6.9 (1.2) 3.1 (0.3) 4.0 (0.6) 8.1 (1.5) 4.5 (0.8) 3.8 (0.3) 2.3 (0.1) 2.7 (0.2)

ORF

Identificacin Activacin veces (SD) una VC0933 VC0934 3.6 (0.2) 3.6 (0.4)

Protena hipottica Biosntesis de polisacridos capsulares glicosiltransferasa Protena hipottica Polisacridos relacionados con la exportacin de protenas Exopolisacrido biosntesis de protenas De la proteasa y Reguladores hapa PRTV hapR Metabolismo Sintasa de cidos Plyhydroxyalkanoic Acetiltransferasa acetil-CoA Fosfotirosina protena fosfatasa Otros Protena hipottica Protena hipottica Protena hipottica Protena hipottica Protena hipottica

VC0935 VC0936

4.7 (1.1) 2.5 (0.4)

VC0937

2.6 (0.1)

VCA0865 VCA0223 VC0583

-2.0 (0.3) -3.6 (1.1) -6.4 (1.1)

VCA0688 VCA0690 VC0916

-3.4 (0.7) -2.9 (0.5) 2.1 (0.1)

VCA0880 VCA0881 VCA0882 VCA0883 VCA0884

-3.0 (0.2) -6.8 (0.2) -11.6 (1.1) -9.9 (0.4) -4.2 (0.1)

ORF

Identificacin Activacin veces (SD) una VC0880 VC2667 VC2668 VCA0074 VCA0075 2.6 (0.4) 2.5 (0.6) 2.3 (0.3) 2.3 (0.1) 2.4 (0.2) 2.3 (0.2)

Hipottica protena conservada Protena hipottica Hipottica protena conservada GGDEF familia de protenas Protena hipottica

Metil-aceptacin de la quimiotaxis de protenas VCA0864

uno

valores positivos representan la activacin de hapR mutantes, los valores negativos representan la represin. SD, la desviacin estndar

de dos experimentos independientes. Los genes slo otra demostracin de los cambios significativos de expresin fueron los vps genes, que se sobreexpresa en un 2,3 a 8,1 veces en hapR biofilms en comparacin con el tipo salvaje biofilms (Tabla 1) . El vps genes previamente identificados como necesarios para la biosntesis de exopolisacridos y la formacin de biofilm [Watnick y Kolter 1999] , [Watnick et al. 2001] y [Yildiz y Schoolnik 1999] y estn positivamente regulados por vpsR , que no se encuentra dentro de la misma vpsopern (Yildiz et al., 2001) . La eliminacin de uno de los vps genes (VC0920) aboli completamente la formacin de biopelculas en tanto de tipo salvaje y hapRmutantes (datos no mostrados), lo que confirma el papel esencial de la vps genes en la formacin de biofilm en V. cholerae . El hapR mutacin no tiene efecto sobrevpsR expresin evaluada por el experimento de microarrays de arriba.

Para caracterizar vps la expresin gnica y su regulacin por la deteccin de qurum, se utiliz oligo-basado en ensayos de proteccin nucleasa S1 para medir vpsexpresin en las distintas cepas en tanto planctnicas y la biopelcula asociada a las clulas (Figura 3) . De acuerdo con resultados anteriores de que el vps genes slo se expresan en las biopelculas (Haugo y Watnick, 2002) , vps expresin no era detectable en las clulas planctnicas de tipo salvaje, pero se detecta fcilmente en la de tipo salvaje biofilms. vps expresin de tipo salvaje biofilms tambin se redujo a las 16 horas en comparacin con menos de 8 horas. Por el contrario, vps se expresa fuertemente en hapR biofilms en ambos momentos, y es detectable incluso en hapR clulas planctnicas en ambos momentos. Curiosamente, el cqsA mutante expres tipo salvaje cantidades de VPS en 8 hr biofilms, pero mostr un aumento vps expresin en 16 horas biofilms, lo que sugiere que la densidad celular juega un papel en vps expresin en momentos posteriores.

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Figura 3.

Oligonucletidos basados en ensayos de proteccin nucleasa S1 para examinar los vps expresin en las clulas planctnicas y Biofilm

Se aisl el ARN de 8 horas y 16 horas y las clulas planctnicas biofilm. Oligonucletidos para VC0920 y 16S rDNA fueron extremo marcado con 32 P. Los datos brutos obtenidos utilizando un phosphoimager tormenta fueron corregidos restando la actividad de fondo, el ajuste de las

variaciones en la expresin del 16S rDNA, y se muestra como algo relativo vps expresin en el grfico. P, las clulas planctnicas, B, asociadas a las clulas del biofilm. Las barras de error muestran la desviacin estndar calculada a partir de dos experimentos individuales.

Funciones fisiolgicas de V. cholerae biopelculas

Biopelcula asociada a las clulas muestran una mayor resistencia a los antimicrobianos, como los detergentes o los antibiticos (Costerton et al., 1999) . Debido a V.cholerae debe sobrevivir al paso por el medio cido del estmago antes de llegar a su sitio de replicacin en el intestino del husped superior, la hiptesis de que la formacin de biofilm podra aumentar la capacidad de la V. cholerae para soportar el choque cido y por lo tanto aumentar el potencial de colonizacin. Por lo tanto, evaluar la viabilidad de las clulas planctnicas y asociados biofilm-despus de la exposicin a un medio acidificado (Figura 4) . Las biopelculas se formaron en algunas perlas de vidrio (50-100 de dimetro). Estas biopelculas se analizaron mediante microscopa de contraste de fase y se encontr que poseen estructuras similares a las biopelculas formadas sobre cubreobjetos (datos no mostrados). V. cholerae clulas son muy sensibles a la exposicin a un pH de 4.5 (Merrell y Camilli, 1999) . En nuestros estudios, la mayora de las clulas planctnicas fueron asesinados inmediatamente despus de la exposicin a pH 4,5 durante 30 minutos. Por el contrario, la biopelcula asociada a las clulas fueron ms de 1000 veces ms resistente a los golpes de cido que se las clulas planctnicas (Figura 4) . La resistencia a los cidos de hapR biofilms es similar a la de tipo salvaje biofilms (datos no mostrados), a pesar de que hapR mutantes forman biofilms ms grueso.Resistencia a los cidos se eliminan cuando las estructuras de biofilm fueron interrumpidas por agitacin con perlas de vidrio antes de la exposicin a un pH bajo.Estos resultados indican que se trata principalmente de la estructura fsica de la biopelcula que confiere proteccin contra las descargas de cido, en lugar de aumento de la resistencia de cido en las clulas individuales.

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Figura 4.

Funciones fisiolgicas de V. cholerae biopelculas

(A) Vibrio biofilms resistir choque cido. Veinticuatro horas C6706 clulas planctnicas (barras grises), las clulas del biofilm (barras de color negro), e interrumpi las clulas del biofilm (barras blancas) se diluyeron en LB (pH 4,5) y se incuba a 37 C durante el perodo indicado. Los porcentajes de clulas supervivientes se calcula comparando el nmero de clulas supervivientes en LB (pH 7) con los mismos tratamientos.

(B) los ensayos de desprendimiento de las biopelculas. Biofilms de veinticuatro horas de la C6706 y hapR mutantes se resuspendieron en 1 ml de LB fresco. Las muestras fueron retiradas a los 5 minutos (barras grises) y 30 min (barras de color negro) y el nmero de clulas bacterianas separado de las biopelculas se determin. El eje y muestra el nmero de clulas separadas por miles. Las barras de error muestran la desviacin estndar calculada a partir de tres experimentos individuales.

Como se seal anteriormente, vps expresin de tipo salvaje biofilms es inferior a 16 horas en comparacin con menos de 8 horas, lo que sugiere que la formacin de biopelculas se desacelera en alta densidad celular. Sin embargo, hapR mutantes mantener altos niveles de vps expresin en 16 horas y por lo tanto forman biofilms ms grueso. Ms gruesa biofilms no puede permitir el escape de las estructuras de biofilm. Para probar si la separacin de las biopelculas estableci un qurum de deteccin mediada por fenotipo, hemos desarrollado un ensayo para medir la tasa de desprendimiento de las clulas planctnicas de biofilms in vitro. El uso de este ensayo, se encontr que hapR mutantes se desprenden de las biopelculas en un grado mucho menor que las bacterias de tipo salvaje (Figura 4) .

Efecto de la formacin de biopelculas en la colonizacin

Dos simples mecanismos por los cuales los biofilms podran afectar a la colonizacin son la mejora de la infectividad y el incremento de la persistencia en el husped.Para investigar si la formacin de biofilm est involucrado en el largo plazo la colonizacin, se inocularon planctnicas de tipo salvaje, hapR y VPS (VC0920) las bacterias en ratones lactantes, y se recuperaron las bacterias en el intestino despus de diferentes perodos de incubacin. V. cholerae podra ser recuperado despus de la infeccin de 11 das, pero un nmero similar de

bacterias se han recuperado para las tres cepas (Figura 5) . Porque las cepas tienen diferentes capacidades de formacin de biopelculas, la formacin de biofilm no pueden participar en persistencia a largo plazo en este modelo de ratn lactante.

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Figura 5.

Los fenotipos asociados con la colonizacin mutantes formacin de biopelculas

(A) infeccin a largo plazo con planctnicas de tipo salvaje (de diamantes), hapR (cuadrados) y VPS (tringulos) V. cholerae . Las bacterias fueron recuperadas de los ratones despus de la infeccin en el momento indicado y se colocaron en el soporte adecuado para la enumeracin. El eje y muestra el nmero de bacterias recuperadas por ratn en miles.

(B) del ratn lactante concurso de ensayo utilizando plancton (los diamantes) o biofilm (cuadrados) y C6706 hapR clulas. El P es el valor <0,005 segn lo determinado por la prueba t de Student. El ndice de competitividad representa la proporcin de la produccin hapRmutantes de tipo salvaje (recuperado desde el intestino), dividido por la relacin de entrada hapR mutantes de tipo salvaje (inoculadas en el ratn).

La resistencia de los biofilms comparable al choque cido, y la capacidad de HapR-dependiente de la V. cholerae se desprenda de los biofilms, puede cada uno contribuir a la eficiencia de la infeccin de los ejrcitos de mamferos a travs de la va oral-gstrica. Para examinar el efecto de la formacin de biopelculas en la infectividad, hemos realizado ensayos de colonizacin la competencia con el modelo de ratn lactante. Planctnicos hapR mutantes colonizar, as como de tipo salvaje, como se inform anteriormente ( [Miller et al, 2002.] y [Zhu et al, 2002.] ; Figura 5B ). Sin embargo, cuando se inocula compuesto de biopelculas se utilizaron para infectar ratones, los hapR mutante mostr un defecto de la colonizacin de 10 veces en comparacin con clulas de tipo salvaje. Porque hapR mutantes no muestran una disminucin de la expresin CT o TCPA in vitro (Zhu et al., 2002) , este resultado sugiere que la deteccin de qurum puede afectar la colonizacin intestinal por un mecanismo que implica un fenotipo HapR dependiente se expresa en las biopelculas, como el desprendimiento. Como se seal anteriormente, el desprendimiento de las biopelculas es defectuoso en hapR mutantes (Figura 4) .

