UNIVERSIDAD NACIONAL DE SANTIAGO DEL ESTERO FACULTAD DE AGRONOMIA Y AGROINDUSTRIAS CATEDRA DE MICROBIOLOGIA GENERAL AO: 2011

INTRODUCCIN AL MICROSCOPIO
El microscopio es un instrumento que permite observar organismos y estructuras que son invisibles a simple vista. El ojo humano no puede percibir objetos con un di metro in!erior a 0"# mm $0"2%0"# mm" dependiendo del ojo del observador& y de ah' que a los microorganismos se los conoci( con la invenci(n del microscopio. )eg*n el principio en que se !unda la ampliaci(n de la imagen" los microscopios pueden ser pticos" o electrnicos. +ara la mayor parte del trabajo de rutina se utili,a el microscopio (ptico y con !ines de investigaci(n" sobre todo para estudiar la estructura celular" se emplea el microscopio electr(nico. Este trabajo pr ctico se limita al uso del microscopio (ptico y solo se hace una breve re!erencia al microscopio electr(nico. MICROSCOPIO PTICO -onsiste en una combinaci(n de lentes para conseguir im genes aumentadas de objetos diminutos. +ueden ser simples o compuestos. .os microscopios simples son conocidos como lupas" compuestos por una lente sencilla montada sobre un arma,(n por lo general graduable" da una imagen virtual" derecha y aumentada" sirve para aumentos d/biles. .os microscopios compuestos (Fi ur! "& tienen dos lentes0 conocidos como objetivo" situado cerca del objeto a observar y ocular que est colocado cerca del ojo humano. -onsta de: !# Parte mecnica: pie y columna o bra,o. El bra,o consta de: platina" rev(lver porta objetivo" cabe,al mono o binocular" sistema de en!oque macro y microm/trico. 1 Pie: sirve de base al aparato y se une en su parte posterior a la columna que sostiene la platina y el tubo. 1 Column! o bra,o es un v stago generalmente articulado al pie y sirve para sostener el tubo. 1 Tu$o% sostiene el sistema de (ptica y tiene en su e2tremo superior el ocular y e2tremo in!erior el objetivo. +uede tener uno o dos oculares" siendo de ese modo llamados microscopios mono o binoculares" respectivamente 1 Re&l&er: se halla en el e2tremo in!erior del tubo y consiste en una placa giratoria que sostiene los objetivos de distintos aumentos. 1 Pl!tin!: placa hori,ontal que posee un ori!icio central" sobre el cual se coloca el preparado que es sujetado por un par de pin,as. .a platina puede ser !ija o movible. El movimiento hori,ontal puede provocarse por dos tornillos laterales haciendo que la platina se desplace en todo sentido para e2aminar el preparado. Algunos modelos" destinados a e2 menes de preparaciones en toda su e2tensi(n pueden tener los verniers-lineales que !acilitan precisar un punto de la preparaci(n que nos interesa. 1 Tornillos m!cro ' microm(trico: son dos tornillos utili,ados para e!ectuar el en!oque del preparado. El macrom/trico reali,a un en!oque r pido y el microm/trico un en!oque de precisi(n. b) Sistema de iluminacin: El sistema de iluminaci(n de un microscopio (ptico es de considerable importancia. .a lu, que entra en el sistema debe en!ocarse sobre el preparado y para esto se usa un sistema de lentes llamado condensador $3igura 4&. Con)ens!)or: sistema de lentes situado debajo de la platina que concentra los rayos luminosos sobre el objeto. Di!*r! m! iris: se halla debajo de la platina entre la !uente y el condensador. 5egula la lu," sirve para graduar la cantidad de rayos que llega al objeto. Filtros )e lu+: son vidrios coloreados" destinado a pasar las radiaciones de onda que conviene utili,ar. C) Sistema ptico de ampliacin Ocul!r: es el juego de lentes m s pr(2imo al ojo del observador y est destinado a recoger la imagen dada por el objetivo" siendo el primero en ampliar la imagen real del objeto que !orma el objetivo. 6ambi/n pueden re!lejar ret'culos" escalas que se coloquen en el ocular $ocular microm/trico&. O$,eti&o: est compuesto por un sistema centrado de lentes convergentes. Es la lente de mayor importancia pues de sus propiedades depende que se consiga o se !rustre la imagen !inal. )e lo describe en el siguiente punto.
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Lente O$,eti&o .as !unciones principales del objetivo son: a& 5eunir los rayos luminosos de cualquier punto del objeto. b& -oncentrar la lu, en un punto de la imagen. c& Ampliar la imagen )e distinguen dos tipos de objetivos: - )ecos .os secos son los que se usan de tal manera que queda aire entre la preparaci(n y la lente del objetivo $#7" 10 7" 8# 7& y en general son llamados aumentos d/biles o medianos. %9nmersi(n los que se usan colocando un l'quido de 'ndice de re!racci(n mayor que el del aire entre el preparado y el objetivo" este l'quido puede ser aceite de cedro $cuyo 'ndice de re!racci(n es similar al del vidrio& o cualquier otro aceite adecuado". )us aumentos var'an entre :0 7 y 100 7. L.mite )e resolucin- Apertur! Num(ric! El ojo humano no puede distinguir con !acilidad dos puntos separados entre s' por menos de 0"# mm. El L.mite )e resolucin $E& de un microscopio es la menor distancia entre dos puntos adyacentes que permite observarlos como entidades distintas y separadas. )i tenemos dos puntos separados por una distancia $d&" a medida que disminuye el lmite de resolucin E " disminuye la distancia ) y aumenta el poder de resoluci(n" esto es" aumenta la capacidad del microscopio para distinguir dos puntos separados por una distancia muy peque;a. El m 2imo l'mite de resoluci(n de microscopio (ptico: es 0"2 m < 200nm< 2000A es de 0"1= microm/tricos El L.mite )e resolucin $E& est determinado por la longitud de onda de la lu, que se ilumina al objeto y por una cualidad de la lente objetivo que se conoce como !pertur! num(ric! (AN#. Esta relaci(n se e2presa por la siguiente !ormula: E Longitud de onda Apertura numrica .a apertura num/rica $A>& es una medida de la capacidad de captar lu, por parte de una lente. Apertura numrica (A>)= n sen . sen < seno del semi ngulo de apertura de incidencia de los rayos de lu, $3igura 2& n < 'ndice de re!racci(n del medio entre la lente !rontal del objetivo y el portaobjeto .a apertura num/rica de un objetivo de inmersi(n de alta calidad es de 1"2%1"8 El 'ndice de re!racci(n del medio situado entre el porta o cubreobjeto y la lente !rontal del objetivo ser : para objetivos secos: n < 1"0 para objetivos de inmersi(n donde el medio es el aceite: n < 1"# resoluci(n $E& y el n*mero de tra,os N0mero )e tr!+os o$ser&!$les en " mm 1?0 ##0 1100 1=#0 2000 2#00

