SECUENCIACION MASSIVA: UN NUEVO DGP?

Santiago Munn, Ph.D.

Reprogenetics Laboratories US: Livingston (NJ), Los Angeles (CA), Chicago (IL), Portland (OR), Boca Raton (FL) / Europe: Barcelona (Spain), Oxford (UK), Hamburg (Germany) / Asia: Kobe (Japan), Macao, Abu Dhabi (UAE) / Latin America: Lima (Peru), Buenos Aires (Argentina), Sao Paulo (Brazil), DF (Mexico)

Porque DGP?

Las anomalas cromosmicas la mayora de las perdida de implantacin

100% 90% 80%

70%
60%

50%
40% 30% 20% 10% 0% <35 35-37 38-40 41-42

% euploid no imp % euploid implan % aneuploid

Datos de Reprogenetics : 96 centros, >3500 ciclos, >19,000 blastocistos analyzados por aCGH hasta 9/2013

Las anomalas cromosmicas la mayora de las perdida de implantacin

90%

100%

80%
70% 60% 50% euploid implant euploid: ??? euploid: mtDNA aneuploid

40%
30% 20% 10% 0% <35 35-37 38-40 41-42

Datos de Reprogenetics : 96 centros, >3500 ciclos, >19,000 blastocistos analyzados por aCGH hasta 9/2013

La hiptesis del DGP - correcta

El 50% de blastocistos son aneuploides La implantacin decrece con la edad materna y la aneuploidia El error del DGP con CCS* es bajo (<2%) La biopsia de blastocisto no daa Por tanto el DGP con CCS y biopsia de blastocisto:
Doblar la tasa de Implantacin Eliminar el efecto de la edad materna
* CCS: complete chromosome screening con aCGH, qPCR, SNP array o NGS

CUANDO BIOPSIAR?

Estado biopsia: Antes de arrays

30% anormalidades postmeiotic indetectable Triple nmero de clulas a analizar vs. blastocistos

30%a to 60%b prdida de posible implantacin

Centros no competentes en cultivo de blastocistos hasta hace poco

DGP puede compensar el dao pero no alcanza su potencial

Clnicamente aplicable en 2005 c

Primer resultado positivo en 2010 d

Scott et al (2013), b Mastenbroek et al. (2007), c McArthur et al. (2005), d Schoolcraft et al. (2010)

Efecto de la biopsia en da 3 y biopsia de blastocisto

estado segmentacin blastocisto biopsia no biopsia no Tasa de implantacin 31% 53% 52% N.S. 54%

P<0.05 (42% reduccin)

pero la biopsia es un procedimiento operador dependiente y sus efectos puedes variar

Scott et al. (2013) Fertil Steril, in press Patients randomized to cleavage of blastocyst biopsy. Two best embryos randomized 1 to biopsy and 1 to no biopsy, both replaced. Biopsied embryos fingerprinted and compared with the fetus.

Biopsia de blastocisto: ventajas

ventajas: Mas ADN: menos sin resultados Menos mosaicismo = menos errores Reduce el impacto de la biopsia Menos embriones a biopsiar

Facilita SET

Desventajas: No todos los embriones llegan a blasto el mismo dia

Correlacin entre MCI y trofectodermo

MCI y el TE se correlacionaron en el 97% (31/32) de los embriones. 97.5% (39/40) de los Blastocistos diagnosticados con aCGH como anormales se confirmaron por FISH como anormales (b).
(a) Capalbo et al. (2013) in press, (b) Colls et al. (2013) ASRM

PGD v.2:
Todos los chromosomas analizados
Biopsia de blastocisto

Ventajas del aCGH

Detecta todas las aneuploidias cromosmicas y translocaciones. Resultados en <16 horas: permite biopsiar a da 5 y transferir a da 6, 10am No se necesita ADN de los padres

ICSI no necesario.