Discusin
En este estudio, hemos demostrado que la deteccin de qurum regula V. cholerae formacin de biopelculas por la represin de Vibrio polisacridos sntesis ( VPS ) operones en altas densidades de clulas. Uno de los dos conoce la deteccin de qurum-circuitos de regulacin (CAI-1) es responsable de activar la transcripcin dehapR , probablemente a travs de Luxo regulador central. HapR entonces regula negativamente (directa o indirectamente) la transcripcin de la vps operones, que son importantes para la formacin de biofilm (ver Figura 6 ).

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Figura 6.

Modelos para el mecanismo y la funcin de deteccin de qurum Reglamento y la formacin de biopelculas en V. cholerae

(A) va gentica para la deteccin de qurum-mediada por el control de la formacin de biofilm y la virulencia. Las flechas continuas representan los efectos positivos, mientras que las barras slidas T representan los efectos negativos. La lnea punteada indica que el AI-2 de sealizacin no afecta a la formacin de biopelculas, a pesar de Luxo no responde a AI-2 con respecto a otros fenotipos (Miller et al., 2002) .

(B) Modelo para las funciones relacionadas de deteccin de qurum y la formacin de biofilm en el V. cholerae infecciosas ciclo. V. choleraeentra en la mquina de forma biofilm resistente a los cidos. Las clulas planctnicas dispersos de la serie de biofilm aumento de la expresin de genes de virulencia, lo que aumenta la colonizacin intestinal. Como las bacterias se multiplican a la alta densidad en el epitelio intestinal, quorum sensing (QS) promueve la separacin por reprimir la expresin de genes de virulencia y el aumento de la expresin Hapa. Independiente Vibrio s se caen y la formacin de biofilm reinducirla a baja densidad celular.

Formacin de biopelculas en V. cholerae es un proceso de varios pasos de desarrollo que est controlada por varias vas de reglamentacin. El VpsR respuesta de dos componentes regulador se requiere para la expresin de la vps genes (Yildiz et al., 2001) , pero las seales ambientales que rigen la activacin por VpsR no han sido identificados. La produccin de VPS y formacin de biopelculas se ven afectados por la mutacin de los genes estructurales flagelar (Watnick et al., 2001) , lo que sugiere que V. cholerae puede controlar el par de flagelos para detectar cuando una superficie se encuentra. Curiosamente, un informe reciente mostr que la protena regula negativamente CYTR la formacin de biofilm por la represin de vps la expresin de genes (Haugo y Watnick, 2002) . CYTR tambin regula genes anlogos de nuclesidos catabolismo en E. coli en respuesta a los niveles de citidina (Thomsen et al., 1999) . La formacin de biofilm por lo tanto, pueden ser controlados por las seales tanto extracelulares e intracelulares.

El trabajo aqu presentado se establece que la deteccin de qurum tambin est involucrado en el desarrollo del biofilm en V. cholerae . La deteccin de qurum regula diversas respuestas fisiolgicas en una amplia variedad de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Procesos como la produccin de factores de virulencia, la conjugacin, la bioluminiscencia, y la simbiosis se han encontrado para ser controladas por este mecanismo. La deteccin de qurum se sabe que controla la formacin de biopelculas en varias especies bacterianas, como P. aeruginosa , Burkholderia cepacia , y Aeromonas hydrophila [Davies et al. 1998] , [Huber et al. 2001] ,[Li et al. 2002] y [Lynch et al. 2002] . En P. aeruginosa , la viabilidad de las biopelculas anaerobias requiere rhl deteccin de qurum y el xido ntrico reductasa (Yoon et al., 2002) , y los mutantes que son incapaces de producir las seales de deteccin de qurum formar biopelculas mucho ms delgada que la falta normal de la arquitectura en tres dimensiones (Davies et al ., 1998) . En cambio, en V. cholerae , hemos encontrado una relacin recproca entre la deteccin de qurum y la formacin de biofilm. En V. cholerae , la deteccin de qurum mutantes forman biofilms ms gruesa, y la deteccin de qurum seales de formacin de biopelculas reprimir por reprimir vps la expresin gnica.

Estudios anteriores mostraron que la deteccin de qurum negativamente controla la produccin de TC y TCP mediante la mejora de hapR expresin, que posteriormente conduce a la represin de TcpPH [Miller et al. 2002] y [Zhu et al. 2002] . Cuando se cultivan in vitro, un planctnicos hapR mutante produce de tipo salvaje cantidades de CT y TCPA (Zhu et al., 2002) . En el presente estudio, de tipo salvaje y hapR clulas mutantes muestran niveles comparables de la colonizacin intestinal en ratones lactantes, si el inculo consiste en clulas planctnicas. Sin embargo, hapR biopelculas mostrar 10 veces menor colonizacin intestinal de tipo salvaje biofilms. Aunque hay muchos mtodos de biofilms en crecimiento, y los diferentes mtodos pueden producir resultados diferentes, nuestros datos sugieren que hapRbiofilms son defectuosos en una colonizacin crtica o la propiedad que la infectividad hapR clulas planctnicas poseen. Porque hapR biofilms mutantes mostrar un desprendimiento de clulas redujo de biofilms para formar las clulas planctnicas (Figura 4) , se postula que el desarrollo del biofilm excesivo o mal regulado es perjudicial para la colonizacin. Curiosamente, un estudio previo de deteccin de qurum en sphaeroides Rhodobacter demostrado que una seal de autoinductor estuvo involucrado en la dispersin de clulas agregadas (Puskas et al., 1997) .

En este estudio, hemos demostrado que V. cholerae clulas presentes en las biopelculas son mucho ms resistentes a la muerte por choque cido que las clulas planctnicas (Figura 4) . La respuesta de tolerancia al cido (ATR) en V. cholerae es conocida para facilitar la colonizacin en el modelo de ratn lactante [Merrell y Camilli 1999] y [Merrell y Camilli 2000] , y la sensibilidad de V. cholerae a un pH bajo puede contribuir a la alta dosis infecciosa requiere para el establecimiento de una infeccin en humanos (Boyd, 1995) . Nuestra hiptesis es que la resistencia al cido choque conferido por la estructura del biofilm pueden mejorar la V. choleraesupervivencia durante el paso por el medio gstrico. Nosotros desafortunadamente no fueron capaces de probar esta hiptesis directamente en los animales, como el estmago del ratn lactante no es muy cido (pH ~ estimado 6).

En conjunto, nuestros datos sugieren un modelo de trabajo de la forma de deteccin de qurum la regulacin de la formacin del biofilm pueden influir en los aspectos crticos de la V. cholerae ciclo de infeccin (Figura 6) . La estructura del biofilm puede ser crtica durante la entrada en el husped, con el fin de protegerse contra las descargas de cido en el estmago. Despus de alcanzar el intestino, la dispersin de las clulas individuales del biofilm permite a estas clulas para apagar la deteccin de qurum mediada por la represin de los genes de la TC y TCP, permitiendo as la colonizacin de los sitios de mxima intestinal. Si no se desmonte el biofilm (como se muestra en hapR mutantes) reduce el nivel general de la colonizacin. Despus de la infeccin, el nmero de V. cholerae en el intestino aumenta, y la

deteccin de qurum nuevamente reprime la TC y la produccin de TCP, y activa la produccin de la proteasa. Esto anima a las bacterias para separar el epitelio, y encontrar nuevos focos infeccin o la salida del husped.

La deteccin de qurum y la formacin de biofilm tambin puede ser importante en la fase de medio ambiente de la V. cholerae ciclo de vida. Se ha sugerido que la formacin de biofilm mejora V. cholerae supervivencia en el medio natural [Mizunoe et al. 1999] , [Wai et al. 1998] y [Yildiz y Schoolnik 1999] . Durante la fase de medio ambiente, la bacteria se encuentra en diversos ambientes acuticos, a menudo en asociacin con el plancton marino (Huq et al., 1983) . Plancton "flores" a menudo preceden a los brotes de clera, lo que sugiere un papel en la epidemiologa de la enfermedad (Colwell, 1996) . En un informe reciente (Colwell et al., 2003) , una simple, tela sari procedimiento de filtracin que elimina las partculas mayores de 20 micras de agua se ha encontrado para reducir los casos de clera en Bangladesh por ms del 50%. Este informe sugiere que el material particulado juega un papel importante en V. cholerae transmisin. El material en partculas por filtracin tela sari puede ser en realidad V. cholerae material de biofilm en lugar de zooplancton asociados a V. cholerae . Si es as, la eliminacin del cido-resistente V. cholerae biofilms podra explicar la utilidad de la filtracin de tela de sari. Por ltimo, Vibrio biofilms pueden ser diseminados por los pacientes de clera, y esto a su vez podra ayudar a explicar el hallazgo interesante que V. cholerae a partir de heces humanas parece ms infeccioso que el V. cholerae a partir de la fase estacionaria en cultivos in vitro cultivados (Merrell et al., 2002) .

Los procedimientos experimentales

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento
Un resistente a la estreptomicina aislamiento de V. cholerae El Tor cepa C6706 se utiliz en este estudio. Las mutaciones en el luxo , hapR , cqsA , luxS , luxS cqsA yluxo hapR fueron construidas por hacer dentro del marco supresiones del marco de lectura completo, y se han descrito anteriormente [Miller et al. 2002] y [Zhu et al.2002] . Dentro del marco deleciones en los genes regulados por HapR VC0920 (uno de los vps genes), VCA0880 (hipottica protena), y VCA0223 ( PRTV ) fueron construidas por crossover PCR (Imai et al., 1991) . GFP etiquetados cepas se construyeron mediante la introduccin de P lac-GFP en el cromosoma lacZ lugar de la V.cholerae (Bomchil et al., 2003) . Para el crecimiento de rutina, todas las cepas fueron cultivadas a 37 C en caldo Luria. Para el ensayo de formacin del biofilm, las cepas se incubaron a 22 C sin agitacin.

