Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Imunologia
2. Gerao da diversidade nos linfcitos T e B
Resumo da aula terica: 14 de Fevereiro de 2008

Como que possvel obter uma diversidade em termos de protenas que excede em muitas ordens de grandeza o nmero de genes do genoma humano?

Trata-se de um processo que est na base da produo de molculas que, alm de terem uma sequncia constante de aminocidos, tem zonas variveis, isto , um anticorpo A e um anticorpo B tm regies constantes, que so iguais, e regies variveis, diferentes entre si, o que permite que reajam contra antignios diferentes.

As molculas formadas por este processo so os receptores dos linfcitos, das clulas B e das clulas T o processo conservado em duas linhagens e, na ausncia deste processo no existe nem uma nem outra. Seres humanos com mutaes nos componentes essenciais para catalisar este processo, no tm linfcitos.

A primeira coisa a ter em ateno que estas protenas so sempre heterodmeros duas cadeias diferentes que tm de heterodimerizar. No caso do TCR, h duas hipteses: ou . No h outro tipo de combinaes. Com base no genoma, h produo de 4 cadeias, mas cada uma delas s tem capacidade de heterodimerizar com outra, associando-se por ligaes dissulfito para formar as combinaes ou . Os homodmeros no so funcionais, no so estveis e no chegam superfcie da clula. Do mesmo modo, o BCR tambm constitudo por duas cadeias diferentes: cadeias pesadas e cadeias leves.

TCR T cell receptor

Podem ser ou . No caso da linhagem , que a dominante, tanto nos humanos como em modelos animais, o TCR tem uma cadeia e outra , estabilizadas por uma ponte dissulfito. Existe um local de ligao ao antignio, mais distal em relao membrana onde o receptor se encontra, mais exposto poro vermelha, que a varivel, capaz de reconhecer um antignio especfico. Tem tambm uma parte constante, com uma sequncia normal de aminocidos, sem caractersticas especiais.

BCR B cell receptor

Quando secretado, designa-se anticorpo. Tem duas cadeias, a pesada, com 4 domnios globulares, e a leve, com apenas 2. H um eixo de simetria e a estrutura duplicada. Na realidade esto presentes 4 cadeias, mas elas so exactamente iguais duas a duas, continuando a designar-se heterodmero. Quando ocorre transcrio e traduo, as cadeias esto prontas para serem emparelhadas: duas protenas iguais de cadeia pesada homodimerizam e depois as duas cadeias leves dimerizam na parte mais exterior da molcula. O anticorpo muitas vezes representado com uma forma de Y pois a forma tridimensional que a molcula tem, de facto.

Uma distino entre o receptor das clulas T e B, que neste caso h 2 locais de ligao ao antignio cada brao do Y permite ligar-se ao antignio. De resto o mesmo tipo de molcula, com uma poro normal, constante, e outra mais especial, a varivel.

O que acontece com a zona varivel que, se analisando a sua sequncia de aminocidos, existem pontos de grande variabilidade que so exactamente os locais de ligao ao antignio. Toda a restante estrutura o que d forma molcula e no to necessrio introduzir variabilidade nessas regies. Estas zonas especiais de ligao chamam-se CDRs complementary determining regions.

Gerao da diversidade nos linfcitos T e B

Se o nmero de genes menor que 105, como que possvel obter 10 12 VRMs para reconhecer toda a diversidade de molculas antignicas se o splicing insuficiente? O problema que se debatia era: o nosso genoma, que finito, no tem a capacidade de conter uma quantidade suficiente de DNA correspondente a mais de 1012 genesso necessrias zonas intergnicas, de regulao, etc. Em vez de ter cada anticorpo diferente estar codificado no genoma como um gene singular, e nesse caso, o genoma teria de ter 1012 genes, existem pedaos de DNA, segmento gnicos num locus gentico. Em ltima anlise, h fragmentos contidos num gene que do origem a uma protena, um anticorpo, mas no organizados num gene normal com enhancer, promotores, etc. O exemplo a cadeia pesada do anticorpo, ou do BCR. Em vez de se ter todos os genes para todos os anticorpos diferentes, tem-se pedaos de informao, que no so lidos como tal porque no tm estrutura de gene - no h um promotor que indique onde se deve iniciar a leitura, etc, isto , no tem uma estrutura que permita a transcrio pela RNA polimerase e originar um mRNA que esteja capaz de exercer a sua funo. Alm disso, esta informao est espalhada por mais de 100 kbp - um gene, mesmo com grandes segmentos intrnicos nunca chega tal espaamento entre exes. Portanto, no genoma da linha germinativa, espermatozides e vulos, no h genes funcionais para BCR nem TCR no herdamos dos nossos pais e mes a sequncia dos nossos anticorpos. Ns temos a mesmo sequncia de genes normais,