46,XY

46,XX+7-10

Validacin de aCGH: Embriones de da 5

Reanalysis method Fragouli et al 2011 Capalbo et al. 2013 Colls et al. 2013 Wells et al. 2013 FISH, aCGH FISH FISH, aCGH Next Gen. Sequencing Confirmed Confirmed Euploid abnormal 23/25 19/20 7/7 17/17 27/27 50/50 39/40 23/23 TOTAL 50/52 69/70 46/47 40/40

Total 96% 99% 1.9% Sensitiv. the Especif. Error 11% of embryos were mosaic, explaining 2.4% error rate
Fragouli et al. (2011) Hum. Reprod. 26: 480-90, Colls et al. (2013) ASRM P-168, Capalbo et al. (2013) Hum Reprod, in press, Wells et al. (2013) ASRM O-435

Anomalas cromosmicas detectadas con aCGH

Aneuploidia se incrementa con la edad pero no con el numero de embriones

% Euploides
# de OvoDon blastocistos 1-3 65% <35 aos 63% 35-37 aos 50% 38-40 aos 40% 41-42 aos 22% >42 aos 14%

4-6
7-10 >7-10

60%
64% 65%

61%
62% 64%

52%
53% 56%

39%
39% 43%

27%
25% 29%

17%
16% 16%

N = 3,571 ciclos y 19,356 embriones, hasta 8/2013. Ata, Munne et al. (2012) Reprod Biomed Online y datos no publicados de Reprogenetics

Pronostico dependiendo de la edad materna y nmero de embriones

% de pacientes con embriones euploides
# de blastocistos OvoDon <35 aos 35-37 aos 38-40 aos 41-42 aos >42 aos

1-3
4-6 7-10 >7-10

86%
95% 100% 100%

85%
97% 99% 100%

72%
95% 96% 98%

60%
88% 92% 98%

58%
69% 85% 92%

24%
54% 65% 83%

N = 3,571 ciclos y 19,356 embriones, hasta 8/2013. Ata, Munne et al. (2012) Reprod Biomed Online y datos no publicados de Reprogenetics

Resultados clnicos

1er estudio Clnico Randomizado: CGH + congelacin

ciclos edad Prev. mat. ciclos CGH : 45 37.7 2.4 Embriones implantacin transferidos 2.0 72%

control : 113

37.1

1.2

2.7

46% p=0.0003

Schoolcraft et al. (2010) Fertil. Steril. 94:1700

2o estudio Clnico Randomizado: biopsia a da 5, transfer a da 6, jovenes

pacientes edad Da trasferencia transferidos Tasa embarazo Embarazo a termino mltiples

Control 48 <35 Day 6 48 (1) 45.8% 41.7%

0

PGS 55 <35 Day 6 55 (1) 70.9% 69.1%

0

P<0.05 P<0.05

Yang et al. (2012) Molec Reprod

3r estudio Clnico Randomizado: transfer a da 6 + qPCR

Buenas respondedoras (promedio 8 blastocistos) Biopsia da 5, transferencia a da 6

edad N blastocistos

PGD 32.2 72 8

Control 32.2 83 7.9

Emb transferidos implantacin Implant. a termino Embarazos a termino

1.9 79.8% 66.4% 84.7%

2.0 63.2% 47.9% 67.5%

P=0.002 P=0.03

P=0.01

Scott et al., 2013 Fertil Steril.

4o estudio Clnico Randomizado: 1 euploide vs 2 no analizados

Tasa de embarazo

1 blastocisto euploide Transfer fresco Transfer congelado 65%

2 blastocistos no analizados 70% NS

55%

52%

NS

Forman et al. (2013) Fertil Steril

Array CGH con biopsia a da 5: Resultados de 20 centros experimentados

total
Centros con biopsia blastocisto Ciclos incluidos Edad materna Embriones biopsiados Embriones transferidos Tasa de implantacion Embarazos / ciclo Embarazos/ transfer A termino / ciclo A termino/ transfer. 96 3571 35.4 5.6 1.1 51% 49% 71% 45% 64%

variacin
11 - 522 34.7 - 38.6 4.5 - 8.4 0.8 - 1.4 35 - 79% 28 - 72% 49 - 90% 26 - 65% 43 - 86%