T!$l! ". 5elaci(n e2istente entre apertura num/rica $A>&" l'mite de observables en el objeto $en mm& para objetivos secos y de inmersi(n. Tipo )e o$,eti&o Seco De Inmersin AN 0"1 0"4 0"= 0": 1"2 1"8 / (m) #"# 1"?8 0":2 0"=2 0"8= 0"4?

)i la apertura num/rica de los objetivos aumenta" E disminuye y aumenta la posibilidad de ver un mayor n*mero de tra,os en 1 mm del objeto observado (T!$l! "&. Funcin )el !ceite )e inmersin: las lentes !rontales de los objetivos tienen un di metro muy peque;o. -uando los rayos luminosos pasan de un medio $vidrio& a otro $aire& se re!ractan perdi/ndose en ese medio bastante rayos. +ara evitar esto se coloca aceite de inmersi(n" como ya se mencion(" entre el porta objetos y el objetivo de inmersi(n
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permitiendo que los rayos cuando pasan del vidrio al aceite no se dispersen antes de llegar al objetivo logrando as' que ingrese por /ste un gran cono de lu, $3igura 8& Aumento o !mpli*ic!cin )el microscopio% es el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular. Por ejemplo: o jetivo de !" # $ ocular de %&#' la ampli(icacin total es de &!" aumentos. .os objetivos llevan indicados aumento propio@apertura num/rica. +or ejemplo la indicaci(n 100@1"2# signi!ica aumento propio @apertura num/rica. Princip!les tipos )e microscopio ptico En microbiolog'a se emplean varios tipos de microscopios (pticos" siendo los m s importantes (Fi ur! 1#: - Campo claro% el campo microsc(pico o ,ona de observaci(n est intensamente iluminado mientras que los objetos observados aparecen oscuros. Es el de mayor uso en los trabajos de microbiolog'a y a los que responde el microscopio descrito en detalle con anterioridad. -on este microscopio" los objetos se ven por di!erencias de contrastes entre ellos y el medio que los rodea. .as di!erencias de contraste provienen de que las c/lulas absorben o dispersan la lu, en grados variables (Fi ur! 2#. - Contraste de fases (Fi ur! 2#: >o requiere de tinci(n o tratamiento alguno que inter!iera con el metabolismo de los microorganismos. +ermite Ain vivoB observar con !acilidad las inclusiones celulares as' como n*cleos. Es una modi!icaci(n del anterior" que consiste en retardar la lu, mediante un anillo de contraste de !ase situado entre el objetivo y el ocular" con el !in de e2agerar la di!erencia del 'ndice de re!racci(n entre las c/lulas y el medio. .a !uente de lu, es un cono hueco que pasa a trav/s de un dia!ragma anular al condensador. Ce esta manera pueden observarse c/lulas sin te;ir que no podr'an ser percibidas sin tal intensi!icaci(n del contraste. - Campo oscuro (Fi ur! 2#: se reali,a la observaci(n sobre un !ondo oscuro" destac ndose los objetos a observar brillantemente iluminados. Este e!ecto se consigue equipando a un microscopio ordinario con un sistema condensador modi!icado para dirigir la lu, a la preparaci(n desde los lados" de tal modo que s(lo la lu, di!ractada por la preparaci(n pasa al ocular y se hace visible. As' bacterias peque;as se notan con !acilidad por su luminosidad. - De fluorescencia (Fi ur! 3#% permite ver objetos !luorescentes" los cuales irradian rayos visibles cuando reciben lu, de onda ultravioleta. Dtili,ando lu, ultravioleta se logra un ligero aumento resolutivo del microscopio (ptico. Dtili,a la propiedad de algunas sustancias qu'micas de absorber la lu, DE y emitirla como visible $!luorescencia&. Esta t/cnica es ! cil para el e2amen de part'culas !luorescentes o que pueden serlo mediante tinciones especiales $3igura #a&. Mont!,e )el m!teri!l p!r! su o$ser&!cin .a preparaci(n es el objeto a observar. Fay preparaciones en !resco que se utili,an para observar microorganismos vivos y preparaciones !ijadas y tenidas en el que los microorganismos est n muertos" !ijados al portaobjeto y te;idos. Al mismo tiempo se puede distinguir las preparaciones de acuerdo al tiempo de duraci(n en: - )emporarias: montados com*nmente en agua. - *emipermanentes: montados en glicerina y bordeados con para!ina o esmalte de u;as. - Permanentes: Gontados en b lsamo y con deshidrataci(n previa del material. /n*o4ue )el prep!r!)o ". -olocar el microscopio en posici(n adecuada respeto a la lu, y al ojo del observador. 