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Prctica 4. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA, LA TEMPERATURA Y DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA.

Objetivo general: El alumno conocer como se desarrolla una reaccin qumica enzimtica y verificar los factores que influyen en la reaccin enzimtica, la concentracin, la temperatura y el pH sobre la velocidad de la reaccin enzimtica.

INTRODUCCIN La velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente depende en forma directa de la concentracin de la enzima. Los sitios activos de las enzimas no se saturan con el sustrato cuando las concentraciones de este son bajas. La proporcin enzimtica vara con las concentraciones del sustrato, a medida que aumenta el nmero de las molculas del sustrato, los sitios activos de las enzimas se van cubriendo cada vez ms en mayor grado hasta que en el punto de saturacin no queda ninguno disponible. La enzima trabaja a su mxima capacidad, y en estas condiciones la velocidad resulta independiente de la concentracin del sustrato.

MATERIAL Y REACTIVO 1 Mechero 1 Tripi, tela de asbesto 1 Vaso de precipitado de 50ml 2 Vasos de precipitado de 250ml 1 Vaso de precipitado de 400ml 2 Pipetas de 1ml 2 Pipetas de 5ml 15 Tubos de ensayo 1 Bao Mara a 85C 1 Gradilla 1 Vaso con hielo a 0C 1 Reloj marcador 1 Placa de porcelana 1 Gotero 2g de almidn de papa 5ml de NaOH al 0.2% 8ml de HCL al 0.2% Solucin yodurada Papel indicador de pH Saliva

PROCEDIMIENTO (SECCION A) Amilasa salival 1. Prepare cuatro tubos de ensayo y ponga en cada uno de ellos 5ml de solucin de almidn al 1%. 2. Al primer tubo adale 1 gota de saliva. Al segundo tubo adale 2 gotas de saliva. Al tercer tubo adale 5 gotas de saliva. Al cuarto tubo adale 10 gotas de saliva. 3. 4. Agtense perfectamente Haga la siguiente prueba al contenido de los cuatro tubos: *con intervalo de 1 minuto mezcle una gota del contenido del tubo con una gota de solucin yodada diluida en las concavidades de una placa de porcelana para coloraciones, determine en cual tubo se llega ms rpido al punto acrmico. 5. Anote los resultados en forma de tabla, de manera que en las hileras horizontales aparezcan los resultados de los diferentes tubos y en las columnas verticales los resultados de los diferentes tiempos, reportando las variaciones de color del azul al incoloro. 6. En el siguiente experimento emplee la cantidad de saliva que fue necesaria para hacer llegar la solucin de almidn al punto acrmico en un perodo de 10 a 15 minutos.

PROCEDIMIENTO (SECCION B) INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA. La temperatura afecta las reacciones enzimticas, por lo tanto son sensibles a los cambios de sta. Debido a la naturaleza proteica de las enzimas, la

desnaturalizacin trmica de estas causada por la elevacin de la temperatura har que disminuya su concentracin efectiva y por lo tanto su velocidad de reaccin. 1. Prepare cuatro tubos de ensayo numerados de 1 a 4, que contenga cada uno 5ml de solucin de almidn al 1%. 2. Prepare cuatro recipientes en los que se incubarn los cuatro tubos de reaccin. a) El primer recipiente deber contener hielo picado mezclado con

aproximadamente un tercio de su peso con sal comn. b) En el segundo se pone agua de la llave y se deja a temperatura Ambiente. c) El tercero se pone agua y se calienta a 38C. d) En el cuarto se pone agua y se calienta a 85C. 3. Teniendo ya todo listo se incuba el tubo No.1 en el bao con hielo, el No.2 en el que est a temperatura ambiente, el No.3 en el que est a 38C y el No.4 en el que est a 85C. 4. Cuando los tubos hayan alcanzado la temperatura de los recipientes se agrega a cada uno de ellos el nmero de gotas de saliva del primer experimento, que fueron necesarias para llevar la solucin al punto acrmico entre 10 y 15 minutos. 5. Se mezclan perfectamente el contenido de cada uno de los tubos y se hace la prueba del yodo sobre la placa para coloraciones a intervalos de 2 minutos. 6. Anote los resultados en una tabla en las que las columnas verticales representen los resultados a una misma temperatura y las hileras horizontales los muestren para un mismo lapso. 7. Despus de 20 minutos, pnganse todos los tubos que hayan dado color con el yodo en el recipiente en el que se haya visto que la hidrlisis es ms rpida, incbense ah durante 25 minutos observando y anotando los resultados. 8. De acuerdo con sus resultados diga si las temperaturas desfavorables inhiben o destruyen las enzimas.

PROCEDIMIENTO (SECCION C) INFLUENCIA DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION ENZIMTICA

El cambio de pH afecta de manera notable a las enzimas, los valores bajos o altos de pH adems de producir efectos inicos pueden determinar una desnaturalizacin considerable, que tambin conduce a la inactivacin. 1. Preprense 7 tubos de ensayo como sigue: 1 5.00 4.00 2 1.35 0.00 7.75 3 0.60 0.00 8.40 4 0.25 0.00 8.75 5 0.00 0.00 9.00 6 0.00 0.25 8.75 7 0.00 1.25 7.75

N de tubo ml HCl 0.2%

ml NaOH 0.2% 0.00 Ml H2O dest. 2.

Al terminar de pipetear el agua, mzclense bien los contenidos de los tubos y agrguense a cada uno de ellos 5ml de solucin de almidn al 1%.

3. 4.

Mzclense bien nuevamente y adase 1 ml de saliva a cada uno. Agite para asegurar una buena mezcla y hgase la prueba de yodo a todos los tubos a los 2, 12, 22, y 32 minutos de la adicin de saliva, teniendo la precaucin de acidificar las muestras de los tubos 6 y 7 antes de probar con el yodo.

5.

Mida el Ph de cada uno de los tubos y relacinese la variacin de la actividad amilolitica de la ptialina de la saliva al final de los 32 minutos con la variacin de Ph.

6.

Para saber si el Ph desfavorable destruyo o solo inhibi a la enzima ajstense los tubos en los que no hubo hidrlisis a un Ph de 6.0 a 7.0 y reincubense durante otros 20 minutos a temperatura optima.

7.

Al terminar el periodo hgales la prueba de yodo.