Biofilm ensayo
Colonias crecidas en placas de agar LB se resuspendieron en medio LB a una densidad ptica a 600 nm (OD
600

) de ~ 0.6. Una dilucin de

1:100 de esta suspensin se inocularon en 10 x 75 mm tubos de vidrio de borosilicato que contiene 1 ml de LB (para la medicin cuantitativa de los biofilms), o 50 ml tubos Falcon con 6 ml de LB con 22 22 mm cubreobjetos. Las biopelculas se formaron al permitir que estas culturas en reposo durante el tiempo indicado a temperatura ambiente. La cuantificacin de las biopelculas de colorante cristal violeta se ha descrito anteriormente (Zhu et al., 2002) . La microscopa confocal de barrido lser con un microscopio confocal MRC-1024 (Bio-Rad), y microscopa electrnica de barrido con un microscopio electrnico (ETEC Autoscan) se realiz de acuerdo a los protocolos previamente publicados (Bomchil et al., 2003) . V. cholerae cepas observadas mediante microscopa confocal de fluorescencia fueron prestados mediante la insercin de P lac -buenas prcticas agrarias en el lacZ lugar (Bomchil et al, 2003). .

Los experimentos de microarrays

La construccin de la totalidad del genoma que contienen manchas microarrays de larga duracin ORFs derivados de V. cholerae N16961 cepa ha sido descrito(Dziejman et al., 2002) . Las biopelculas se formaron con 100 x 15 mm de poliestireno placas de Petri que contiene 2 ml de LB con 20 l de inculo descrito anteriormente y se incubaron durante 8 horas a 22 C. Las clulas planctnicas fueron retirados por lavado con PBS, y el ARN de las clulas del biofilm fue aislado utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se purifica mediante el uso de un kit RNAeasy (Qiagen). Preparacin de la etiqueta fluorescente hibridacin cDNA, anlisis de microarrays de diapositivas, y anlisis de datos han sido descritos (Zhu et al., 2002) .

CAI-1 Produccin de ensayo

El ensayo para el CAI-1 de produccin se llev a cabo como se describi previamente (Miller et al., 2002) . En pocas palabras, las biopelculas se formaron en 10 x 75 mm tubos de borosilicato de vidrio que contiene 1 ml de LB. En los puntos de tiempo indicado, las clulas planctnicas fueron retirados y biofilms fueron lavadas con PBS. Las clulas del biofilm se resuspendi en 1 ml de LB por agitacin con perlas de vidrio. Sobrenadantes de las clulas planctnicas y las clulas del biofilm se analizaron para la estimulacin Lux de MM920 ( cqsA , luxQ ; tambin contiene pBB1, que lleva el lux opern de V. harveyi ), que no puede producir CAI-1 y no puede detectar el AI-2 seales. Sobrenadantes de cultivo se aadi a una concentracin final de 30% (v / v). Luminiscencia se detect con un luminmetro Berthold LB9507.Los datos se presentan como la induccin de veces ms que el nivel de fondo de luz que se produce por la adicin de LB solo.

Oligonucletidos basados en S1 nucleasa Ensayo de proteccin

El anlisis cuantitativo de ARNm S1 usando sondas de oligonucletidos se llev a cabo como se describi previamente (Greene y Struhl, 1993) . Las sondas de oligonucletidos utilizados en una sonda de 45 nucletidos VC0920 y una sonda de 45 nucletidos de V. cholerae ARNr 16S como control. El extremo 3 'de cada oligonucletido contena cinco nucletidos que no son complementarios a los ARNm. Quinientos picogramos de
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P-etiquetados oligonucletidos se hibridaron con 10 mg de ARN total de 12 horas y luego digiere con

250 unidades de S1 nucleasa (Promega) durante 1 hora a 37 C. Las reacciones fueron luego precipitado con etanol, se resuspendi en 5 l de NaOH 0,1 M, y 5 l de colorante de carga formamida se aadi. Cinco microlitros de cada muestra de tamao fraccionado en 18% de desnaturalizacin geles de poliacrilamida y se cuantifica mediante una tormenta phosphoimager (Molecular Dynamics). oligonucletidos (2,5 pg) se incluy en cada gel como un marcador de tamao.
32

P-etiquetados

Anlisis funcional de la V. cholerae biopelculas

Colonias crecidas en placas de agar LB se resuspendieron en medio LB a una densidad ptica a 600 nm (OD
600

) de ~ 0.6. Una dilucin de

1:100 de esta suspensin se inocularon en 100 15 mm de poliestireno placas de Petri que contiene 2 ml de LB y 10 cuentas de vidrio mg (50-100 ; Polysciences), y se incubaron durante 24 horas a 22 C con agitacin muy lenta (10 rpm). Las clulas planctnicas fueron retirados por lavado cuidadosamente con PBS, y las biopelculas de cuentas de vidrio A continuacin se aadieron 5 ml en LB a pH 7 o pH 4,5 (ajustado con HCl). Los tubos se incubaron durante el tiempo indicado a 37 C con agitacin lenta. Para interrumpir las estructuras del biofilm, las culturas se agitaron durante 1 minuto en la presencia de perlas de vidrio de gran tamao (1 mm). El examen microscpico de las biopelculas interrumpido indic que este mtodo no interrumpe las biopelculas de manera eficiente. Las clulas supervivientes se enumeran a continuacin, por la dilucin en serie y placas de agar LB.

Los ensayos fueron realizados por desprendimiento de resuspensin de cuentas de vidrio cubierta con biofilms en LB fresco y de incubacin a 22 C. Las muestras fueron retiradas en diferentes momentos y se sembraron en agar LB para determinar el nmero de clulas bacterianas.

La colonizacin del ratn lactante de ensayo

El ensayo de colonizacin del ratn lactante se realiz como se describi previamente (Gardel y Mekalanos, 1996) mediante la inoculacin de aproximadamente 10 5 V.cholerae clulas por ratn en 6 das de edad ratones lactantes. Despus de un perodo de la colonizacin, homogeneizados intestinal fueron recolectados, y la relacin de dos cepas (ensayos de la competencia) o el nmero de bacterias (a largo plazo los ensayos de colonizacin) se determin en placas de agar LB que contiene 5-bromo-4-cloro-3 -indolil-D-galactsido. Para los ensayos de colonizacin con biofilms como inculo, las biopelculas se formaron en las cuentas de vidrio como se describe anteriormente por 24 horas y luego se inocularon intragstrica como se describi anteriormente.

Cclica diguanylate (c-di-GMP) regula Vibrio cholerae formacin de biopelculas

1. Anna D. Tischle

Resumen
Mientras que el estudio de la regulacin de genes de virulencia en Vibrio cholerae durante la infeccin del intestino del husped pequeos, se identificaron VieA como un regulador de respuesta de dos componentes que contribuyen a la expresin activa de la toxina del clera. Aqu mostramos que VieA reprime la transcripcin de Vibrio exopolisacrido sntesis ( VPS ) los genes que participan en la formacin de biofilm por un mecanismo independiente de su phosphorelay y actividades de unin al ADN. VieA controla la concentracin intracelular de los nucletidos cclicos segundo diguanylate mensajero cclico (c-di-GMP), utilizando un dominio EAL que funciona como un c-di-GMP fosfodiesterasa. Dos dimensiones cromatografa en capa fina de los extractos de nucletidos confirm que VieA reduce la concentracin de cdi-GMP, se oponen a la accin de las protenas sintetasa c-di-GMP. Expresin de no relacionados V. cholerae c-di-GMP sintetasa o protenas phosphodiesterae tambin modulada c-di-GMP concentracin y vps la expresin gnica. Proponemos que el c-di-GMP sintetasa y la fosfodiesterasa de dominio que contienen protenas contribuyen a la formacin de biofilm que regula mediante el control de c-di-GMP concentracin.

Introduccin
Vibrio cholerae , una bacteria Gram-negativos que causa la infeccin aguda intestinal del clera, es un patgeno facultativo que existe en los hbitats acuticos. Dos factores de virulencia importante contribuir a la enfermedad, la toxina del clera (CT) es responsable de la diarrea secretora abundante, mientras que la toxina co-regulados pilus (TCP) es necesario para la colonizacin del intestino delgado (Taylor et al , 1987. ; Kaper et al ., 1994 ). Una cascada de factores de transcripcin incluyendo Apha / B, TCPP / H, toxR / S y ToxT regulan la expresin de la TC y TCP, tanto in vitro (para una revisin ver Reidl y Klose, 2002 ) y durante la infeccin ( en vivo ) ( Lee et al ., 1999 ).Recientemente, los reguladores adicionales, incluyendo la deteccin de qurum represor HapR ( Zhu et al ., 2002 ) y compite A / B / tres componentes de la seal del sistema de transduccin ( Tischler et al ., 2002 ) se ha demostrado que modulan la expresin de factor de virulencia. La evidencia de dos diferentes en vivo las pantallas sugiere que compite / A / B contribuye a regular la expresin gnica durante la infeccin ( Camilli y Mekalanos, 1995 ; Lee et al ., 2001 ). El vieSAB genes en un opern evidente en V. cholerae cromosoma I, pero se expresan diferencialmente de los promotores de varios ( Lee et al ., 1998 ). El sensor de histidina quinasa del gen, compite , se identific en una pantalla para en vivo los reguladores de la TC ( Lee et al , 2001. ) Vies / A / B contribuye a la produccin de CT en in vitrocondiciones de induccin ( Tischler et al , 2002. ). El regulador de respuesta VieB tiene un tpico dominio N-terminal phosphoreceiver pero carece de motivo de unin a ADN reconocible. El vieA gen codifica un regulador de segunda respuesta, que al igual que VieB tiene un motivo phosphoreceiver conserva en su N-terminal. VieA tambin tiene una familia LuxR-hlice-giro-hlice (HTH) motivo de unin a ADN en su C-terminal, que est previsto que participen en la regulacin transcripcional, y un dominio conservado de funcin desconocida que fue recientemente nombrado el dominio EAL despus de su aminocidos conservados ( Galperin et al ., 2001 ). Aunque no ha sido demostrado directamente, el dominio EAL se prev que la actividad de la fosfodiesterasa tienen en contra de un dinucletido cclico novela cclica diguanylate (c-di-GMP, bis (3 ', 5')-cclico del cido diguanylic), sobre la base de su presencia de las enzimas con esta actividad ( Tal et al , 1998. , Chang et al ., 2001 ) y su ocurrencia en las isoenzimas que regulan la produccin de celulosa en la bacteria Gluconacetobacter xylinus (antes Acetobacter xylinum ) ( Tal et al , 1998. ; Galperin et al ., 2001 ). En G. xylinus se ha demostrado que c-di-GMP regula positivamente la produccin de celulosa por alostricamente la activacin de la enzima de la celulosa sintasa ( Ross et al , 1986. , 1987 ; 1990 ; Weinhouse et al ., 1997 ). El anlisis mutacional identificado seis genes que controlan la concentracin intracelular de c-di-GMP por la sntesis de la influencia o la hidrlisis de la molcula ( Tal et al ., 1998 ). Cada uno de estos genes codifica tanto un dominio EAL y un segundo motivo conservado, GGDEF, tambin el nombre de residuos de aminocidos conservados. Una vez ms, aunque no ha sido demostrado directamente, la actividad de la adenilato diguanylate se le ha asignado el dominio GGDEF sobre la base de la alineacin de secuencias con la adenilato ciclasa eucariotas ( Pei y Grishin, 2001 ) y la capacidad de las protenas de dominio GGDEF de otros organismos para activar la produccin de celulosa en Rhizobium yAgrobacterium ( Ausmees et al . 2001 ). Las protenas que contienen dominios GGDEF y EAL son codificadas por varias bacterias gram-positivas y casi todos los de vida libre gram-negativas especies bacterianas secuenciado hasta la fecha, y algunas especies de puerto paralogous grandes familias de cada dominio ( Galperin et al ., 2001 ). De las protenas que contienen dominios GGDEF y EAL que se han caracterizado parcialmente, la mayora de las propiedades de control que afectan a interacciones clula-clula. Al igual que en G. xylinus , GGDEF EAL y las protenas de dominio han sido implicados en la regulacin de la sntesis de celulosa en Salmonella ( Romling et al , 2000. ; Zogaj et al ., 2001 ) , R. leguminosarum ( Ausmees et al , 1999. ),