fundamentais, mas no a dos BCRs e TCRs porque no temos a capacidade de herdar da nossa me ou pai sequncias codificantes de 1012 anticorpos diferentes. O que herdado o mecanismo que vai permitir formar as tais 1012 molculas diferentes, porque este um mecanismo enzimtico, cujas enzimas esto codificadas em genes normais, esses sim, iguais aos dos nossos pais. O que especial nos linfcitos no so os genes que do origem aos receptores mas o mecanismos que permite construir esses mesmos genes. O vulo e o espermatozide tm genes para os BCR e TCR partidos aos pedaos que no originam nenhuma protena funcional, at porque as nicas clulas que expressam BCR so as clulas B e as que expressam TCR so as T, porque so as nicas a possuir estes genes funcionais, que tm o mecanismo necessrio para os tornar funcionais.

A questo que se pe : como combinar estes segmentos gnicos?

O gene funcional ser, por exemplo, para um anticorpo, um segmento cor-derosa, combinado com um o azul do meio, e com o amarelo. Quando estes 3 pedaos se juntarem, ento a especificidade vai ser para um antignio de salmonela, por exemplo. Se em vez do cor-de-rosa, for o preto a juntar-se aos mesmos 2, como a sequncia de aminocidos diferente, o anticorpo vai interagir com um outro antignio, e assim por diante. Portanto, estas diferentes sequncias de DNA vo combinar-se e dar origem um gene o gene a unio dos pedaos certos, com uma estrutura de gene tpica, que pode ser transcrito e traduzido numa certa sequncia peptdica com especificidade par um antignio. Esta a zona varivel.

Sabendo que existem zonas variveis e zonas constantes, fizeram-se experincias usando 2 sondas de DNA para fazer um Southern blot: Digesto do DNA com enzimas de restrio Electroforese com migrao dependente de tamanho e carga Hibridao com sonda Uma sonda hibridava na zona constante e outra na zona varivel. Sendo que as sequncias constante e varivel eram as mesmas na clula B e na germinativa, colocava-se a questo de como que estas se juntavam, se justapunham.

 No DNA da germline, ou de outras que derivam directamente dela, a sonda para a regio constante, igual em todos os anticorpos, hibridava com uma zona do gel e a sonda para a regio varivel, a especfica para cada tipo de anticorpo estava noutra zona do gel. Isto significa que cada sonda hbrida com diferentes fragmentos de DNA as regies varivel e constante esto separadas por vrios bp. No DNA retirado de um linfcito B (um dos tipos de clula especial em que ocorre este processo), as sondas passavam a hibridar com um mesmo fragmento. As zonas constante e varivel esto ento num mesmo fragmento, estando justapostas no genoma. Em clulas B e T, as zonas que se sabiam estar muito distantes uma da outra, esto agora no mesmo fragmento. O que aconteceu entre a clula normal e o linfcito B que a estrutura do DNA modificou-se de modo a que dois fragmentos distintos, da zona constante e a varivel, se encontrem agora justapostas. A nica forma de elas estarem no mesmo fragmento ter que o DNA tenha sido alterado. As clulas B e as T tm a uma capacidade que outras clulas no tm: conseguem juntar duas regies de DNA RECOMBINAO SOMTICA/REARRANJO VDJ. Noutras quaisquer clulas, o DNA sempre igual, estvel, h mecanismos de proteco do DNA para que este seja imutvel. As clulas B e T tm a necessidade de modificar o seu DNA, para passar a expressar o seu receptor especfico e assim se diferenciarem. O nico modo de o fazerem alterar o seu DNA com corte e costura para que fragmentos que esto distncia fiquem justapostos formando-se assim um gene funcional codificante do receptor. O que acontece que vo ser juntos segmentos gnicos distribudos ao longo do genoma. Os pedaos esto organizados ao longo de 3 grandes zonas: V de varivel, a zona mais varivel do gene D de diversidade, uma diversidade adicional J de juno, so os segmentos que juntam aquele bloco com a zona constante Os fragmentos so juntos por uma ordem: primeiro juntam-se D e J e s depois vem D. H ento, basicamente, 3 blocos que um gene funcional tem de conter tem de haver um representante de cada um dos blocos. S assim se obtm uma protena com uma forma que lhe permita