1. Dbicar la preparaci(n sobre la platina !ij ndola con los sujetadores y mover /sta hasta dejar la preparaci(n sobre la parte iluminada" asegur ndose que el preparado quede hacia arriba 2. En!ocar con el objetivo de bajo aumento" es regla general en!ocar el preparado de abajo hacia arriba. +ara ello" se apro2ima el objetivo al preparado" de modo que la distancia entre ambos sea menor que la distancia !ocal. 3. Girar por el ocular" y hacer retroceder el tubo lentamente mediante el tornillo macrom/trico" hasta lograr ver la preparaci(n m s o menos en!ocadas. 5. 3inalmente en!ocar adecuadamente con el tornillo microm/trico. +ara cambiar el objetivo siguiente de mayor aumento" basta girar el rev(lver y en!ocar con el microm/trico 6. Eolver al objetivo de menor aumento a la posici(n de trabajo antes de cambiar la preparaci(n o guardar el microscopio. P!r! el empleo )el o$,eti&o )e inmersin en !ceite ("77 8# Es el objetivo que con mayor !recuencia se utili,a para observar bacterias" debido a que proporciona mayor ampli!icaci(n que cualquier otro tipo de objetivo. A la ve, que mayor cuidado requiere en su manejo" debido a que el punto de en!oque est muy pr(2imo a la preparaci(n. El aceite de inmersi(n proporciona un medio (ptimo
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homog/neo al paso de la lu, entre el porta y el lente !rontal del objetivo. +so del o jetivo de inmersin % )ubir el tubo" colocar el objetivo 1002 % Cejar caer una gota de aceite de inmersi(n sobre la parte iluminada de la preparaci(n" evitando as' la !ormaci(n de burbujas. % Hajar el tubo mirando por !uera hasta hacer contacto con la gota de aceite" pero sin tocar el portaobjeto. %. 3inalmente" en!ocar adecuadamente con el tornillo microm/trico. C!us!s posi$les )e m!los result!)os En el en(o,ue % objetivos !uera de lugar %. .entes sucias. %. +reparado mal centrado o al rev/s. Por im-genes e.tra/as %. -orp*sculos de polvo en el ocular $se despla,an al hacer girar&: en el objetivo $se mantienen a*n sin en el preparado&" burbujas de aire $se observan en !orma de c'rculos con borde negros&. En iluminacin % -ondensador bajo" o descendido en la muestra. %. Cia!ragma muy cerrado. Consi)er!ciones import!ntes p!r! el cui)!)o ' m!ntenimiento )el microscopio ptico Evitar mover el microscopio cuando la l mpara est/ encendida" ya que el !ilamento de la l mpara incandescente es e2tremadamente sensible. >o tocar las lentes de oculares y objetivos con los dedos" para evitar ensuciar con grasitud. Ciariamente" eliminar el polvo por medio de un soplete de aire o pincel !ino" limpiar el aceite de inmersi(n de lentes y otras super!icies del microscopio. Apagar la !uente de lu, del microscopio. -ubrir el microscopio con su !unda. 3rotar el objetivo de inmersi(n sin presionar con papel de lente" usando /ste una sola ve,. Iuitar el grueso del aceite" l'mpiar con una segunda hoja de papel ligeramente mojada en 2ilol" y por *ltimo s/quelo con una tercera hoja. >o usar cantidades e2cesivas de solventes porque puede disolver el cemento de los componentes de los lentes. >o usar alcohol" pues da;a la super!icie enlacadas del instrumento. Anualmente. .impiar pro!undamente" inspeccionar las partes y lubricar $Jeneralmente lo reali,an t/cnicos especiali,ados&.