y A. tumefaciens ( Ausmees et al ., 2001 ). La produccin de celulosa contribuye al comportamiento multicelular de estos organismos, facilitando la interaccin simbitica o patgenos con una gran cantidad ( Ross et al ., 1991 ). Las protenas con dominios EAL GGDEF y tambin han sido implicados en la formacin de biofilm. En P. aeruginosa , WSPR, que contiene un dominio GGDEF, regula la expresin de una supuesta adhesina fimbrial necesarios para la formacin del biofilm ( D'Argenio et al ., 2002 ). Adems, PvrR, una P. aeruginosa regulador de respuesta que contiene un dominio EAL, se ha demostrado recientemente para regular la formacin del biofilm y resistencia a los antibiticos ( Drenkard y Ausubel, 2002 ). La persistencia de la V. cholerae en ambientes acuticos entre las epidemias de clera es probable que aporta su capacidad para formar biopelculas. Las biopelculas son ms resistentes a los numerosos problemas ambientales, como el cloro y los antibiticos, y puede ayudar en la adquisicin de nutrientes ( Shirtliff et al ., 2002 ). Adems, el estado de biofilm aumenta la infectividad de la V.cholerae , posiblemente ofrezcan proteccin innata de las funciones del sistema inmunolgico ( Zhu y Mekalanos, 2003 ). Las interacciones clula-clula dentro de V. cholerae biofilms son estabilizados por la produccin de exopolisacridos (EPS) de la matriz. Un grupo de genes necesarios para la produccin de EPS ( VPSA-Q ) ha sido identificado ( Yildiz y Schoolnik de 1999 , Ali y otros ., 2000 ), y su expresin est controlada en parte por la transcripcin VpsR activador ( Yildiz et al , 2001. ). HapR tambin regula la formacin de biofilm por la represin de la VPSA-Q genes independientemente de VpsR ( Hammer y Bassler, 2003 ). Adems, las protenas con el GGDEF conservado y dominios EAL se han implicado en la regulacin de la produccin de EPS en Vibrio especies. V. cholerae MBAAmutantes sobreproduccin de EPS y muestran una mayor formacin de biopelculas ( Bomchil et al ., 2003 ). V. cholerae ROCS se requiere para el cambio de lisa a rugosa morfologa de las colonias, un fenotipo asociado con la sobreproduccin de EPS ( Rashid et al., 2003 ). Por ltimo, V. parahemolyticus SCRC regula los genes necesarios para la produccin de polisacrido capsular ( Boles y McCarter, 2003 ). Estos hallazgos sugieren que, adems de su conocido papel como un activador alostrico, c-di-GMP pueden actuar como un segundo mensajero dentro de las bacterias, el acoplamiento de seales ambientales para la regulacin de genes. Aqu nos proporcionan la prueba de conexin c-di-GMP concentracin con la transcripcin de la V. cholerae vps genes. Despus de identificar el VieA regulador de respuesta como un represor de la vps de racimo en un examen gentico, hemos tratado de caracterizar el mecanismo de regulacin. Nosotros demostramos que el dominio VieA EAL es responsable de la represin de vps transcripcin y mostrar en dos dimensiones cromatografa en capa fina (TLC-2D) de los extractos de nucletidos que VieA reduce la concentracin intracelular de c-diGMP. Proponemos un modelo en el que las protenas que contienen dominios de EAL y GGDEF transduccin de seales mltiples en la concentracin del mensajero c-di-GMP segundos para afectar vps la expresin gnica y la formacin del biofilm.

Resultados
VieA extracelular regula los genes de sntesis de polisacridos
Hemos informado anteriormente de que el V. cholerae vieSAB tres componentes de la seal de transduccin del sistema contribuye a la regulacin de ctxAB , los genes que codifican CT ( Tischler et al ., 2002 ). Para identificar otros genes especficamente controlado por el regulador de respuesta VieA, un biotipo clsico V. cholerae tensin (AC-V1352) fue construido en el que vieA se sobreexpresa de la arabinosa-inducible P araBAD promotor ( Guzmn et al ., 1995 ). Elegimos trabajar con el biotipo clsico porque VieA es necesaria para la regulacin de la produccin de CT durante el crecimiento en el M9 ms asparagina, arginina, glutamato y la serina (M9 + NRES) (ADT y AC, datos no publicados), una condicin que induce a la toxR -regulon en clsico, pero no biotipo El Tor V. cholerae ( Miller y Mekalanos, 1988 ). Al azar lacZ fusiones transcripcionales se generaron en AC-V1352 por mutagnesis transposn con MTN 5lacZ .Aproximadamente

6000 mtn 5lacZ mutantes fueron rplica chapada a Luria-Bertani (LB) y LB medios de comunicacin que contienen arabinosa la colorimetra -galactosidasa sustrato X-gal y deteccin visual de la alteracin de -galactosidasa actividad en la presencia o la ausencia de arabinosa. De los seis supuestos VieA regulados lacZ fusiones para que el genoma-mtn 5lacZ unin se determin, dos resultaron ser regulados especficamente por VieA despus de fagos mediada por la transduccin generalizada en los fondos cepa nueva. Una fusin en VCA0707 fue reprimida de 10 veces a la induccin de vieA , mientras que la sobreexpresin de VieB no tuvo ningn efecto sobre la actividad de fusin ( Fig.. 1A ). El producto del gen VCA0707 est anotado como un UHPC supuesto, una protena implicada en la deteccin extracelular de glucosa-6-fosfato. Una fusin en el VC0928, que codifica una protena hipottica, fue reprimida de 100 veces por vieA induccin ( la fig. 1B ). La sobreexpresin de VieB reprimido la fusin VC0928 aproximadamente el doble, pero esto parece ser un efecto de arabinosa porque VC0928:: lacZ la actividad tambin se redujo en un doble por arabinosa en un refugio cepa pBAD33 ( Fig. 1B. ). Figura 1. VieA reprime la actividad de MTN 5lacZ fusiones de VCA0707 y VC0928. galactosidasa -ensayos se realizaron despus de que el crecimiento durante la noche en LB (barras slidas) o LB + 0,2% de arabinosa (barras rayadas) a 30 C con agitacin. Los resultados son la desviacin media desviacin estndar de las tres culturas independientes. A. VCA 0707:: lacZ actividad en V. cholerae albergan los plsmidos indicados. B. VC 0928:: lacZ actividad en V. cholerae albergan los plsmidos indicados. C. VC 0928:: lacZ actividad de tipo salvaje y vieA V. cholerae plsmidos albergar a los dominios de la protena inducible arabinosa se indica en el x -axis. D. VC 0928:: lacZ actividad de tipo salvaje y vieA V. cholerae que alberga un plsmido que codifica arabinosa-inducible VCA0956. Los ensayos se realizaron despus de que el crecimiento durante la noche en LB 0,2% arabinosa, o M9 + NRES arabinosa 0,2%.

Porque VC0928:: lacZ fue reprimida fuertemente por la sobreexpresin de VieA, la fusin fue traducida en el tipo silvestre, vieA , y vieBfondos tensin para comprobar si la eliminacin de los nativos vieA podra aliviar la represin. En el fondo de tipo salvaje, VC0928:: lacZno se activa durante el crecimiento en M9 + NRES ( Tabla 1 ). Mientras que la eliminacin de vieB no tuvo efecto sobre VC0928:: lacZ la actividad, el vieA mutante exhibi actividad de aproximadamente 100 veces mayor de la fusin ( Tabla 1 ). En conjunto, estos datos indican que VieA es un regulador negativo de VC0928. Tensin Genotipo relevantes -galactosidasa actividad (unidades Miller)

1.

Las cepas fueron cultivadas durante la noche en el M9 + NRES a 30 C con agitacin y se analiz la actividad -galactosidasa.Los resultados

presentados son la desviacin media desviacin estndar de las tres culturas independientes. AC-V1417 de tipo salvaje 1,4 1,0

AC-V1418

vieA

97 4

AC-V1419

vieB

1,0 0,8

AC-V1729

vieA135-375 (EAL)

110 23

Tensin

Genotipo relevantes

-galactosidasa actividad (unidades Miller)

AC-V1598

vieAE170A

100 16

AC-V1614

vieAD286A

86 28

Tabla 1. Actividad de la VC0928:: lacZ de fusin en diferentes vieA antecedentes cepa mutante.

VC0928 codifica una protena hipottica sin dominios conservados ni ortlogos en el NCBI no redundante base de datos, pero se encuentra entre dos operones, VPSA-K y Q-vpsL , que se requieren para la produccin de EPS y la formacin de biofilm ( Yildiz y Schoolnik, 1999 ; Ali et al ., 2000 ). Para confirmar que regula VieA VC0928 en el nivel de la transcripcin y para probar si VieA regula elvps operones, los ensayos de proteccin de ribonucleasa (RPA) se llevaron a cabo. Riboprobes se generaron para VC0928, VPSA yvpsL , y se utiliza para detectar la transcripcin de ARN de los genes de tipo salvaje, vieA y vieB cepas, as como una cepa que contiene una delecin en el marco de la VieA HTH motivo de unin a ADN. Transcripcin de VC0928, VPSA y vpsL se desreprimido en gran medida en la vieA mutante, mientras que los niveles de transcripcin se mantuvieron sin cambios para el vieB mutantes en comparacin con la de tipo salvaje ( Fig.. 2A ). A pesar de desrepresin modesta de las tres transcripciones se observ para el vieAHTH-mutante, cada transcripcin estaba presente en niveles ms bajos en este mutante en comparacin con la supresin completa devieA . Estos resultados indican que la regulacin de la vps grupo de genes por VieA requiere un dominio funcional que no sea el de unin al ADN putativo motivo HTH. Figura 2. ensayos de proteccin de ribonucleasa (RPA) para analizar la regulacin de VPSA , vpsL , VC0928, y vpsR por VieA. Se aisl el ARN de tipo salvaje o el mutante de V. cholerae cepas indicadas encima de cada carril despus de un crecimiento en M9 + NRES. Las transcripciones fueron detectados en 1 g de ARN total por el EPR. Intensidades de las bandas se cuantificaron y normalizado a la intensidad de la rpoB banda. L indica ARN escalera (los tamaos en nmero de bases = 400, 300 y 200). A. Intensidad media en relacin con el tipo salvaje de al menos tres experimentos independientes se presentan a continuacin cada carril. U1 indica digerirrpoB (banda inferior), VPSA (banda superior), y VC0928 (banda media) sondas. U2 indica digerir vpsL sonda (banda inferior) y una sonda de relacin. B y C. La intensidad de los de larga duracin (superior) vpsRbanda protegidas en relacin con el tipo salvaje durante al menos tres experimentos independientes se presentan a continuacin cada carril. U indica cortar vpsR y rpoB sondas.