ser um anticorpo. Na ausncia de algum destes componentes, j no se obtm um anticorpo, a molcula colapsa e no exerce a sua funo. Para ter uma sequncia final, necessrio ter os elementos que constituem um gene. Os locus so altamente instveis enquanto se faz o rearranjo mas, terminado este processo, o locus fecha. Este ento um processo irreversvel que marca a aquisio de especificidade pela clula, para um antignio, e esta est pronta para ser uma clula B ou uma clula T. Todos os mecanismos que protegem o DNA da clula vo tambm actuar sobre este gene uma vez formado e funcional.

RAG Recombination activated gene

A recombinao somtica necessita que hajam cortes no DNA, sendo estas reaces catalisadas por enzimas. As clulas humanas no possuem enzimas de restrio estas apenas existem nas bactrias como um modo de defesa contra os patognios, mas possuem uma endonuclease capaz de cortar DNA para este processo em particular. Essa endonuclease a RAG recombination activated gene. Na realidade, existem duas enzimas RAG 1 e RAG 2, que funcionam como um complexo, que catalisa a recombinao somtica. Ratinhos gerados sem RAG no conseguem formar clulas B nem T. Da mesma forma, humanos com mutaes em RAG so desprovidos de clulas B e T. A nica forma de garantir que este processo seja especfico dos linfcitos fazer com que esta enzima seja expressa apenas nas clulas B e T: as RAG so, portanto, especficas dos linfcitos T e B, ou dos seus precursores na medula ssea apenas. Nas outras clulas, o locus da RAG est completamente fechado sobre si prprio, sem qualquer acessibilidade, no expresso de todo.

A expresso da RAG modulada muito precisamente, at mesmo nas clulas B e T, onde s est activo durante a formao dos receptores. Se continuasse activa, haveria retrocesso da recombinao e danos no DNA. Uma vez o receptor formado, a RAG desaparece: o receptor formado, quando chega superfcie, envia um sinal para o ncleo para indicar que est funcional e esta deixa de ser expressa assim que os linfcitos esto formados. Tem uma vida curta mas essencial para a formao de linfcitos funcionais, com especificidade. Antes da aco da RAG, no existem genes funcionais, isto porque no h uma estrutura organizada com promotor, enhancer, sequncia sinal que indique o destino da protena, etc. Estes elementos esto separados por sequncias de muitos bp. Tem de haver uma estrutura que permita que todos os cofactores necessrios transcrio eficaz sejam recrutados e se localizem de forma a realizar a sua aco, e esta estrutura conseguida com a recombinao somtica. Mesmo se houver uma transcrio basal dos segmentos no reorganizados, o transcrito no tem significado, no pode ser traduzido numa protena funcional. A protena final, funcional, s se obtm com este rearranjo que torna segmentos gnicos no funcionais num gene funcional. Cada clula B e T utiliza este processo para criar um receptor que a caracteriza pela especificidade para um qualquer antignio da diversidade que exista na natureza. Pode-se dizer que cada linfcito tem um genoma modificado o que mudou foi o seu locus gentico para o receptor, graas aco da RAG que o tornou um gene funcional.