Reprogenetics data to 8/2013

El efecto de la edad materna en la implantacin desaparece con aCGH

Los arrays eliminan el efecto de la edad materna en la tasa de implantacin

60%
50% implnatacion 40% 30% 20% 10% 0% <35 35-37 39-40 41-42 >42
n/a No PGS * SART blastocyst PGS (aCGH) **

Edad materna
* SART 2011 ** Harton, Munn et al. (2013) Fertil Steril. And unpublished data to 8/2013. N >800 blast biopsies

Aborto espontaneo despus de DGP

Comparado a no DGP (SART): 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% SART This study Comparado a otros DGPs:
Embara edad zos Harton et al. 2013
Scott et al. 2013

% aborto 7.5%
8.3%

307
72

34.9
32.2

<35

35-37 38-40 41-42

Harton et al. (2013) Fertil Steril, + datos no publicados, Reprogenetics

Con DGP se mantiene con la edad la tasa de embarazo / transfer

80%

70%
60% 50% 40% 30% 20% 10%

0%
<35 OPR/ transfer 35-37 38-40 41-42 no transfer OPR/ cycle

Harton, Grifo, Munne, Wells et al. (2013) Fertil Steril, + datos de Reprogenetics N >800 ciclos

PGD v3: Secuenciacin masiva (NGS)

Un genoma por $1000

1000$ *
2014

* Solo incluye reactivos

Diferencias entre mtodos para PGD de enfermedades hereditarias

PCR PCR + aCGH si si si si no 0 SNP Next Gen arrays* Sequencing si si no no si 0 si si si no no 1*

Detecta aneuploidia Detecta defectos gnicos Detecta errores mitticos >2 meses de preparacin Requiere un familiar afecto # genomas / run
* Karyomapping using BlueGnome ** with NextSeq

no si no si no 0

SEQUENCIACION DE SIGUIENTE GENERACION (NGS)

Fragmentacin Cada regin del genoma secuenciado mltiples veces

GTACCATAGGATACGACTTGCAGCGGCA

ATATTGCGTATA

CAGCGGCAGATGATTCGGGGATATTG Se producen millones de secuencias cortas AGGATACGACTTGCAGCGGCAGATGATT TGCGTATAGG Las secuencias se comparan a la secuencia CAGATGATTCGGGGATATTGCGTA general conocida ACCATAGGATACGACTTGCAGCGGC TAGAGTACCATAGGATACGACTTGCAACGGCAGATGATTCGGGGATATTGCGTATAGGCTA Secuencia conocida (gen Fibrosis Quistica del cromosoma 7) Detecta mutaciones y la cantidad de DNA facilitando el diagnostico de aneuploidia

Plataformas usadas en DGP

Ion torrent (ThermoFisher): PGM Proton

Illumina: MiSeq NextSeq HiSeq Complete genomics (BGI)

Diferentes rendiminetos para diferentes necesidades

muestras / run *

Genoma Exoma NIPT Screening portadores PGS

1 6-12 16-20 24-96 96

El analysis de cromosomas requiere mucho menor rendimiento (output)

* using NextSeq, x30 coverage, 120 Gb

Codigo de barras (barcoding)

El precio se reduce si se usan codigos de barras:
Embrin 1 Embrin 2 Embrin 3 Aadir cdigo Mezclar muestras secuenciar
AAGG CAGATGATTCGTGGATATTGCGTA

CCTT

CAGATGATTCGTGGATATTGCGTA

GTAC

CAGATGATTCGGGGATATTGCGTA AAGGCAGATGATTCGTGGATATTGCGTA

CCTTCAGATGATTCGTGGATATTGCGTA
GTACCAGATGATTCGGGGATATTGCGTA GTAC

Slide adapted from D. Wells

Codigo de barras (barcoding): Mas muestras, menos secuencia

muestras / run Genoma PGS * 1 16- 96

genoma secuenciado 100% 10%

profundidad de secuenciacin x 30 x1 to x3

Wells, Kaur, Rico, Grifo, Anderson, Sherlock, Taylor, Munne (2013) ESHRE, Yin et al (2013) Biol Reprod 88, 69 * Output: MiSeq = PGM << NextSeq