VieA regula los genes vps a travs del control de la transcripcin vpsR
El VPSA-Q genes estn positivamente regulados por VpsR, un factor de transcripcin con homologa a sigma-54 activadores dependientes y de dos componentes reguladores de la respuesta ( Yildiz et al ., 2001 ). Para probar si VieA indirectamente podra regularVPSA-Q , al afectar la expresin de vpsR , RPA se realiza para examinar vpsR los niveles de transcripcin. Similar a los resultados obtenidos para VPSA , vpsL y VC0928, vpsR transcripciones estuvieron presentes en niveles mucho ms altos en el vieA mutante que en el tipo salvaje ( Fig.. 2B y

C ). Por el contrario, vpsR los niveles de transcripcin se mantuvieron sin cambios, tanto para el vieA -HTH y vieB mutantes ( Fig.. 2B y datos no presentados). Dos bandas distintas se han observado consistentemente asociada con la vpsRsonda, la banda ms pequea puede representar un sitio diferente inicio de la transcripcin, la terminacin prematura de la transcripcin o una planta de tratamiento posttranscripcional en el vpsR secuencia de codificacin. La hiptesis de terminacin se ve favorecida por una similar veces la regulacin de ambas bandas en el vieA mutante. Estos resultados sugieren que regula VieA VPSA-Q y VC0928 por la expresin de control del regulador positivo VpsR. Para comprobar que la desrepresin de VPS de transcripcin en el vieA mutante no es resultado de una mutacin secundaria, el mutante se complement con la arabinosa-inducible vieA plsmido. Transcripcin de vpsR y VPSA fueron restaurados a los niveles de tipo salvaje a la induccin de VieA con arabinosa, pero no en un control de vectores pBAD33 (datos no mostrados). Estos resultados confirman que la supresin de vieA es responsable de los defectos en vpsR expresin.

VieA es un represor de la formacin de biofilm

Para confirmar que VieA regulacin de vps genes es importante para la formacin de biofilm, tanto cuantitativa tincin de cristal violeta y microscopa de fluorescencia cualitativa se llevaron a cabo. A flaA ( aflagellate) cepa que no forman biofilms maduros, ya que no adhieren a la superficie ( Watnick y Kolter, 1999 ) se incluy en estos experimentos, como control negativo. Se observ la formacin de biofilm doble reforzada por la vieA mutantes en comparacin con el tipo silvestre cuando las bacterias se cultivaron en LB sin aireacin ( Fig. 3A ). Adems, la formacin de biofilm por la cepa de tipo salvaje se redujo tres por arabinosa inducida por la expresin de VieA (Fig. 3B ). Por microscopa de fluorescencia confocal, las biopelculas se cultivaron en cubreobjetos de vidrio y las bacterias adheridas se visualizaron por tincin con DAPI. En tres experimentos independientes, el vieA mutante formado biofilms ms gruesa que la de tipo salvaje, el vieA biofilms mutantes conserva la arquitectura normal, con pilares de bacterias rodeadas por canales llenos de lquido [comparar la figura. 3C (tipo salvaje) y 3D ( vieA )]. Estos resultados son consistentes con VieA acta como un regulador negativo de lavps genes que son responsables de la sntesis de EPS y la formacin de biofilm. Figura 3. Ensayos para la formacin de biofilm. A. El tipo silvestre, vieA y flaA cepas se cultivaron en LB sin aireacin y las bacterias adheridas se tieron con cristal violeta. La tincin se cuantifica mediante la solubilizacin de cristal violeta en etanol al 100% y la determinacin de la absorbancia a 570 nm. B. cristal violeta y la cuantificacin se realiz como en la parte A de la cepa de tipo salvaje albergar tanto pBAD33 o pBAD33:: vieA crecido en LB arabinosa 0,2%. C y D. Confocal imgenes de microscopa de fluorescencia de tipo salvaje y vieA biofilms cultivaron en cubreobjetos y se tieron con DAPI. El centro de cada figura es un XY-seccin a travs de la biopelcula (bar = 25 m). Secciones verticales de los biofilms se muestra a la derecha y abajo.

Un dominio de la fosfodiesterasa VieA es responsable de la regulacin vps

La unin al ADN putativo motivo HTH de VieA fue en gran parte prescindibles para la regulacin de vpsR , VPSA Q- y VC0928, lo que sugiere que VieA tiene una actividad distinta de la unin al ADN que es responsable de la represin de la expresin gnica. Una posibilidad es que la fosforilacin de la quinasa VieA por sensor de sistema de intercambio es importante para la represin de la vpsgenes. VieA contiene dos dominios phosphoreceiver putativo, el receptor N-terminal se prev que sea funcional, mientras que un segundo pseudo-receptor inmediatamente adyacente al motivo HTH se prev que estar inactivo debido a que carece de residuos de varios crticos de la fosforilacin. Las mutaciones puntuales que convierten aspartato conservado para no phosphorylatable residuos fueron construidos para probar si la fosforilacin en estos sitios es necesario para la actividad VieA. Los mutantes D52A y D403N individuales y dobles se generaron y se pusieron a prueba tanto para vpsR y VPSA los niveles de transcripcin por el EPR. Cada una de las cepas mutantes punto exhibieron niveles de tipo salvaje de los dos expedientes ( fig. 2B , y datos no presentados), lo que indica que la fosforilacin en la D52 y la D403 residuos no es esencial para VieA mediada por la represin de vps la expresin gnica. Ya que los dominios de funcin conocida en VieA no eran responsables de la regulacin del vps genes, hemos tratado de definir el dominio represor mnimo por clonacin versiones truncadas de VieA bajo el control de la pBAD33 arabinosa-promotor inducible. Estos truncamientos se probaron para la capacidad de reprimir la actividad de VC0928:: lacZ , tanto en el tipo salvaje y vieA mutantes antecedentes durante el crecimiento en LB. Inicialmente, se observ que el N-terminal de 386 aminocidos de VieA falta el motivo HTH fueron suficientes para la represin ( Fig. 4. , fila 3). Para confirmar que la fosforilacin de los residuos D52 no es importante para la actividad VieA, un vector similar fue construido con la vieAD52A mutacin puntual. La sobreexpresin del truncamiento D52A reprimidos VC0928:: lacZ actividad tan eficientemente como el de tipo salvaje ( Fig. 4. , fila 4). A continuacin, una serie de N-y C-terminal truncamientos de los activos 1-386 fragmento de aminocidos de VieA se generaron. Un polipptido correspondiente a los aminocidos 110-386 de VieA fue un dominio total de la represin de la actividad de la VC0928:: lacZ fusin ( Fig. 4. , fila 8). Eliminaciones ms en esta regin, ya sea de la N-o C-terminal derog la capacidad de la protena para reprimir la transcripcin de la fusin ( Fig. 4. , filas 5, 9 y 10). Todos los truncamientos N-terminal de VieA se marcaron en el extremo C-terminal con sus seis eptopo, que permite la deteccin de las protenas por inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal contra la polihistidina. Todas las protenas no se detectaron en la ausencia de arabinosa, y se expresaron en niveles similares a la induccin (datos no mostrados). Figura 4. Represin de la VC0928:: lacZ fusin por la sobreexpresin de truncamientos VieA. Regiones de vieA codificacin de los aminocidos indicados fueron clonados bajo el control de la arabinosa-inducible P araBADpromotor en pBAD33 y se introdujeron en el tipo salvaje y vieA V. choleraeque contiene el VC0928:: lacZ fusin. Las cepas fueron cultivadas durante la noche en LB (barras slidas en blanco y negro) o LB + 0,2% arabinosa (barras rayadas claras y oscuras) a 30 C con aireacin y se analiz la actividad galactosidasa. Valores son la media desviacin estndar de al menos tres culturas independientes. Abreviaturas dominio de la protena se phosphoreceiver (Rec), pseudo-phosphoreceiver (Rec *), de la fosfodiesterasa (EAL), la etiqueta de hlice-giro-hlice (HTH) y 6-Histidina (H6).

La porcin de VieA clonado en el plsmido pAT1568 codifica un dominio de ingls como idioma adicional, que se prev que funcione como una fosfodiesterasa de c-di-GMP ( Galperin et al ., 2001 ). Para confirmar que el dominio VieA EAL es necesario para la regulacin de la vps genes, una delecin en el marco de este dominio (aminocidos 135-375) se construy en el cromosoma I. Adems, dos muy conservadas residuos cidos (E170 y D286) que se prev que sea importante para la coordinacin de un ion metlico que participan en la catlisis ( Galperin et al ., 2001 ) fueron mutados a alanina. Los mutantes EAL, E170A, y D286A se analizaron tanto VPSA ( datos no mostrados) y vpsR ( Fig.. 2C ) los niveles de transcripcin por el EPR. En los tres mutantes, la transcripcin de VPSA y vpsR es ms elevada que la de tipo salvaje, similar a la completa eliminacin en el marco de vieA . Adems, las mutaciones EAL, E170A y D286A se construyeron en el VC0928:: lacZ cepa de antecedentes y pruebas de la actividad -galactosidasa. Similar a los resultados de la RPA, VC0928:: lacZ actividad se increment en cada uno de los mutantes de dominio EAL ( Tabla 1 ). Por ltimo, VieA EAL dominios que contienen la E170A y mutaciones D286A punto fueron clonados en pBAD33 y la prueba de la capacidad de reprimir VC0928:: lacZactividad. Ni el E170A ni el punto de D286A mutante fue capaz de reprimir la expresin de la VC0928:: lacZ fusin ( Fig. 4. , filas 11 y 12), a pesar de que las protenas se expresa en altos niveles (datos no mostrados).