Quais as implicaes deste processo?

um processo necessrio para gerar clulas B e T. A RAG, como qualquer enzima, reconhece sequncias especficas, apenas cliva o genoma nos locais do V, D e J, onde a sua actividade til para seleccionar os segmentos teis para formar o anticorpo, por exemplo. Tem de haver uma proteco do genoma em geral e uma susceptibilidade apenas dos genes em que a RAG tem de actuar: BCR se a clula for uma clula B em potncia ou TCR se a clula for uma clula T em potncia. Portanto, o que acontece que, nesses locus genticos, nos receptores das clulas B e T, os fragmentos vo ser sinalizados com sequncias especficas que indicam os locais de aco da RAG. Estas sequncias especficas para a RAG designam-se RSS recombinational signal sequences. Nada deixado ao acaso neste processo: A recombinao apenas ocorrer nos genes em que suposto ocorrer.

Sndrome de Omenn
Quando os genes RAG esto ausentes ou mutados, surge a Sndroma de Omenn. Esta sindroma caracterizada pela ausncia de RAG funcional: as enzimas no esto funcionais e por isso no catalisam a recombinao somtica e originam linfcitos.

Caso Clnico: A criana foi internada porque ao 1 ms de idade, exibindo sintomas de inflamao e de infeco: tinha pus muito abundante nos olhos, nos ouvidos, que foi analisado e que mostrou haver uma infeco por Candida albicans e Staphylococcus aureus, infeces essas que no sero muito graves se o sistema imunitrio estiver eficaz, mas, naquele caso, estavam a causar complicaes muito graves como dificuldade em respirar, etc. A criana era filha de primos direitos, e isto importante dado que a doena recessiva, s se manifesta em homozigotia - a probabilidade de a doena se manifestar aumenta quando os projenitores tm laos familiares. Fizeram-se anlises sanguneas e estas mostraram que, dos seus glbulos brancos, apenas 6% eram linfcitos, tratando-se linfcitos T, em oposio aos normais 50%. Os nveis de anticorpos, principalmente os IgG, essenciais a uma boa resposta imunitria, estavam muitssimo baixos. Visto que os linfcitos B estavam praticamente ausentes, os anticorpos em circulao teriam sido herdados da me. Portanto, a criana no teria imunidade celular e humoral eficaz. Estando ambas as linhagens B e T afectadas, pode suspeitar-se que a deficincia seja num processo comum a ambas as linhagens, como o da recombinao somtica. Fez-se ento um ensaio enzimtico para a RAG (in vitro, adiciona-se DNA com RSS enzima RAG retirada de clulas da criana e regista-se a actividade enzimtica) que indicou que a actividade desta enzima era apenas de 20%. A sequenciao do gene RAG revelou uma mutao missense na sequncia da RAG 1, que provocava a destabilizao do complexo e diminuio da funo. Esta doena rapidamente fatal, pois a criana fica incapaz de resistir a infeces mais graves. O nico tratamento disponvel o transplante de medula ssea, desde que se encontre um dador compatvel. Um transplante de medula ssea permite transferir clulas estaminais hematopoiticas que vo repovoar a medula ssea. As clulas estaminais transferidas do dador tero a enzima RAG funcional, podendo assim originar-se linfcitos B e T normais.

Outros mecanismos de gerao de diversidade

Com a recombinao somtica, formam-se muitas combinaes diferentes que conferem a diversidade resposta imunitria, mas os fragmentos gnicos nos locus dos receptores das clulas B e T so apenas suficientes para assegurar 106 molculas diferentes. O mecanismo que permite amplificar esta diversidade reside na insero aleatria de nucletidos nos locais de juno dos segmentos gnicos recombinados somaticamente, nos locais

de ligao ao antignio. Assim, a afinidade do anticorpo para um antignio vai ser diferente. Novamente, para que este processo seja especfico das clulas B e T, apenas estas clulas vo expressar a enzima TdT terminal deoxynucleotide transferase cuja funo inserir nucletidos aleatoriamente entre os fragmentos recombinados no rearranjo VDJ.

A gerao de diversidade destas molculas resulta da recombinao dos fragmentos que esto espalhados nos locus genticos (que permitem 106 combinaes diferentes) e ainda da multiplicidade de fragmentos que so adicionados aleatoriamente pela TdT entre os segmentos gnicos, conseguindo-se assim obter uma diversidade de 1012 diferentes combinaes, prontas a reconhecer os muitos antignios.