PGS con SNG: Mtodo

Amplificacin de una muestra de todo el genoma Preparacin de la Librera: Fragmentar DNA Aadir adaptadores y cdigos de barra (16) Secuenciar

D Wells, KKaur, A Rico, J Grifo, S Anderson, J Sherlock, JC Taylor , S Munne (submitted) Rapid genetic analysis of single cells using a next generation sequencing methodology: application to human embryos reveals aneuploidy and DNA sequence mutations

Validacin de NGS para DGP

Reanalizamos a ciegas 40 blastocistos previamente analizados con aCGH :
21/21 euploides 55/56 aneuploides 1 polyploide

1.3% de disconcordancia

Primer bebe nacido con DPG-NGS

Primer bebe NGS: David Levy

Una colaboration de Reprogenetics-US, Reprogenetics-UK (Dagan Wells) y Main Line Fertility (Dr. Glassner)

Cantidad de mtDNA y edad materna

La cantidad de mtDNA aumenta con la edad de la mujer (P= 0.0067) El aumento es tanto para embriones euploides como aneuploides

Edad materna

Cantidad de mtDNA e implantacin

Se ha detectado un umbral en la cantidad de mtDNA por encima del cual no hay implantacin 100% de los embriones por encima de este umbral, no implantan 25% de los embriones que no implantan contienen altos niveles de mtDNA

Implantation

No Implantation

Secuenciacin masiva: conclusiones

Ventajas actuales: -Misma resolucin que aCGH para el analisis cromosmico -Permite la cuantificacin del mtDNA -Permite la deteccin simultanea de anomalas cromosmicas y genticas (si previamente conocidas) Ventajas potenciales: -PGD por secuenciacin completa

Que ventajas tendra la secuenciacin completa en PGD?

Con las plataformas actuales de NGS (ion torrent PGM, MiSeq) y <10% secuenciado se pueden analizar simultaneamente anomalias cromosmicas, mitocondriales, y gnicas (con screening previo de los padres). Que ventajas tiene secuenciar todo el genoma embrionario? La edad paterna esta ligada a un aumento en las mutaciones de novo (Kong et al. 2012, Nature) explicando la epidemia de autismo actual

Primera secuenciacin completa de biopsias de embrin

Se analizaron >20 biopsias de blastocisto Plataforma: Complete Genomics Se secuenci un 97% del genoma (<10% con PGM) Un promedio de 20 genes funcionales estaban afectados por embrin pero solo 1/20 eran genes con funcin conocida. PROBLEMA: DEMASIADA INFORMACION Se encontraron 3000 variaciones de novo por embrin, con solo 30 de ellas con efectos negativos conocidos
Pieters et al., Complete Genomics and Reprogenetics, unpublished

Demasiada informacin?
Mi papa dice que nos espias No es tu papa

Reprogenetics
Scientists Jacques Cohen, PhD (US) Santiago Munne, PhD (US) Dagan Wells, PhD (UK) Renata Prates (US) Samer Alfarawati (UK) Souraya Jaroudi (UAE) Tomas Escudero (US) Mireia Sandalinas, PhD (Spain) Luis Guzman, PhD (Peru) J. Horcajadas, PhD (Latin Am.) M. Konstantinidis, PhD (US) NNeka Goodall (US) Allen Kung (US) Lia Ribustello (US) Lab & Medical Directors Pere Colls, PhD (US) Carles Gimenez, PhD (Spain) Elpida Fragouli, PhD (UK) Karsten Held, MD (Germany) Tetsuo Otani, MD (Japan) Muriel Roche, PhD (Japan) Braulio Peramo, MD (UAE) Ahmed Yesilyurt, MD (Turkey) Xuezhong Zeng, MD (China) Francisco Rocha (Mexico) Embryologists Kelly Ketterson Catherine Welch Tim Schimmel

Genetic Councilors Jill Fischer Amy Jordan Erin Mills G. Manassero, MD

munne@reprogenetics.com www.reprogenetics.com