Ciclasa diguanylate o dominios de la fosfodiesterasa puede regular vps expresin

Para hacer frente a si la regulacin de la vps genes es especfica para el dominio VieA EAL o como resultado de su actividad como un supuesto c-di-GMP de la fosfodiesterasa, EAL dominios a partir de dos protenas no relacionadas se sobreexpresa en pBAD33 y evaluados por la capacidad de reprimir VC0928:: lacZ . VC0653 ( rocs ) fue recientemente demostrado ser importante para el cambio entre la morfologa de colonia lisa y rugosa ( Rashid et al ., 2003 ), un fenotipo asociado con la produccin de EPS, y se anota como un supuesto c-di-GMP fosfodiesterasa. VCA0785 no ha sido implicado en ninguno vps regulacin de los genes o la formacin de biofilm.Tanto el VCA0785 y protenas ROCS tambin contienen un dominio N-terminal GGDEF al dominio EAL. Mientras que el dominio EAL solo de VCA0785 fue capaz de reprimir VC0928:: lacZ actividad similar a la sobreexpresin del dominio VieA EAL, el dominio EAL de ROCs causado slo un modesto represin de VC0928:: lacZ ( Fig. 1C. ). Sin embargo, la sobreexpresin de la GGDEF ROC y dominios EAL junto causado una drstica disminucin en VC0928:: lacZ actividad ( . Fig. 1C ), lo que sugiere que el dominio EAL rocs no es funcional cuando se toman fuera del contexto de la protena intacta. Estos datos indican que la represin de vps genes no es una funcin especfica en el dominio VieA EAL, pero que otras protenas con actividad enzimtica similar se puede cumplir esta funcin. Debido a que los dominios son GGDEF ciclasas supuesta diguanylate que generan c-di-GMP a partir de GTP, hemos probado si la sobreexpresin de una protena de la familia GGDEF podra activar VC0928:: lacZ , similar a la eliminacin de vieA . Expresin de larga duracin VCA0956, una protena citoplasmtica que contiene un dominio GGDEF como el motivo slo se conserva, result en una mayor actividad de VC0928:: lacZ , tanto en el tipo salvaje y vieA antecedentes cepa ( Fig. 1D. ). Cabe destacar que la cepa de tipo salvaje expresar VCA0956 exhibido VC0928:: lacZ actividad similar a la actividad de la vieA mutante. La induccin de la VCA0956 causado un defecto severo en el crecimiento de la vieA fondo mutante, que incluya una medicin precisa de VC0928:: lacZ actividad. El defecto de crecimiento podra ser debido a la alta concentracin intracelular de c-di-GMP resultante de la sntesis en la ausencia de VieA mediada por hidrlisis. Estos resultados sugieren que el c-di-GMP induce la sntesis de vps expresin de los genes, al igual que la supresin del dominio VieA EAL.

VieA actividad de la fosfodiesterasa regula la concentracin intracelular de c-di-GMP

Basado en el anlisis mutacional de vieA y en la sobreexpresin de EAL y otros dominios GGDEF, VieA parece controlar vps la expresin de genes que afectan por c-di-GMP concentracin. Para detectar esta molcula, 2D-TLC se llev a cabo en los extractos de nucletidos de las

clulas pulsadas con 32 P-etiquetados ortofosfato en un fosfato de limitacin de medio mnimo. VieA reprime vps la expresin de genes en este medio, segn la evaluacin de la medicin de VC0928:: lacZ actividad (datos no mostrados). En extractos de la vieAcepa, un lugar se detect de forma reproducible con R f valores (0,16 en el NH 4 HCO 3 dimensiones, 0,32 de KH 2 PO 4 dimensin, fig. 5B y D ) similar a los valores publicados por c-di-GMP [0,19 y 0,31, respectivamente ( Ross, 1986 )]. Este lugar estaba por debajo del lmite de deteccin en los extractos de la cepa de tipo salvaje ( Fig.. 5A y C ). Adems, un punto que corresponde a c-di-GMP se observ cuando el VCA0956 GGDEFfamilia de protenas se expresan en el fondo de tipo salvaje. El punto c-di-GMP slo estaba presente cuando la expresin de protenas fue inducida con arabinosa y el aumento en la intensidad con el tiempo de induccin y de etiquetado ( la figura. 5E-G ). c-di-GMP era indetectable despus de la induccin arabinosa de una cepa que alberga el vector pBAD33, lo que indica que VCA0956 expresin es necesaria para su sntesis (datos no mostrados). El c-di-GMP es intracelular, ya que no se detect en el sobrenadante de cultivo de clulas marcadas (datos no mostrados). Figura 5. bidimensionales cromatografa en capa fina para detectar c-di-GMP. A y B. Los nucletidos se extrajeron de la de tipo salvaje (A) y vieAmutante (B) obtenidas en MOPS + NRES con 32 P-ortofosfato, manchas en las placas de TLC (origen en la esquina inferior izquierda), y se desarroll en 0,2 M de NH 4 HCO 3 , pH 7,8 en la primera dimensin (de abajo hacia arriba) y 1,5 M KH 2 PO 4 , pH 3,65 en la segunda dimensin (de izquierda a derecha). La flecha blanca indica el punto correspondiente a c-di-GMP.Flechas en negro indican los puntos con R f valores similares a los valores publicados por el GTP, el PIB, y GMP. Zona C y D. caja se indica en A y B, respectivamente, magnificado y sobreexpuestos a mostrar el punto c-di-GMP. E-G. Los nucletidos se extrae de la cepa de tipo salvaje albergar pBAD33:: VCA0956 crecido en MOPS + NRES con 32 P-ortofosfato y separados por 2D-TLC, como en A y B. Las flechas blancas indican el punto c-di-GMP. E. no inducido, 1 h Tiempo de etiquetado total. F. inducida por 30 min (1 h etiquetado totales). G. inducida por 2 h (2,5 etiquetado totales h). H. 1DTLC de veneno de serpiente de la fosfodiesterasa (SVPD) y fosfatasa alcalina (CIP) tratados c-di-GMP eluye de 2D-TLC placas. Calle 1, no enzimtica, calle 2, SVPD, calle 3, SVPD + CIP, de 4 carriles, el CIP.

Para confirmar que el punto observado por 2D-TLC es c-di-GMP, las propiedades de la molcula se analizaron por digestin enzimtica.Debido a que c-di-GMP cclico es un dinucletido, es resistente a la fosfatasa pero sensible a la fosfodiesterasa ( Ross et al ., 1986 ).Mientras que el punto identificado por 2D-TLC era resistente a la fosfatasa alcalina (CIP), el tratamiento con phophodiesterase (SVPD) dio lugar a un producto que comigrates con GMP y que es sensible a la CIP ( fig. 5H ). En conjunto, estos datos indican que el punto observado por 2D-TLC es c-di-GMP, y que su concentracin se incrementa en tanto la eliminacin de vieA o sobreexpresin de la VCA0956 GGDEF-familia de protenas.

Discusin
En este informe se describe una pantalla de genes controlados por el VieA seales de dos componentes de transduccin de regulador de respuesta. Podemos identificar dos genes, VCA0707 (putativo UHPC ) y VC0928, que estn reprimidas 10 - y 100 veces por VieA, respectivamente. Reglamento de VC0928 fue estudiado en detalle, ya que est fuertemente reprimida por VieA y est vinculada a genes

implicados en la produccin de EPS y la formacin de biofilm. Nuestros resultados muestran que VieA es un regulador negativo de VC0928 y de dos operones grandes, vecinos, VPSA-K y Q-vpsL , que se requieren para la produccin de EPS. Adems, inhibe la transcripcin de VieA VpsR, un regulador positivo de la vps genes. Por lo tanto, sugieren que VieA controla la expresin de la vpsoperones indirectamente afectan a la transcripcin de vpsR . VieA no regula vpsR transcripcin unindose directamente la vpsRpromotor, sin embargo, porque la supresin del motivo HTH VieA de unin al ADN tuvo poco efecto en vpsR los niveles de transcripcin.Por el contrario, sobre la base de truncamiento y el anlisis de supresin, es el dominio VieA EAL, un supuesto c-di-GMP de la fosfodiesterasa, lo que se requiere para la regulacin de la transcripcin de la vpsR gen. El modesto (menos del doble) el aumento devpsR transcripcin observada para el vieA-HTH mutante puede ser debido a la auto-regulacin de vieA transcripcin ( Lee et al ., 1998). Consistente con esto, observamos que vieA los niveles de transcripcin se reducen de cuatro veces en la vieA-HTH mutantes en comparacin con el tipo salvaje (datos no mostrados). Presumiblemente, la protena VieA, y por lo tanto c-di-GMP actividad de la fosfodiesterasa, tambin se redujeron marginalmente en el vieA HTH- mutante, lo que resulta en cambios modestos en vpstranscripcin. Varias lneas de evidencia indican que la actividad enzimtica del dominio VieA EAL es necesario para reprimir la produccin de EPS. En primer lugar, VC0928:: lacZ actividad no fue reprimida por EAL dominios, ya sea con la E170A o las mutaciones puntuales D286A, que deben derogar la coordinacin de iones metlicos ( Galperin et al , 2001. ), lo que indica que las protenas son inactivas. Sobreexpresin de la segunda, de los dominios de EAL o VC0653 (ROC) o VCA0785 actividad reprimida de VC0928:: lacZ . Nuestros experimentos puso de relieve una diferencia entre la ROC, VCA0785 y VieA, porque ROCS requiere el dominio GGDEF en cis para su actividad. No est claro por qu algunas protenas de dominio EAL puede ser que necesite un dominio GGDEF de actividad de la fosfodiesterasa, pero los tres de la supuesta G. xylinus c-di-GMP fosfodiesterasas contienen un dominio N-terminal GGDEF al dominio EAL ( Tal et al ., 1998 ). En tercer lugar, hemos sido capaces de aliviar la represin de VC0928:: lacZ la actividad por la sobreexpresin de la enzima guanilato ciclasa supuesto, VCA0956. Por ltimo, hemos sido capaces de demostrar por 2D-TLC de los extractos de nucletidos que el c-di-GMP concentracin es mayor, tanto en el vieA mutante y una cepa que sobreexpresa el VCA0956 GGDEF-familia de protenas. Para confirmar que el dominio VieA EAL ha c-di-GMP actividad de la fosfodiesterasa, hemos intentado in vitro ensayos utilizando el Su 6 etiquetados dominio VieA EAL purificado por varios mtodos de purificacin de afinidad. Esta protena se activa como un c-di-GMP fosfodiesterasa en vivo , ya que reduce la concentracin de c-di-GMP a un nivel no detectable por 2D-TLC cuando se expresa en la vieAfondo (datos no mostrados). Hasta ahora, sin embargo, no hemos sido capaces de recuperar esta actividad in vitro. Es posible que el dominio EAL VieA requiere un cofactor para la actividad que no est presente en nuestra in vitro las condiciones de reaccin. Por otra parte, VieA puede formar un complejo con otra protena (s) en vivo para hidrolizar c-di-GMP. En conjunto, nuestros datos apoyan el modelo descrito en la figura. 6 . El aumento de c-di-GMP concentracin, que se derive de reduccin de la actividad del dominio VieA EAL fosfodiesterasa o aumento de la actividad de una o ms diguanylate ciclasas GGDEF activa la expresin de la vps genes. Debido a la supresin de la transcripcin de dominio VieA EAL desreprimido del regulador positivo VpsR, se sugiere que la seal de c-di-GMP modula vpsR transcripcin de afectar la produccin de EPS. Una protena, o, alternativamente, un sRNA reguladoras, puede sentir c-di-GMP para regular vpsR expresin. Figura 6. Modelo de V. cholerae vps regulacin de los genes y por VieA GGDEF otros / EAL protenas de dominio. Dominios GGDEF sintetizar c-di-GMP a partir de GTP, mientras que las protenas de dominio EAL actuar como fosfodiesterasas de c-di-GMP, degradando a GMP. VieA es un importante contribuyente a la c-di-GMP hidrlisis bajo las condiciones de crecimiento que hemos probado, por lo que la eliminacin de vieA conduce a un aumento de la concentracin intracelular de c-di-GMP. Esto afecta a la transcripcin de vpsR ,

posiblemente, al influir en la actividad de una protena c-di-GMP de deteccin (factor X). El aumento de vpsR transcripcin conduce a la induccin de la VPSA-Q grupo de genes, la produccin de EPS, y la formacin de biofilm.