Microscopio electrnico Ci!iere del microscopio (ptico en que se utili,an ondas de electrones en lugar de rayos luminosos $3igura #&. Estas ondas proporcionan al microscopio electr(nico una superioridad !undamental !rente al microscopio (ptico por su e2traordinario poder de ampliaci(n. >o !ue sino hasta que se desarroll( el microscopio electr(nico" en la d/cada del 40 y cuyo empleo se di!undi( ampliamente en los a;os #0" que los investigadores estuvieron en condiciones de estudiar los detalles !inos o estructuras de las c/lulas. El l.mite de resoluci(n es 100 veces mayor que el microscopio (ptico. l.mite )e resolucin )el microscopio ptico% (8 "577#% 7.177 m Microscopio electrnico% !# Tr!nsmisin% 1 A $# 9!rri)o% "7 A El en!oque del ha, de electrones se reali,a por medio de campos electromagn/ticos circulares en lugar de lentes. .as lentes no pueden utili,arse por ser el vidrio opaco a los electrones. El !oco var'a con la
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magnitud del campo magn/tico aplicado y el objeto" que es opaco a los electrones" intercepta el chorro de /stos" modelando un AhuecoB que puede ser observado en una pantalla o !otogra!iado. .a longitud de onda de los chorros de electrones que se utili,an en el microscopio electr(nico es del orden de 1@200 m o sea apro2imadamente 1@100.000 de la longitud de onda de la lu, visible utili,ada en la microscop'a (ptica. El microscopio electr(nico puede resolver part'culas de 2 a 8 m. )e utili,a este instrumento para lograr aumentos entre 10.000 y #0.000 veces" proporcionando im genes de mol/culas de prote'nas" cristales de virus" bacteri(!agos" !lagelos" estructuras internas de bacterias" etc. E2isten dos tipos de microscopios electr(nicos (Fi ur! 6#: % Tr!nsmisin de electrones: se usa para observar objetos muy peque;os enteros como los virus y bacterias o secciones muy delgadas $tejidos in!ectados&. .os espec'menes son sombreados o te;idos con un metal pesado" para incrementar el contraste. % 9!rri)o se usa para observar estructuras m s gruesas $ej. hongos&. )e secan y sombrean los espec'menes !orm ndose la imagen de los electrones que se re!lejan en la super!icie de las estructuras.
9i$lio r!*.! :HrocK Hiolog'a de los microorganismos. 7 edici(n. Gadigan" G.6." GartinKo"L.G. and +arKer" L. +rentice Fall. 2008. 1Hiology o! microorganisms. E99 ed. HrocK" 6.C." Gadigan" G.6." GartinKo"L.G.and y +arKer" L. +rentice Fall. 1::8. 1 Gicrobiolog'a. E9 edici(n. HrocK" 6.C." Gadigan" G.6." GartinKo"L.G.and y +arKer" L. +rentice% Fall Fispanoamericana. 1::4. 1 Hiolog'a. E9 edici(n en espa;ol. -urtis" F." Harnes" >. 2000.. Editorial +anamericana. 1Ju'a de trabajos practicos de Gicrobiolog'a Jeneral. 3-A%D>G+%A;o 2000 1 )tanier 5." 9ngraham L." Mheelis G." +ainter 5..1::=. Gicrobiolog'a. Editorial 5evert/ ). A. Espa;a. p. N#0. 16/cnicas generales y e2perimentaci(n bacteriol(gica. Eerna" .. El Ateneo.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL
O$,eti&os )el tr!$!,o pr;ctico ". -onocer el !undamento y uso del microscopio (ptico. 1. Cesarrollar destre,a en el uso del microscopio. 2. Adquirir destre,a en el montado el montaje de un material. 3. Cesarrollar habilidades para la reali,aci(n de preparados temporarios de diversos microorganismos. 5. Ci!erenciar diversos tipos de microorganismos teniendo en cuenta la !orma y el tama;o del mismo. 6. Apreciar caracter'sticas de los microorganismos tales como movilidad Acti&i)!)es ". Reconocer l!s p!rtes )el microscopio )obre la mesada se ubicar n microscopios (pticos compuestos y cada alumno reconocer las partes del mismo. 1. Re!li+!r prep!r!)os tempor!rios ' o$ser&!r (preparados al estado !resco& %. -olocar una gota de agua destilada sobre un portaobjeto limpio y desengrasado. %. -on la ayuda de un ansa o aguja colocar el material a observar sobre la gota de agua. %. -olocar un cubreojeto en un ngulo de 8#O y apoyar el mismo evitando la !ormaci(n de burbujas. 1.". 5eali,ar preparados de las siguientes c/lulas: Fongos pluricelulares $hi!as& Fongos unicelulares $levaduras) Hacterias !orma de bast(n $0acillus&. Hacterias en !ormas de cocos $)arcinas& Hacterias m(viles $A1ospirillum&. Hacterias agrupadas en cadenas $Lacto acillus $ *treptococcus). Gicroorganismos de distintos ambientes cultivados por los alumnos en la primera clase pr ctica. 1.1. O$ser&!r c!)! prep!r!)o con aumento 207 y dibujar lo observado en el preparado tal como lo observa en el microscopio. 1.2 O$ser&!r los prep!r!)os con m!'or !umento. 23on ,u aumento o serva con claridad las acterias4 23on ,u aumento o serva una ma$or proporcin de levaduras ? 1.3. Comp!r!r el t!m!<o )e l!s c(lul!s de cada uno de los preparados observados con un mismo aumento. +ara ello los alumnos rotar n sus preparados entre ellos. 1.5. C!lcul!r el !umento )e l! im! en" multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular 1.6. O$ser&!r mo&ili)!): reali,ar preparados al estado !resco de los siguientes microorganismos - )acharomyces cerviceae. - A,ospirillum lipo!erum - Hacillus subtilis - +aenibacillus larvae 2*e o serva movilidad en todos los preparados4. 2Logra di(erenciar el movimiento de la corriente citopl-smatica del movimiento del microorganismo4. Microor !nismos /uc!riot!s

"- =on os pluricelul!res%Aspergillus Penicillum otros

Aumento: 207<

8#7<

1007

1- =on os unicelul!res (le&!)ur!s#% Sacc!arom"ces cereviceae

Aumento: 207<

8#7<

1007

Microor !nismos proc!riot!s "- 9!cteri!s en *orm! )e $!stones

Aumento: 107< 1- #acterias en forma de cocos

8#7<

1007

Aumento: 207< 2- #acteria en forma de bastones mu" cortos )

8#7<

1007

Aumento: 207< 3- 9!cteri!s ! rup!)!s en c!)en!s

8#7<

1007

Aumento: 107< 5- 9!cteri!s con mo&ili)!)

8#7<

1007

Aumento: 207<

8#7<

1007

6- Celul!s euc!riot! m;s c(lul!s proc!riot! (#acillus subtilis $Sacc!arom"ces cereviceae)

Aumento: 207<

8#7<

1007<