Nuestro modelo predice que cualquier otra protena con diguanylate ciclasa o c-di-GMP actividad fosfodiesterasa podran estar implicados en la modulacin de vps la expresin gnica. V. cholerae 41 codifica protenas con un dominio GGDEF y protenas 22, con un dominio EAL ( Galperin et al , 2001. ), sin embargo, VieA parece ser un importante regulador de la vps genes en las condiciones de crecimiento que hemos probado, otras protenas de dominio EAL o bien debe se expres mal o enzimticamente inactivo en estas condiciones. Aunque los experimentos que aqu se llevaron a cabo en el V. cholerae biotipo clsico, los datos de otros sugieren que la regulacin de la produccin de EPS por c-di-GMP tambin ocurre en el biotipo El Tor ( Bomchil et al , 2003. , Rashid et al ., 2003 ). VieA no lo hace, sin embargo, juegan un papel central en vps regulacin de los genes en el biotipo El Tor porque la supresin de vieA no tuvo efecto sobre VC0928:: lacZ la actividad en varios fondos de El Tor tensin durante el crecimiento en comn los medios de laboratorio (ADT y AC, sin publicar de datos). Nos sugieren que las protenas funcionalmente redundantes EAL dominio expresado en El Tor V.cholerae puede compensar la prdida de VieA. La existencia de mltiples GGDEF y protenas EAL dominio en V. cholerae sugiere la posibilidad de integracin de mltiples seales que modulan la c-di-GMP concentracin. En base a nuestros datos, los aminocidos son una seal de tal manera que se transmite a travs VieA. El sensor quinasa Vies contiene dos motivos de su dominio periplsmico con homologa a las protenas de unin de cidos amino, y es posible que compite VieA fosforila en respuesta a las seales de aminocidos altera la actividad enzimtica del dominio VieA EAL. La fosforilacin de la Caulobacter crescentus regulador de respuesta GGDEF que contienen Se declar es necesaria para la regulacin del desarrollo celular acechado en esta especie y, probablemente, los controles de la actividad GGDEF dominio ( Aldridge et al ., 2003 ). Dado que los residuos conservados de aspartato en los dominios de phosphoreceiver VieA no eran necesarias para vpsactividad regulatoria, se sugiere que VieA unphosphorylated es activo como c-di-GMP fosfodiesterasa. La seal de c-di-GMP pueden coordinar la regulacin de otros genes que son importantes para la formacin de biopelculas, como los que participan en el metabolismo y transporte de los azcares EPS. La supuesta UHPC glucosa-6-fosfato del sensor, que se identific como VieA reprimidos en nuestra pantalla, pueden tener un papel indirecto en la formacin del biofilm debido a que el UHPC :: lacZtransposn insercin mutantes mostraron un defecto moderado en la formacin del biofilm (datos no mostrados) . Estamos en el proceso de identificacin de otros genes y protenas que son reguladas por c-di-GMP. Nuestros resultados preliminares indican que ms del 20 secretadas y protenas de las clulas sobre, adems de los presentados aqu, son regulados por c-di-GMP (ADT, AC y Yildiz FH, datos no publicados). Aunque nuestros datos muestran que el c-di-GMP regula vpsR transcripcin, que se carece de informacin acerca de cmo se logra esto. Sugerimos que la actividad de una protena necesaria para la regulacin de vpsR se ve afectada por la unin de c-di-GMP, al igual que en el caso de la celulosa sintasa de G. xylinus ( Weinhouse et al ., 1997 ) . VpsR se puede obligar a c-di-GMP, ya que contiene un motivo de

unin a nucletidos tpico de sigma-54 activadores de la transcripcin dependiente, pero no requiere sigma-54 para activar la transcripcin ( Yildiz et al . , 2001 ). Tal vez los sentidos VpsR c-di-GMP a travs de este motivo, y activa la transcripcin de su propio gen y la de los vps genes. Porque VpsR tiene un motivo phosphoreceiver, una segunda posibilidad es que controla la actividad de fosforilacin VpsR. En este escenario, una quinasa sensor puede activar VpsR por la fosforilacin de la presencia de c-di-GMP. Se estn realizando estudios para identificar el factor que los sentidos c-di-GMP para regular la produccin de EPS.

Los procedimientos experimentales

Condiciones de crecimiento
Las bacterias se cultivaron en caldo LB con aireacin a 37 C a menos que se indique lo contrario. M9 sales ms el 0,5% de glicerol, trazas de metales (1 ml l -1 de 5% MgSO 4 , 0,5% MnCl 2 4H 2 O, 0,5% de FeCl 3 , 0,4% de cido trinitriloacetic) ( Callahan et al , 1971. ) yL asparagina, L -arginina, L -glutamato y L -serina, cada uno de 25 mm (M9 + NRES) fue preparado como se describi previamente (Miller y Mekalanos, 1988 ). De 32 P etiquetado de los nucletidos, las bacterias se cultivaron en un medio similar el uso de sales MOPS como base ( Sambrook y Russell, 2001 ). Arabinosa se aadi en el 0,2% concentracin final de inducir la expresin de la P araBADpromotor. Los antibiticos se aadieron a las siguientes concentraciones a menos que se indique lo contrario: estreptomicina (SM) 100 mg ml -1 , ampicilina (Ap) 50 mg ml -1 , kanamicina (Km) 100 mg ml -1 , cloranfenicol (Cm) 10 mg ml -1 .

La construccin del plsmido y la tensin

Todas las cepas y plsmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 2 . Plsmidos con oriR6K fueron propagadas por el E.coli DH5pir; todos los otros plsmidos fueron propagadas por el E. coli DH5a. Una descripcin detallada de la tensin y la construccin del plsmido se proporcionan en el material complementario . Adems, las secuencias de los oligos se presentan en la Tabla A1 en el material complementario . Tensin o un plsmido Genotipo y el fenotipo relevante Fuente o referencia

E. coli cepas

DH5a

F- ( lacZYA-ARGF ) U169 recA1 endA1 hsdR17 supE44 thi-1 gyrA96 relA1

( Kolter et al , 1978. ; Hanahan, 1983 )

DH5pir

F- ( lacZYA-ARGF ) U169 recA1 endA1 hsdR17 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 :: pir

( Kolter et al , 1978. ; Hanahan, 1983 )

SM10pir

thi Reca THR leu ton encaje supe RP4-2-TC:: Mu :: pir

La cepa de laboratorio

AC-E1380

SM10pir (pAT1379), Ap r

Este trabajo

V. cholerae cepas

O395

biotipo clsico, Sm r

( Taylor et al ., 1987 )

AC-V61

O395 lacZ :: res-tet-res , la eliminacin espontnea parcial de lacZ, Sm r , Tc r

( Camilli y Mekalanos, 1995 )

AC-V1198

AC-V61 vieAB , Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1200

AC-V61 vieB , Sm r , Tc r

Este trabajo

Tensin o un plsmido

Genotipo y el fenotipo relevante

Fuente o referencia

AC-V1212

AC-V61 vieA- HTH, Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1386

AC-V61 vieA , Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1487

AC-V61 vieAD52A , Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1543

AC-V61 vieAD403N , Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1544

AC-V61 vieAD52A, D403N , Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1728

AC-V61 vieA135-375 ( EAL), Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1596

AC-V61 vieAE170A , Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1597

AC-V61 vieAD286A , Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1539

AC-V61 flaA , Sm r , Tc r

Este trabajo

AC-V1351

AC-V1198 pBAD33, Sm r , Tc r , Cm r

Este trabajo

AC-V1352

AC-V1198 pAT1337, Sm r , Tc r , Cm r

Este trabajo

AC-V1353

AC-V1198 pAT1338, Sm r , Tc r , Cm r

Este trabajo

AC-V1409

AC-V1352 uhpT :: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r , Cm r

Este trabajo

AC-V1420

AC-V1351 uhpT :: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r , Cm r

Este trabajo

AC-V1421

AC-V1353 uhpT :: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r , Cm r

Este trabajo

AC-V1407

AC-V1352 VC0928:: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r , Cm r

Este trabajo

AC-V1415

AC-V1351 VC0928:: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r , Cm r

Este trabajo

AC-V1416

AC-V1353 VC0928:: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r , Cm r

Este trabajo

AC-V1417

AC-V61 VC0928:: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r

Este trabajo

AC-V1418

AC-V1386 VC0928:: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r

Este trabajo

AC-V1419

AC-V1200 VC0928:: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r

Este trabajo

AC-V1729

AC-V1593 VC0928:: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r

Este trabajo

AC-V1598

AC-V1596 VC0928:: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r

Este trabajo

AC-V1614

AC-V1597 VC0928:: MTN 5-lacZ , Sm r , Tc r , Km r

Este trabajo

Tensin o un plsmido

Genotipo y el fenotipo relevante

Fuente o referencia

AC-V1460

AC-V61 pBAD33, Sm r , Tc r , Cm r

Este trabajo

AC-V1461

AC-V61 pAT1337, Sm r , Tc r , Cm r

Este trabajo

AC-V1463

AC-V1386 pBAD33, Sm r , Tc r , Cm r

Este trabajo

AC-V1464

AC-V1386 pAT1337, Sm r , Tc r , Cm r

Este trabajo

AC-V1726

AC-V61 pAT1662, Sm r , Tc r , Cm r

Este trabajo

Plsmidos

pUTmTn5Km2-STM

oriR6K mobRP4 mtn 5 Km2, Km r Ap r

( Hensel et al ., 1995 )

pAT1379

pUTmTn5Km2:: lacZ , Km r Ap r

Este trabajo

pCVD442

oriR6K mobRP4 sacB , Ap r

( Donnenberg y Kaper, 1991 )

pAC274

pCVD442:: vieAB , Ap r

( Lee et al ., 1998 )

pSL108

pCVD442: vieB , Ap r

( Lee et al ., 1998 )

pAT1211

pCVD442:: vieA- HTH, Ap r

( Tischler et al ., 2002 )

pAT1385

pCVD442:: vieA , Ap r

Este trabajo

pAT1486

pCVD442:: vieAD52A , Ap r

Este trabajo

pAT1542

pCVD442:: vieAD403A , Ap r

Este trabajo

pAT1591

pCVD442:: vieA135-375 (EAL), Ap r

Este trabajo

pAT1594

pCVD442:: vieAE170A , Ap r

Este trabajo

pAT1595

pCVD442:: vieAD286A , Ap r

Este trabajo

pSL140

pCVD442:: flaA , Ap r

( Lee et al ., 2001 )

PCR-script

f1 (+) Ori , Ap r

Stratagene

pGEM-T

f1 ori , Ap r

Promega

pAT856

pGEM-T:: ' rpoB , Ap r

( Tischler et al ., 2002 )

pAT1454

pGEM-T:: ' VPSA , Ap r

Este trabajo

pAT1455

pGEM-T:: "VC0928", Ap r

Este trabajo

Tensin o un plsmido

Genotipo y el fenotipo relevante

Fuente o referencia

pAT1456

pGEM-T:: ' vpsL , Ap r

Este trabajo

pAT1509

pGEM-T:: ' vpsR " , Ap r

Este trabajo

pAT1537

pGEM-T:: ' vieA , Ap r

Este trabajo

pBAD33

pACYC184 Ori , araC P araBAD , Cm r

( Guzmn et al ., 1995 )

pAT1337

pBAD33:: vieA , Cm r

Este trabajo

pAT1338

pBAD33:: vieB , Cm r

Este trabajo

pAT1535

pBAD33:: vieA -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1536

pBAD33:: NT vieA -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1561

pBAD33:: NT vieAD52A -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1564

pBAD33:: NTR1 vieA , Cm r

Este trabajo

pAT1567

pBAD33:: NTF2 vieA -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1568

pBAD33:: NTF3 vieA -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1575

pBAD33:: NTF4 vieA -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1581

pBAD33:: NTF5 vieA -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1582

pBAD33:: NTF1 vieA -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1583

pBAD33:: NTF6 vieA -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1615

pBAD33:: NTF3 vieAE170A -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1616

pBAD33:: NTF3 vieAD286A -Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1645

pBAD33:: VC0653-GGDEF-Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1646

pBAD33:: VC0653-EAL-Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1647

pBAD33:: VC0653-GGDEF + EAL-Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1648

pBAD33:: VCA0785-EAL-Su 6 , Cm r

Este trabajo

pAT1662

pBAD33:: Su VCA0956- 6 , Cm r

Este trabajo

Tabla 2. cepas bacterianas y plsmidos utilizados en este estudio.

Pantalla para VieA genes regulados

Tensin AC-V1352 [ V. cholerae O395 vieAB lacZ:: res-tet-res (pBAD33:: vieA ), Sm r , Tc r , Cm r ] fue aumentado a mediados de la fase exponencial de LB y se mezcla 1:1 con crecimiento exponencial E. coli Sm10pir llevar a la RPT 5lacZ mini-transposn vector de entrega.Un total de 100 l de la mezcla de apareamiento se extendi sobre una placa de LB y se incub durante 1 hora a 37 C. Las bacterias fueron rplica chapada con papel Whatman de LB con Sm (150 mg ml -1 ), Km (180 mg ml -1 ), y Cm y se incubaron 16 horas a 37 C para seleccionar V. cholerae exconjugates albergar mtn 5lacZ transposiciones. Las colonias fueron rplica chapada en LB Plus SM, Km, y Cm que contiene 40 g ml -1 5-bromo-4-cloro-3-indolil-- D -galactopiransido (X-gal) arabinosa 0,2% y se incubaron 16 horas a 30 C. Colonias rplica chapada fueron examinados por el fenotipo azul / blanco. Las cepas que mostraron diferencias de color eran la prueba de sensibilidad a la AP para confirmar que albergaba una mtn 5lacZ adaptacin y no una integracin del plsmido donante. El MTN 5lacZ del cromosoma unin fue identificado en cada punto de acceso s la tensin por arbitraria preparado por PCR y secuenciacin de ADN utilizando primers Arb1/5Lac Arb2/5Lac2 y como se describe ( Merrell et al ., 2002 ). -galactosidasa se midi la actividad despus de un crecimiento durante la noche en LB 0,2% de arabinosa a 30 C como se describe ( Miller, 1972 ).

Ribonucleasa proteccin de ensayo

RPA se llevaron a cabo esencialmente como se describe ( Tischler et al ., 2002 ) utilizando ARN total aislado de las cepas cultivadas en M9 + NRES a 30 C a finales de la fase exponencial (OD 600 = 1,0). Riboprobes para VC0928, VPSA , vpsL , vpsR , vieA y hapR se generaron como se describe en materiales y mtodos complementarios. El rpoB riboprobe se incluy en todas las hibridaciones para servir como control de carga como se describe ( Tischler et al ., 2002 ). Los datos fueron recogidos con un phosphorimager y analizados con ImageQuant (Molecular Dynamics). Intensidades de las bandas se normalizaron a la intensidad de la rpoB banda, y se presentan como la diferencia promedio de veces en comparacin con el tipo salvaje durante al menos dos experimentos independientes.

Cristal violeta tincin de las biopelculas

Las cepas se cultivaron en LB 16 h, diluida 1:50 en LB 0,5 ml ms antibiticos en tubos de vidrio borosilicato, y se incuban a temperatura ambiente sin ventilacin durante 24 h. Se aspir el medio y biofiolms adherentes se lavaron tres veces suavemente con LB. Las biopelculas se tieron con 0,5 mg ml -1 de cristal violeta durante 5 minutos, luego se lava exhaustivamente con agua. Obligado cristal violeta se solubiliz con 1 ml de etanol al 100% y se cuantifica por absorbancia a 570 nm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Las imgenes fueron adquiridas con una cmara digital.

La microscopa confocal de biofilms

Las bacterias fueron inoculadas en OD600 = 0,01 ml de LB 7 ms antibiticos en un tubo Falcon de 50 ml que contiene un cubreobjetos de vidrio de borosilicato y se incuban a temperatura ambiente durante 24 horas sin aireacin. Las biopelculas se tieron con 1 mg ml -14 ',6diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 10 minutos, enjuagar con LB, y montado en diapositivas colgando cada de LB. Las biopelculas se visualizaron con un aumento de 60 utilizando un microscopio confocal Odyssey (Noran). Las imgenes fueron capturadas con una cmara CCD (Fotometra) y procesados utilizando tres experimentos independientes.
METAMORPH

software (Universal Imaging Corp.). Las imgenes presentadas son representativos de

2D-TLC
Las bacterias se cultivaron durante 5 horas en MOPS + NRES + 0,75 mM KH 2 PO 4 a 30 C con aireacin hasta un OD 600 = 0,6 se alcanz. Las clulas se sedimentaron, se resuspendieron en medio de ms 100 Ci ml -1 32 ortofosfato P (PerkinElmer), y se incub durante 1 hora a los nucletidos de la etiqueta. Para las cepas que contienen pBAD33 o un derivado, los cultivos se incubaron sin induccin durante 30

minutos a los nucletidos etiqueta, despus de lo cual se dividi la cultura y expresin de la protena fue inducida en un medio con 0,2% de arabinosa. Los nucletidos se extrae en un cido frmico M como se describe ( Bochner y Ames, 1982 ).Polietilenimina (PEI)-celulosa placas de TLC (Selecto Cientfico) se prelavado en remojo durante 15 minutos en dH 2 O y en desarrollo en dH 2 O. Las muestras (10 l) fueron vistos en alcuotas de 0,5 l de 10 cm x 10 cm placas. Las placas se desarrollaron en 0,2 M de NH 4HCO 3 , pH 7,8 en la primera dimensin, empapados en el 100% de metanol durante 20 minutos, secado al aire, y se desarroll en 1,5 M KH 2 PO 4 , pH 3,65 en la segunda dimensin. Las placas fueron secadas al aire, expuestos a las pantallas de fsforo (Kodak), y los datos fueron recogidos con un phosphorimager y analizados con ImageQuant (Molecular Dynamics). Para confirmar la identidad del punto c-di-GMP, que fue cortado de la placa 2D-TLC y se eluy en 20 l de 0,5 M (NH 4) 2 CO 3 . El eluido se puso a prueba la sensibilidad a la pantorrilla intestinal fosfatasa alcalina (CIP, New England Biolabs) y veneno de serpiente de la fosfodiesterasa I (SVPD, Amersham) en un tampn que contiene 50 mM Tris, pH 8,5 y 10 mM MgCl 2 . Las muestras fueron avistados en PEIcelulosa placas de TLC, desarrollado en 1,5 M KH 2 PO 4 , pH 3,65, y se detecta como se detalla anteriormente.

Nota aadida en pruebas

Si bien este manuscrito estaba en prensa, Paul et al. , (2004) demostraron que purifica PLED, una C. crescentus GGDEF contienen regulador de respuesta, tiene una actividad guanilato ciclasa in vitro . Ciclasa actividad fue realzada por la fosforilacin del dominio del receptor y requiere un dominio de GGDEF salida intacto. Celular Paul, R., Weiser, S., Amiot, Carolina del Norte, Chen, C., Schirmer, T., Giese, B., y Jenal, U. (2004) dependiente del ciclo localizacin dinmica de un regulador de respuesta bacteriana con una . novela de di-guanilato ciclasa de dominio de salida Genes Dev. 18: 715-727.

Agradecimientos
Damos las gracias al P. Watnick, Yildiz F., Belitsky B., Merrell D. y S. Butler, til para los debates, K. Kierek para obtener ayuda con la microscopa confocal, y M. Fisher para la secuenciacin de MTN 5lacZ inserciones. Damos las gracias a A. Sonenshein para la lectura crtica del manuscrito. Este material est basado en trabajo apoyado en una NSF Graduate Research Fellowship de ADT Esta investigacin fue financiada por el NIH subvencin AI45746 de AC y el Centro de Gastroenterologa de investigacin sobre los procesos de absorcin y de secrecin, NEMC (P30 DK34928).

Material complementario
El siguiente material est disponible en http://www.blackwellpublishing.com/products/journals/suppmat/mmi/mmi4155/mmi4155sm.htm Apndice S1. Plsmido construccin y la tensin y sus seis Immunoblotting. Tabla A1. Secuencias de oligonucletidos utilizados en este estudio.